DE2301858A1 - Immunologisches diagnose-reagens - Google Patents

Immunologisches diagnose-reagens

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DE2301858A1
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Hans Jacob Hager
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F Hoffmann La Roche AG
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Description

w. Ing. A. m ^ Werft 1 5< Jaa i973
PATHNiANWXlII
RAN 4090/54-1
F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz
Immunologisches Diagnose-Reageiis
Die vorliegende Erfindung betrifft wertvolle diagnostische Reagenzien zur Bestimmung von Gonorrhoe, ein Verfahren zu deren Heroteilung und diagnostische Methoden, worin solche Reagenzien Verwendung finden.
Die Diagnose von pathologischen oder anderen Zuständen in Menschen und Tieren wird oft unter Anwendung von immunologischen Prinzipien durchgeführt. Diese Prinzipien werden zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen in den Körperflüssigkeiten des Lebewesens benützt. Ein Antigen ist eine fremde Substanz, welche, wenn sie dem lebewesen appliziert wird, die Bildung von gewissen löslichen und als Antikörper bezeichnete Substanzen bewirkt. Irgendeine Substanz wie z.B. ein Protein, welche normal nicht in einem bestimmten Lebewesen vorhanden ist, kann die Bildung von Antikörpern verursachen, wenn sie dem lebewesen unter geeigneten Bedingungen applisiert wird.
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Nach ihrer Bildung reagieren die Antikörper mit den Antigenen und schützen auf diese Weise, im Pail eines Bakterienoder Virus-Fremdkörpers, gegen Infektionen·
Immunologische Testverfahren beruhen auf der Antigen-Antikörper-Reaktion, welche sich gewöhnlich durch ünlöslichkeit oder Agglutination manifestiert.
Im allgemeinen wird die Anwesenheit eines Antigens oder eines Antikörpers dadurch bestätigt oder bestimmt, dass man den entsprechenden Antikörper oder das entsprechende Antigen einer Körperflüssigkeit des Lebewesens, meistens Urin, Blutserum oder einem speziell behandelten Bluteactrakt, zugibt. Es können jedoch auch andere Körperflüssigkeiten verwendet werden. Man stellt die Anwesenheit des Antikörpers oder des Antigens in der Körperflüssigkeit des Lebewesens fest, wenn sich ein unlöslicher Antigen-Antikörperkomplex bildet.
Weil einige Komplexe sich nur sehr langsam bilden und sehr geringe Teilchengrössen besitzen, ist es notwendig Träger zu benützen, um sie sichtbar zu machen. Als Träger werden unter anderem Erythrocyten von Mensch und Schaf, Bakterien, Bentonit, 1Latexteilchen wie z.B. Polystyrol, anionische phenolische Harze und fein verteilte diazotierte Aminocellulose verwendet.
Die bekannten Träger, welche die serologisch bestimmende
Materialien wie wasserlösliche zellartige Komponenten von Neisseria Gnorrhoeae physikalisch binden, sind in ihren Anwendungsmöglichkeiten und ihrer Brauchbarkeit für immunologische Diagnose verfahr en beschränkt, weil sie eine Anzahl Nachteile aufweisen. Einige der wichtigsten Nachteile sind in vielen Fällen ein Mangel an Empfindlichkeit und oft eine geringe Stabilität. Diese Mängel sind vor allem dadurch verursacht, dass, wenn Latexteilchen mit dem serologisch reaktiven Material
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d.h. wasserlösliche zellartige Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae überzogen sind, sich ein Gleichgewicht zwischen dem freien und dem gebundenen Material einstellt. Dies hat eine !competitive Hemmung der Reaktion zwischen dem freien und dem an den Latex gebundenen Antikörper oder Antigen und dem entsprechenden Antigen oder Antikörper zur Folge. Weiterhin können viele negativ geladene Proteine nicht physikalisch an inerte Latexteilchen gebunden werden, ohne dass Hydrolyse oder enzymatischer Abbau eintritt. Dieses Verfahren kann Konformationsänderungen der Struktur verursachen, die für die Spezifität der Reaktion nachteilig sein können. Ferner eignen sich kleine Peptide nicht zu einer physikalischen Beschichtung von inerten Polymeren. Hierdurch wird die Anwendung dieses Verfahrens auf viele Immunologische Diagnosemethoden vereitelt.
Aus diesem Grund besteht ein Bedürfnis für einen serologisch inerten Träger, welcher mit wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae ein diagnostisch verwendbares Reagenz bilden kann, das stabil, spezifisch und empfindlich ist und eine leicht nachweisbare visuelle Bewertung in sehr kurzer Zeit ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein wasserunlösliches immunologisches Diagnosereagenz mit einem etwa dem von Waeser entsprechenden spezifischen Gewicht in Form diskreter Teilchen eines serologisch inerten Latexpolymerträgers, auf den über Amidbindungen wasserlösliche zellartige Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae kondensiert sind.
Weiter bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Reagenzes, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man wasserlösliche zellartige Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae mit einem serologisch inerten Latex— polymeren, welcher reaktive Gruppen enthält, die eine Amidbindung
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bilden können, in Anwesenheit eines wasserlöslichen Garbodiimids bei einer Temperatur von 50C bis 4O0C umsetzt.
Es wurde festgestellt, dass die wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae, welche bisher nicht befriedigend physikalisch an Latexpolymerträger gebunden werden konnten, auf chemische Weise durch Ausbildung einer Amidbindung an eine gewisse Gruppe von serologisch inerten Latexpolymerträgern kovalent gebunden werden können.
Die Menge an wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae, welche an die serologisch inerten Latexpolymer-Träger gebunden sind,beträgt in der Regel 0,01 bis 15,0 Gewichtsprozent. Jedoch werden die wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae in einer Menge benützt, welche sich in einem diagnostischen Test am zweckmässigsten erweist. Aus diesem Grunde werden sie mit dem Träger in einem Verhältnis kombiniert, welches den jeweiligen spezifischen Anforderungen am besten entspricht. Die vorliegende Erfindung umfasst deshalb die Verwendung einer solchen Menge an wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae in Kombination mit einem serologisch inerten Latexpolymer-Träger, die geeignet ist, ein zur Bestimmung von Gonorrhoe nützliches Reagens zu liefern.
Die Ausdrücke "serologisch inerte Latexpolymere" oder "serologisch inerte Latexpolymer-Träger" umfassen wasserunlösliche Latexpolymere mit einer Teilchengrösse von ungefähr 0,01 bis 0,9 μ und einem etwa dem von Wasser entsprechenden spezifischen Gewicht. Dies hat zur Folge, dass nach der Bindung an die wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae das spezifische Gewicht der Teilchen ungefähr 1,0 beträgt, wodurch erreicht wird, dass diese Teilchen in einer wässrigen Suspension verbleiben. Die Teilchen müssen dem immuno-
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logischen diagnostischen Test gegenüber inert sein und auch eine genügende Ladungsdichte an der Oberfläche besitzen, damit nach der Bindung mit den wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae ihre abstossende Kräfte gross genug sind, um eine Agglutination zu verhindern. Weiter müssen die Teilchen reaktive Gruppen besitzen, welche fähig sind eine Amidbindung mit den wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neiseeria Gonorrhoeae durch Kondensation einer primären oder sekundären Aminogruppe mit einer Carboxylgruppe zu bilden. Aus diesem Grunde können die Polymer-Träger entweder Carboxylgruppen, Amino-' gruppen sowie Gruppen, welche in diese umwandelbar sind oder irgendeine Kombination dieser Gruppen enthalten. Besonders geeignete Gruppen am Polymer-Träger sind solche, welche ein aktives Wasserstoffatom besitzen, wie z.B. -COOH, -CONH2, eine Nitrilgruppe, eine sekundäre Aminogruppe, eine primäre Aminogruppe oder irgendeine Kombination derartiger Gruppen.
Die chemische Umsetzung zur Ausbildung der Amidbindung wird erfindungsgemäss in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimide als Kondensationsmittel durchgeführt. Der Grad der Bindung der wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae an den Träger mittels Carbodiimiden ist abhängig von der Dichte der reaktiven Gruppen in dem Polymeren. Die Dichte der reaktiven Gruppen ist für die Durchführbarkeit der Erfindung solange nicht massgebend, als eine ausreichende Menge davon vorhanden ist, um die Bindung einer genügenden Menge an wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae zu gewährleisten und ein nutzbares Reagenz zur Bestimmung von Gonorrhoe zu liefern.
Besonders geeignete Trägerteilchen sind diejenigen, welche in Form einer wässrigen Latexsuspension mit einer Peststoff konzentration von 4C$ bis 60% im Handelt erhältlich sind. Für die Zwecke dieser Erfindung eignen sich viele Arten von
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Latexpolymeren, vorausgesetzt, dass sie die oben erwähnten Kriterien erfüllen. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung aller geeigneten Latexpolymeren.
Ganz besonders geeignete Latexpolymere sind carboxylierte Copolymere aus Butadien und Styrol, carboxylierte Polystyrole, carboxylierte Polystyrole mit Aminogruppen, Acrylsäure-Polymere, Methacrylsäure-Polymere, Mischpolymere aus Acrylnitril, Butadien und Styrol, Polyvinylacetatacrylate, Polyvinylpyridine, Vinylchlorid-Acrylate u.dgl. Einige im Handel erhältliche Polymere, welche im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Amsco Res 4150, Amsco Res 3011 (American Mineral Spirits Co.); Dow Latex 815, Dow Latex 816, Dow Latex 620, Dow Latex 859 (The Dow Chemical Co.)? Hycar 1512, Hycar 1877X8, Hycar 2600x120 (Goodrich Chemical Co.); Gelva 900, Lytron 612, Lytron 624 (Monsanto); Rhoplex LC40 3216, Amberlite Ultrafine (Rohm and Haas).
Gemäss der vorliegenden Erfindung werden bei der kovalenten Bindung von den wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae an diskrete Trägerteilchen, wasserlöbliche Monocarbodiimide der allgemeinen Formel
worin R und R1 ein 5 oder 6 gliedriger Cycloalkylrest, ein Alkylrest mit 2 bis 12 Kohlenstoff atome wie z.B. Aethyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl, sec-Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl, Amyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Uhdecyl und Dodecyl; ein monoarylsubstituierter niederer Alkylrest, wie z.B. Benzyl, α- und ß-Phenyläthyl; ein Monoarylrest, wie z.B. Phenyl; Morpholinyl; Piperidyl; ein Morpholinyl-substituierter niederer Alkylrest, wie z.B. Aethylmorpholinyl; ein Piperidyl-
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substituierter niederer Alkylrest wie z.B. Aethylpiperidyl; ein Di-nieder alkylamino-niederer alkylrest; und ein Pyridyl-substituierter niederer alkylrest wie z.B. α, β und γ Methyl- oder Aethylpyridyl bedeutet,
sowie Säureadditionssalze und quaternäre Amine davon, als Kondensationsmittel benützt.
Die Carbodiimide können gemäss dem allgemeinen Verfahren von E. Schmidt, F. Hitzler und E. Lahde, Ber. 71, 1933 (1938) durch Oxydation der entsprechenden Thioharnstoffe mit Quecksilberoxyd in Aceton hergestellt werden. Die symmetrischen Thioharnstoffe können durch Umsetzung des entsprechenden Amins mit Schwefelkohlenstoff erhalten werden. Die unsymmetrischen Thioharnstoffe können durch Umsetzung eines Amins mit einem Isothiocyanat hergestellt werden. Die Carbodiimide können auch aus den entsprechenden Harnstoffen erhalten werden. Wie bereits erwähnt, sind wasserlösliche Carbodiimide besonders geeignet für den Zweck der vorliegenden Erfindung. Wenn das Carbodiimid eine terminale Aminogruppe besitzt, kann es durch Bildung eines Säureadditionssalzes mit einer Halogenwasserstoffsäure wie HCl, HBr oder HI, Schwefelsäure, Sulfonsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und Phosphonsäuren wasserlöslich gemacht werden. Auch tertiäre Aminogruppen können durch Quatemisierung mit einem geeigneten Quaternisierungsmittel wie Methyltosylat, Methylbromid, Methyliodid, Benzylbromid, Aethyliodid, Aethylbromid, Benzyliodid, Aethyltosylat, Methylsulfat, Aethylsulfat usw. wasserlöslich gemacht werden.
Erfindungsgemäss werden die wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae in wässrigem Medium, vorzugsweise bei Zimmertemperatur (200C bis 250C) mit dem Träger zur Reaktion gebracht. Die Temperatur kann jedoch auch zwischen 50C und 400C liegen. Um die wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae mit Sicherheit an den
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Träger zu binden, wird eine derartige Menge an Kondensationsmittel benützt, die genügt, alle möglichen Amidbindungen mit Gewissheit zu bilden.
Im allgemeinen kann das Gewicht eines wasserlöslichen Carbodiimides 0,05 bis 2,0 Prozent des Gewichts der Teilchen betragen, jedoch wird in der Regel 1% benützt.
Der pH-Wert der Reaktionen ist wichtig. Er darf nicht so gewählt werden, dass ein Protein-Reaktionspartner denaturiert wird. In der Regel liegt der pH-Wert zwischen 5 und 8,5. Dieser pH-Wert wird unter Verwendung von geeigneten üblichen anorganischen Puffer-Systemen wie Phosphätpuffer u.dgl., aufrechterhalten.
Die Reaktion ist innerhalb 5 Minuten bis 24 Stunden, gewöhnlich in 4 bis 5 Stunden, vollständig abgelaufen.
Das Endprodukt ist ein wasserunlösliches Material, welches in einer wässrigen Pufferlösung vom pH-Wert 5,0 bis 8,5 suspendiert ist, wobei der pH-Wert der Lösung von dem im einzelnen verwendeten System und von den Anforderungen an die Stabilität der wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae abhängig ist. Das spezifische Gewicht des Produktes entspricht etwa demjenigen vom Wasser, wodurch eine stabile Suspension des Produkts erreicht wird. Die Produkte können z,B. durch Zentrifugieren in Form weisser, etwas thixotropischer viskoser tonartiger Materialien isoliert werden. Chemisch gesehen ist das Produkt eine Einzelschicht von wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Keisseria Gonorrhoeae, welches auf diskrete Teilchen des serologisch inerten Trägers mittels einer Amidbindung kondensiert ist.
Ausser allfälligen Verunreinigungen, welche nicht auf die 309829/115 6
Spezifität der Reaktion einwirken, sind die wasserlöslichen zellartigen Konponenten von Neieseria Gonorrhoeae der einzige aktive Bestandteil in dem Produkt.
Sie vorliegende Erfindung umfasst alle Produkte, welche aus den die oben erwähnten Kriterien erfüllenden Reaktionspartnern hergestellt werden und welche selbst wiederum diesen bereits angegebenen Kriterien entsprechen.
Brfindungsgemässe spezifische Produkte sind beispielsweise diejenigen, worin wasserlösliche zellartige Komponenten von Neisseria Gonorrhoeas über eine Amidbindung an ein earboxyliertes Copolymer aus Butadiene und Styrol mit einem Monomerenverhältnis von 45^ Butadien und 55S^ Styrol, sowie einer Dichte von Carboxylgruppen zwischen 1 u4d 5 Gewichtsprozent (gewöhnlich 3 Gewichtsprozent), gebunden sind.
Nach seiner Herstellung kann das Produkt in einem diagnostischen Test zur Bestimmung von Gonorrhoe, welcher auf immunologischen Prinzipien aufgebaut ist, verwendet werden. Das Produkt kann in jeder Konzentration benütat werden, jedoch sind Konzentrationen zwischen 1 und 3»O Gewichtsprozent geeignet, wobei Konzentrationen zwischen 1,3 und 2,5 Gewichtsprozent bevorzugt-ßind.
Das Testverfahren kann eowohl auf direkte als auch auf indirekte Weise durchgeführt werden. Beispielsweise kann das durch Bindung von wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae an den Träger erhaltene Produkt in einem direkten Test zur Bestimmung von Gonorrhoe bei einem Patient verwendet werden. Dies kann z.B. dadurch erreicht werden, dass man einen Tropfen (ungefähr 0,05 ml) gepuffertes Testserum auf ein Glasplättchen bringt und mit einem Tropfen (ungefähr 0,05 ml) Antigen-Trägerreagenz in wässeriger Suspension mischt. Die Er-
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gebnisee des Tests werden nach zwei bis drei Hinuten festgestellt; Pur diesen spezifischen Test eignen sich besonders Extrakte oder Fraktionen aus Wachstumaphasen von K. Gonorrhoea«, die als T1 und T. bekannt sind. Das Antigenträeerreagenz ergibt positive Reaktionen mit Serum von Patienten, welche schon einmal durch If. Gonorrhoeae angesteckt wartn. Das positive Ergebnis manifestiert sich durch Agglutinationen, die beobachtet büw. gemessen werden können. Serum von Menschen, welche infektionsfrei Bind» ergibt in der Regel negative Ergebnisse und nur ab und zu ein positives Ergebnis.
Die Vorteile einer solchen Methode sind ihre Einfachheit» Schnelligkeit, Genauigkeit und die Vermeidung falscher positiver Ergebnisse. Der Grund hierfür ist, dass keine durch eine nichtspezifische Beschichtung verursachte Einwirkung von anderer Proteinen stattfindet.
Die in derartigen immunologischen Testverfahren nutzbaren Reagenzien können vorteilhaft für kommerzielle Zwecke beispielsweise im Pail eines indirekten Tests in eine diagnostische Testgarnitur mit zwei Behältern, der eine für das geeignete Antiserum und der andere für die durch eine Amidbindung an einen serologisch inerten Träger gebundenen wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae in wässriger Suspension, abgepackt werden. Im Palle eines direkten Tests wird nur ein Behälter für die durch eine Amidbindung an einen serologisch inerten Träger gebundenen wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae in wässriger Suspension verwendet. Die wässrige Suspension der durch eine Amidbindung an einen serologisch inerten Träger gebundenen wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Keisseria Gonorrhoeae kann in irgendeiner Konzentration vorhanden sein. Jedoch ist eine Konzentration von 1,0 bis 2,5 Gewichtsprozent bevorzugt.
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Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispielen veranschaulicht.
Beispiel 1
Wasserlösliche zellartige Komponenten von Heisseria Gonorrhoeae werden wie folgt hergestellt:
Ein T? 62-Stamm von N. Gonorrhoeae wird an der Oberfläche eines angereicherten Difco GCB Ägarmedium kultiviert. Dieses Nährmedium enthält pro 500 ml 2 Gewichtsprozente an einem bestimmten Zusatz bestehend aus 0,001 g Cocarboxylase, 0,5 g Glutamin und 20 g Dextrose in 100 ml durch Filtration steri3.isierten destilliertem Wasser; 0,005 Gewichtsprozent an einem Eisenzusatz bestehend aus 0,2 g Eieen(III)-Nitrat 9H2O in 200 ml durch Filtration sterilisierten destilliertem Wasser; und 5 ml an VCN-Hammer bestehend aus 1500 μg/500 ml Vaneomycin, 3750 ug /500 ml Colistin und 6250 Einheiten/500 ml Nystatin.
Standard Petri-platten, welche das Agar-medium enthalten, werden beimpft und bei 350C in einer Atmosphäre mit 4 bis 8 Prozent CO2 über Nacht inkubiert. Am Ende der Inkubationsperiode werden typische T, und T. Kolonienvarianten mit Hilfe eines Präpariermikroskops sorgfältig ausgesucht und jede Kolonienart wird anschliessend auf der Oberfläche mehrerer frischer Agarplatten angeimpft und wie vorstehend erwähnt inkubiert.
Nach einer Nacht Inkubationszeit werden die Platten, welche hauptsächlich T-,- oder T.-Varianten enthalten, zum Beimpfen von 200 zusätzlichen Platten mit einer dieser Varianten verwendet. Die als Inokulum ausgewählten !,-Platten werden zum sicherstellen, dass sie weniger als 10$ Tp, T-, oder T- Variantenformen enthalten, unter einem Präpariermikroskop untersucht. Man beimpft 200 Platten, indem man von 200 aussortierten Platten
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durch vorsichtiges Waschen mit 1-2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, das Wachstum sorgfältig entfernt. Die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und mit einer Kochsalzlösung auf ein Volumen von 30 ml verdünnt. Anschliessend werden zwei Tropfen (0,1 ml) des gereinigten Inokulums auf die Oberfläche jeder Platte aufgetragen und mittels eines I-förmigen Glasstäbchens auf die Oberfläche verteilt. Alte Platten werden dann bei 350C in einer Atmosphäre mit 4 bis 8 Prozent COp über Nacht inkubiert.
Nach der Inkubation wird das bakterielle Wachstum (Inokulum) von den mit T..- oder mit T.-Varianten beimpften Platten mittels einem sterilen I-förmigen Stäbchen zurückgewonnen und gesammelt. Das gesammelte Inokulum wird dann mit Wasser auf ein Volumen von 25 ml verdünnt. Ungefähr 5O?6 dieser 25 ml sind N. Gonorrhoeae Zellen.
25 ml der erhaltenen Zellensuspension werden in einem X-Presskoffer (Biotec Instruments, Rockville, Maryland) eingebracht und in einem Trockeneis-Alkohol-Bad auf -250C abgekühlt. Die eingefrorene Zellsuspension wird dann bei 748 Atü in dem Z-Presskoffer geschädigt.(Unter dem Mikroskop wurde festgestellt, dass auf diese Weise ungefähr 95^ der Gonokokken durch Risse beschädigt werden).
Der erhaltene Zellextrakt wird aus dem X-Presskoffer zurückgewonnen, bei Raumtemperatur (240C) auftauen gelassen und dann bei 40C während 30 Minuten bei 16.500 U.p.m. zentrifugiert .
Nach Zentrifugierung wird die überstehende Flüssigkeit (roher N. Gonorrhoeae Extrakt) sorgfältig dekantiert und bei 40C aufbewahrt.
Eine weitere Reinigung des rohen überstehenden Extrakts 309829/1156
(wasserlösliche zellartige Komponenten von N. Gonorrhoeae) wird durch eine 3-stündige Zentrifugierung bei 40.000 U.p.m. in einer Ultrazentrifuge durchgeführt. Nach der Zentrifugierung wird die überstehende Flüssigkeit sorgfältig dekantiert und bei 40C aufbewahrt.
b) Eine Latexsuspension bestehend aus einem carboxylierten Copolymer von Butadiene und Styrol wird mit destilliertem Wasser von einem Peststoffgehalt von 50$ auf einen Peststoffgehalt von 5# verdünnt. Die erhaltene Suspension wird zweimal bei 15.000 U.p.m.zentrifugiert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach dem letzten Waschen wird das Harz bis su einem Peststoffgehalt von 5 Prozent erneut in Wasser suspendiert. Eine Volumeneinheit an wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae (von T,- oder von T.-Varianten), welche 3-17 mg/ml Protein enthält, wird zu 4 Volumeneinhsiten der gewaschenen Latexsuspension gegeben. Eine Volumeneinhcit einer frisch hergestellten 1 prozentigen Lösung von 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthylJ-carbodiiraid-metho-p-toluolsulfonat wird der Protein-Latex-Mischung bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren zugegeben. Die Reaktionsmischung wird unter ständigem Rühren während 3 bis 16 Stunden inkubiert. Das erhaltene gekuppelte Latex wird zweimal bei 1500 U.p.m. zentrifugiert und mit destilliertem Wasser gewaschen.
Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert, und das Produkt wird in Form einer tonartigen, weissen Masse, welche aus Teilchen, die mit wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae überzogen sind, besteht, zurückgewonnen. Die Teilchen besitzen einen Durchmesser von ungefähr 0,20-0,25 u und ein spezifisches Gewicht von 1,01.
Das Produkt wird in destilliertem Wasser oder in einer mit 0,02 M Tris-Puffer auf einen PH-Wert von 7,5 gepufferten Salzlösung suspendiert. Die Konzentration des Produkts wird
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auf 2 bis 3 Prozent- eingestellt. Es können andere Puffer, welche 0,1 M Glycin, 0,1 M Imidazol, 1$ Albumin, vom Rind, 0,l?S Polyvinylpyrrolidon oder Kombinationen davon enthalten, verwendet werden. Puffer mit einem PH-Wert von 6,0 bis 8,2 sind befriedigend .
Das Produkt wird in eine diagnostische Testgarnitur mit einem Behälter, welcher eine gepufferte wässerige Antigen-Träger Suspension in einer Konzentration von ungefähr 2,5 Gewichtsprozent enthält, verpackt. Der Behälter enthält ungefähr 1 bis 10 ml Reagenz.
Beispiel 2
Eine mit Diäthylaminoäthylcellulose gefüllte Kolonne wird mit einem 0,02 M Tris-NaCl-Puffer vom PH-Wert 7,5 (0,05 M NaCl) equilibriert. Die überstehende Flüssigkeit aus den gemäss Beispiel 1 (a) hergestellten Extrakten wird gegen den Tris-NaCl-Puffer dialisiert und die Lösung auf die Kolonne gegeben. Eine schrittweise Elution der Kolonne mit Puffer von einem konstanten PH-Wert (7,5) steigender Ionenstärke ergibt Fraktionen, welche zwischen 0,1 und 0,2 M NaCl enthalten. Die Fraktionen wandern in der Agar-Elektrophorese im gleichen Bereich wie α-Globulin.
Die Bindung dieser Fraktionen an Latex erfolgt in gleicher Weise wie im Beispiel 1 (b) für den Extrakt, welcher nach Zentrifugierung erhalten wurde, beschrieben und die Produkte haben die gleichen physikalischen Charakteristika. Diese an Latex gebundenen Fraktionen ergeben einen positiven Agglutinationstest mit Sera -von einer grossen Anzahl Kranker, die mit N. Gonorrhoeae infiziert sind.
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Claims (15)

  1. Patentansprüche
    (l) Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen immunologischen Diagnose-Reagenzes mit einem etwa dem von Wasser entsprechenden spezifischen Gewicht in Porm diskreter Teilchen eines serologisch inerten Latexpolymer-Trägers, auf den über Amidbindungen wasserlösliche zellartige Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae kondensiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass man wasserlösliche zellartige Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae mit einem serologisch inerten Latexpolymeren, welcher reaktive Gruppen enthält, die eine Amidbindung bilden können, in Anwesenheit eines wasserlöslichen Carbodiimide bei einer Temperatur von 5° bis 4O0C umsetzt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des wasserlöslichen Carbodiimide 0,05 bis 2 Gewichtsprozent beträgt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche Carbodiimid l-Cyclohexyl-3-[2-morpholinyl-(4)-äthyl]-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat ist.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das serologisch inerte Latexpolymere ein etwa dem von Wasser entsprechendes spezifisches Gewicht und eine Teilchengrösse von ungefähr 0,01 bis 0,9 μ besitzt.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der an das serologisch inerte Latexpolymere gebundenen wasserlöslichen zellartigen Komponenten von Neisseria Gonorrhoeae 0,01 bis 15,0 Gewichtsprozent beträgt. ·
    30 9829/1156
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das serologisch inerte Latexpolymere ein wasserunlösliches carboxyliertes Copolymer aus Styrol und Butadien ist.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das serologisch inerte Latexpolymere ein wasserunlösliches Mischpolymer aus Acrylonitril, Butadien und Styrol ist.
  8. 8. Verfahren zum Nachweis von Gnorrhoe, dadurch gekennzeichnet, dass man ein wasserunlösliches immunologisches Diagnose-Reagenz gemäß Ansprüchen 1-7 verwendet.
  9. 9. Testgarnitur für das Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einem Behälter ein wasserunlösliches immunologisches Diagnose-Reagenz gemäß Ansprüchen 1-7 enthält.
    309829/ 1 1 56
  10. 10. Wasserunlösliches immunologisches Diagnose-Reagenz mit einem etwa dem von V/asser entsprechenden spezifischen Gewicht in Form diskreter Teilchen eines serologisch inerten Latexpolymer-Trägers, an den über Amidbindungen wasserlösliche zellartige Komponenten von Neisseria ßonorrhoeae gebunden sind.
  11. 11.. Reagenz nach Anspruch 10 , dadurch gekennzeichnet, dass das serologisch inerte Latexpolymere ein etwa dem von Wasser entsprechenden spezifisches Gewicht und eine Teilchengrösse von 0,01 bis 0,9 μ besitzt.
  12. 12. Reagenz nach einem der Ansprüche 10 und Ii, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des serologisch bestimmbaren Materials 0,01 bis 15»0 Gewichtsprozent beträgt.
  13. 13. Reagenz nach einem der Ansprüche lo bis 12 , dadurch gekennzeichnet, dass das serologisch inerte Latexpolymere ein wasserunlösliches carboxyliertes Copolymer aus Styrol und Butadien ist.
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  14. 14.Reagenz nach einem der Ansprüche 10 bis .12. dadurch gekennzeichnet, dass das serologisch inerte Latexpolymere ein wasserunlösliches Mischpolymer aus Acrylonitril, Butadien und Styrol ist.
  15. 15.Verwendung eines Reagenzes geraäss einem der Ansprüche 10 bis 14 in einem Verfahren gemäss Ansprüche.
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