DE2243688A1

DE2243688A1 - Verfahren zur isolierung von antithrombin aus tierischem material durch adsorption an sulfatisierte kohlenhydrate

Info

Publication number: DE2243688A1
Application number: DE2243688A
Authority: DE
Inventors: Lars-Olof Andersson; Maggie Millerandersson
Original assignee: Kabi AB
Current assignee: Phadia AB
Priority date: 1971-09-08
Filing date: 1972-09-06
Publication date: 1973-03-22
Also published as: AU4637372A; HU165070B; AT324549B; FR2154483A1; NO135302C; BE787284A; CS172957B2; FI50583B; FR2154483B1; DE2243688C3; IE36670B1; NL154118B; CA979805A; CH577829A5; ES406199A1; IL39982A; IL39982A0; DE2243688B2; DK131128B; ZA726024B

Description

betreffend

Verfahren zur Isolierung von Antithrombin aus tierischem Material durch Adsorption an oulfatisierte Kohlenhydrate.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Antithrombin aus Blut öder Blutprodukten durch Adsorption an eine G-elmatrix, enthaltend sulfatisierte Kohlenhydrate.

Die Blutgerinnung ist ein komplizierter Prozess, der zahlreiche Faktoren umfaßt. Die Bildung eines Blutpjropfens kann durch eine Anzahl verschiedener Reize eingeleitet v/erden, von denen der häufigste die mechanische Zerstörung von einem oder mehreren Blutgefäßen ist. Die Gerinnung oder Koagulation wird darm teilweise einge-

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leitet durch Kontaktaktivierung bestimmter Faktoren im Blut und teilweise durch Gewebeaktiv-vtoren, die aus der verletzten Stelle austreten. Die Zusammenballung von Blutklumpen oder -pfropfen, die-gleichzeitig stattfindet, führt auch zur Einleitung der Blutgerinnungο Eine Reaktionskette wird eingeleitet, die schließlich zur Bildung eines Klumpenq oder Gerihrsels an der Verletzungsstelle führt. Eine der letzten und wichtigsten Stufen bei der Bildung eines Fibriripfropfens ist die Wirkung von thrombin, einem Enzym., das bei der Blutgerinnung Über Fibrinogen gebildet wird, wobei zwei kleine Peptidteile von dem Fibrinogen abgespalten werden, was zu einem modifizierten Fibrinogen führt, v/elcheo ■ dann schnell vernetzt und einen Pfropfen bildet.,

Um die Koagulationsneigung des Blutes zu regeln und zu verhindern, daß sich eine örtliche Koagulation ausbreitet und zu einer vollständigen intravaskulären !Pfropfenbildung führt, sind verschiedene Substanzen im Blut vorhanden, die eine Hemmung der Koagulation bewirken. Einer der wichtigsten' derartigen Inhibitoren ist Antithroinbin, ein Protein, das "mit Thrombin reagiert und dieses inaktivierte Derartig inaktiviertes Thrombin kann das Fibrinogen nicht mehr angreifen und die Bildung von Pfropfen wird verhinderte

Bei verschiedenen (Krankheits-)Zuständen wurde ein pathologisch verminderter Antithrombingehalt beobachtet, verbunden mit einer erhöhten Gefahr von Thrombose, z.B. nach größeren Operationen. Die Annahme ist begründet, daß eine Antithrombintherapie zur Behandlung derartiger Fälle wertvoll sein kann- Ein verminderter Antithrombingehalt hat sich auch in Verbindung mit der Anwendung bestimmter Steroide gezeigte

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Bisher wurde Ant!thrombin nur in Spuren isoliert und ist infolgedessen verhältnismäßig wenig bekannt. Die bisher hierfür- angewandten Verfahren sind sehr kompliziert und haben zu sehr geringen. Ausbeuten-von 1 bis 2 $'geführt. Das unten beschriebene Verfahren erlaubt die Extraktion von Ant!thrombin in Ausbeuten von über 90 $.

In Zusammenhang mit Versuchen, Koagulaiionsfaktoren aus Blutplasma durch Adsorption an Gele/ αϊe 'sulfatisierte Kohlenhydrate enthalten, hat es sich überraschenderweise gezeigt, daß spezifische KoagulatioiiBfaktoren an diese G-ele" gebunden werden. Eine zusätzliche Trennung des Materials durch Gelfiltration erlaubt eine Isolierung einer Komponente -mit einem Llolekulargev/icht von ungefähr 65 000, die eine starke Koagulationsinhibitorwirkung besitzt. Untersuchungen dieses Proteins mit physikalisch-chemischen und immunologischen Untersuchungsverfahren zeigen die Identität dieser Probe mit dem früher beschriebenen Antithrombin IH₀ Untersuchungen mit einer Gefälleeluierung (gradient eluation) des Gels in der Säule zeigen/laß Antithrombin direkt in angemessener Trennung von den anderen Proteinen des Ausgangsmaterials erhalten werden kanne Um große Mengen Antithrombin zu erhalten, hat es sich als günstig erwiesen, es von der Cohnfruktion IV (Verfahren 6") durch Zugabe des Gele 'zu einer lösung diocer Fraktion zu adsorbieren. Kach der Adsorption kann das GoI abfiltriert, gewaschen Und eluiert werden. Nach Gelfiltration des Eluats über ein dreidimensional vernetztes Polysaeharid auf Dextranbasis (Sephadex^ GVJO der "Pharmacia Pine Chemicals, Uppsala ,Schweden) wurde ein vollständig reines.Ant!thrombin erhalten. -

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Beispiele für als Adsorbentien geeignete Gele sind: 1) vernetstes Dextransulfat , 2) vernetztes Dextransulfat ■Agarose, 3) vernetztes Heparin, 4) vernetztes Heparin, garose und 5) vernetztes Chondroitinsulfat Agarose. Die vernetzten einzelnen Gele 1) und 3) werden hergestellt durch Zugabe von Cyanbromid zu einer Lösung des Polysaccharide_β Durch Einstellung des pH-7/ertes auf ungefähr 11 tritt eine Vernetzung der Moleküle und Bildung des Gels ein. Die gemischten Gele 2), 4) und 5) werden erhalten durch Zusatz des sulfatisierten Polysaccharide zu einem Agarosegel (Sephadex 4B, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala^Schvedeη) und anschließende Zugabe von Cyanbromid bei pH 11. Derartige Gele sind leichter zu handhaben und führen zu höheren Fließgeschwindigkeiten als die einheitlichen Gele»

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

. , Zu einer Lösung von 100 cm Dextransulfat (20 mg/cm ) wurden 5 g BrCN zugegeben. Der pH-Wert wurde dann mit Hilfe von 5 m NaOH 7 min lang auf 11,0 eingestellt und das Gemisch unter Rühren über Nacht stehengelassen. Es bildete sich eine weiße, körnige, gelartige Paste. Die Paste wurde in eine kleine Säule mit 5 mm 0 χ 8 cm gegeben und mit 0,02 m TRIS, 0,01 m Citrat und 0,15 m NaCl-Puffer, pH 8,5, äquilibriert. 2 cor normales Plasma wurden durch die Säule gegeben. Nach dem Durchgang durch die Säule hatte das Plasma seine Koagulationsfähigkeit verloren. Die Säule wurde zunächst mit dem Originalpuffer gewaschen und dann durch stufenweise Erhöhung der Salzkonzentration auf 1 m NaCl eluiert. Das Eluat enthielt ein Material, das nach der Dialyse gegen Phosphatpuffer

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die Koagulationszeit von normalem Plasma nach der Recralzifizierung von 3 auf 45 min verlängert. .Die immunologische Analyse zeigte das Vorhandensein von Antithrombin und einigen Lipoproteinen in dem Eluat. ,

Beispiel 2

Adsorption von Plasma mit vernetstem'pextransulfat — /igarosegel. Gradienteluierung.

Das Dextransulfat wurde hergestellt durch Vermischen

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einer Lösung von 30 cm DextransuDf at (15 mg/cnr), 50 cm 4 5^-iger perlenförmig polymerisierter Agaröse und 1 g BrGH bei pH 11₀ Das Gemisch wurde 7 min unter Rühren stehengelassen und der pH-Wert durch kontinuierliche Zugabe von NaOH aufrechterhalten. Anschließend wurde die Zugabe von Alkalihydroxid abgebrochen und der pH-Wert fiel innerhalb von 5 min auf 8,5. Es wurde über Nacht bei Raumtemperatur weitergerührt und dann das' gebildete Gel gewaschen. Eine Säule wurde mit der erhaltenen Dextransul fat' Agarose gefüllt. Bei der Adsorption wurden 3 cm normales Plasma im Verhältnis 1 ί 1 mit dem Puffer (0,02 m TRIS, 0,01 m Citrat, 0,15 m NaCl, pH 8,5) vermischt und durch die Säule geleitet. Nach dem

3 Durchgang durch die Säule wurde das Konzentrat auf 3 cm eingeengt und auf seine Koagulationsfähigkeit untersucht. Während.des Durchgangs durch die Säule hatte das Plasma seine Koagulationsfähigkeit verloren und besaß z.B. die Koagulationsfaktoren VIII und IX nicht mehr. Das adsorbierte Material wurde mit 0,02 IRIS und 0,01 Gitrat (_ph 7,3) mit einem Salzgradienten von 0,15. m NaGl desorbiert. Das Eluat entsprach ungefähr 2 $ des Ausgangsmaterials und bestand hauptsächlich aus zwei Komponenten,einer. Lipoproteinfraktion

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vom Typ Prä-ß und Ant!thrombin III. die Identifizierung wurde durch immunologische und physikalisch-chemische Verfahren durchgeführt.

Beispiel 3

Adsorption aus Plasma mit vernetzten Dexüran3ulfät Agarosegel. Stufenweise Eluierung» Gelfiltration.

Die Adsorption an Dextransulfat ~Agaro3egel wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt. Die Desorption wurde in einem Schritt mit 0,02 TRIS und 0,01 m Na-Citrat, 1 BrNaCl, pH 7,3, durchgeführt. Daa Desorbat wurde eingeengt und der Gelfiltration über Sephadex* G150 in physiologischem Phosphatpuffer unterworfene Man erhielt reines Antithrombin in einer !Fraktion, die von der Lipoproteinfraktion gut abgetrennt war.

Beiap.lel 4

Adsorption von Plasma mit Hilfe von vernetzten! Heparin-Agarosegolo

Heparin· Agarosegel wurde wie in Beispiel 2 für das Dextransulfat Agarosegel beschrieben, hergestellt. Anstelle von Dextransulfat' wurden 30 cm einer Heparinlösung verwendet (5.000 IU/cm ). Das Gel wurde in eine Säule gegeben und der Versuch wie in Beispiel 2 durchgeführt. Man erhielt ähnliche Ergebnisse wie in Beispiel 2.

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Bei sp:i el 5, . '" --■■"".

Adsorption an 'Dextransuüfat A^arosegel von einem Plasmaproteinmaterial von. der Colinfraktion Iv" (Verfahren 6). Stufenweise Eluierung. Gelfiltration.

Bei Anwendung immunologischer Verfahren kann gezeigt werden, daß Antithrombin in der Oohnfraktion IV (Methode 6) vorhanden ist. 135 g einer Fraktion. IV Paste wurden in 4 1 Adsorptionspuffer gelöst und 500 cm Dextransulfat A garosegei wurden zugegebene Das Gemisch wurde 1 h unter Kühlen langsam gerührt und anschließend die Lösung abdekantiert" und das Gel mit Adsorptionspuffer gewaschen. Das Gel wurde in eine Ionenaustauschersäule gegeben und durch zunehmende Konzentrationen des ITaCl des TRIS Puffers, pH 7,2 (0,5 m, 1 m, 1,5 m) stufenweise eluiert. Das Eluat, das Lipoprotein und Antithrombin enthielt, wurde durch Ultrazentrifugieren eingeengt und weiter durch Gelfiltration über Sephadex^ GI50 gereinigt. Die Identifizierung und Reinheitsuntersuchung wurde mit Hilfe immunologischer und physikalisch-chemischer Verfahren "durchgeführt.

Beiepiel__6

■7, Durch Vermischen von 250 mg Chondroitinsulfat VI,. 40 cm'

perlenförmiger polymerisiert er 4 -fä-iger Agarose und 1 g BrCiT bei pH 11, wurde Chondroitinsulfat Agarosegel hergestellt. Das Gemisch wurde 7 min bei pH 11 stehengelassen und der pH-Wert durch kontinuierliche Zugabe einer HaOH-Lösung auf diesen)wert gehalten. Hur eine kleine Menge Alkali war nötig und nach 7 min wurde der pH-Wert vorsichtig durch Zugabe von Essigsäure auf 8,5 herabgesetzt» Es wurde bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 8,5 über Wacht gerührt und anschließend

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das Gel gewaschen. Eine Säule wurde mit dem Gel beschickt und unter de.n gleichen Bedingungen,wie oben beschrieben, wurden 3 cm normales Plasma» das 1 : 1 verdünnt war, durch die Säule gegeben. Anschließend konnte Antithrombin mit dem in Beispiel 1 verwendeten Puffer aus dem Gel eluiert werden.

Patentansprüche

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Claims

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1o Verfahren zur Isolierung von Ant!thrombin aus tierischem Material, dadurch gekennzeichnet, daß man ein sulf atisiertes Kohlenhydrat als Adsorptionsmittel verwendet und das Antithormbih davon eluiert.

2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e α η zeichnet , daß man ein sulf .atisiertes Kohlen- ■ hydrat, das zu einer Matrix vernetzt oder auf andere V/eise unlöslich gemacht worden ist, verwendet.

3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet ,. daß man ein ; sulf. atisiertes Polysaecharid als Adsorptionsmittel verwendet.

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4. ' Verfahren nach Anspruch 1 bis 3» dadurch g e — kennzeichnet , daß man'ein mit Hilfe von Cyanbroiüid vernetztes sulf.atisiertes Polysaccharid, wie Dextransulfat,_: Dextran-Acarose oder Heparin-Agarose, als Adsorptionsmittel verwendet.

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