DE2241513A1 - Verfahren zur analytischen bestimmung der nucleotideinheiten in polynucleotiden - Google Patents

Verfahren zur analytischen bestimmung der nucleotideinheiten in polynucleotiden

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Description

einheiten in Polynucleotide^
Im allgemeinen wird die analytische Bestimmung der Polynucleotide zur Ermittlung der speziellen Anordnung der Nucleotideinheiten in. der Weise ausgeführt, daJ3 ein Polynucleotid an einem stark basischen Anionenaustauschermaterial adsorbiert wird, das endständige Nucleoside des Polynucleotidemit einem Perjodat oxidiert, überschüssiges Perjodat durch Reaktion mit 1-Rhamnose entfernt, das adsorbierte Polynucleotid dann mit einem Amin zur Entfernung des Nucleosidrests aus dem Polynueleotidrnoiekül behandelt und schlie/31ich mit einer Phosphatase umgesetzt wird, um die auftretende endständige Phosphatgruppe aus dem restlichen PolynucleoLidmolekül abzuupalteri, worauf schließlich der so erhaltene Nucleosidrest aua dem adsorbierten Polynucleofcid für die
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nachfolgende Identifizierung abgetrennt wird und das Ganze für jede Kuoleotideinheit dea Polynucleotide wiederholt wird.
Bekanntlich sind Polynucleotide oder Polyribonucleotide langkettige Polymere« enthaltend eine Vielzahl iron Nucleotid- oder Ribonuoleotideinheiten. Jede Nucleotideinheit (Nucleoaid) besteht aus einer Ribose, enthaltend einen Purin- oder Pyrimidin-Substituent. Die Riboseteile der benachbarten Nucleoside sind über Phosphatgruppen verbunden. Es ist in der biochemischen und medizinischen Forschung oft von größter Wichtigkeit, die spezielle Anordnung zu kennen, in der die Nucleotideinheiten aneinander hängen im Aufbau des Polynucleoti^moleküla. Verschiedene Methoden wurden bereits bekannt zum Abbau des Polynucleotidmoleküls in einzelne Nucleoside oder Hucleosideinheiten, die sich dann analysieren lassen, um die einzelnen-Purin- oder Pyrimidinbasen zu ermitteln, die daraus gebildet werden können· Durch diese Analyse bezweckt man die feststellung der Sequenz der einzelnen Basen innerhalb der Polynucleotidkette·
Nach einem bekannten Verfahren zur Analyse eines Polynucleotide wird ein exonucleolytisches Enzym angewandt, welches angeblich die endständigen Nucleotldeinholten abzuspalten und damit deren
zu gestattet«
Analyse ermöglichen Dieses enzymetisehe Verfahren ist jedoch nicht erfolgreich, da die dafür vorgesehenen Enzyme variierende und nicht reproduzierbare Aktivität besitzen und ungenaue Ergebnisse liefern·
Es wurde auch bereits ein stufenweiser chemischer und enzymatischer Abbau bekannt. Dabei erfolgt eine Reaktion mit einer Phosphatase zur Abspaltung der endständigen 3'-Phosphatgruppe des Polynucleotide, Oxidation der unsubstituierten cis-Hydroxylgruppen der endständigen Nucleotideinheit zu Dialdehydgruppen, woraufhin die alkalisch katalysierte Abspaltung des endständigen Nucleosidfragments erfolgt. Das so erhaltene Fragment wird dann hinsichtlich des Purin- oder Pyrimidinsubstituenten
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identifiziert. Diese Maßnahme wird für jede Nueleosideinheit des Polynucleotidmolekülg -wiederholt. Dieses Verfahren weist verschiedene Nachteile auf» Es gibt keine einfache und.wirksame Möglichkeit zur Trennung der freigesetzten iTucleosidfragmente,.da alle Reaktionskomponenten und -produkte sich in lösung befinden« Es muß größte Sorgfalt angewandt werden, um gleichzeitige Anwesenheit der Phosphatese,von Perjodat und Alkali in der Reaktionsmischung zu verhindern. Andererseits würde die Abspaltung der Nucleosidfragmente in unkontrollierbarer Weise stattfinden und damit zu fehlerhaften Ergebnissen führen.
Eine Terbesserung erreichte man durch Anwendung von lonenaustauscherchromatographie zur Trennung der freigesetzten ITucleosidreste von dem zurückbleibenden Polynucleotidmolekül jeweils nach einer Abbaustufe. Dies ist zwar günstig, hat jedoch den Nachteil, daß diese Vorgangsweise sehr zeitraubend ist und zu beträchtlichen Materialverlusten führt. Dieses Verfahren läßt sich also nur für relativ wenige Abbaustufen heranziehen und nicht für die Analyse komplexerer Polynucleotidmoleküle.
Auch Versuche zur Ausfällung der freigesetzten Uucleosidreste, •um sie dann zu trennen von dem zurückbleibenden Polynucleotidmolekül fführten zu keinen Erfolgen auf Grund der komplizierten Vorgangsweise und den damit verbundenen Materialverlusten.
Die Erfindung betrifft somit ein genaues und praktisches Verfahren zum stufenweisen Abbau eines Polynucleotide in bestimmte reproduzierbare Nucleosidfragmente, die dann der Identifizierung hinsichtlich ihrer Purin- oder Pyrimidinbasen zugänglich sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur analytischen Bestimmung des Aufbaus von Polynucleotiden besteht darin, daß 1· an einem stark basischen anionenaustauschenden Material ein jpolynucleotid, dessen endständige S'-Phosphatgrupp.e vorher entfernt wurde, adsorbiert wird;
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?. das adsorbierte Polynucleotid mit einem Perjodat behandelt wird« um die nicht substituierten cis-Hydroxylgruppen der endständigen Nucleosideinheiten des Polynucleotide zu oxidieren zu Dialdehydgruppen;
3. L-Rhamnose zugesetzt wird, um durch die erfolgende Reaktion restliches Perjodat zu entfernen;
4. das adsorbierte Polynucleotid mit einem Amin behandelt wird zur Abspaltung der endständigen Fucleotideinheit von dem Polynucleotidmolekülj während im wesentlichen gleichzeitig eine Behandlung mit Phosphatase stattfindet zur Entfernung der gebildeten endständigen 3'-Phosphatgruppe aus dem zurückbleibenden Polynucleotidmolekül;
5. Abtrennen des so erhaltenen Nucleosidrestes von dem adsorbierten Polynucleotid für die anschließende Identifizierung und Wiederholung der obigen Verfahrensstufen 2 bis 5 für die verbleibenden Nucleotideinheiten des Polynucleotidmoleküls.
Für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich Polynucleotide, wie sie als Polyribonucleotide bekannt sind und in biologischen Materialien verfügbar sind oder synthetisiert werden können. Um für das erfindungsgemäße Verfahren herangezogen zu werden, muß von dem Polynucleotid zuerst die endständige 3'-Phosphatgruppe abgespalten werden. Dies geschieht in üblicher Weise unter Anwendung einer alkalischen Phosphatase.
Zur Anwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete stark basische anionenaustauschende Materialien befinden sich im Handel. Sie werden beispielsweise hergestellt durch Suspensionspolymerisation von Styrol mit Divinylbenzol. Die erhaltenen Polymerperlen werden dann umgesetzt mit Chlormethyläther in Gegenwart von Aluminiumchlorid oder Zinkchlorid als Katalysator, um die Chlormethylgruppe an die Benzolringe des Polymers einzuführen. Dieses Produkt wird dann z.B. mit Trimethylamin aminiert
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zu einer hochionisierten quaternären Ammonium'gruppe an den Benzolringen.
Wie erwähnt, "befinden sich die verschiedensten stark basischen Anionenaustauscherharze mit quaternären Ammoniumgruppen als Reaktionsstellen im Handel.
Als bevorzugtes Anionenaustauschermaterial wendet man erfindungsgemäß "Dowex 1 x 2" an, d.ho, ein Austauschermaterial "Dowex 1", bestehend aus Polystyrol und vernetzt mit 2 fo Divinylbenzol, welches ebenfalls quaternäre Ammoniumgruppen als Reaktionsstellen enthält. Dieses Material besitzt die gewünsehte chemische Stabilität und ausreichende Austauseherkapazität über einen pH-Wertbereich für die Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren.
Als Perjodat für die Oxidation der cis-Hydrosylgruppen von dem von Phosphatgruppen befreiten Hucleosid des Polynucleotid kann man bekannte Produkte anwendeng die allgemeinen Reaktionsbedingungen sind ebenfalls bekannt.
Die Anwendung eines hydroxylhaltigen Stoffs wie Xthylenglykol und,Butan-2, 3-diol zur Umsetzung mit überschüssigem Perjodat ist bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Ii-Rhamnose angewandt, da diese Substanz als am wirksamsten und am leichtesten reagierend für diesen Zweck befunden werden konnte9 Dadurch kann die gesamte Verfahrenszeit verringert werden, was ein gewisser Vorteil gegenüber den bekannten Verfahren ist«
Die Anwendung von alkalischen Produkten wie Amine zum Abbau des Polynucleotide durch Entfernung der endständigen Nucleosidfragmente ist bekannt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Gemisch von Gyclohexylamin und N,N,N1,N'-Tetramethylglycinaraid-Hydrochlorid angewandt,
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da dieses Gemisch eine "bessere pH-Werteinstellung aui den gewünschten Wert von 8,5 während des gesamten Verfahrens gestattet.
Während die Arbeitstemperaturen nicht eigentlich kritisch sind, wird vorgezogen, die Reaktion des Polynucleotide mit dem Perjodat, die Behandlung mit L-Rhamnose und die !Trennung des abgebauten Nucleosidfragments von dem adsorbierten Polynucleotid bei etwa 10C und die Aminumsetzung mit dem Polynucleotid zum Abbau und Entfernung des endständigen Nucleosidfragments bei etwa 450C durchzuführen.
Der wesentliche Punkt des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Adsorption des Polynucleotide an einem unlöslichen Träger, Umsetzung verschiedener Materialien mit dieser damit unlöslich gemachten Form des Polynucleotide und leichter Abtrennung des abgebauten und damit löslich gewordenen Nucleosidfragments von dem unlöslich verbleibenden Teil des Polynucleotide. Es ist gleichzeitig wesentlich, daß die Reaktionsprodukte von dem Polynucleotid so abgespalten werden, daß das restliche Polynucleotid als Qesamtes an dem Anionenaustauschermaterial adsorbiert bleibt. Dies erreicht man durch Verdünnen der Flüssigkeit in Berührung mit dem Anionenaustauschermaterial bis zu einem solchen Punkt, daß die Konzentrationen der Anionen mit Ausnahme derer der Polynucleotide auf ein solches Niveau gesenkt werden, daß sie nicht das Polynucleotid vom Adsorbens verdrängen. Die speziellen Bedingungen,unter denen ein Polynucleotid von einem Anionenaustauschermaterial freigegeben und wieder adsorbiert werden kann, hängt ab von der Größe des Polynucleotidmoleküls· Hat man beispielsweise ein Polynucleotid mit 10 Nucleotideinheiten, so wird dieses vom Anionenaustauschermaterial freigesetzt, wenn die entsprechende Anionenkonzentration über einmolar steigt. Ein solches Polynucleotid wird vollständig neuerlic adsorbiert, wenn die verdrängende Anionenkonzentration durch Verdünnung auf etwa 0,1 m verringert wurde. Ein Polynucleotid enthaltend nur 2 Polynucleotideinheiten wird freigegeben, wenn die verdrängende Anionenkonzentration über etwa 0,4 m ansteigt
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und wird wieder vollständig adsorbiert, wenn die verdrängende Anionenkonzentration unter etwa 0,05 m absinkt.
Ist das Nueleosidfragment abgetrennt von dem Polynucleotid, kann es hinsichtlich seiner Purin- oder Pyrimidinbase nach bekannten Methoden analysiert werden. Z.B. kann der Ablauf aus der Abbaustufe, enthaltend die endständige Nucleotideinheit|Amin und Phosphatase zum Trocknen eingedampft werden. Es wird Ameisensäure zugesetzt und die Reaktionsmischung im Autoklaven erwärmt. Diese Säurebehandlung wandelt die endständigen Hucleosidreste in freie Purin- oder Pyrimidinbasen um, die dann durch Anionenaustauscherchromatographie identifiziert werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird am folgenden Beispiel weiter erläutert.
BEISPIEL
0,1 ecm Anionenaustauscherharz in der Chloridforra ("Dowex 1 χ 2") mit einer Korngröße von unter 37/unxwurde in ein Glasrohr gegeben und zwischen Glaswollstopfen fixiert. Das Harzbett wurde mit einer Puffermischung von 0,5 m Natriumchlorid und 0,01 m tr is (Hy d'r oxyme thy 1) aminome tha η mit einem pH-Wert von 7,5 gewaschen und dann mit kaltem destilliertem Wasser zur Entfernung von überschüssiger Pufferlösung gespült. Das Austauscherbett wurde auf einer Temperatur von etwa 10C gehalten, indem man es in einem Wasserbad anordnete.
Das zu untersuchende Polynucleotid wurde mit alkalischer Phosphatase zur Abspaltung der endständigen 3'-Phosphatgruppe behandelt. Eine wäßrige lösung, enthaltend etwa 100 nMol des erhaltenen Polynucleotide wurde einige Male mit Hilfe einer Rücklaufpumpe durch das Austauscherbett geführt, wobei sich der Hauptanteil des Polynucleotid am Harz adsorbierte. Nicht
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adsorbiertes Polynucleotid wurde durch weiteres Waschen mit destilliertem Wasser aus dem Bett entfernt. 0,5 com einer O,an Natronperjodatlösung wurde bei 1° C etwa 15 Minuten immer wieder durch das Bett gepumpt. Die Perjodatlösung führte zu einer Oxidation der cis-Hydroxylgruppen an den endständigen Nucleosiden unter Bildung von Dialdehydgruppen; wegen seines ionischen Charakters desorbierte es das Polynucleotid vom Harz. Biese Polynucleotid-haltige Lösung wurde mehrere Haie durch das Harz geleitet, dann wurden 0,5 ecm einer 1m L-Rhamnose-Lösung der im Kreislauf geführten Lösung zugesetzt und das Ganze immer wieder durch das Bett geleitet, während 5 Minuten. Die L-Rhamnose hatte während dieser Zeit die Möglichkeit, nicht umgesetztes Perjodat zu zerstören. 4,6 ecm kaltes destilliertes Wasser wurden dann eingebracht« um die Jodationenkonzentration auf etwa 0,017ta herabzudrticken. Das Umpumpen der gesamten Flüssigkeit wurde noch 10 Minuten fortgesetzt, so daß das Polynucleotid wieder adsorbiert werden konnte. Bann wurde die Flüssigkeit aus dem Bett abgelassen und das Harz mit 1 ecm kaltem destilliertem V/asser gewaschen. 0,1 ecm bakterieller alkalischer Phosphatese wurden dann in das Bett eingebracht und anschließend 0,1 ecm einer 1m Cyelohexylemin- und 2m , N,N1N*,N1-tetramethylglycinamid-Hydrochlorid-Lösung in das Bett geleitet. Weiters wurden 0,1 ecm der Aminlösung zugefügt und diese Flüssigkeit nun 2 Stunden bei 45° C wiederholte Male durch das Bett geleitet. Dieses Gemisch der Amine und Phosphatese spaltete die endständigen Nucleoside aus dem Polynucleotidmolekülab und ebenso die so gebildete endständige 3'"-Phosphatgruppe· Auch diese Lösung wegen ihres ionischen Charakters verdrängte das Polynuoleotid vom Harz. Nun wurden 5 ecm destilliertes Wasser der Reaktionsmischung zugesetzt, wodurch die Aminkonzentration auf etwa 0,04m absank. Die Temperatur des Bettes wurde auf etwa 10G gesenkt und obiges Flüssigkeitsgemisch 15 Minuten bei 1 C wiederholte Male durch das Harz geleitet. Bas Polynucleotid, dem sein ursprünglich endständiges Nuoleosid fehlte, wurde wieder adsorbiert. Die verdünnte Lösung, enthaltend Amin-Phosphatase und das Fragment des endständigen Neucleosids,
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wurde aus dem Bett abgeleitet und in einem mit einer Schraubkappe "versehenen Proberöhrchen aufgefangen* Das Reaktionsgefäß mit dem Austauscherharz wurde dann mit 1 ecm kaltem destilliertem Wasser gewaschen, welches dann auch in das Proberöhrchen lief. Die Gesamtzeit für die obige Perjodat-Oxidation, Abspaltung des endständigen Nucleoside und der Phosphorsäuregruppe betrug etwa 200 Minuten* Das Austauscherharz mit adsorbiertem Polynueieotid^wurde-dann-wieder nach obigem Reaktionszyklus behandelt, um die nächste endständige ÜTucleotideinheit zu entfernen» Dieser Kreislauf würde wiederholt bis die gesamten iFucleotideinheiten des Polynucleotids abgespalten waren*
Die kombinierten Abläufe der einzelnen Verfahrenssyklen hatten ein mittleres Volumen von etwa 8 ecm* Die einzelnen Abläufe wurden getrennt auf 100° G 2 Stunden in einem verschlossenen Rohr erwärmt} die gebildete freie Purin- oder Pyrimidinbase in jedem Prüfröhrchen wurde nun durch Anionenaustauschchromatographie analysiert*
Das ganze Verfahren äiente dazu, die Sequenz der Fucleosideinheiten eines Polynucleotid in an sich bekannter Weise durch stufenweisen Abbau zu ermitteln. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt auch die Bestimmung der Sequenz der Uucleotideinheiten in Polynucleotide^ deren Sequenzen bisher noch nicht bekannt waren.
Die Analyse nach der Erfindung bringt exakte Werte in wesentlich kürzerer Zeit und von viel komplexeren Polynucleotide^ als dies bei den bekannten Anaiysenverfahren der Pail war« Durch die einfachen Verfahrensmaßnahmen ist eine Automation für den Ablauf des gesamten Bestimmungsprozesses möglich*
Pa tentansprüche
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Claims (3)

  1. Patentansprüche
    [1.) Verfahren zur analytischen Bestimmung der Sequenzen eines Polynucleotide', dadurch gekennzeichnet , daß man
    a) das Polynucleotid, dessen endständige 3'--Phosphatgruppe entfernt ist, an einem stark basischen Anionenauatauschermaterial adsorbiert»
    "b) mit einem Perjodat zur Oxidation der unsubstituierten cis-Hydroxylgruppen der endständigen Hucleotideinheiten zu Dialdehydgruppen behandelt,
    o) mit L-Rhaminose überschüssiges Perjodat zerstört,
    d) das adsorbierte Polmucleotid mit einem Amin zur Abspaltung der endständigen Nucleotideinheit aus dem Molekül und im wesentlichen gleichzeitig mit einer Phosphatese zur Entfernung der sich bildenden endständigen 3'-Phosphatgruppe behandelt, denn
    e) die so gewonnenen Nucleosidreste vom adsorbierten Polynucleotid getrennt und identifiziert werden, woraufhin die Verfahrensstufen
    b) bis ö) für jede vorliegende Nucleotideinheit des Polynucleotide wiederholt werden.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzei net, daß man die Verfahrensstufen b), c) und e) bei etwa 10C und die Verfahrensstufe d) bei etwa 45° C vornimmt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man vor den Verfahrensstufen b), c) und e, die Konzentration der Anionen, außer denen des Polynucleotide in der mit dem Ionenaustauschermaterial in Berührung stehenden Flüssigkeit so weit verringert, daß sie nicht das Polynucleotid aus dem Anionenaustausch^harz verdrängen.
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    4· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man als Anionenaustausch^ material ein Polystyrol, vernetzst mit Divinylbenzol und enthaltend als reaktionsfähige Gruppen quaternäre Aramoniuragruppen, anwendet.
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