DE2241513C3 - Verfahren zur analytischen Bestimmung der Sequenzen eines Polynucleotids - Google Patents

Verfahren zur analytischen Bestimmung der Sequenzen eines Polynucleotids

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    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Description

CfI.
Bchanntlich sind Polynucleotide oder Polyriboliucleotide langkcttigc Polymere, enthaltend eine Vielzahl von Nucleotid- oder Ribonucleotideinheiten. Jede Nucleotideinheit (Nucleosid) besteht aus einer Ribosc, enthaltend einen Purin- oder Pyrimidin-Substituer.t. Die Riboseteile der benachbarten Nucleoside sind über Phosphatgruppen verbunden. Es ist in der biochemischen und medizinischen Forschung oft von größter Wichtigkeit, die spezielle Anordnung zu kennen, in der die Nucleotideinheiten aneinanderhängen im Aufbaudes Polynucleiotidmoleküls. Verschiedene Methoden wurden bereits bekannt zum Abbau des Polynucleotidmoleküls in einzelne Nucleoside oder Nucleosideinheiten, die sich dann analysieren lassen, um die einzelnen Purin- oder Pyrimidinbasen zu ermitteln, die daraus gebildet werden können. Durch diese Analyse bezweckt man die Feststellung der Sequenz der einzelnen Basen innerhalb der Polynucteotidkette.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein genaues und praktisches Verfahren zum stufenweisen Abbau eines Polynucleotids in bestimmte reproduzierbare Nuclcosidfragmente zu erstellen, die dann der Identifizierung hinsichtlich ihrer Purin- ode· Pyrimidinbasen zugänglich sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur analytischen Bestimmung der Sequenzen eines Polynucleotids ist dadurch gekennzeichnet,
a) daß das Polynucleotid, dessen endständige 3'-Phosphatgruppe vorher entfernt ist, an einem stark basischen anionenaustauchenden Material adsorbiert wird,
b) daß das adsorbierte Polynucleotid mit einem Perjodat zur Oxydation der unsubstituierten cis-Hydroxylgruppen der endständigen Nucleosideinheiten zu Dialdehydgruppen behandelt wird,
c) daß zur Entfernung von überschüssigem Perjodat L-Rhamnosc zugesetzt wird,
d) daß das adsorbierte Polynucleotid mit einem / min zur Abspaltung der entständigen Nucleotideinheit aus dem Molekül und im wesentlichen
gleichzeitig mit einer Phosphatase zur Entfernung der gebildeten endständigen 3'-Phosphatgruppe behandelt wird,
e) daß die so gewonnenen Nucleosidreste vom adsorbierici": Polynuclcctid getrennt und identifiziert werden und
f) daß die Verfahrensstufen b) bis e) für jede verbleibende Nucleotideinheit des Polynucleotids wiederholt werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich Polynucleotide, wie sie als Polyribonucleotide bekannt sind und in biologischen Materialien verfügbar sind oder synthetisiert werden können. Um für das erfindungsgemäße Verfahren herangezogen zu werden, muß von dem Polynucleotid zuerst die endständige 3'-Phosphatgruppe abgespalten werden. Dies geschieht in üblicher Weise unter Anwendung einer alkalischen Phosphatase.
Zur Anwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete stark basische anionenaustauschende Materialien befinden sich im Handel. Sie werden beispielsweise hergestellt durch Suspensionspolymerisation von Styrol mit Divinyibenzoi. Die erhaltenen Polymerperlen werden dann umgesetzt mit Chlormethyläther in Gegenwart von Aluminiumchlorid oder 2inkchlond als K.atalvsatQr um die Chlorroethvlgruppe an die Benzolringe des Polymers einzuführen. Dieses Produkt wird dann z. B. mit Trimethylamin unliniert zu einer hochionisierten quaternären Ammoniumgruppe an den Benzolrinnen.
Wie erwähnt, befinden sich die verschiedensten stark basischen Anionenaustauscherharze mit quaternären Ammoniumgruppen als Reakuonsstellen im Handel.
Als bevorzugtes Anioner.aus luschermaterial wendet man ein Austauschermaterial, bestehend aus Polystrol, vernetzt mit 2% Divinyibenzoi, an, welches ebenfalls quaternäre Ammoniumgruppen als ReaktionssHlen enthält. Dieses Material besitzt die gewünschte chemische Stabilität unci ausreichende Austau-cherkapazität über einen pH-Wertbereich für die Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren.
Als Perjodat für die Oxydation der cis-Hydro.xylgruppen von dem von Phosphatgruppen befreiten Nucleosid des Polynucleotids kann man bekannte Produkte anwenden; die allgemeinen Reaktionsbedingungen sind ebenfalls bekannt.
Die Anwendung eines hyJroxylhaltigen Stoffs wie Äthylenglykol und Butan-2,3 -diol zur Umsetzung mit überschüssigem Perjodat ist bekannt. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird dagegen L-Rhamnose angewandt, da diese Substanz als am wirksamsten und am leichtesten reagierend für diesen Zweck befunden werden konnte. Dadurch kann die gesamte Vcrfahrer.szeit verringert werden, was ein gewisser Vorteil gegenüber den bekannten Verfahren ist.
Die Anwendung von alkalischen Produkten wie Amine zum Abbau des Polynucleotids durch Entfernung der endständigen Nucleosidfragmente ist bekannt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Gemisch von Cyclohexylamin und Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyiglycinamid-Hydrochlorid angewandt, da dieses Gemisch eine bessere pH-Werteinstellung auf den gewünschten Wert von 8,5 während des gesamten Verfahrens gestattet.
Während die Arbeitstemperaturen nicht eigentlich kritisch sind, wird vorgezogen, die Reaktion des Polynucleotids mit dem Perjosat, die Behandlung mit L-Rhamnose und die Trennung des abgebauten Nudeosidfragments von dem adsorbierten Polynucleotid bei etwa l°Cunddie Aminumsetzungmitdem PoIynudeotid zum Abbau und Entfernung des endständigen Nicleosidfragments bei etwa 45" C durchzuführen. Der wesentliche Punkt des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Adsorption des Polynucleotids an einem unlöslichen Träger, Umsetzung verschiedener Materialien mit dieser damit unlöslich gemachten
ίο Form des Polynucleotids und leichter Abtrennung des abgebauten und damit löslich gewordenen Nudeosidfragments von dem unlöslich verbleibenden Teil des Polynucleotids. Es ist gleichzeitig wesentlich, daß die R.eaktionsprodukte von dem Polynucleotid so abge-
»5 spalten werden, daß das restliche Polynucleotid als Gesamtes an dem Anionenaustauschermaterial adsorbiert bleibt. Dies erreicht man durch Verdünnen der Flüssigkeit in Berührung mit dem Anionenaustauschermaterial bis zu einem solchen Punl i, dnP die Konzentrationen der Anionen mit Ausnahme derer der Polynucleotide auf ein solches Niveau gesenkt werden, daß sie nicht das Polynucleotid vom Adsorbens verdrängen. Die speziellen Bedingungen, unter denen ein Polynucleotid von einem Anionenaustauschermaterial freigegeben und wieder adsorbiert werden kann, hängt ab von der Größe des Polynucleotidmoleküls. Hat man beispielsweise ein Polynucleotid mit 10 Nucleotideinheiten, so wird dieses vom Anionenaustauschermaterial freigesetzt, wenn die entsprechende Anionenkonzentration über 1 molar steigt. Ein solches Polynucleotid wirci vollständig neuerlich adsorbiert, wenn die verurängende Anionenkonzentration durch Verdünnung auf etwa 0,1 m verringert wurde. Ein Polynucleotid, enthaltend nur 2 Polynuclcotideinheitcn, wird freigegeben, wenn die verdrängende Anionenkonzentration über etwa 0,4 m ansteigt und wird wieder vollständig adsorbiert, wenn die verdrängende Anionenkonzentration unter etwa 0,05 m absinkt.
Ist das Nucleosidfragmeni abgetrennt von dem Polynucleotid, kann es hinsichtlich seiner Purin- oder Pyrimidinbase nach bekannten Methoden analysiert werden. Zum Beispiel kann der Ablauf aus der Abbaustufe, enthaltend die endständige Nucleotideinheit, Amin und Phosphatase zum Trocknen eingedampft
werden. Es wird Ameisensäure zugesetzt und die Reaktionsmischurig im Autoklav erwärmt. Diese Säurebehandlung wandelt die endständigen Nuckosidr^.ic in freie Furin- oder Pyrimidinba^n um, die dann durch Anionenaustauscherchromatographie identifiziert werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird am folgenden Beispiel weiter erläutert.
Beispiel
0,1 ecm Anionenaustauscherharz in der Chloridform mit einer Korngröße von unter 37 μίτι wurde in ein Glasrohr gegeben und zwischen GlaswoDstopfen fixiert. Das Harzbett wurde mit einer Puffermischung von 0,5 m Natriumchlorid und 0,01 m tris(Hydroxymethyl)aminomethan mit einem pH-Wert von 7,5 gewaschen und diann mit kaltem destilliertem Wasser zur Entfernung von überschüssiger Pufferlösung gespült. Das Austauscherbett wurde auf einer Temperatur von etwa TC gehalten, indem man es in einem Wasserbad anordnete.
Das zu untersuchende Polynucleotid wurde mit alkalischer Phosphatase zur Abspaltung der endständigen 3'-Phosphatgruppe behandelt. Eine WaB1 ige Lü-
sung, enthaltend etwa 100 nMol des erhaltenen PoIynucleotids wurde einige Male mit Hilfe einer Rücklaufpumpe durch das Austauscherbett geführt, wobei sich der Hauptanteil des Polynucleotid am Harz adsorbierte. Nicht adsorbiertes Polynucleotid wurde durch weiteres Waschen mit destilliertem Wasser aus dem Bett entfernt. 0v5 ecm einer 0,2 m Nairünperjodatlösung wurde bei TC etwa 15 Minuten immer wieder durch das Bett gepumpt. Die Perjodatlösung führte zu einer Oxydation der cis-Hydroxylgruppen an den end- ίο ständigen Nucleosiden unter Bildung von Dialdehydgruppen; wegen seines ionischen Charakters desorbierte es das Polynucleotid vom Harz. Diese Polynucleotidhaltige Lösung wurde mehrere Male durch das Harz geleitet, dann wurden 0,5 ecm einer 1-m-L-Rhamnose-Lösung der im Kreislauf geführten Lösung zugesetzt und das Ganze immer wieder durch das Bett geleitet, während 5 Minuten. Die L-Rhamnose hatte während dieser Zeit die Möglichkeit, nicht umgesetztes Pcrjodat zu zerstören. 4,6 ecm kaltes destilliertes Wasscr wurden dann eingebracht, um die Jodationenkonzentration auf etwa °,01 m herabzudrücken. Das Umpumpen der gesamten Flüssigkeit wurde noch 10 Minuten fortgesetzt, so daß das Polynucleotid wieder adsorbiert werden konnte. Dann wurde die Flüssig- *5 keit aus dem Bett abgelassen und das Harz mit 1 ecm kaltem destilliertem Wasser gewaschen. 0,1 ecm bakterieller alkalischer Phosphatase wurden dann in das Bett eingebracht und anschließend 0,1 ecm einer 1-m-Cyclohexylamin- und 2-m-N,N,N',N'-tetramethyl- 3<> glycinamid-Hydrochlorid-Lösung in das Bett geleitet. Weiter wurden 0,1 ecm der Arninlösung zugefügt und diese Flüssigkeit nun 2 Stunden bei 45 C wiederholte Male durch das Bett geleitet. Dieses Gemisch der Amine und Phosphatase spaltete die endständigen Nucleoside aus dem Polynucleotidmolekül ab und ebenso die so gebildete endständige 3'-Phosphatgrupp;. Auch diese Lösung wegen ihres ionischen Charakters verdrängte das Polynucleotid vom Harz. Nun wurden 5 ecm destilliertes Wasser der Reaktionsmischung zugesetzt, wodurch die Aminkonzentration auf etwa 0,04 m absank. Die Temperatur des Beties wurde auf etwa TC gesenkt und obiges Flüssigkeitsgemisch 15 Minuten bei 1CC wiederholte Male durch das Harz geleitet. Das Polynucleotid, dem sein ursprünglich endständiges Nucleosid fehlte, wurde wieder adsorbiert. Die verdünnte Lösung, enthaltend Amin-Phosphatase und das Fragment des endständigen Nucleosids, wurde aus dem Bett abgeleitet und in einem mit einer Schraubkappe versehenen Proberöhrchen aufgefangen. Das Reaktionsgefäß mit dem Austauscherharz wurde dann mit 1 ecm kaltem destilliertem Wasser gewaschen, welches dann auch in das Proberöhrchen lief. Die Gesamtzeit für die obige Perjodat-Oxydation, Abspaltung des endständigen Nucleosids und der Phosphorsäuregruppe betrug etwa 200 Minuten. Das Austauscherharz mit adsorbiertem Polynucleotid wurde dann v/ieder nach obigem Reaktionszyklus behandelt, um die nächste endständige Nucleotideinheit zu entfernen. Dieser Kreislauf wurde wiederholt bis die gesamte1^ Nucleotideinheiien des Polynucleotids abgespalten waren.
Die kombinierten Abläufe der einzelnen Verfahrenszyklen hatten ein mittleres Volumen von etwa 8 ecm. Die einzelnen Abläufe wurden getrennt auf 100 C .? Stunden in einem verschlossenen Rohr erwärmt; die gebildete freie Purin- oder Pyrimidinbase in jedem Prüfröhrchen wurde nun durch Anionenaustauschchromatographie analysiert.
Das ganze Verfahren dienti dazu, die Sequenz der Nucleosideinheiten eines Polynucleotid in an sich bekannter Weise durch stufenweisen Abbau zu ermitteln. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt auch die Bestimmung der Sequenz der Nucleotideinheiten in Polynucleotide^ deren Sequenzen bisher noch nicht bekannt waren.
Die Analyse nach der Erfindung bringt exakte Werte in wesentlich kürzerer Zeit und von viel komplexeren Pooynucleotiden, aus dies bei den bekannten Analysenverfahren der Fall war. Durch die einfachen Verfahrensmaßnahmen ist eine Automation für den Ablauf des gesamten Bestimmungsprozesses möglich.

Claims (4)

2 !513 Patentansprüche:
1. Verfahrein zur analytischen Bestimmung tier Sequenzen eines Polynucleotids, dadurch gekennzeichnet,
a) daß das Polynucleotid, dessen endständige 3'-Phosphatgruppe entfernt ist, an einem stark basischen Anionenaustauschermaterial adsorbiert wird, ίο
b) daß das adsorbierte Polynucleotid mit einem Perjodat zur Oxydation der unsubstituierten cis-Hydroylgruppen der endständigen Nucleotideinheiten zu Dialdehydgruppen behandelt wird,
c) daß zur Entfernung von überschüssigem Perjodat L-Rhamnose zugesetzt wird,
d) daß das adsorbierte Polynucleotid mit einem Amin zur Abspaltung der endständigen Nucleotideinheit aus dem Molekül und im wesentlichen gleichzeitig mit einer Phosphatase zur Entfernung der sich bildenden endständigen 3'-Phosphatgruppe behandelt wird,
e) daß die so gewonnenen Nucleosidreste vom adsorbierten Polynucleotid getrennt und identifiziert werden,
f) daß die Verfahrensstufen b) bis e) für jede verbleibende Nucleotideinheit des Polynucleotids wiederholt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verfahrensstufen b), c) und e) bei etwa 1 C und die Verfahiendstufe d) bei etwa 45 Λ '. vorgenommen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß vor den Verfahrensstufen b), c) und e) die Konzentration der Anionen, außer denen des Polynucleotids, in der mit dem ionenaustauschermateria! in Berührung stehenden Flüssigkeit so weit verringert wird, daß sie nicht das Polynucleotid aus dem Anionenaustauscherharz verdrängen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Anionenaustauscher-Material ein Polystyrol, vernetzt mit Divmylbenzol und enthaltend als reaktionsfähige Gruppen quüicniarc Amnioniurrigruppcr;, vcr wendet wird.
Nach einem bekannten Verfahren zur Analyse eines Polynucleotids wird ein exonucleolytisches Enzym angewandt, welches angeblich die endständigen Nucleofideinheiten abzuspalten und damit deren Analyse zu ermöglichen gestattet. Dieses enzymatisch^ Verfahren ist jedoch nicht erfolgreich, da die dafür vorgesehenen Enzyme variierende und nicht reproduzierbare Aktivität be^en und ungenaue Ergebnisse hefern.
Es wurde auch bereits ein stufenweiser chemischer und enzymatischer Abbau bekannt. Dabei erfolgt eine Reaktion mit einer Phosphatase zur Abspaltung der endständigen 3'-Phosphatgruppe des Polynucleotids. Oxydation der unsubstituierten c.s-Hydroxylgruppen der endständigen Nucleotideinheit zu Dialdehydgruppen, woraufhin die alkalisch katalysierte Abspaltung des endständigen Nucleosidfragments erfolgt. Das se erhaltene Fragment wird dann hinsichtlich des Punn- oder Pyrimidinsubstituenten identifiziert. Diese Maßnahme wird für jede Nucleosidcinheit des Polynucleo tidmoleküls wiederholt. Dieses Verfahren weist ve, schiedene Nachteile auf. Es gibt keine einfache un,. wirksame Möglichkeit zur Trennung der freigesetzter Nucleosi.Jfragmente, da alle Reaktionskomponente; und -produkte sich in Lösung befinden. Es muß grobi.: Sorgfalt angewandt werden, um gleichzeitige Anwesenheit der Phosphatase, von Perjodat und Alkali .1 der Reaktionsmischung zu verhindern. Andererseits würde die Abspaltung der Nucleosidfragmente in unkontrollierbarer Weise stattfinden und damit zu fehlerhaften Ergebnissen führen.
Eine Verbesserung erreichte man durcn Anwenaunc von Ionenaustauscherchromatographie zur Trennung der freigesetzten Nucleosidreste .on dem zurückbleibenden Polynucleotidmolekül jeweils nach einer Abbaustufe. Dies ist zwar günstig, hat jedoch den Nachteil daß diese Vorgangsweise sehr zeitraubend ist uiki zu beträchtlichen Materialverlusten führt. Dieses Verfahren läßt sich also nur für relativ wenige Abbaustufen heranziehen und nicht für die Analyse komplexerer Polynucleotidmoleküle.
Auch Versuche zur Ausfällung der freigesetzten Nucleosidreste, um sie dann zu trennen von dem zurückbleibenden Polynucleotidmolekül, führten zu keinen Erfolgen auf Grund der komplizierten Vorgangsweise und den damit verbundenen Matcnal-
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