DE2320943A1

DE2320943A1 - Mittel fuer mikrobiologisches arbeiten

Info

Publication number: DE2320943A1
Application number: DE2320943A
Authority: DE
Inventors: Ronald Freake; Billy Harper Haden
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1972-04-26
Filing date: 1973-04-25
Publication date: 1973-11-08
Also published as: US3814670A; GB1406180A; JPS4920386A; HU167637B; JPS554389B2; FR2182074A1; SE416313B; DE2320943B2; CA986827A; FR2182074B1

Description

betreffend

Mitt el für mikrobiologisches Arbeiten

Die Erfindung betrifft Prüfmittel zum Kulitvieren, Fachweisen und Analysieren von Mikroorganismen, umfassend ein absorbierendes flächiges Material und eine im -wesentlichen trockene, stabile, zusammenhängede Schicht aus einem Gel wie Agar oder Gelatine, die miteinander über eine zusammenhängende Grenzschicht verbunden sind, die ein integraler Bestandteil des saugfähigen Materials und der -Gelschicht ist und.aus dem saugfähigen Material und der Gelschicht besteht. Das Prüfmittel kann außerdem eine oder mehrere im wesentlichen trockene, stabile, zusammenhängede Deckschichten aus einem Gel umfassen, die sich laminatartig über der ersten Gelschicht befinden. Eine derartige Geldeckschicht enthält vorzugsweise ein Reagenz, umfassend mikrobiologische Nährmedien, Hintergrundfarbstoffe und/oder 3?arbindikatoren.

Der Nachweis und die Analyse von Mikroorganismen wie Bakterien, Pilzen und Hefen, die zu Krankheiten bei Menschen und Tieren führen, ist von großer Bedeutung für diejenigen,

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die mit der Bekämpfung derartiger Krankheiten befaßt sind. Die Einfachheit des Fachweises sowie die Zuverlässigkeit und Stabilität der Prüfmittel beeinflussen weitgehend die Wirksamkeit und den Erfolg bei der Heilung und Bekämpfung von Krankheiten. Es wurden im Bereich der Mikrobiologie viele Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen entwickelt, seit man festgestellt hat, daß derartige Mikroorganismen die Ursache vieler Krankheiten bei Menschen und Tieren sind. Ein für diesen Zweck angewandtes Prüfmittel sollte möglichst einfach anzuwenden, zuverlässig bezüglich der Zeit und der Umweltbedingungen,stabil, strukturell kompakt aus Gründen der leichten Lagerung und des Transportes und billig sein. Durch seine Anwendung würde die derzeitige Beschränkung des Nachweises von Mikroorganismen auf sterile Labors aufgehoben. Ein derartiges Prüf mittel ist auch nicht beschränkt auf die Diagnose von Krankheiten, sondern ist geeignet für alle industriellen oder medizinischen Bereiche, bei denen ein einfacher und zuverlässiger Nachweis von Mikroorganismen erforderlich ist.

Verfahren und Prüf mittel, wie sie heute zum Nachweis und der Analyse von Mikroorganismen allgemein angewandt werden, umfassen die Untersuchung verschiedener Substanzen und Bereiche des Körpers, die Mikroorganismen enthalten können wie Blut, Urin, Speichel und Haut. Um das Vorhandensein oder nicht Vorhandensein von krankheitserzeugenden Mikroorganismen und das Ausmaß der Infektion, soweit eine solche vorhanden ist, zu bestimmen, werden bei diesen Untersuchungen im allgemeinen Kultivierungsverfahren angewandt, die geeignet sind, qualitative und quantitative Ergebnisse zu liefern. Üblicherweise umfassen diese Kultivierungsverfahren das Beimpfen eines geeigneten mikrobiologischen Wachstumsmediums, das Inkubieren des Systems unter stadardisierten Bedingungen und die Beobachtung und Analyse der Kolonien des Mikroorganismuswachstums.

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Bei dem üblichen Kultivierungsverfahren wird Agargel oder ein ähnliches Gel in Petrischalen als Medium für die systematische Beimpfung, Inkubation und Analyse angewandt. Agargel ist besonders geeignet als Kultivierungsmedium, aufgrund seiner günstigen physikalischen Eigenschaften. Die Herstellung und Anwendung des Agargel-Schaben -Verfahrens sind jedoch zeitraubend und die Stabilität des Systems ist bezüglich der Zeit wegen der Zerstörung des Mediums begrenzt. Außerdem stellt unter bestimmten Lagerbedingungen die Verunreinigung ein wesentliches Problem dar. Das Ergebnis dieser Begrenzungen ist die Beschränkung dieses Verfahrens auf Untersuchungen im Laboratorium. Verbesserungen des Agargelverfahrens sind erforderlich, um den Nachweis und die Analyse von Mikroorganismen bei der Diagnose von Krankheiten zu erleichtern.

Verfahren, bei denen saugfähige Kissen wie Papierstücke, die mit einem Nährmedium für Mikroorganismen imprägniert sind, angewandt werden, wurden vor einiger Zeit entwickelt. Solche Kissen werden nach dem Imprägnieren mit den Nährstoffen getrocknet, wodurch die Stabilität gegenüber dem Verfahren mit Agargelschalen verbessert wird. Die Reihenfolge der Verfahrensschritte zum Nachweis von Mikroorganismen mit Hilfe solcher Prüfmittel umfaßt ein Beimpfen durch Eintauchen des Kissens in die zu untersuchende Flüssigkeit, Inkubieren unter standardisierten Bedingungen und Beobachtung der entstehenden Mikroorganismuskolonien. Daher werden derartige Systeme häufig als "Eintauch-Inkubier-Ables-Prüfmittel bezeichnet. Halbquantitative Ergebnisse können möglich werden durch die zusätzliche Zugabe eines Parbindikators. Da die Kolonien jedoch innerhalb des gesamten Kissens und nicht nur auf der Oberfläche wachsen, sind die Morphologieuntersuchungen im allgemeinen begrenzt. Eine Entfernung reiner Kolonien für die weitere Analyse und Klassifizierung ist ebenfalls sehr begrenzt.

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Die weitere Entwicklung von "Eintauch-InkuMer-Ables"-Prüfmittein führte dazu, daß man eine semipermeable Membran mit der Oberfläche des imprägnierten saugfähigen Kissens zusammen brachte. Ein Beimpfen durch das wahlweise Verfahren des "AufStreichens" kann bei diesen Prüfmitteln ange-

crualj/tative.

wandt werden, wobei man/Ergebnisse erhält, und die Untersuchung der Morphologie der Mikroorganismuskolonien ermöglicht wird. Halbquantitative Ergebnisse sind möglich unter Anwendung des Standard "Eintauch-Inkubier-AbIes"-Systems. Das auftretende Wachstum der Mikroorganismuskolonien auf der Oberfläche der semipermeablen Membran ist jedoch verzögert, wenn bei dem Zusammenbringen der Membran mit dem Kissen keine ausreichende Verbindung zwischen den beiden Strukturen zum "Übergang der Nährstoffe auf den inkubierten Mikroorganismus entstanden ist. Auch wird die subjektive schnelle Diagnose durch die morphologische Beobachtung reiner Kolonien durch die Variation des Mikroorganismuswachstums, wie es auf der Oberfläche der Membran beobachtet wird, verglichen mit dem Wachstum, wie es in dem klassischen Agargel beobachtet wird, beeinflußt. Die Möglichkeit, die Mikroorganismen, die ein reines Kulturwachstum ergeben, schnell und genau zu klassifizieren, sowie das Ausmaß der Infektion quantitativ zu bestimmen, sind daher begrenzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Prüfmittel für mikrobiologisches Arbeiten, umfassend ein absorbierendes Material und eine im wesentlichen trockene, zusammenhängende Schicht aus einem Gel, die laminatartig mit dem absorbierenden Material verbunden ist über eine zusammenhängende Zwischenschicht zwischen dem saugfähigen Material, und dem Gel, die zusammengesetzt ist aus dem saugfähigen Material und dem Gel. Das erfindungsgemäße Prüfmittel kann weiter eine oder mehrere im wesentlichen trockene, zusammenhängende Deckschichten aus einem Gel umfassen, die sich laminat-

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artig über der ersten Gelschicht befinden. Das absorbierende Material und/oder die Gel ob er schicht oder -Oberschichten enthalten vorzugsweise ein Beagenz oder Reagentien. Bevorzugte Reagentien umfassen mikrobiologische Nährmedien, Susoder Pensionsmittel, Hintergrundfarbstoffe und/Farbindikatoren. Die Erfindung betrifft auch ein Prüfmittel für mikrobiologisches Arbeiten zum Züchten, Nachweisen und zur Analyse von Mikroorganismen mit einer Geloberfläche für mikrobiologisches Wachstum, das zuverlässig bezüglich der Zeit und Umgebung, stabil, einfach und kompakt ist zur leichten Lagerung und Transport, das billig ist und das eine Entfernung der Mikroorganismuskolonien für die weitere Analyse ermöglicht. Außerdem sind bei Verwendung von Agar als Gel,das die Oberschicht oder -Oberschichten bildet, Morphologieuntersuchungen der entstehenden Mikroorganismen möglich, die vergleichbar sind mit den Ergebnissen, die man bei üblicherweise angewandten Agarschalen erhält. Die angegebene Struktur ist vorzugsweise befestigt an oder auf andere Weise verbunden mit einem Träger oder Halter und versehen mit einem dicht abschließbaren Behälter und bildet mit diesem zusammen ein integrales Prüfmittel.

Die Erfindung wird anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Dabei ist

Fig. Λ eine perspektivische Draufsicht auf ein Prüfmittel mit der laminierten Struktur der vorliegenden Erfindung;

Fig. 2 ein Querschnitt des Prüfmittels der Fig. 1 entlang der Linie 2-2 und die

Fig. 3j 4 und 5 Draufsichten auf erfindungsgemäße Prüfmittel, die das Muster des Mikroorganismuswachstums zeigen;

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Fig. 6 eine Draufsicht auf ein anderes erfindungsgemäßes Prüfmittel, das in einem dicht verschließbaren Behälter enthalten ist; und

Fig. 7 ein vergrößerter teilweiser Querschnitt entlang der Linie 7-7 der Fig. 6.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein integrales Prüfmittel zur Kultivierung, zum Nachweis und zur Analyse von Mikroorganismen, das verschiedene einzelne Merkmale oder Verbesserungen gegenüber den bekannten Prüfmitteln besitzt. In erster Linie ist das erfindungsgemäße Prüfmittel in der Anwendung. einfach und billig, verglichen mit den zeitraubenden und zur Zeit üblichen Verfahren unter Verwendung von Agargelschalen.-Zweitens ist es strukturell kompakt und kann daher leicht gelagert und transportiert v/erden, im Gegensatz zu dem mühsamen Agargelverfahren. Drittens ist es bezüglich der Zeit und Umgebung stabil, da es entwässert ist und dadurch die Lebensdauer der kolloidalen Oberfläche verlängert und das Mikroorganismuswachstum durch Verunreinigungen verhindert wird. Viertens ist es zuverlässig im Vergleich zu Kissen, die mit Membranen zusammengebracht sind, da die Struktur der zusammenhängenden Grenzschicht einen wirksameren Kontakt zwischen den einzelnen Strukturteilen ergibt. Das führt dazu, daß das Reagenz sich selbst gleichmäßig verteilt und dadurch das Wachstum und der Nach-

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weis von Mikroorganismen unabhängig wurd/von den strukturellen Fehlern, die sich beim Zusammenbringen von Membranen mit Kissen ergeben. Fünftens erlaubt/die Entfernung von Mikro- ' Organismuskolonien zur weiteren Analyse die mit üblichen imprägnierten Kissen nicht möglich ist. Ferner stellt es ein Mittel dar zum Nachweis von Mikroorganismen mit einer minimalen Verzögerung durch Änderung der Umgebung, indem es möglich ist, die Eehydratisierung in dem flüssigen Medium durchzuführen, das die Mikroorganismen enthält. Und schließlich

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erhält man
bei Verwendung von Agargel als Gel für die Deckschicht

.; eine Agaroberflache für das Mikroorganismuswachs tum, die übereinstimmt mit den klassischen Agargeloberflachen in Petrischalen, die den Mdkrobiologen vertraut sind. Diese Eigenschaft erlaubt eine schnelle Diagnose durch morphologische Beobachtung des Mikroorganismuswachstums.

Die Fig. 1 zeigt ein mehr teili^psPrüfmittel 10, umfassend ein längliches, im allgemeinen rechteckiges Basisteil 12
mit einer Reihe von darin geformten rechteckigen Vertiefungen 18. Das Basisteil kann aus Kunststoff geformt sein und kann eine Verlängerung 19 mit einem aufgerauhten Oberflächenteil 11 umfassen, die als Griff dient und mit den !Fingern gehalten werden kann. Die Vertiefungen 18 sind «jeweils mit laminierten Strukturen 13, 14, 15 und 16 versehen, die mit den gleichen oder verschiedenen Reagenzien imprägniert sind. Die laminierten Strukturen können mit Gitterlinien 17 versehen sein, um die Zählung der Kolonien zu erleichtern, wie in
der laminierten Struktur 13 angegeben ist. Für die vorliegende Beschreibung umfaßt der Ausdruck Reagenz Chemikalien und biologische Substanzen, wie mikrobiologische Nährmedien.

Ifig. 2 zeigt die laminierte Struktur 14-, umfassend ein absorbierendes Material 20, wie Papier und eine Schicht 22 aus einem Gel, wobei eine Grenzschicht 21 aus saugfähigem Material und Gel entsteht, die mit dem saugfähigen Material und dem Gel einen integralen Bestandteil bildet und aus dem saugfähigen Material 20 und der Gelschicht 22 besteht. Diese laminatartige Struktur kann zusätzlich eine
Deckschicht 23 aus einem Gel enthalten. Die Gelschichten
22 und 23 und die Grenzschicht 21 sind zusammenhängend
und im wesentlichen trocken. In dem Basisteil 12 sind Öffnungen 24 vorgesehen, um ein Eindringen der Flüssigkeit in
das saugfähige Material 20 zu ermöglichen.

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Die Fig. 6 und 7 zeigen ein Prüfmittel 31, "bestehend aus einem länglichen Kunststoffstreifen 24 als Handgriff und eine laminatartige Struktur 35* die mit einem Reagenz oder Reagentien imprägniert ist und an dem einen Ende des Griffes befestigt ist. Das Prüfmittel ist in einer dicht abschließbaren transparenten Plastikhülle 32 enthalten mit einem ineinandergreifenden Verschluß 33·

Fig. 7 zeigt die laminatartige Struktur 35, umfassend ein absorbierendes Material 36,wie Papier,und eine Schicht

38 aus einem Gel, wobei eine Grenz schicht 37 sas saugfähigem Material und Gel entsteht, die mit dem saugfähigen Material 36 "und der Gelschicht 38 integral ist und aus dem saugfähigen Material 36 und der Gelschicht 38 besteht. Diese laminatartige Struktur 31 kann zusätzlich eine Deckschicht

39 aus einem Gel umfassen. Die Gelschichten 38 und 39 und die Grenzschicht 37 sind zusammenhängend und im wesentlichen

trocken. Die Kanten der Hülle 32 sind bei 40 verschweißt.

Die beiden grundlegenden, in den Zeichnungen gezeigten Prüfmittel 10 und 31 bestehend aus ähnlichen laminierten Strukturen 13 bis 16 bzw. 35- Abgesehen von gelegentlichen Ausnahmen bezüglich der Größe und der Art der Befestigung der laminierten Strukturen an dem Basisteil können die Strukturen bei der folgenden Diskussion ihrer Eigenschaften und Funktionen zusammen betrachtet werden. Beide umfassen ein absorbierendes Material, eine Gelschicht und eine Grenzschicht zwischen saugfähigem Material und Gel und können zusätzlich eine oder mehrere Geldeckschichten umfassen.

Das absorbierende Material besteht aus saugfähigem Papier, Stoff, Holz oder irgendeiner anderen geeigneten Substanz, die Flüssigkeit absorbieren und festhalten'kann. Die Dimensionen des saugfähigen Materials können frei gewählt

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werden und das Material kann eine Vielzahl von Formen annehmen wie Platten, Zylinder usw. Das saugfähige Material ist vorzugsweise mit mikrobiologischen Nährstoffen und Suspensionsmitteln imprägniert und kann auch mit FärbIndikatoren oder Hintergrundfarbstoffen imprägniert sein.

An diesem Punkte ist es wichtig, die Verwendung der Ausdrücke "Schicht" und "Deckschicht" im Zusammenhang mit der Beschreibung zu verstehen. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Prüfmittel, umfassend ein flächiges saugfähiges Material und eine "Schicht" aus einem Gel in laminarer Beziehung zueinander, wie später näher beschrieben wird. Das Prüfmittel kann auch eine zusätzliche "Schicht" oder "Schichten" umfassen, die als "Deckschicht" oder "Deckschichten" bezeichnet werden, die sich in laminarer Beziehung zueinander befinden, wie im folgenden näher beschrieben wird. Die "Deckschicht", soweit eine solche vorhanden ist, ist nur die "Schicht" oder "Schichten", die über der ursprünglichen "Schicht" liegen. Die Unterscheidung beruht auf der unterschiedlichen Zusammensetzung der zwei oder mehr Schichten und nicht auf Standards wie Dicke oder Herstellungsverfahren.

Zur weiteren Erläuterung gibt es drei allg-emeine Kategorien, die die möglichen Unterscheidungen der Zusammensetzung^ die zur Bildung von zwei oder mehreren "Schichten", wie der Ausdruck hier gebraucht wird, führen. Das sind erstens die aufeinanderfolgende Abscheidung von zwei oder mehr verschiedenen Gelgemischen. Zweitens die aufeinanderfolgende Abscheidung von zwei oder mehreren Gelgemischen, bestehend aus dem gleichen Gel und unterschiedlichen Beagentien oder unterschiedlichen Eeagenzkonzentrati on en und drittens die aufeinanderfolgende Abscheidung von zwei oder mehr Gelgemischen, bestehend aus verschiedenen Gelen und verschiedenen Eeagentien oder verschiedenen Eeagenzkonzentratio-

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nen. Eine weitere Erläuterung geht aus den unten angegebenen Beispielen hervor.

Die erste Schicht oder einzige Schicht, wenn keine Deckschicht vorhanden ist, des Gels in laminarer Beziehung zu dem absorbierenden Material ist zusammenhängend und im wesentlichen trocken mit einem bevorzugten Dehydratisierungsbereich von ungefähr 68 bis 99 %· Bei Abwesenheit einer Geldeckschicht dient diese Schicht, wie^ später näher erläutert wird, als Deckschicht und besitzt deren Eigenschaften. Wenn sie zusammen mit einer Geldeckschicht angewandt wird, was bevorzugt ist, dient diese Schicht zum Abdichten der Oberfläche des absorbierenden Materials, wobei eine Grenzschicht aus absorbierendem Material und Gel und eine neue Oberfläche gebildet wird, die keine kleinen Löcher besitzt . ("pinhole free")· Eine solche Oberfläche, die keine kleinen Löcher besitzt, ist für Mikroorganismen und organische Farbstoffe in nicht wässrigen Lösungsmitteln undurchlässig aber durchlässig für mikrobiologische Nährstoffe und Feuchtigkeit, Es hat sich gezeigt, daß bei der hier angegebenen v/irksamen Dicke eine solche Durchlässigkeit stärker abhängt von der Konzentration des Gels als von der Dicke. Ein Konzentrationsbereich des Gels, der die gewünschte Durchlässigkeit.dieser Gelschicht für Feuchtigkeit und mikrobiologische Nährstoffe ergibt, liegt bei ungefähr 1,5 bis 20 Gew.-% im rehydratisierten Zustand und vorzugsweise ungefähr 3 bis 15 Gew.-%, wobei die Konzentration von dem jeweiligen verwendeten Gel abhängt. Ein wirksamer Dickenbereich beträgt ungefähr 0,05 bis 1 mm im rehydratisieren Zustand mit einer bevorzugten Dicke von ungefähr 0,1 bis 0,5 hhh_;wieder in Abhängigkeit von dem speziellen angewandten Gel.

Im Rahmen dieser Erfindung umfaßt der Ausdruck'"Gel" homogene oder heterogene feste Phasen kolloidaler Lösungen.

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Gele, die angewandt werden können, umfassen Gelatine, Agar, Gemische von Gelatine und Agar und Gemische von Gelatine und/oder Agar mit kolloidalen Substanzen wie Cellulosegummen, Alginaten, Albuminen bzw. Proteinen, Carrageenen und komplexen Polysacchariden und Polypeptiden. Andere Gele und Gemische von gelartigen und kolloidalen Substanzen, die lyophil sind und die eine Oberfläche bilden, die keine kleinen Löcher enthält, können ebenfalls angewandt werden. Die Gelschicht kann auch ein Reagenz oder fieagentien einschließlich mikrobiologische Nährstoffe, Färbindikatoren oder Hintergrundfarbstoffe enthalten.

Die Grenz- schicht zwischen saugfähigem Material und Gel nimmt aufgrund ihrer Art die Eigenschaften von beiden, nämlich dem absorbierenden Material und der Gelschicht an. Imprägnierungen, die sich in dem absorbierenden Material und/ oder der Gelschicht befinden, finden sich daher auch in der

Grenzschicht. Diese Grenz-schicht dient dazu, die Wirkung zwischen dem absorbierenden Material und der Gelschicht bezüglich der darin enthaltenen Seagentien sowie der Beimpfung oder sterilen Flüssigkeit, die bei der Verwendung zugeführt wird, zu erleichtern. Diese zusammenhängende Grenzschicht beschleunigt die Diffusion von Flüssigkeit und Nährstoffen und dient als Übergangsschicht zwischen dem absorbierenden Material und der Gelschicht, so daß die günstigen Eigenschaften sowohl des absorbierenden Materials als auch der Gelschicht bezüglich des Mikroorganismuswachstums vereinigt sind, wodurch eine günstigere Struktur entsteht.

Me Geldeckschicht wird vorzugsweise laminar auf die erste Gelschicht aufgebracht, ist zusammenhängend und im wesentlichen trocken mit einer bevorzugten Dehydratisierung von ungefähr 68 bis 99 %. Die Oberfläche dieser Geldecks'chicht dient als Träger für das Mikroorganismuswachstum. Für diese

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Punktion hat es sich gezeigt, daß eine geeignete Konzentration des Gels ungefähr 1,5 Ms 20 Gew.-% beträgt, ,je nach dem verwendeten Gel. Ein wirksamer Dickebereich für diese Deckschicht beträgt ungefähr 0,05 bis 1 mm in dehydratisiertem Zustand, wobei ein Bereich von ungefähr 0,1 bis 0,5 nun je nach dem verwendeten Gel, bevorzugt ist. Eine günstige Dicke ergibt ein ausreichendes Volumen, um die eingebauten Reagentien wirksam zurückzuhalten und diffundieren zu lassen, um das Wachstum des Mikroorganismus zu unterstützen, während sie im wesentlichen eine Rehydratisierung ermöglicht.

Es können eine oder mehrere Deckschichten angewandt werden und Gele, die dafür geeignet sind, umfassen Gelatine, Agar, Gemische aus Gelatine und Agar und Gemische aus Gelatine und/oder Agar mit kolloidalen Substanzen wie Cellulosegummen, Alginaten, Albuminen, Carrageenen und komplexen Polysacchariden und Polypeptiden. Andere Gele und Gemische gelartiger und kolloidaler Substanzen, die lyophil sind, und das Wachstum von Mikroorganismen und Diffundieren der imprägnierten Reagentien erlauben, können ebenfalls verwendet werden. Agar ist besonders geeignet, da es zur Zeit als Träger für Mikroorganismen üblich ist. Die Geldeckschicht enthält vorzugsweise ein Reagenz oder Reagentien, umfassend mikrobiologische Nährstoffe, Farbindikatoren und Hintergrundfarbstoffe, ge nach Wunsch. ν .

Wie oben gesagt, umfaßt eine bevorzugte Ausführungsform das Imprägnieren der Struktur insgesamt oder einer oder mehrerer Gelschichten mit einem mikrobiologischen Nährmedium, das verschiedene Nährst of fzub ereitungen umfassen kann wie Actinomycesbrühe, Rinderlactose, Hirn- und Herzinfusion, Aziddextrose, Christensens Zubereitung, Eosinmethylenblau, Formiat, Ricinoleatbrühe, Tryptoseblutagar, M-Hefebrühe, modifizierte Sabouraudbrühe usw. und deren Variationen. Bei der

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Auswahl eines Nährmediums und Hemmstoffgemisches, das für einen einzelnen Mikroorganismus spezifisch ist, ist es auch möglich, das Vorhandensein oder nicht Vorhandensein eines bestimmten Mikroorganismus durch die Beobachtung eines Wachstums oder nicht-Wachstums nachzuweisen.

Wie oben gesagt, können auch Färbindikatoren und Hintergrundfarbstoffe enthalten sein. Solche Färb indikator en und Hintergrundfarbstoffe sind verschiedene Kategorien für diese Beschreibung. Der Ausdruck Farbindikator bezeichnet einen Farbstoff, der als Reaktion auf das Vorhandensein von Mikroorganismuswachstum eine Farbänderung ergibt. Als solcher kann er ein einfacher pH-Indikator, wie Phenolrot sein, der von gelborange nach leuchtend rosa umschlägt in Gegenwart von Mikroorganismen, die Harnstoff in der Verbindung zersetzen können. Es kann auch ein Oxidations-Reduktiqns-Indikator sein, wie eine der verschiedenen Tetrazoliumverbindungen z.B. 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, der von farblos nach intensiv rot umschlägt in Gegenwart der meisten Mikroorganismen. Der Farbindikator dient zur Verstärkung der Lage der Mikroorganismuskolonien bei der Verwendung des Prüf mittels für halbquantitative Bestimmungen. Andererseits bezeichnet Hintergrundfarbstoff einen Farbstoff, der durch das Vorhandensein oder nicht Vorhandensein von Mikroorganismen nicht beeinflußt wird. Der Hintergrundfarbstoff ergibt einen gefärbten Hintergrund zur Beobachtung der Kolonienbildung von Mikroorganismen, die in Abwesenheit eines solchen Farbstoffs schwer zu beobachten ist, wie im Falle von Mikroorganismuskolonien, die im wesentlichen transparent sind. Verschiedene Farbstoffe können hierbei verwendet werden wie Amaranthrot, das einen roten Hintergrund für Mikroorganismen ergibt.

Eine bevorzugte Ausführungsform umfaßt das Imprägnieren des absorbierenden Materials mit einem Reagenz, das ein

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Suspensionsmittel, wie inerte Gummen, Carrageene, Alginate und verschiedene komplexe Polysaccharide und Polypeptide umfaßt. Das Suspensionsmittel erleichtert das Imprägnieren und dient dazu, das Auslaugen der Reagentien aus dem absorbierenden Material zu verhindern, wodurch es ein Auslaugen solcher Eeagentien aus dem absorbierenden Material beim Rehydratisieren des Prüfmittels verhindert.

Die Herstellung der erfindungs gemäß en Prüfmitt el umfaßt zwei grundlegende Schritte, nämlüch das Abscheiden einer Gelschicht oder -schichten und das Trocknen der entstehenden Struktur. Das absorbierende Material oder die Gelschichten werden vorzugsweise vor der Abscheidung der Gelschicht oder -schichten imprägniert. Das Abscheiden der Gelschicht oder -schichten kann erreicht werden durch Aufgießen, Eintauchen, Aufrollen oder Aufsprühen einer wässrigen Lösung des Gels, so daß eine zusammenhängende Schicht entsteht, die mit der ersten Schicht eine zusammenhängende Grenzschicht ergibt, wie oben beschrieben. In Beziehung auf die Herstellungsverfahren für die Prüfmitt el sind die Ausdrücke "Schicht" und "Deckschicht" nicht auf einzelne Eintauch-, Aufgieß—, Aufroll- oder Aufsprühoperationen beschränkt, sondern sie können auch das Ergebnis mehrerer derartiger Operationen sein. Die Unterscheidung zwischen Schichten beruht auf der unterschiedlichen Zusammensetzung der Schichten, die auf der Abscheidung verschiedener Gele oder verschiedener daran^ enthaltender Eeagentien oder verschiedener Konzentrationen von Reagentien beruht und nicht auf der Dicke oder der Art der Herstellung.. Die entstehende Struktur wird dann nach einer von zahlreichen möglichen Methoden getrocknet, wie durch ein geregeltes Trocknen im Ofen, Trocknen bei Raumtemperatur bei vermindertem Druck usw.. Ein Trocknungsverfahren wurde durchgeführt, indem man das Prüfmittel Raumtemperatur bei herabgesetzten Feuchtigkeitsbedingungen wie 5 bis 20 % relativer

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Feuchtigkeit 10 bis 15 h aussetzte. Ein schnelleres Trocknungsverfahren umfaßt eine Trocknung im Ofen bei 5O°C innerhalb 1/2 bis 2 h. Das entstehende, im wesentlichen trockene Prüfmittel wird vorzugsweise an oder auf einem Träger befestigt, wie aus den Fig. 1 und 6 hervorgeht. Die Art der Befestigung der laminatartigen Struktur auf dem Träger muß so sein, daß sie für die Mikroorganismen nicht schädlich ist und die Diffusions- oder Absorptionseigenschaften des Prüfmittels nicht verschlechtert.

Wie oben gesagt, können die erfindungsgemäßen Prüfiaittel verschiedene Formen und Anwendungsarten zum Kultivieren Nachweisen und Analysieren von Mikroorganismen umfassen. Solche Formen sind beispielhaft in den Zeichnungen angegeben. Anwendungsarten, die durch die Verwendung der erfindungsgemässen Prüfmittel möglich sind, sind ein "Aufstreichen" und "Eintauchen-Inkubieren-Ablesen".

Bei Anwendung eines "Aufebreich"-Verfahrens wird das Prüfmittel in eine sterile Flüssigkeit eingetaucht oder auf andere Weise mit ihr zusammengebracht und zwar solange, daß es ausreicht, die Gelschicht oder -schichten im wesentlichen zu hydratisieren und anschließend durch "Aufstreichen" auf die Oberfläche der Geldeckschicht beimpft. Es ist möglich, halbquantitative Ergebnisse durch das Aufstreichverfahren zu erhalten, wobei ein bekanntes Volumen oder bekannte Menge der zu untersuchenden Probe auf die Oberfläche des Gels aufgestrichen wird. Nach Inkubieren unter standardisierten Bedingungen, vorzugsweise in einem dicht verschlossenen Behälter wie dem Behälter 32, ipi ein Entweichen von Feuchtigkeit zu verhindern, kann das Vorhandensein oder nicht-Vorhandensein eines Mikroorganismuswachstums leicht durch Beobachtung der Geloberfläche bestimmt werden. Bei Anwendung des oben beschriebenen halbquantitativen AufStreichverfahrens

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ergibt ein geeigneter Vergleich der Dichte des Mikroorganismuswachstums auf der Geloberfläche mit einem Standard eine halbquantitative Bestimmung des Ausmaßes der Infektion.

Bei Anwendung eines "Eintauch-Inkubier-Ables"-Verfahrens wird das Prüfmittel in die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe eingetaucht und nach einer entsprechenden Zeit, die ausreicht, um die Gelschicht, oder -schichten im wesentlichen zu rehydratisieren, daraus entfernt und die überschüssige Flüssigkeit ablaufen gelassen. Das führt zu einer gleichzeitigen Rehydratisierung der Gelschichten und Beimpfung des Prüfmittels. Die für das Mikroorganismuswachstum erforderliche Feuchtigkeit wird dadurch in dem absorbierenden Material absorbiert. Mikroorganismen, soweit solche in der Flüssigkeit vorhanden sind, werden in dem saugfähigen Material absorbiert und auf der Geloberfläche abgeschieden. Es tritt daher ein Mikroorganismuswachstum innerhalb des absorbierenden Materials/auf der Oberfläche des Gels auf. Die innerhalb des absorbierenden Materials gebildeten Kolonien treten neben dem hauptsächlichen Wachstum auf dem Gel auf. Nach dem Inkubieren unter standardisierten Bedingungen in einem dicht verschließbaren Behälter zur Vermeidung des Entweichens von Feuchtigkeit, kann das Vorhandensein oder nicht-Vorhandensein von Mikroorganismuswachstum leicht durch Beobachtung der Geloberfläche bestimmt werden.

Bei den beiden oben beschriebenen Anwendungsverfahren tritt auf der Geloberfläche ein Mikroorganismuswachstum auf, wodurch die Entfernung der Kolonien für die weitere Untersuchung, wie Gramfärbung, ermöglicht wird. Durch die Verwendung von Gelen wie Agar, die üblicherweise bei den Petrischalenverfahren angewandt werden, kann es auch möglich sein, eine schnelle Diagnose der.Art der Infektion durch morphologische Beobachtung reiner Kolonien zu stellen. Die Oberfläche der Agarschicht entspricht der Oberfläche des Agargels bei dem

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Petrischalenverfahren. Diese beiden Eigenschaften des Oberflächenwachstums und der Geloberfläche liefern dem Mikrobiologen und Diagnostiker ein außerordentlich wirksames Prüfmittel zum Nachweis von Mikroorganismen. Die erfindungsgemässen Prüfmittel besitzen auch notwendigerweise eine sehr gute Stabilität, da sie im wesentlichen wasserfrei sind, wodurch die Lebensdauer der Geloberfläche verlängert wird und eine Verunreinigung aus der Umgebung vermieden wird. Sie sind zuverlässig durch die zusammenhängende Grenzschicht, die die Wechselwirkung zwischen dem absorbierenden Material als Feuchtigkeit sb ehält er und der Geldeckschicht als Nährstoff und Träger für die Mikroorganismen verbessert. Sie sind aufgrund ihrer Kompaktheit einfach und gegenüber bekannten Prüfmitteln und Systemen billig. Die erfindungsgemäßen Prüfmittel sind daher für die Mikrobiologie außerordentlich günstig.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert :

Beispiel

26 Streif en. Schleicher- und Schuell-Filterpapier Nr. 4-70 wurden in einer Größe von Jx1 ei geschnitten und mit einer wässrigen Lösung der folgenden Zusammensetzung imprägniert:

Tryptose-Blut-Agar-Basis 30 g/l

Bindeisxtrakt 9 g/l

Natriumchlorid 5 g/l

Natriumalginat 2 %

Das Imprägnieren wurde durch 5 min langes Eintauchen der Streifen in die oben angegebene Lösung und Durchleiten der Streifen durch eine Ausquetschvorrichtung und anschließend

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ungefähr 1-stündiges Trocknen bei 5O°C durchgeführt. Eine erste Schicht, bestehend aus einer wässrigen Lösung von 5 % Agar und 0*2 % Amaranthrot Hintergrundfarbstoff wurde dann auf die eine Seite der trockenen, imprägnierten Papierstreifen aufgesprüht. Die entstehende erste laminierte Struktur umfaßte eine zusammenhängende Grenzschicht aus imprägniertem Papier und Agarlarbstofflösung und wurde dann ungefähr 1 h bei 50°C getrocknet.

25 der Streifen wurden in 5 Gruppen von jeweils 5 Stück eingeteilt. Es wurde eine Deckschicht aus verschiedenen Gelen, die Reagentien enthielten, auf jede Gruppe aus 5 Streifen aufgerollt. Die Deckschicht bestand aus einer wässrigen Lösung der folgenden Zusammensetzung:

Tryptose-Blut-Agar-Basis 30 g/l

Binderextrakt 9 g/l

Natriumchlorid 5 g/l

Natriumalginat 2 %

und den folgenden Konzentrationen der jeweiligen Gele:

Gruppe 1 5 % Agar

Gruppe 2 20 % Gelatine / 1,25 % Agar • Gruppe 3 1 % Cellulosegummi / 4 % Agar Gruppe 4 1 % Alginat / 4 % Agar Gruppe 5 .1 % fötales Kalbsserum / 5 % Agar.

Die entstehenden laminierten Strukturen wurden dann ungefähr 1 h bei 50°C getrocknet. 5 Prüfmittel, eines aus jeder der 5 Gruppen.wurdenin die vorher hergestellten flüssigen Medien, enthaltend 10 , 10^, 10^, 10^ und 10 Mikroorganismen pro cnr Escherichia coli eingetaucht und nach 5 bis 30 sek, je nach dem flüssigen Medium, entfernt. Überschüssige Plüssig-

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keit ließ man von den Prüfmitteln ablaufen. Die beimpften Pi¹Ufmittel wurden in einen sterilen, dicht verschlossenen Behälter, wie den Behälter 32 der Pig. 6, gegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert. Auf allen beimpften Prüfmitteln wurden abgegrenzte transparente, runde,erhabene Mikroorganismuskolonien gegenüber dem amaränthroten Hintergrund beobachtet. Die Dichte der beobachteten Kolonien auf der Oberfläche der Deckschichten war eine Funktion des Eintauchens und der standardisierten Inkubierung, sowie der Dichte der Mikroorganismen in dem untersuchten Medium. Die Dichte auf der erhaltenen Oberfläche ergab eine ausreichend gleichmäßige Verteilung, Trennung und Größe der Kolonien, um halbquantitativ zwischen 10 und 10^ Mikroorganismen/2 cnr zu unterscheiden. Solche entstehenden Oberflächendichten sind in den Pig. 3, 4- und 5 gezeigt, die ein Mikroorganismuswachstum 30a, 30b und 30c entsprechend einer halbquantitativen Verteilung von 10^, 10 und 10^ Mikroorganismen/cm·^ zeigen. Die Deckschicht der Prüfmittel erlaubt ein Entfernen der Kolonien für eine weitere Analyse.

Der restliche Streifen wurde mit einer Deckschicht, wie in Gruppe 1, versehen und anschließend 1 h bei 50°C getrocknet. Es wurde dann steriles Wasser auf die Papierseite des Prüfmittels gegeben zur Rehydratisierung und die Oberfläche der Deckschicht wurde mit einer Schleife bestrichen, die eine Probe einer Brühe von Escherichia coli enthielt. Dieses beimpfte Prüfmittel wurde anschließend in einen sterilen dicht verschlossenen Behälter gegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert. Es wurden abgegrenzte transparente, runde, erhabene Mikroorganismuskolonien beobachtet, die charakteristisch sind für Escherichia coli auf Agarplatten. Die Deckschicht des Prüfmittels erlaubte eine Entfernung der Kolonien für eine weitere Analyse.

Pat ent an sp rü ch e 62XXV

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Claims

Pa tentansprüche

1. Mittel für mikrobiologisches Arbeiten, umfassend ein im wesentlichen flächiges, absorbierendes Material und mindestens eine im wesentlichen trockene, zusammenhängende Schicht aus einem Gel, wobei das saugfähige Material und die 1· Gelschicht über eine zusammenhängende Grenzschicht miteinander verbunden sind, die mit dem absorbierenden Material und der Gelschicht integral ist und aus dem absorbierenden Material und dem Gel besteht.

2· Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß es mindestens eine, im wesentlichen trockene, zusammenhängede Deckschicht aus einem Gel besitzt, die sich über der ersten Gelschicht befindet.

3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekenn ζ eichn e t , daß das Gel Gelatine, Agar, ein Gemisch aus Gelatine und Agar und/oder ein Gemisch aus Gelatine und/oder Argar mit zumindestens einer kolloidalen Substanz ist.

4. Mittel nach Anspruch 3, dadurch g e k e η η ζ e i ohne t , daß die kolloidale Substanz ein Cellulosegummi, Carrageen, Alginat, Albumin, Polysaccharid und/oder PoIypeptid ist.

5. Mittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß das Gel Agar oder ein Gemisch aus Agar und Gelatine ist.

6. Mittel nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das absorbierende Miteral ein Reagens -2-

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enthält,

7, Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz mikrobiologische Nährstoffe, Suspensionsmittel und/oder Farbindikatoren umfaßt,

8, Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Suspensionsmittel ein inerter Gummi, Karrageen, Alginat, Polysaccharid und/oder Polypeptid ist,

9, Mittel nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Gelschicht ein Reagenz enthält,

10, Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß das Reagenz mikrobiologische Nährstoffe und/oder einen Farbindikator umfaßt,

11, Verfahren zur Herstellung der Mittel nach Anspruch bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß man eine erste zusammenhängende Schicht aus einer Gellösung auf das im wesentlichen flächige, absorbierende Material aufgießt und anschließend die entstehende Struktur trocknet und gegebenenfalls anschließend eine oder mehrere weitere Gelschichten aufbringt.

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