DE2241513B2 - Verfahren zur analytischen Be Stimmung der Sequenzen eines Poly nucleotids - Google Patents

Description

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Behanntlich sind Polynucleotide oder Polyribonucleotide langkettige Polymere, enthaltend eine Vielzahl von Nucleotid- oder Ribonucleotideinheiten. Jede Nucleotideinheit (Nucleosid) besteht aus einer Ribose, enthaltend einen Purin- oder Pyrimidin-Substituent. Die Riboseteile der benachbarten Nucleoside sind über Phosphatgruppen verbunden. Es isl in der biochemischen und medizinischen Forschung oft von größter Wichtigkeit, die spezielle Anordnung zu kennen, in der die Nucleotideinheiten aneinanderhängen im Aufbau des Polynucleotidmoleküls. Verschiedene Methoden wurden bereits bekannt zum Abbau des Polynucleotidmoleküls in einzelne Nucleoside oder Nucleosideinheiten, die sich dann analysieren lassen, um die einzelnen Purin- oder Pyrimidinbasen zu ermitteln, die daraus gebildet werden können. Durch diese Analyse bezweckt man die Feststellung der Sequenz der einzelnen Basen innerhalb der Poiynucleotidkette.

Nach einem bekannten Verfahren zur Analyse eines Polynucleotids wird ein exonucleolytisches Enzym angewandt, weiches angeblich die endständigen Nucleotideinheiten abzuspalten und damit deren Analyse zu ermöglichen gestattet. Dieses enzymatische Verfahren ist jedoch nicht erfolgreich, da die dafür vorgesehenen Enzyme variierende und nicht reproduzierbare Aktivität besitzen und ungenaue Ergebnisse liefern.

Es wurde auch bereits ein stufenweiser chemischer und enzymatischer Abbau bekannt. Dabei erfolgt eine Reaktion mit einer Phosphatase zur Abspaltung der endständigen 3'-Phosphatgruppe des Polynucleotids, Oxydation der unsubstituierten cis-Hydroxylgruppen der endständigen Nucleotideinheit zu Dialdehydgruppen, woraufhin die alkalisch katalysierte Abspaltung des endständigen N .leosidfragments erfolgt. Das so erhaltene Fragment vird dann hinsichtlich des Purin- oder Pyrimidinsubstituenten identifiziert. Diese Maßnahme wird für jede Nucleosideinheit des Polynucleotidmoleküls wiederholt. Dieses Verfahren weist verschiedene Nachteile auf. Es gibt keine einfache und wirksame Möglichkeit zur Trennung der freigesetzten Nucleosidfragmente, da alle Reaktionskomponenten und -produkte sich in Lösung befinden. Es muß größte Sorgfalt angewandt .erden, um gleichzeitige Anwesenheit der Phosphatase, von Perjodat und Alkali in der Reaktionsmischung zu verhindern. Andererseits würde die Abspaltung der Nucleosidfragmente in unkontrollierbarer Weise stattfinden und damit zu fehlerhaften Ergebnissen führen.

Eine Verbesserung erreichte man durch Anwendung von lonenaustauscherchromatographie zur Trennung der freigesetzten Nucleosidreste von dem zurückbleibenden Polynucleotidmolckül jeweiU nach einer Abbaustufe. Dies ist zwar günstig, hat jedoch den Nachteil, daß diese Vorgangsweise sehr zeitraubend ist und zu beträchtlichen Materialverlusten führt. Dieses Verfahren läßt sich also nur für relativ wenige Abbaustufen heranziehen und nicht für die Analyse komplexerer Polynucleotidmoleküle.

Auch Versuche zur Ausfällung der freigesetzten Nucleosidreste, um sie dann zu trennen von dem zurückbleibenden Polynucleotidmolekül, führten zu keinen Erfolgen auf Grund der komplizierten Vorgangsweise und den damit verbundenen Materialverlusten.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein genaues und praktisches Verfahren zum stufenweisen Abbau eines Polynuueotids in bestimmte reproduzierbare Nucleosidfragmente zu erstellen, die dann der Identifizierung hinsichtlich ihrer Purin- oder Pyrimidinbasen zugänglich sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur analytischen Bestimmung der Sequenzen eines Polynucleotids ist dadurch gekennzeichnet,

a) daß das Polynucleotid, dessen endständige 3'-Phosphatgruppe vorher entfernt ist, an einem stark basischen anionenaustauehenden Material adsorbiert wird,

b) daß das adsorbierte: Polynucleotid mit einem Perjodat zur Oxydation der unsubstituierten cis-Hydroxylgruppen der endständigen Nucleosideinheiten zu Dialdehydgruppen behandelt wird,

c) daß zur Entfernung von überschüssigem Perjodat L-Rhamnose zugesetzt wird,

d) daß das, adsorbierte Polynucleotid mit einem Amin zur Abspaltung der entständigen Nucleotideinheit aus dem Molekül und im wesentlichen

gleichzeitig mit einer Phosphatase zur Entfernung der gebildeten endständigen 3'-Phosphatgruppe behandelt wird,

e) daß die so gewonnenen Nucleosidreste vom adsorbierten Polynucleotid getrennt und identifiziert werden und

f) daß die Verfahrensstufen b) bis e) für jede verbleibende Nucleotideinheit des Polynucleotids wiederholt werden.

Für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich Polynucleotide, wie sie als Polyribonucleotide bekannt sind und in biologischen Materialien verfügbar sind oder synthetisiert werden können. Um für das erfindungsgemäße Verfahren herangezogen zu werden, muß von dem Polynucleotid zuerst die endständige 3'-Phosphatgruppe abgespalten werden. Dies geschieht in üblicher Weise unter Anwendung einer alkalischen Phosphatase.

Zur Anwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete tark basische anionenaustauschende Materialien befinden sich im Handel. Sie werden beispielsweise hergestellt durch Suspensionspolymerisation von Styrol mit Divinylbenzol. Die erhaltenen Polymerperlen werden dann umgesetzt mit Chlormethyläther in Gegenwart von Aluminiumchlond cder Zinkchlorid als Katalysator, um die Chlormethylgruppe an die Benzolringe des Polymers einzuführen. Dieses Produkt wird dann z. B. mit Trimethylamin aminiert zu einer hochionisierten quaternären Ammoniumgruppe an d.n. Benzolringen.
• Wie erwähnt, befinden sich die verschiedensten stark basischen Anione;iaustauscherhar?e mit quaternären Air.moniumgruppen als Reaktionszeiten im Handel.

Als bevorzugtes Anionenaustauschermaterial wendet man ein Austauschermaterial, bestehend aus Polystrol, vernetzt mit 2% Divinylbenzol, an. welches ebenfalls quaternäre Ammoniumgruppen als Reaktioimtellen enthält. Dieses Material besitzt die gewünschte chemische Stabilität und ausreichende Austauscherkapazität über einen pH-Wertbereich für die Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren.

Als Perjodat für die Oxydation der cis-Hydroxylgruppen von dem von Phosphatgruppen befreiten Nucleosid des Polynucleotids kann man bekannte Produkte anwenden; die allgemeinen Reaktionsbedingungen sind ebenfalls bekannt.

Die Anwendung eines hydroxylhaltigen Stoffs wie Äthylenglykol und Butan-2,3 -diol zur Umsetzung mit überschüssigem Perjodat ist bekannt. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird dagegen L-Rhamnose angewandt, da diese Substanz als am wirksamsten und am leichtesten reagierend für diesen Zweck befunden werden konnte. Dadurch kann die gesamte Verfahrenszeit verringert v/erden, was ein gewisser Vorteil gegenüber den bekannten Verfahren ist.

Die Anwendung von alkalischen Produkten wie Amine zum Abbau des Polynucleotids durch Entfernung der endständigen Nucleosidf ragmente ist bekannt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Gemisch von Cyclohexylamin und Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethylglycinamid-Hydrochlorid angewandt, da dieses Gemisch eine bessere pH-Werteinstellung auf den gewünschten Wert von 8,5 während des gesamten Verfahrens gestattet.

Während die Arbeitstemperaturen nicht eigentlich kritisch sind, wird vorgezogen, die Reaktion des Polynucleotids mit dem Perjosat, die Behandlung mit L-Rhamnose und die Trennung des abgebauten Nucleosidfragments von dem adsorbierten Polynucleotid bei etwa I⁰C und die Aminumsetzung mit dem Polynucleotid zum Abbau und Entfernung des endständigen Nicleosidfragments bei etwa 45° C durchzuführen. Der wesentliche Punkt des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Adsorption des Polynucleotids an einem unlöslichen Träger, Umsetzung verschiedener Materialien mit dieser damit unlöslich gemachten

ίο Form des Polynucleotids und leichter Abtrennung des abgebauten und damit löslich gewordenen Nucleosidfragments von dem unlöslich verbleibenden Teil des Polynucleotids. Es ist gleichzeitig wesentlich, daß die Reaktionsprodukte von dem Polynucleotid so abge-

-., spalten werden, daß das restliche Polynucleotid als Gesamtes an dem Anionenaustauschermaterial adsorbiert bleibt. Dies erreicht man durch Verdünnen der Flüssigkeit in Berührung mit dem Anionenaustauscherrnaterial bis zu einem solchen Punkt, daß die Konzentrationen der Anionen mit Ausnahme derer der Polynucleotide auf ein solches Niveau gesenkt werden, daß sie nicht das Polynucleotid vom Adsorbens verdrängen. Die speziellen Bedingungen, unter denen ein Polynucleotid von einem Anionenaustauschermaterial freigegeben und wieder adsorbiert werden kann, hängt ab von der Größe des Polynucleotidmoleküls. Hat man beispielsweise ein Polynucleotid mit 10 Nucleotideinheiten, so wird dieses vom Anionenaustauschermaterial freigesetzt, wenn die entsprechende Anionenkonzentration über 1 molar steigt. Ein solches Polynucleotid wird vollständig neuerlich adsorbiert, wenn die verdrängende Anionenkonzentration durch Verdünnung auf etwa 0,1 m verringert wurde. Ein Polynucleotid, enthaltend nur 2 Polynucleotideinheiten, wird freigegeben, wenn die verdrängende Anionenkonzentration über etwa 0,4 m ansteigt und wird wieder vollständig adsorbiert, wenn die verdrängende Anionenkonzentration unter efva 0,05 m absinkt.
1st das Nucleosidfragment abgetrennt von dem Polynucleotid, kann es hinsichtlich seiner Purin- oder Pyrimidinbase nach bekannten Methoden analysiert werden. Zum Beispiel kann der Ablauf aus der Abbaustufe, enthaltend die endständige Nucleotideinheit, Amin und Phosphatase zum Trocknen eingedampft werden. Es wird Ameisensäure zugesetzt und die Reaktionsmischung im Autoklav erwärmt. Diese Säurebehandlung wandelt die endständigen Nucleosidreste in freie Purin- oder Pynmidinbasen um, die dann durch Anionenaustauscherchromatographie identifiziert werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird am folgenden Beispiel weiter erläutert.

Beispiel

0,1 ecm Anionenaustauscherharz in der Chloridform mit einer Korngröße von unter 37 μΐη wurde in ein Glasrohr gegeben und zwischen Glaswollstopfen fixiert. Das Harzbett wurde mit einer Puffermischung von 0,5 m Natriumchlorid und 0,01 m tris(Hydroxy methyl)aminomethan mit einem pH-Wert von 7,5 ge waschen und dann mit kaltem destilliertem Wasser zur Entfernung von überschüssiger Pufferlösung gespült. Das Austauscherbett wurde auf einer Temperatur von etwa 1° C gehalten, indem man es in einem Wasser-

⁶S bad anordnete.

Das zu untersuchende Polynucleotid wurde mit alkalischer Phosphatase zur Abspaltung der endständigen 3'-Phosphatgruppe behandelt. Eine wäßrige Lö-

sung, enthaltend etwa 100 η Mol des erhaltenen PoIynucleotids wurde einige Male mit Hilfe einer Rücklaufpumpe durch das Austauscherbett geführt, wobei sich der Hauptanteil des Polynucleotid am Harz adsorbierte. Nicht adsorbiertes Polynucleotid wurde durch weiteres Waschen mit destilliertem Wasser aus dem Bett entfernt. 0,5 ecm einer 0,2 m Natronperjodatlösung wurde bei 1°C etwa 15 Minuten immer wieder durch das Bett gepumpt. Die Perjodatlösung führte zu einer Oxydation der cis-Hydroxylgruppen an den endständigen Nucleosiden unter Bildung von Dialdehydgruppen; wegen seines ionischen Charakters desorbierte es das Polynucleotid vom Harz. Diese Polynucleotidhaltige Lösung wurde mehrere Male durch das Harz geleitet, dann wurden 0,5 ecm einer 1-m-L-Rhamnose-Lösung der im Kreislauf geführten Lösung zugesetzt und das Ganze immer wieder durch das Bett geleitet, während 5 Minuten. Die L-Rhamnose hatte während dieser Zeit die Möglichkeit, nicht umgesetztes Perjodat zu zerstören. 4,6 ecm kaltes destilliertes Wasser wurden dann eingebracht, um die Jodationenkonzentration auf etwa 0,01 m herabTudrücken. Das Umpumpen der gesamten Flüssigkeit wurde noch 10 Minuten fortgesetzt, so daß das Polynucleotid wieder adsorbiert werden konnte. Dann wurde die Flüssigkeil aus dem Bett abgelassen und das Harz mit 1 ecm kaltem destilliertem Wasser gewaschen. 0,1 ecm bakterieller alkalischer Phosphatase wurden dann in das Bett eingebracht und anschließend 0,1 ecm einer 1-m-Cyclohexylamin- und 2-m-N,N,N',N'-tetramethylglycinamid-Hydrochlorid-Lösung in das Bett geleitet. Weiter wurden 0,1 ecm der Aminlösung zugefügt und diese Flüssigkeit nun 2 Stunden bei 45° C wiederholte Male durch das Bett geleitet. Dieses Gemisch der Amine und Phosphatase spaltete die endständigen Nucleoside aus dem Polynucleotidmolekül ab und ebenso die so gebildete endständige 3'-Phosphatgruppe. Auch diese Lösung wegen ihres ionischen Charakters verdrängte das Fclynucleotid vom Harz. Nun wurden 5 ecm destilliertes Wasser der Reaktionsmischung zugesetzt, wodurch die Aminkonzentration auf etwa 0,04 m absank. Die Temperatur des Bettes wurde auf etwa Γ C gesenkt und obiges Flüssigkeitsgemisch 15 Minuten bei 1°C wiederholte Male durch das Harz geleitet. Das Polynucieotid, dem sein ursprünglich endständiges Nucleosid fehlte, wurde wieder adsorbiert. Die verdünnte Lösung, enthaltend Amin-Phosphatase und das Fragment des endständigen Nucleosids, wurde aus dem Bett abgeleitet und in einem mit einei Schraubkappe versehenen Prooeröhrchen aufgefangen. Das Reaktionsgefäß mit dem Austauscherharz wurde dann mit 1 ecm kaltem destilliertem Wasser gewaschen, welches dann auch in das Proberöhrchen lief. Die Gesamtzeit für die obige Perjodat-Oxydation, Abspaltung des endständigen Nucleosids und der Phosphorsäuregruppe betrug etwa 200 Minuten. Das Austauscherharz mit adsorbiertem Polynucleotid wurde dann wieder nach obigem Reaktionszyklus behandelt, um die nächste endständige Nucleotideinheit zu entfernen. Dieser Kreislauf wurde wiederholt bis die gesamten Nudeotideirvheiten des Polynucleotide abgespalter varen.

Die kombinierten Abläufe der einzelnen Verfahrenszyklen hatten ein mittleres Volumen von etwa 8 ecm. Die einzelnen Abläufe wurden getrennt auf 100 C 2 Stunden in einem verschlossenen Rohr erwärmt; uie gebildete freie Purin- oder Pyrimidinbase in jedem Prüfröhrchen wurde nun durch Anionenaustauschchromatographie analysiert.

Das ganze Verfahren diente dazu, die Sequenz der

Nucleosideinheiten eines Polynucleotid in an sich bekannter Weise durch stufenweisen Abbau zu ermitteln. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt auch die Bestimmung der Sequenz der Nucleotideinheiten in Polynucleotide^ deren Sequenzen bisher noch nicht bekannt waren.

Die Analyse nach der Erfindung bringt exakte Werte in wesentlich kürzerer Zeit und von viel komplexeren Pooynucleotiden, als dies b^i den bekannten Analysenverfahren der Fall war. Durch die einfachen

Verfahrensmaßnahmen ist eine Automation für den Ablauf des gesamten Bestimmungsprozesses möglich.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur analytischen Bestimmung der Sequenzen eines Polynucleotide, dadurch gekennzeichnet,

a) daß das Polynucleotid, dessen endständige 3'-Phosphatgruppe entfernt ist, an einem stark, basischen Anionenaustauschermaterial adsorbiert wird, ίο

b) daß das adsorbierte Polynucleotid mit einem Perjodat zur Oxydation der unsubstituierten cis-Hydroylgruppen der endständigen Nueleotideinheiten zu Dialdehydgruppen behandelt wird,

c) daß zur Entfernung von überschüssigem Perjodat L-Rhamnose zugesetzt wird,

d) daß das adsorbierte Polynucleotid mit einem Amin zur Abspaltung der endständigen Nucleotideinheit aus dem Molekül und im we- *α sentlichen gleichzeitig mit einer Phosphatasezur Entfernung der sL-h bildenden endständigen 3'-Phosphatgruppe behandelt wird,

e) daß die so gewonnenen Nucleosidreste vom adsorbierten Polynucleotid getrennt und identifiziert werden,

Π daß die Verfahrensstufen b) bis e) für jede verbleibende Nucleotideinheit des Polynucieotids wiederholt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verfahrensstufen b), c) und e) bei etwa IC uid die Verfahrensstufe d) bei etwa 45 C voigenommen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß vor den Verfahrensstufen b), c) und e) die Konzentration der Anionen, außer denen des Polynucleotids, in der mit dem lonenaustauschermatenai in Berührung stehenden Flüssigkeit so weit verringert wird, daß sie nicht das Polynucleotid aus dem Anioneiiaustauscherharz verdrängen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Anionenaustauscher-Material ein Polystyrol, vernetzt mit Divinylbenzol und enthaltend als reaktionsfähige Gruppen quaternäre Ammoniumgruppen, verwendet wird.