DE2409696A1

DE2409696A1 - Mittel und verfahren zur bestimmung von cholesterin

Info

Publication number: DE2409696A1
Application number: DE2409696A
Authority: DE
Inventors: Peter Newmann Tarbutton
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1973-03-01
Filing date: 1974-02-28
Publication date: 1974-09-19
Also published as: BG26960A4; FR2220062A1; JPS502594A; NO146558B; ZA74266B; NL181368C; NO146557C; NO751299L; AR201939A1; DE2409696C2; BE811728A; NO740693L; US4186251A; CS176267B2; DD110118A5; NO146557B; AU6456674A; ES437270A1; AU467471B2; NL7401974A

Description

Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin

Die Erfindung betrifft Mittel und Verfahren zur Bestimmung von freiein und Gesamtcholesterin - Gehalten in Flüssigkeiten wie Körperflüssigkeiten. Es wird eine Untersuchung auf freies Cholesterin beschrieben, wobei Wasserstoffperoxid bestimmt wird, das durch die Wirkung eines chemischen Systems mit Cholesterinoxidaseaktivitrlt auf freies Cholesterin freigesetzt wird. Ein bevorzugtes Mittel zur Bestimmung des freigesetzten Wasserstoffperoxids umfasst die Anwendung einer Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit und eines Oxidations-Reduktions-Indikator. Die Zugabe eines chemischen Systems mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität zu dem Mittel zur Bestimmung von freiem Cholesterin, ergibt ein integrales Pr\ifmittel zur Bestimmung von Gesamtcholesterin.

Cholesterin findet sich in nahezu allen pflanzlichen und tierischen Zellen, entweder in freier Form oder in Form von Estern, Freies Cholesterin bezeichnet Cholesterin in seinem nicht umgesetzten Zustand (λ "-Cholesterin oder Cholest-5-en-3ß-ol). Gesamtcholesterin bezeichnet die Summe aus freiem Cholesterin und seinen Esterderivaten wie dem Linoleat, Oleat, Palmitat,

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Arachidonat, Palmitoleat, Linolenat, Stearat und Myristat. Cholesterin findet sich in konstanten Mengen- im Serum bei normalen Bedingungen. Im allgemeinen sind 25 i° des Gesamtcholester-ins im Serum in Form von freiem Cholesterin vorhanden, während die restlichen 75 'f° in Form von Esterderivaten vorliegen.

Es ist ziemlich gut gesichert, daß der G-esamtcholesteringehalt des ganzen Blutes in direktem Zusammenhang steht mit bestimmten Erkrankungen bei Menschen und Tieren. Zu diesen Krankheiten, die im Zusammenhang mit Gesamtcholesteringehalten im Blut stehen, gehören die Leberzellen betreffende Krankheiten, Unregelmäßigkeiten des Schilddrüsenstoffwechsels , Gallenabf^ßstörungen und vielleicht als wichtigste ArterioslsLerose und andere Gefäßerkrankungen. Bis in die letzten 10 Jahre war es üblich, den Gesamtcholesteringehalt des gesamten Blutes zu bestimmen. Aber es ist jetzt bekannt, daß der Serumgehalt durch Faktoren verändert wird, die den Gehalt in den roten Zellen nicht beeinflussen. Als Ergebnis davon werden die meisten klinischen Bestimmungen sowohl des freien als auch des gesamten Cholesterins an Serum und nicht an gesamtem Blut durchgeführt.

-νίοτμ
Da die klinische BedeutungN^^&ehalten an freiem und Gesamtcholesterin zunehmend anerkannt wird, .führte der Bedarf an schnellen und zuverlässigen Verfahren zur Bestimmung von Cholesterii in Flüssigkeiten zu erhöhten Forschungsanstrengungen. Dadurch wurden zahlreiche neue Verfahren und Modifizierungen von üblichen Verfahren entwickelt. Eine allgemeine Behandlung der vielen Verfahren, die für Cholesterinbestimmungen zur Zeit zur Verfugung stehen,findet sich in American Journal of Clinical Pathology, Bd. 25:1(1955) S.433-46. Allgemein umfassen die zur Zeit übliehen Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholosterin in Flüssigkeiten besonders in Serum_fdie vier Grundschritte der Extraktion von freiem Cholesterin und Cholesterinestern aus der Flüssigkeit, · Verseifung der Cholesterinester zu freiem Cholesterin, Isolierung des freien Cholesterins, das dabei entsteht und Bestimmung des Isolierten freien Cholesterins. Das allgemein übliche oder Standardverfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin ist das

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Verfahren von Abell, et al, in the Journal of Biological Chemistry, Bd. 195 (1952) S. 357). Nach diesem Verfahren werden die Cholesterinester verseift durch Inkubieren mit alkoholischem . Kaliumhydroxid und das freie Cholesterin wird dann mit Petroläther extrahiert. Das isolierte freie Cholesterin wird spektrophotometrisch bestimmt mit Hilfe eines modifizierten Liebermann-Burchard-Reagenz (Essigsäureanhydrid, Schwefelsäure und Essigsäure). Dieses Ständardverfahren und die zahlreichen sonstigen zur Verfügung stehenden Verfahren besitzen die klinischen Nachteile, daß sie sehr komplizierte Verfahren sind, wobei zahlreiche Reagenzien angewandt werden müssen und außerordentlich zeitraubend sind. '

Es hat sich nun gezeigt, daß Prüfmittel und Verfahren zur Bestimmung von sov/ohl freiem als auch Gesamtcholesterin entwickelt werden können auf der Grundlage der katalysierten Abbaureaktionen von freiem Cholesterin und Cholesterinestern. Die Erfindung betrifft ein Prüfmittel zur Bestimmung von freiem Cholesterin in einer Flüssigkeit, umfassend ein chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivität und Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid. Ein besonders bevorzugtes Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid umfasst ein Reagenzsystem,. umfassend eine Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit und eine Indikatorsubstans, die in Gegenwart von Peroxid und der Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit oxidiert wird und die dabei ihre Farbe ändert. Es ist auch bevorzugt, daß ein Puffermaterial, das im Stand ist, einen pH-Wert zwischen ungefähr 4 und 9 aufrecht zu erhalten, wenn es mit der Flüssigkeitsprobe zusammen kommt, in dem 2?rüfmittel enthalten ist. Vorzugsweise enthält das Prüfmittel zur •Bestimmung von freiem Cholesterin auch ein oberflächenaktives Mittel, das im Stande ist, das gesamte der flüssigen Probe vorhandene freie Cholesterin löslich zu machen, bzw. zu solubii-lisieren.

Die Erfindung betrifft auch ein Mittel zur Bestimmung von Gesamtcholesterin in einer Flüssigkeit, umfassend ein chemisches System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivit-It neben dem Mittel zur Bestimmung von freiem Cholesterin, das oben beschrieben ist.

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Ein "bevorzugtes chemisches System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivit-it umfaßt das Enzym Cholesterinesterhydrolase urü einen Gallenenzym -Cofaktor dazu. Wenn das Testmittel so modifiziert ist, daß es zur Bestimmung von Gesamtcholesterin geeignet ist, soll die Puffersubstanz, die vorzugsweise enthalten ist, im Stande sein, einen pH-Wert von ungeführt 5 "bis 8 aufrecht zu erhalten, wenn sie mit der flüssigen Probe zusammenkommt. Das Prüfmittel kann auch eine Substanz zur Hemmung bzw. Verhinderung des Bakterienwachstums enthalten, wie Eatriumazid, um das störende Wachstum von Bakterien zu verhindern.

Das beschriebene Verfahren zur Bestimmung von freiem Cholesterin in einer Flüssigkeitsprobe umfaßt das Zusammenbringen der flüssigen Probe mit einem oben. . beschriebenen Priifnittel zur Bestimmung von freiem Cholesterin und Beobachtung der auftetenden (Farbreaktion. Es ist bevorzugt, daß die entstehende Reaktion eine vorher bestimmte Zeit ablaufen kann, bevor die auftretende ' Wirkung beobachtet wird. Es ist auch bevorzugt, das Gemisch der flüssigen Probe und des PrUfmittels mit einer sauren Substanz zusammenzubringen, um die Entwicklung der Indikatorreaktion zu verstärken. Halbquantitative Ergebnisse werden erhalten, wenn man die entstehende colorimetrische Reaktion visuell beobachtet und die Farbreaktion mit einer Standardfarbkarte vergleicht. Quantitative Ergebnisse werden erhalten, wenn man die auftretende Farbreaktion instrumenteil beobachtet. Ähnliche Verfahrensschritte werden angewandt zur Bestimmung von Gesamtcholo.sterin in einer Flüssigkeitsprobe. Das für diesen Zweck angewandte Prüfmittel ist jedoch das, das oben zur Anwendung zur Bestimmung von Gesamtcholesterin beschrieben worden ist.

Ein Verfahren zur Herstellung eines Auszugs enthaltend Cholesterinesterhydrolase, der im wesentlichen frei ist von proteolytischer Aktivität, wird ebenfalls angegeben und umfaßt die Stufen des Zusammenbringens einer Substanz 'enthaltend Cholesterinesterhydrolase wie Pankreatin und einer ersten wässrigen Flüssigkeit, die ein anorganisches Salz in Lösung enthalten kann, Trennung der flüssigen und festen Phasen, die dabei entstehen, Durch-

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leiten der flüssigen Phase durch eine Säule, enthaltend ein Adsorptionsmittel, umfassend einen ädsorptionsfähigen Diethylamin ο äthyla nt eil und !Durchleiten einer zweiten wässrigen Flüssigkeit, umfassend eine anorganische Salzlösung durch die Säule, wobei die anorganische Salzlösung im. Stande ist, Cholesterinesterhydrolase aus der Säule zu eluieren. Das Adsorptionsmittel in der Säule umfaßt vorzugsweise Diäthylaminoäthylcellulose. Eine Substanz, die im Stande ist, Cholesterinesterhydrolase vor proteolytischer Aktivität zu schützen, ist ebenfalls vorzugsweise sowohl in der ersten als auch in der zweiten !Flüssigkeit, enthalten.

Die beiliegende Zeichnung ist eine graphische Darstellung, die die Zusammensetzung der Bestandteile der einzelnen 5'aktionen des Auslaufs aus der Säule bei Anwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Esterhydrolase-Reinigungsprozesses zeigt .__J|Unter dem Ausdruck "Bestimmung" ist sowohl der qualitative Nachweis als auch die halbquantitative oder quantitative Analyse zu verstehen, soweit nicht anders angegeben.

Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Tatsache, daß bei der Reaktion von freiem Cholesterin in Gegenwart von molekularem Sauerstoff und bestimmten chemischen Systemen, die Cholesterinoxidaseaktivität besitzen, Wasserstoffperoxid gebildet wird. Der Ausdruck"Cholesterinoxidaseaktivität" der hier verwendet wird, bezieht sich, auf die Katalyse von freiem Cholesterin über eine Oxidation—s-Reaktion,bei der Wasserstoffperoxid als Produkt entsteht. Die Reaktion zwischen derartigen chemischen Systemen und freiem Cholesterin und die anschließend vorzugsweise angewandten Mittel zur Bestimmung des mit Hilfe des Reagenzes gebildeten Wasserstoffperoxids, kann durch die folgenden chemischen Gleichungen angegeben v/erden.

Freies Cholesterin +O₂ ^choleste^^lno3Cldas^Gholesten-3-on

Aktivität

^{+ H}2°2

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H₂O₂ + Indikator peroxidative _> oxidierter Indikator

Wirksamkeit (Farbänderung)

Selbstverständlich, kann freies Cholesterin auch.bestimmt wer-" den durch Bestimmung des freigesetzten.Δ -Cholesten-3-ons.

Es hat sich gezeigt, daß,wenn das oben angegebene System angewandt wird zusammen mit einem chemischen System,das Cholesterinesterhydrolaseaktivität besitzt durch die Cholesterinester in freies Cholesterin umgewandelt werden können, man.ein Mittel zur Bestimmung von G-esamtcholesterin erhält. Der Ausdruck "Cholesterinesterhydrolaseaktivit'vt" bezeichnet die Katalyse von Cholesterinestern zu freiem Cholesterin durch Hydrolyse. Diese Katalyse kann durch die folgende Gleichung angegeben werden:

Cholesterinester Cholesterinesterhydrolase^ _freies Cholesterin

Aktivität + Fettsäuren.

Ein chemisches System mit Cholesterinoxidase.aktivität kann erhalten werden durch verschiedene Verfahren und in verschiedenen Formen. Üblicherweise wird ein derartiges System erhalten durch Extraktion natürlich vorkommender Substanzen wie Mikroorganismen, die durch, die Folgenden beispielhaft angegeben v/erden können:

Verschiedene . Mycobakterien v/ie Mycobakterium rubrum, verschiedene ITo.cardia v/ie Hocärdia crythropols und verschiedene Streptomycesstämme.

Ein besonderes chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivität ist das EnzymCholesterinoxidase, das erhalten worden ist durch Extraktion von Mycobakterium r.ubrum nach dem Verfahren, das angegeben ist in Methods in Enzymology Bd. 1, herausgegeben von Colowick und Kaplan, Academic Press ( New York, 1955) S. 678-81).

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Die· Herstellung kann kurz folgendermaßen beschrieben werden. Hasse, gepackte Zellen von Mycobakterium rubrum werden nach einem-üblichen Verfahren zum Beispiel durch Vermählen in Sand aufgebrochen. Das vermählende Material wird in einem Puffer, wie einem Phosphatpuffer suspendiert und zur Entfernung der unlöslichen Substanzen zentrifugiert. Der Puffer, der das lösliche Protein enthält, von dem Cholesterinoxidase ein Teil ist, 'wird dann behandelt, um störende niedermolekulare Substanzen, zum Beispiel durch Dialyse zu entfernen.

Ein chemisches System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität kann ebenfalls nach verschiedenen- Verfahren in zahlreichen Formen erhalten v/erden. Üblicherweise wird ein solches System erhalten durch Extraktion \^ron natürlich vorkommenden Substanzen wie tierischem oder menschlichem Pancreas, Leber oder Eingeweiden bzw. Gedärmen. Handelsübliches Pancreatin ist besonders geeignet. Aufgrund seiner hohen proteolytischen Aktivität muß es jedoch gereinigt werden, um eine derartige Aktivität zu entfernen, wie später näher beschrieben wird.

Gemäß der vorliegenden Erfindung hängt die Bestimmung von freiem Cholesterin unter Anv/endung eines chemischen Systems mit Cholesterinoxidaseaktivität ab von einem Mittel zur Bestimmung von dem durch die 'katalysierte Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxid. Derartige Mittel, die angewandt werden können, umfassen alle bekannten Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid in Flüssigkeiten. Eine besonders günstige Arbeitsweise umfaßt die Anwendung eines Reagenzes, umfassend eine Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit und einen Indikator,der . in Gegenwart von Peroxid und der Substanz mit peroxidativer ■Wirksamkeit oxidiert wird und der zu einer colorimetrischen Reaktion oder Farbänderung fahrt.

Substanzen mit peroxidativer Wirksamkeit umfassen solche natürlich vorkommenden Peroxidasen wie Meerrettich-Beroxidase und Kartoffelperoxxdase. Andere Substanzen mit peroxidativer Wirksamkeit bzw. peroxidativer Aktivität umfassen bestimmte organische

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Substanzen wie normales ganzes Blut, rote Blutzellen, lyophilysiertes ganzes Blut, Uroh'ämin, Metalloporphyrine usw. Bestimmte anorganische Substanzen sind ebenfalls geeignet wie Jodidsalze und Molybdatsalze, Eisensulfocyanat, Eisentannat, Eisenferrocyania und Kaliumchromsulfat.

Indikatorsubstanzen der oben angegebenen Art umfassen Oxidations-.Reduktions-Indikatoren mit einem"Oxidations-Reduktions-Potential, das geeignet ist, Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Substanzen mit peroxidativer Wirksamkeit nachzuweisen bzw. zu bestimmen. Perartige Indikatoren umfassen o-Tolidin, Syringaldazin, Yanillinazin, die Kombination von Phenol und 4-Aminoantipyrin, 2,7-Diaminofli»ein, Benzidin und Derivate von Benzidin wie o-Dianisidin.

Bei der Bestimmung von freiem Cholesterin ist vorzugsweise in dem Mittel ein· 'Puffermaterial enthalten, das vorzugsweise im Stande ist, einen pH-Wert von ungefähr 4 bis 9 aufrecht zu erhalten, wenn es mit der zu untersuchenden flüssigen Probe zusammenkommt. Ein solcher pH-Bereich sichert die Stabilität der Bestandteile des Prüfmittels besonders wenn das Enzym Cholesterinoxidase angev/andt wird. Der günstigste pH-Bereich für den Nachweis und die Bestimmung von freiem Cholesterin unter Anwendung von Cholesterinoxidase liegt bei ungefährt 7 bis 7,2. Wenn ein chemisches System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität ebenfalls angewandt wird, um das Gesamtcholesterin zu bestimmen, liegt der pH-Bereich vorzugsweise zwischen ungefähr 5 und 8 mit einem Optimum bei 6,6, wenn das Enzym Cholesterinesterhydrolase angev/andt wird. Es kann irgendein Puffermaterial angewandt werden, solange es den entsprechenden pH-Bereich einstellt und die Wirksamkeit des Prüfmittels zum Nachweis von freiem Cholesterin oder G-esaintcholesterin nicht stört.ίΕΐη oberflächenaktives Mittel, das im Stande ist, im wesentlichen das gesamte in der Flissigkeitsprobe vorhandene Cholesterin löslich zu machen, ist vorzugsweise in dem Prüfmittel zur Bestimmung von freiem Cholesterin enthalten, da freies Cholesterin in bestimmten Flüssigkeiten, wie wässrigen Lösungen nur gering löslich ist. Wenn Cholesterinesterhydrolase und ein Gallen-Co-Faktor hierfür zur Bestimmung des gesamten Cholesterins enthalten ist, ist ein oberflLichen-

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aktives Mittel nicht- erforderlich, da der Gallen-Co-Faktor selbst als löslich machendes Mittel wirkt. So braucht bei Anwendung von Cholesterinesterhydrolase und deren G-allen-Co-Faktör kein löslich machendes Mittel f-ir das freie Cholesterin zugesetzt zu werden, wodurch sich das Prüfmittel vereinfacht. Oberflächenaktive Mittel, die angewandt werden können, umfassen sowohl ionische als auch 'nichtionische oberflächenaktive Mittel und verschiedene andere Detergenzien, die als löslich machende Mittel bekannt sind. G-allensalze sind besonders geeignet. Solche oberflächenaktive Mittel, die sowohl als löslich machende Mittel für freies Cholesterin als auch als Co-Faktoren für Cholesterinesterhydrolase geeignet sind, umfassen. CI10I7 Glycochol·; Taurochol'-und Taurodeoxycholsäure und deren Salze. Die Natriumsalze dieser Verbindungen'sind besonders geeignet.

Das angegebene Verfahren zur Bestimmung von freiem Cholesterin oder G-esamtcholesterin umfasst grundsätzlich das Zusammenbringen der zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe mit entsprechenden Prüfmitteln _twie sie oben beschrieben sind,und Beobachtung der auftretenden Reaktion. Die Reaktion ist vorzugsweise eine colorimetrische Reaktion oder eine Farbänderung, die erreicht wird durch Anwendung von Indikatormaterialien, wie sie oben beschrieben sind. Das entsprechende Prüfmittel kann mit der Flüssigkeitsprobe auf verschiedene Arten zusammengebracht werden, z.B. durch Vermischen der flüssigen Probe mit einer Lösung, wie einer wässrigen Lösung₍enthaltend das Prüfmittel. Das Prüfmittel kann auch.im trockenen Zustand, z.B. in lyophilisiertem Zustand vorliegen und direkt zu der flüssigen Probe gegeben oder vor dem Vermischen rehydratisiert werden. Das Prüfmittel kann auch in einem Träger eingebaut sein, z.B. durch Imprägnieren von adsorbierenden Kissen, wobei eine Prüfvorrichtung entsteht. Eine derartige Vorrichtung kann in die Fl^;Jssigkeitsprobe eingetaucht werden, um das Prüfmittel mit der Flüssigkeitsprobe in Berührung zu bringen.

Esist bevorzugt, daß man die Reaktion zwischen den Bestandteilen des PrUfmittels und der flüssigen Probe eine ausreichend lange Zeit ablaufen läßt, um die Entwicklung einer ausreichenden

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colorimetrischen Reaktion zu förd-ern, die zuverlässige und empfindliche Ergebnisse liefert. Diese Inkubation kann von einer so kurzen Zeit wie ungefähr 1 Minute bis zu einer längeren Zeit, z.B. über Nacht variieren. Bei Anwendung der bevorzugten Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid beträgt die Inkubationszeit üblicherweise zwischen 0,5 bis 1 Stunde und die Inkubationstemperatur 0 bis_i 50⁰O vorzugsweise ungefähr "37⁰C Es hat

auch
sich gezeigt, daßVdie Zugabe einer sauren Substanz, z.B. von Schwefelsäure zu dem Pr'ifmittel und der JPlüssigkeitsprobe die Farbentwicklung bei Anwendung des bevorzugten Prüfmittels fördert.

Halbquantitative Ergebnisse v/erden erhalten, wenn die Reaktion visuell beobachtet und mit einer Standardfarbkarte verglichen

tReaktioru
wird, die aierybei Anwendung bekannter Konzentrationen von freiem und Gesamtcholesterin zeigt,, verglichen wird. Quantitative Ergebnisse v/erden erhalten wenn spektrgiohotometrische oder Reflektionsverfahren zur Bestimmung derySealrtion angewandt werden, die dann mit einer Standardkurve verglichen wird.

Bei der vorliegenden Erfindung umfaßt der Ausdruck "chemisches System· nit einer'gewissen¹ enzyaatischen Aktivität" alle chemischen Verbindungen einzeln oder in Kombination, die die angegebene enzymatische Aktivität besitzen. Es ist nicht bekannt, ob diskrete Moleküle oder Enzyme mit der gewünschten Aktivität verbunden sind, da das Mittel hergestellt wird aus Auszügen natürlich vorkommender Substanzen, wobei die Auszüge, die gewünschte Aktivität besitzen. Z.B. kann Cholesterinoxiüaseaktivität erhalten werden aus einem Auszug des Mikroorganismus Mycobakterium rubrum und es ist nicht bekannt, ob ein einziges Molekül oder Enzym für die Aktivität verantwortlich ist. Die Aktivität kann bestimmte Enzym-Co-Faktoren oder komplizierte Enzymsysteme umfassen. Es ist nicht erforderlich, daß Enzyme beteiligt sind, da das System mit Cholesterinoxidaseaktivität nur eine katalytische Aktivität besitzt und kein Reagenz darstellt, das entweder bei der Reaktion verbraucht wird oder zur Bildung eines Produktes dient. So tritt die Wirkung nur als katalytische Aktivität in Erscheinung und bei der vorliegenden

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Erfindung wird dauer der Ausdruck chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivität angewandt. Die gleiche Situation

drolaseJ trifft auf die GholesterinesterhjijSktxvitat zu. Es ist jedoch über '"bestimmte chemische Systeme, die diese Aktivität "besitzen, .Näheres "bekannt. Z.B. ist bekannt, daß die Enzymcholesterinesterhydrolase einen Enzym-Co-Faktor erfordert, der von der G-alle stammt. Diese G-alleenzym-Co-Faktoren umfassen Chol·-, Glycochol-, Taurochol-und Taurodeoxycholsäurenund ihre Salze.

Es ist erforderlich, daß .wenn das Prüfmittel Proteine wie Enzyme in dem katalytischen chemischen System umfaßt, das Prüfmittel im wesentlichen frei ist von proteolytischer Aktivität, das heißt, frei von Substanzen, die deö Abbau von Proteinen "beschleunigen. Wenn eine proteolytische Aktivität vorliegt, werden die Proteine zerstört und dadurch ihre Teilnahme an der katalytischen Aktivität verschlechtert bzw. verhindert. Der Enzym-Co-Faktor für Cholesterinesterhydrolase schützt dieses Enzym vor einer proteolytischen Zerstörung und wirkt außerdem bei der katalytischen Aktivität des chemischen Systems mit. Cholesterinoxidase und Peroxidase sind auf diese V/eise nicht geschützt. So darf, wenn das Prüfmittel diese Substanzen enthält, keine proteolytische Aktivität vorhanden sein. So erfordert die erfindungsgemäße Kombination von extrahierter Cholesterinester-■ hydrolase mit solchen Proteinen wie Gholesterinoxidase und Peroxidase ein neues Verfahren zur Herstellung eines Ausaugs enthaltend Cholesterinesterhydrolase, die im wesentlichen frei ist von proteolytischer Aktivität.

Ein solches Verfahren besteht darin, daß man eine Substanz enthaltend Cholesterinesterhydrolaseaktivität und eine erste - wässrige Flüssigkeit, die ein anorganisches Salz in-Lösung enthalten kann, zusammengibt, die entstehende flüssige und feste Phase trennt, die flüssige Phase durch eine Säule gibt, enthaltend ein Adsorbenz, das einen adsorptionsfähigen Diäthylaminoäthylanteil besitzt,und eine zweite wässrige Flüssigkeit, .umfassend eine anorganische Salzlösung, durch die Säule leitet, wobei die anorganische Salzlösung im Stande ist, die

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Cholesterinesterhydrolase von der Säule zu eluieren. Es hat sich gezeigt, daß bei einer geeigneten Konzentration an anorganischen Salzen, Cholesterinesterhydrolase eine größere Affinität zu Adsorbenzien mit Diäthylaminoäthylanteilen besitzt als Substanzen mit proteolytischer Aktivität. Ein bevorzugtes Adsorbtionsmittel ist Diäthylaminoäthylcellulose, obwohl der Diäthylaminoäthylanteil auch an ein anderes Gerüst oder anderen Träger gebunden sein kann als Cellulose. Andere Trägerteile umfassen die verschiedenen Cellulosederivate usw.

Die.erste wässrige Flüssigkeit kann ein organisches Salz in Lösung enthalten oder nicht. Sowohl die erste als auch die zweite wässrige Flüssigkeit enthalten vorzugsweise einen Puffer um einen pH-Wert für die Cholesterinesterhydrolase aufrecht zu erhalten, der sich auf deren katalytische Aktivität nicht nachteilig auswirkt. Der pH-Wert des Puffers liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 5 und 3 mit einem Optimum bei 6,6. Es ist ferner bevorzugt, daß das anorganische Salz selbst eine derartige Pufferfunktion ausübt. Besonders geeignete erste und zweite Flüssigkeiten sind Kaliunphosphatlösungen mit einer Konzentration von bis zu 0,05 m bzw. zwischen 0,15 und 1,0 m. Anorganische Salzlösungen mit einer Ionenstärke entsprechend den Kaliumphosphatlösungen in den oben angegebenen Bereichen können ebenfalls die ersten und zweiten wässrigen Flüssigkeiten ausmachen. Beispiele für anorganische Salzpuffer, die angewandt werden können, umfassen Acetat·; Citraty Tartrat-und Phthalatpuffer. Ein besonders geeignetes Verfahren ist in Beispiel 4 beschrieben. Es ist auch bevorzugt, daß sowohl die ersten als auch die zweiten Flüssigkeiten eine Substanz enthalten, die im Stande ist, Cholesterinesterhydrolase vor proteolytischer Aktivität zu schützen, wie Chol·? Glycochol·? Taurochol- und Taurodeoxycholsäuren und deren Salze. Ein Bakterienhenmstoff kann ebenfalls in der ersten und zweiten wässrigen Lösung vorhanden sein, um sörendes Bakterienwachstum zu verhindern. Ein besonders geeigneter Bakterienhemmstoff ist Natriumazid.

Flüssige Proben, die erfindungsgemäß untersucht werden können, sind vorzugsweise wässrige Lösungen, wenn das bevorzugte Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid angewandt wird. Solche

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flüssigen Proben umfassen Körperflüssigkeiten wie Serum, Urin Plasma usw. sowie andere Lösungen enthaltend freies oder G-esamtcholesterin wie sie bei Labor- oder Herstellungsverfahren auftreten. (fl)as Prüfmittel kann in Form einer Lösung, wie einer wässrigen Lösung als getrocknetes oder lyophylisiertes Pulver vorliegen oder kann in trockenem Zustand in einem Träger enthalten sein. Die Bestandteile können auch getrennt gelagert und bei der Vervrendung zusammengegeben werden. G-eeignete Träger sind im Stande die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe zu absorbieren und umfassen saugfähiges Papier, Pappe, polymere Kissen, poröse Kunststoffe usw. Das trockene Prüfmittel kann in einem Träger imprägniert, der Träger kann damit überzogen, es kann chemisch an den Träger gebunden, physikalisch darin eingeschlossen sein oder es kann irgendeine Kombination davon vorliegen. Der Träger kann auch mit einem Kalter oder Stützglied verbunden oder auf andere Weise daran befestigt sein.

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Bestimmung sowohl von freiem als auch von G-esamtcholosterin, das gegenüber den bekannten Mitteln einfach und schnell ist. Es ist außerordentlich geeignet zur klinischen Anwendung durch Personen mit minimalen technischen Kenntnissen und führt zu einer Erhöhung der Anzahl von Cholesterinbestimmungen, wie sie von Ärzten gefordert wird. Es ist besonders überraschend, daß es möglich war, ein v/irksames Bestimmungssystem zu entwickeln, das so komplex ist, wie das bevorzugte Mittel zur Bestimmung von G-esamtcholesterin. In seiner bevorzugten Ausfuhrungsform umfaßt dieses Mittel die Enzyme Cholesterinoxidase, Cholesterinesterhydrolase und Peroxidase, einen Enz3nn Co-Faktor und ein Oxidations-Reduktions-Indikatormaterial. Dieses System erfordert jedoch keine mühsame Steuerung der Versuchsbedingungen um quantitative Ergebnisse zu liefern.

Die Erfindung wird durch die folgenden nichtfeinschränkenden Beispiele näher erläutert:

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Beispiel 1

Die Bildung von Wasserstoffperoxid durch Zusammenbringen einer flüssigen Probe_/ enthaltend freies Cholesterin,mit einem erfin-dungsgem"ßen Prüfnittel wird hier beschrieben.

Ein seilfreier Extrakt von Cholesterinoxidase von Mycobakterium E.ubrum wurde nach dem von Stadtman in Methods in Enzymology, Bd. I, herausgegeben von Cofowick und Kaplan, Academic Press (Hew York, 1955) S. 67Q-81) beschriebenen Verfahren erhalten. Es wurden drei lösungen, enthaltend die folgenden Bestandteile, hergestellt:

1m Kaliun-phosphat-Puffer (pH 7,5)

Cholesterinoxidase-Auszug (0,13 Einheiten/ml)

Cholesterinoxidase Auszug
abgekocht 15 min

Aceton

Cholesterin in Aceton

Peroxidase/o-Dianisidin

Enzym-Cholesterin ^lösiins

Lösung
ml.

Vergleichs- Abgekochte Enzym-Blindprobe

0,2

0,3

0,1
1,0

ml.

0,2

0,3

0,1

1,0

ml.

0,2

0,ü

0,1 1,0

Eine Einheit Cholesterinoxidase-Enzymaktii'ltat ist hier definiert als die Menge-, die im Stande ist, die Oxidation von 1 /U Mol Cholesterin zu 1/u Mol Δ -Cholesten-3-on und 1 /u Mol Wasserstoffperoxid pro Stunde zu katalysieren. Eine Einheit Cholesterinesterhydrolase-Enzymaktiviflt ist hier definiert als die Menge, die im Stande ist, die Hydrolyse von 1 p. Mol Cholesteryloleat pro Stunde zu katalysieren.

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Die- Peroxidase/o-Dianisidinlösungen enthielten 1 mg Peroxidase/ml und waren in Beziehung auf o-Dianisidin · 2 HGl gesättigt. Diese Lösungen wurden 1 Stunde bei 37⁰C inltubiert, nachdem sie mit molekularem Sauerstoff durchspült worden waren. Nach aer Inkubation wurde 1 nl 65 $ HoSO. zu jeder Lösung zugegeben.-Die. Lösungen wurden filtriert -und die Absorption bei 540 nm bestimmt. Die Vergleichslösung und die zum Sieden erhitzte Enzymblindprobe ergaben optische Dichten von 0,08 bzw..0,020. Die Enzym-Cholesterinlösung ergab eine optische Dichte von 0,540. Das bestätigt die Bildung von Wasserstoffperoxid, das durch die Oxidation von o-Dianisidin nachgewiesen worden ist.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Anwendung des erfindungsgemäßen Prv.fmittels und Verfahrens zum Nachweis bzw. zur Bestimmung sowohl von freiem als auch von Gesamtcholesterin.

Es wurden die folgenden Reagenzien hergestellt: Cholesterinesterhydrolase - 32 Einheiten/ml, 9,4 mg Protein/ml in 0,1m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,6), 0,23 fo Natriuntaurocholat und 0,01 fo NaN₇.

Cholesterinoxidase 4 Einheiten/ml, 16 mg Protein/ml in 0,1m Kaliunphosphatpuffer (pH 7,0) und 0,01 ^cß> NaN .

Peroxidase Lösung - 0,1 mg/ml, in 0,1m Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) und 0,01 f NaN₇

o-Dianisidin - 1 mg/ml in 90$ Ithylenglykolmonomethy.läther

Puffer - 0,1m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,6), 0,28 <fo Natriumtaurocholat und 0,01 % NaN^

Serum - Serachol * standartisierte Serumprobe Nr. 1560031

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Diese Reagenzien wurden folgendermaßen vermischt:

Gesamt- Gesamt- Freies freies

cholesterin cholesterin-Cholesterin Cholesterin-

Blindprobe Probe Blindprobe Probe (ml.) (dl·) (ml.) (ml.)

Cholesterin-ester- hydrolase	1,0	1,0	1,0	1,0
Cholesterin- oxidase	1,0	1,0	0,ö	0,0
Peroxidase	0,8	0,0	0,2	0,2
o-Dianisidin	0,2	0,2	1,0	1,0
Puffer	-	-		0,05
Serum	_	0,05

* Das angewandte Serium war ein standartisiertes Serum, enthaltend 346 mg/100 ml Gesamtcholesterin und 74 mg/100 ml freies Cholesterin (Warner-Chilcott laboratories, Morris Plains, New Jersey "Serachol".) Die vier Lösungen wurden dann 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert und am Ende dieser Stunde wurden die optischen Dichten (OD) bei 450 nm gemessen:

450

Gesamtcholesterin Blindprobe Gesamtcholesterin Probe Freies Cholesterin Blindprobe Freies Cholesterin Probe

0,245 0,845 0,140 0,230

Die Analyse dieser Daten zeigt, daß beim Subtrahieren der Blindproben sowohl von dem freien als auch von dem Gesamtcholesterin ein Verhältnis von 0,233 zwischen freiem und Gesantcholesterin erhalten wird. Das entspricht gut dem bekannten Verhältnis von 0,214 in dem standartisierten Serum.

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rf 1A-44 349 Beispiel 3 .lh .

Dieses Beispiel zeigt, daß erhöhte Gehalte an freiem Cholesterin zu erhöhten Farbreaktionen führen "bei Anwendung der bevorzugten Prüfmittel für freies Cholesterin.

0,5 mg/ml und 1,0 mg/ml freies Cholesterin enthaltende Standardacetonlösungen wurden hergestellt. 0,5 ml einer Enzymlösung enthaltend 0,13 Einheiten/ml Cholesterinoxidase und 0,5 ml einer Peroxidase/o-Dianisidinlösung enthaltend 1 mg Peroxidase/ml und gesättigt mit o-Dianisidin · 2 HCl wurden jeweils zu 0,05 ml der Standardlösungen und 0,05 ml einer Vergleichslösung enthaltend 0,05 ml Aceton gegeben. Die drei Lösungen wurden mit molekularem Sauerstoff gespült und 1,0 Stunden bei 37⁰C inkubiert, lach dieser Zeit wurde 1 ml 65 folge H₀SO. zugegeben. Die optische Dichte (OD) wurde bei 540 nm gemessen. Man erhielt die folgenden Ergebnisse;

Vergleich 0,5 mg/100 ml '1,0 mg/100 ml

Beispiel _4

Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von extrahierter Cholesterinesterliydrolase, die im wesentlichen frei ist von proteolytischer Aktivität. -

Eine Lösung von '10 g handelsüblichem Pankreatin(4XNi¹ _> hergestellt nach dem Verfahren von National Formulary XIII American Pharmaceutical Association, Washington, D.C,1970) in 100 ml-0,05 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,6), 0,28 fa Natrium-taurocholat und 0,01 fo NaN^ wurde ungefähr 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. 1 ml dieser Pancreatinsuspension wurde mit 2 ml 0,05 m Kaliumphosphat puff er (pH 6,6) und 0,28 <fo Natriumtauroeholat und 0,01 io NaIT- vermischt und nach dem Verfahren des Beispiels 5 die enzymatisch^ Aktivität bestimmt.

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OD	540
0	,07
0	,12
0	,21

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Das verbleibende Volumen der Suspension wurde in 4 gleiche Volumina aufgeteilt und 30 min "bei 4°C mit 15 000 UpM zentrifugiert. Die überstehenden Pl ^;ssigkeiten wurden zusammengegeben und 0,1 ml dieses Pufferauszuges wurde mit 9,9 ml 0,1 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,6) und 0,28 f> Natriumtauroeholat und 0,01 f> NaH₇ vermischt. Dieser verdünnte Auszug wurde nach dem in Methods in Enzymology Bd. Ill, herausgegeben von Colowick und Kaplan, Academic Press ( New York, 1957) S. 451-4 angegebenen Verfahren bestimmt. Außerdem wurden 0,1 ml des Pufferauszuges mit 0,2 ml 0,1 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,6) 0,28 ^ Hatriumtaurocholat und 0,01 # NaIT₇ vermischt und die enzymatische Aktivität nach dem in Beispiel 5 angegebenen Verfahren bestimmt.

DEAE-Cellulose(DE-52 der VThatnan Biochemicals Ltd., Maidstone, Kent, England)wurde in.0,05 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,6) 0,23 fo Natriumtaurocholat und 0,01 fo NaN-, gewä sehen .und als Aufschlämmung in eine 5 x 90 cm große S'ule gegeben, wobei ein 1 Liter Bett mit 200 ml der den Puffer enthaltenden Waschflüssigkeit oberhalb des Bettes entstand. Das gesamte Volumen von 4 Liter des Phosphatpufferauszugs wurde dann auf die Säule gegeben und anschließend 50 ml eines ersten Eluierpuffers von 0,05 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,6) 0,28 fo Natriumtaurocholat, 0,01 fo NaN₇ und 0,01 m Mercapto vfchanol. Ein zweiter Eluierpuffer wurde dann kontinuierlich zugegeben, bestehend aus 0,2 m Kaliumphosphatpuffer. (pH 6,6) und 0,23 fo Natriumtaurocholat, 0,01 fo NaN₇ und 0,01 m Mercapto ethanol. Der Auslauf aus der S^:^ule wurde in 22 ml Pranktionen aufgefangen und auf seine enzymatische Aktivität untersucht, nach dem in diesem Beispiel angegebenen Verfahren und auf Protein wie oben angegeben.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle und dem Diagramm der beiliegenden Zeichnung angegeben:

	VoI	Protein	Enzym-	Spezifi	Rück	-19-
	ml	. mg.	Aktivität Einheiten	sche Ak tivität	gewinnung f>
				Einheiten/
	105	10 000		EIg
Pancreatin-			3150	0,3	Ί00
su3pensian	91	5 960
Puffer-	103	260	1340	0,3	5B
Auszug DEAE-Cellulose		409838/	850	3,3	27
		0736

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Die Cholesterinesterhydrolase enthaltenden Franktionen des Auslaufs wurden zusannengegeben und das Volumen auf einer Ultrafiltrationsmembran (Diaflo TOI-IO der Amicon Corporation, Lexington, Massachusetts) auf ungefähr 100 ml eingedampft und dann gegen 100 Volumina 0,05 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,6) 0,2ö fo Natriumtaurocholat und 0,01 $ NaIT₇ über Nacht "bei 4°0 mit einmaligem Pufferwechsel dialysiert.

Es zeigte sich, daß die 0,2.m'Kaliumphosphatpuffer (pH 6,6) 0,28 fo Natriumtaurocholat, 0,01 fo NaN, und 0,01m- Mercaptoäthanol enthaltenden Franktionen des Auslaufs keine proteolytische Aktivität von Trypsin oder Chymotrypsin enthielten.

Im folgenden ist die Herstellung des Cholesteryloleatsubstrats zur Anwendung hei der Bestimmung von Cholesterinesterhydrolaseaktivität und das Bestimmungsverfahren selbst beschrieben.

a) Herstellung des Substrats

10 mg Cholesteryloleat und 18 mg DL-Lecithin -wurden in 1 ml Äthyläther in einem Homogenisierungsrohr, das mit einem Teflonstempel versehen war, gelöst. 6 ml 0,1 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,6) und 0,28 fo xlatriumtaurocholat und 0,01 <?o NaN₇ wurden dann zugegeben und das Gemisch mit Hilfe des Stempels 5 min homogenisiert. Der Äther wurde entfernt, indem man das Rohr 15 min unter heißes fließendes Wasser hielt und gelegentlich den Stempel bewegte. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt und 15 min zur Zerstörung der Zellen beschallt (Sonifier^ cell, disrupter Model ¥140 und Sonifier® converter Model L der Branson Sonic Power Company, Plainview, New York).. Die Lösung wurde dann mit 2500 UpM 15 min lang zentrifugiert und die unlöslichen Anteile verworfen.

b) Bestimmungsverfahren

25·/Ul der Enzymlösung wurden zu 1 ^mI der vorher auf 37⁰C erwärmten Substratlösung gegeben und 10 min bei 37⁰C inkubiert. 4 ml Bloor's Lösungsmittel (75 % Äthylalkohol, 25 % Äthyläther) wurden zugegeben und die Lösung 10 min mit 2000 UpM zentrifugiert. 1 ml der überstehenden Flüssigkeit wurde mit 1 ml einer

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1,0 <fo Digitonxnlosung in 50 <fo Äthylalkohol + 50 $ Wasser, vermischt. Man ließ den Niederschlag 12h koagulieren und die Lösung wurde dann 15 min mit 2500 UpM zentrifugiert. Der Niederschlag wurde nit 4 ml Aceton gewaschen und erneut zentrifugiert. Dieser Niederschlag wurde in einem leichten Luftstrom bei Raumtemperatur getrocknet und 3 ml 0,1 °/o PeCl

getrocknet und 3 ml 0,1 /o PeCl, · ₂ in Eisessig wurden zum Lösen des Niederschlags zugegeben. 2-ml konz. HpSO. wurden langsam zugegeben, wobei sioh zwei Schichten bildeten, die schnell vermischt wurden. Die optische Dichte wurde bei 560 nm gemessen. Diese Werte wurden dann durch die optische Dichte einer Probe, enthaltend eine bestimmte Menge freies Cholesterin, die -demselben Bestimmungsverfahren unterworfen worden war, dividiert. Um Ergebnisse in Vierten von Einheiten pro ml zu erhalten, wie sie oben angegeben sind, wurden die Quotienten dann mit Zeit- und Verdünnungsfaktoren multipliziert, um Ergebnisse in Werten von u Mol Cholesterin pro ml und Stunde zu erhalten. Speziell wurde 0,1 ja Mol freies Cholesterin dem oben angegebenen Bestimnungsverfahren unterworfen, wobei 2,5 ml der '-.berstehenden Flüssigkeit angewandt wurden. Man erhielt eine optische Dichte von 1,243. Da die Bestimnungszeit 10 min und das angewandte Volumen 25 /Ul betrugen, waren die Zeit und Verdünnungsfaktoren 6 bzw. 40 und die Cholesterinesterhydrolaseaktivität wurde folgendermaßen berechnet:

OD
Einheiten/ml =(560 ^ _{χ 24Q}

Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

. Prüfmittel zur Bestimmung von Gesamtcholesterin in einer üssigen Probe, umfassend ein System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität, ein chemisches System mit Chol'esterinoxidaseaktivität und Mittel zur Bestimmung von mindestens einem der Reaktionsprodukte, die entstehen, wenn freies Cholesterin mit dem chemischen System mit Cholesterinoxidaseaktivität in Gegenwart von Sauerstoff 'zusammengebracht wird.

2. Prüfmittel nach Anspruch- 1, dadurch g e k e η η - * zeichnet.,, daß es zusätzlich eine Puff ersubstanz enthält;

3· Prüfmittel nach Anspruch 2, dadurch g e k e η η ζ e i c h η .e t , daß die Puffersubstanz einen pH-Wert 'von ungefähr 5 bis 8 aufrechterhält, wenn sie mit der Flüssigkeit in Berührung kommt..

4· Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß das chemische System' mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität Cholesterinesterhydrolase und einen Gallenenzym-Co-F.aktor dafür umfaßt.

5· Prüfmittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Gallenenzym-Co-Paktor Chol- Glycochol7 Taurochol-und/oder Taurodeoxychols'iure oder ein Salz davon ist.

6. Pr :,if mittel nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet', daß das Mittel zur Bestimmung von mindestens einem der Reaktionsprodukte ein Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid ist, umfassend eine Substanz mit peroxiaativer Wirksamkeit urid einen Indikatqr, der in Gegenwart von Peroxid una der Substanz mit Peroxidaseaktivität unter farbänderung

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oxidiert wird.

7. Prüfinittel nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß es in einen saugfähigen Träger enthalten ist.. . .

8. Anwendung des Prüfnittels nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß nan die zu untersuchende Probe mit dem Prüfnittel zusammenbringt und die Farbreaktion beobachtet.

9· Anwendung des Prüfmitteüß nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß man vor der Beobachtung der Farbänderung die Reaktion eine vorbestimmte Zeit lang ablaufen läßt.

10. Anwendung des Prüfmittels nach Anspruch 8 oder 9» dadurch gekennzeichnet , daß man die beobachtete colorimetrische Reaktion mit einer Standard-Farbkarte vergleicht.

11. Anwendung des Pr'ifmittels nach Anspruch 8 bis 9» dadurch gekennzeichnet , daß man die Farbänderung spektrophotometrisch beobachtet.

12. Verfahren zur Herstellung" eines Auszugs mit Cholesterin- -esterhydrolaseaktivität zur Verwendung in den Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet , daß man

a) eine Substanz mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität und eine erste wässrige Flüssigkeit zusammenbringt;

b) die' entstehende feste und flüssige Phase von einander trennt; p) die flüssige Phase_fenthaltend die Cholesterinesterhydrolase^ durch eine Säule leitet, enthaltend ein Adsorptionsmittel mit einem,adaorptionsfähigen Diäthylaminoäthylanteil und

d) eine zweite wässrige Lösung durch die Säule leitet, die die Cholesterinesterhydrolase aus der Säule eluiert.

13· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch g e k e η η zeichnet , daß man als Adsorptionsmittel Diäthylaminoäthylcellulose verwendet.

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Ί4· Verfahren nach Anspruch 12 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß man als erste und zweite wässrige Lösung

vgalseine anorganische*^Lösung verwendet. .

15· Verfahren nach Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet , daß man als anorganische Salzlösung eine pH-Pufferlösung verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 12 Ms 15» dadurch gekennzeichnet , daß man als erste wässrige Lösung eine Kaliumphosphatpufferlösung mit einer Konzentration bis zu 0,5 m und als zweite wässrige Lösung^ eine Kaliumphosphatpufferlösung mit einer Konzentration von 0,15 m bis 1,0 m verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch-12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als erste und zweite wässrige Lösung eine solche verwendet, die eine Substanz enthält, die Cholesterinesterhydrolase vor proteolytischer Aktivität schützt.

19·'" Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet', daß die Schutzsubstanz Chol-7 Glycocholr Tauroehol-und/oder Taurodeoxycholsäure oder eines deren Salze ist. "

20. Verfahren nach Anspruch 12 bis 19, dadurch gekennzeichnet , daß die Substanz mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität Pancreatin ist.

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