DE2243688B2

DE2243688B2 - Verfahren zur Isolierung von Antithrombin

Info

Publication number: DE2243688B2
Application number: DE2243688A
Authority: DE
Inventors: Lars-Olof Knivsta Andersson; Maggie Jakobsberg Miller-Andersson
Original assignee: KABI STOCKHOLM AB
Current assignee: KABI STOCKHOLM AB
Priority date: 1971-09-08
Filing date: 1972-09-06
Publication date: 1978-06-15
Also published as: DE2243688A1; AU4637372A; HU165070B; AT324549B; FR2154483A1; NO135302C; BE787284A; CS172957B2; FI50583B; FR2154483B1; DE2243688C3; IE36670B1; NL154118B; CA979805A; CH577829A5; ES406199A1; IL39982A; IL39982A0; DK131128B; ZA726024B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Antithrombin aus Blut oder Blutprodukten.

Die Blutgerinnung ist ein komplizierter Prozeß, der zahlreiche Faktoren umfaßt. Die Bildung eines Blutpfropfens kann durch eine Anzahl verschiedener Reize eingeleitet werden, von denen der häufigste die mechanische Zerstörung von einem oder mehreren Blutgefäßen ist. Die Gerinnung oder Koagulation wird dann teilweise eingeleitet durch Kontaktaktivierung bestimmter Faktoren im Blut und teilweise durch Gewebeaktivatoren, die aus der verletzten Stelle austreten. Die Zusammenballung von Blutklumpen oder -pfropfen, die gleichzeitig stattfindet, führt auch zur Einleitung der Blutgerinnung. Eine Reaktionskette wird eingeleitet, die schließlich zur Bildung eines Klumpens oder Gerinnsels an der Verletzungsstelle führt. Eine der letzten und wichtigsten Stufen bei der Bildung eines Fibrinpfropfens ist die Wirkung von Thrombin, einem Enzym, das bei der Blutgerinnung über Fibrinogen gebildet wird, wobei zwei kleine Peptidteile von dem Fibrinogen abgespalten werden, was zu einem modifizierten Fibrinogen führt, welches dann schnell vernetzt und einen Pfropfen bildet.

Um die Koagulationsneigung des Blutes zu regeln und zu verhindern, daß sich eine örtliche Koagulation ausbreitet und zu einer vollständigen intravaskulären Pfropfenbildung führt, sind verschiedene Substanzen im Blut vorhanden, die eine Hemmung der Koagulation bewirken. Einer der wichtigsten derartigen Inhibitoren ist Antithrombin, ein Protein, das mit Thrombin reagiert und dieses inaktiviert. Derartig inaktiviertes Thrombin kann das Fibrinogen nicht mehr angreifen und die Bildung von Pfropfen wird verhindert.

Bei verschiedenen (Krankheits-)Zuständen wurde ein pathologisch verminderter Antithrombingehalt beobachtet, verbunden mit einer erhöhten Gefahr von Thrombose, z. B. nach größeren Operationen. Die Annahme ist begründet, daß eine Antithrombintherapie zur Behandlung derartiger Fälle wertvoll sein kann. Ein verminderter Antithrombingehalt hat sich auch in Verbindung mit der Anwendung bestimmter Steroide gezeigt.

Bisher wurde Antithrombin nur in Spuren isoliert und ist infolgedessen verhältnismäßig wenig bekannt. Die zur Isolierung angewandten Verfahren sind sehr kompliziert und haben zu sehr geringen Ausbeuten von 1 bis 2% geführt. Das unten beschriebene Verfahren erlaubt die Extraktion von Antithrombin in Ausbeuten von über 90%.

In Zusammenhang mit Versuchen, Koagulationsfaktoren aus Blutplasma durch Adsorption an Gele

"· zu isolieren, die sulfatisierte Kohlenhydrate enthalten, hat es sich überraschenderweise gezeigt, daß spezifische Koagulationsfaktoren an diese Gele gebunden werden. Eine zusätzliche Trennung des Materials durch Gelfiltration erlaubt eine Isolierung einer Komponente mit einem Molekulargewicht von ungefähr 65000, die eine starke Koagulationsinhibitorwirkung besitzt. Untersuchungen dieses Proteins mit physikalisch-chemischen und immunologischen Untersuchungsverfahren zeigen die Identität dieser Probe mit

μ dem früher beschriebenen Antithrombin III. Untersuchungen mit Hilfe einer Gradient-Eluierung des Gels in der Säule zeigen, daß Antithrombin direkt in angemessener Trennung von den anderen Proteinen des Ausgangsmaterials erhalten werden kann. Um große Mengen Antithrombin zu erhalten, hat es sich als günstig erwiesen, es von der Cohnfraktion IV (Verfahren 6) durch Zugabe des Gels zu einer Lösung dieser Fraktion zu adsorbieren. Nach der Adsorption kann das Gel abfiltriert, gewaschen und eluiert werden. Nach Gelfiltration des Eluats über ein dreidimensional vernetztes Polysaccharid auf Dextranbasis wurde ein vollständig reines Antithrombin erhalten. Beispeile für als Adsorbentien geeignete Gele sind: 1) vernetztes Dextransulfat, 2) vernetztes Dextransulfat-Agarose, 3) vernetztes Heparin, 4) vernetzte Heparin Agarose und 5) vernetzte Chondroitinsulfat-Agarose. Die vernetzten einzelnen Gele 1) und 3) werden hergestellt durch Zugabe von Cyanbromid zu einer Lösung des Polysaccharide. Durch

■40 Einstellung des pH-Wertes auf ungefähr 11 tritt eine Vernetzung der Moleküle und Bildung des Gels ein. Die gemischten Gele 2), 4) und 5) werden erhalten durch Zusatz des sulfatisierten Polysaccharids zu einem Agarosegel und anschließende Zugabe von Cyanbromid bei pH 11. Derartige Gele sind leichter zu handhaben und führen zu höheren Fließgeschwindigkeiten als die einheitlichen Gele.

Im einzelnen wurden die in den Beispielen verwendeten Gele folgendermaßen hergestellt:

Gel A: Vernetztes Dextransulfat

Zu einer Lösung von 100 cm³ Dextransulfat (20 mg/cm³) wurden 5 g BrCN zugegeben. Der pH-Wert wurde dann mit Hilfe von 5 m NaOH 7 min lang auf 11,0 eingestellt und das Gemisch unter Rühren über Nacht stehengelassen. Es bildete sich eine weiße, körnige, gelartige Paste.

Gel B: Vernetztes Dextransulfat-Agarose-Gel

bo Das Gel B wurde hergestellt durch Vermischen einer Lösung von 30 cm' Dextransulfat (15 mg/cm³), 50 cm³ 4%iger perlcniormig polymerisierter Agarose und 1 g BrCN bei pH 11. Das Gemisch wurde 7 min unter Rühren stehengelassen und der pH-Wert durch

b5 kontinuierliche Zugabe von NaOH aufrechterhalten. Anschließend wurde die Zugabe von Alkalihydroxid abgebrochen, und der pH-Wert fiel innerhalb von 5 min auf 8,5. Es wurde über Nacht bei Raumtempe-

ratur weitergerührt und dann das gebildete Gel gewaschen.

Gel C: Vernetztes Heparin-Agarose-Gel
Heparin-Agarose-Gel wurde, wie für das Dextransulfat Agarose-Gel beschrieben, hergestellt. An Stelle von Dextransulfat wurden 30 cm³ einer Heparinlösung verwendet (5000 IU/cm³).

Gel D: Vernetztes Chondroitinsulfat-Agarose-Gel

Durch Vermischen von 250 mg Chondroitinsulfat VI, 40 cm³ perlenförmiger polymerisierter 4%iger Agarose und I g BrCN bei pH 11, wurde Chondroitinsulfat Agarose-Gel hergestellt. Das Gemisch wurde 7 min bei pH 11 stehengelassen und der pH-Wert durch kontinuierliche Zugabe einer NaOH-Lösung auf diesem Wert gehalten. Nur eine kleine Menge Alkali war nötig, und nach 7 min wurde der pH-Wert vorsichtig durch Zugabe von Essigsäure auf 8,5 herabgesetzt. Es wurde bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 8,5 über Nacht gerührt und anschließend das Gel gewaschen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Paste A wurde in eine kleine Säule mit 5 mm 0X 8 cm gegeben und mit 0,02 m TRIS, 0,01 m Citrat und 0,15 m NaCl-Puffer, pH 8,5, äquilibriert. 2 cm³ normales Plasma wurden durch die Säule gegeben. Nach dem Durchgang durch die Säule hatte das Plasma seine Koagulationsfähigkeit verloren. Die Säule wurde zunächst mit dem Originalpuffer gewaschen und dann durch stufenweise Erhöhung der Salzkonzentration auf 1 m NaCI eluiert. Das Eluat enthielt ein Material, das nach der Dialyse gegen Phosphatpuffer die Koagulationszeit von normalem Plasma nach der Recalzifizierung von 3 auf 45 min verlängert. Die immunologische Analyse zeigte das Vorhandensein von Antithrombin und einigen Lipoproteinen in dem Eluat.

Beispiel 2

Adsorption von Plasma mit vernetztem Dextransulfat-Agarose-Gel (B). Gradienteluierung.

Eine Säule wurde mit Gel B gefüllt. Bei der Adsorption wurden 3 cm^J normales Plasma im Verhältnis 1:1 mit dem Puffer (0,02 m TRIS, 0,01 m Citrat, 0,15 m NaCl, pH 8,5) vermischt und durch die Säule geleitet. Nach dem Durchgang durch die Säule wurde das Konzentrat auf 3 cm³ eingeengt und auf seine Koagulationsfähigkeit untersucht. Während des Durchgangs durch die Säule hatte das Plasma seine Koagulationsfähigkeit verloren und besaß z. B. die Koagulationsfaktoren VIII und IX nicht mehr. Das adsorbierte Material wurde mit 0,02 TRIS und 0,01 Citrat (pH 7,3) mit einem Salzgradienten von 0,15 m NaCI desorbiert. Das Eluat entsprach ungefähr 2 % des Ausgangsmaterials und bestand hauptsächlich aus zwei Komponenten, einer Lipoproteinfraktion vom Typ Ρτ'ά-β und Antithrombin HI. Die Identifizierung wurde durch immunologische und physikalisch-chemische Verfahren durchgeführt.

Beispiel 3

Adsorption aus Plasma mit vernetztem Dextransulfat-Agarose-Gel. Stufenweise Eluierung. Gelfiltration.

Die Adsorption wurde wie in Beispiel 2 an Gel B durchgeführt. Die Desorption wurde in einem Schritt mit 0,02 TRIS und 0,01 m Na-Citrat, 1 m NaCl, pH 7,3, durchgeführt. Das Desorbat wurde eingeengt und der Gelfiltration über ein dreidimensional vernetztes Polysaccharid auf Dextranbasis in physiologischem Phosphatpuffer unterworfen. Man erhielt reines Antithrombin in einer Fraktion, die von der Lipoproteinfraktion gut abgetrennt war.

Beispiel 4

Adsorption von Plasma mit Hilfe von vernetztem Heparin-Agarose-Gel (C).

Das Gel wurde in eine Säule gegeben und der Versuch wie in Beispiel 2 durchgeführt. Man erhielt ähnliche Ergebnisse wie in Beispiel 2.

Beispiel 5

Adsorption an Dextransulfat-Agarose-Gel von ei-

JO nem Plasmaproteinmaterial von der Cohnfraktion IV (Verfahren 6).

Stufenweise Eluierung. Gelfiltration.
Bei Anwendung immunologischer Verfahren kann gezeigt werden, daß Antithrombin in der Cohnfraktion IV (Methode 6) vorhanden ist. 135 g einer Fraktion IV Paste wurde in 4 1 Adsorptionspuffer gelöst und 500 cm³ Gel B wurden zugegeben. Das Gemisch wurde 1 h unter Kühlen langsam gerührt und anschließend die Lösung abdekantiert und das Gel mit Adsorptionspuffer gewaschen. Das Gel wurde in eine Ionenaustauschersäule gegeben und durch zunehmende Konzentrationen des NaCl des TRIS Puffers, pH 7,2 (0,5 m, 1 m, 1,5 m) stufenweise eluiert. Das Eluat, das Lipoprotein und Antithrombin enthielt, wurde durch Ultrazentrifugieren konzentriert und weiter durch Gelfiltration über ein dreidimensional vernetztes Polysaccharid auf Dextranbasis gereinigt. Die Identifizierung und Reinheitsuntersuchung wurde mit Hilfe immunologischer und physikalisch-chemischer

so Verfahren durchgeführt.

Beispiel 6

Eine Säule wurde mit Gel D beschickt und unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben, wurden 3 cm³ normales Plasma, das 1:1 verdünnt war, durch die Säule gegeben. Anschließend konnte Antithrombin mit dem in Beispiel 1 verwendeten Puffer aus dem Gel eluiert werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Isolierung von Antithrombin aus Blutplasma oder Biutprodukten, dadurch gekennzeichnet, daß Antithrombin an einer Matrix, die ein vernetztes Detransulfat, Detransulfat-Agarose, Heparin-Agarose oder Chondroitinsulfat-Agarose enthält, adsorbiert und daraus das Antithrombin durch Gradient-Eluierung mit Hilfe eines Puffers mit zunehmender NaCI-Konzentration eluiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer eine Lösung von 0,02 m TRIS und 0,01 m Citrat und NaCl zunehmender Konzentration verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Eluierung bei einem pH-Wert von 7,2 bis 8,5 durchführt.