DE2409696C2 - Prüfvorrichtung zur Bestimmung von Cholesterin - Google Patents

Prüfvorrichtung zur Bestimmung von Cholesterin

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DE2409696C2 DE2409696A DE2409696A DE2409696C2 DE 2409696 C2 DE2409696 C2 DE 2409696C2 DE 2409696 A DE2409696 A DE 2409696A DE 2409696 A DE2409696 A DE 2409696A DE 2409696 C2 DE2409696 C2 DE 2409696C2
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Description

enthält
2. Prüfvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch Μ gekennzeichnet, daß das Reagenz zusätzlich eine Puffersubstanz enthält
3. Prüfvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Puffersubstanz einen pH-Wert von 5—8 aufrechterhalt, wenn sie mit der Flüssigkeit in Berührung kommt
4. Prüfvorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das chemische System mit CholesterinesterhydrolaseaktivitätCholesterinesterhydrolase und einen Gallenenzym-Co-Faktor dafür Μ umfaßt
5. Prüfvorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Gallenenzym-Co-Faktor Chol-, Glycochol-, Taurochol- und/oder Taurodeoxycholsäure oder ein Salz davon ist
6. Prüfvorrichtung nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Bestimmung von mindestens einem der Reaktionsprodukte ein Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid ist, umfassend eine Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit und einen Indikator, der in Gegenwart von Peroxid und der Substanz mit Peroxidaseaktivität unter Farbänderung oxidiert wird.
7. Prüfvorrichtung nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger saugfähig für die flüssige Probe ist.
so
Die Erfindung betrifft eine Prüfvorrichtung zur Bestimmung von Gesamtcholesterin-Gehalten in Flüssigkeiten, wie z. B. Körperflüssigkeiten. Das Bestimmungsverfahren mittels der erfindungsgemäßen Prüfvorrichtungen beruht auf dem Nachweis von freiem Cholesterin, indem Wasserstoffperoxid bestimmt wird, das durch die Wirkung eines chemischen Systems mit Cholesterinoxidaseaktivität auf das Freie Cholesterin freigesetzt wird. Ein bevorzugtes Mittel zur Bestimmung des freigesetzten Wasserstoffperoxids umfaßt jö eine Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit und einen Oxidations-Indikator. Die Zugabe eines chemischen Systems mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität zu dem Mittel, welches zur Bestimmung von freiem Cholesterin dient, ergibt ein integrales Prüfmittel zur Bestimmung von Gesamtcholcstcrin.
Cholesterin findet sich in nahezu allen pflanzlichen und tierischen Zellen, entweder in freier Form oder in
Form von Estern, Freies Cholesterin bezeichnet Cholesterin in seinem nicht umgesetzten Zustand (/^-Cholesterin oder ChoIest-5-en-3/i-ol). Gesaratcholesterin bezeichnet die Summe aus freiem Cholesterin und seinen Esterderivaten wie dem Ljnoleat, Oleat, Palmitat Arachidonat, PaJmitoleat, Linolenat, Stearat und Myristat Cholesterin findet sich in konstanten Mengen im Serum bei normalen Bedingungen. Im allgemeinen sind 25% des Gesamtcholesterins im Serum in Form von freiem Cholesterin vorhanden, während die restlichen 75% in Form von Esterderivaten vorliegen.
Es ist ziemlich gut gesichert, daß der Gesamtcholesteringehalt des ganzen Blutes in direktem Zusammenhang steht mit bestimmten Erkrankungen bei Menschen und Tieren. Zu diesen Krankheiten, die im Zusammenhang mit Gesamtcholesteringehalten im Blut stehen, gehören die Leberzellen betreffende Krankheiten, Unregelmäßigkeiten des Schilddrüsenstoffwechsels, Gallenabflußstörungen und vielleicht als wichtigste Arteriosklerose und andere Gefäßerkrankungen. Bis in die letzten 10 Jahre war es üblich, den Gesamiehölesteringehalt des gesamten Blutes zu bestimmen. Aber es ist jetzt bekannt, daß der Serumgehalt durch Faktoren verändert wird, die den Gehalt in den roten Zellen nicht beeinflussen. Als Ergebnis davon werden die meisten klinischen Bestimmungen sowohl des freien als auch des gesamten Cholesterins an Serum und nicht an gesamtem Blut durchgeführt
Da die klinische Bedeutung von Gehalten an freiem und Gesamtcholesterin zunehmend anerkannt wird, führte der Bedarf an schnellen und zuverlässigen Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin in Flüssigkeiten zu erhöhten Forschungsanstrengungen. Dadurch wurden zahlreiche neue Verfahren und Modifizierungen von üblichen Verfahren entwickelt Eine allgemeine Behandlung der vielen Verfahren, die für Cholesterinbestimmungen zur Zeit zur Verfügung stehen, findet sich in American Journal of Clinical Pathology, Bd. 25 :1 (1955) S. 433-46. Allgemein umfassen die zur Zeit üblichen Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin in Flüssigkeiten, besonders in Serum, die vier Grundschritte der Extraktion von freiem Cholesterin und Cholesterinestern aus der Flüssigkeit, Verseifung der Cholesterinester zu freiem Cholesterin, Isolierung des freien Cholesterins, das dabei entsteht und Bestimmung des isolierten freien Cholesterins. Das allgemein übliche oder Standardverfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin ist das Verfahren von Abell, et al., in the Journal of Biological Chemistry, ΒΛ 195 (1952) S. 357). Nach diesem Verfahren werden die Cholesterinester verseift durch Inkubieren mit alkoholischem Kaliumhydroxid und das freie Cholesterin wird dann mit Petroläther extrahiert. Das isolierte freie Cholesterin wird spektrophotometrisch bestimmt mit Hilfe eines modifizierten Liebermann-Burchard-Reagenz (Essigsäureanhydrid, Schwefelsäure und Essigsäure). Dieses Standardverfahren und die zahlreichen sonstigen zur Verfügung stehenden Verfahren besitzen die klinischen Nachteile, daß sie sehr komplizierte Verfahren sind, wobei zahlreiche Reagenzien angewandt werden müssen und außerordentlich zeitraubend sind.
In der DE-PS 22 24 132 ist bereits ein Verfahren und ein Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin vorgeschlagen worden, das die Bestimmung von Gesamtcholesterin mit Hilfe von Cholesterinesterase in Verbindung mit Cholesterinoxidase unter Ermittlung des Sauerstoffverbrauchs oder des gebildeten H2O2 bzw. Cholestenon betrifft'
Es hat sich nun gezeigt, daß Prüfvorrichtungen zur Bestimmung von sowohl freiem als auch Gesamtcholesterin entwickelt wt,4en können auf der Grundlage der katalysierten Abbaureaktionen von freiem Cholesterin und Cholesterinestenu Die Erfindung betrifft eine Prüfvorrichtung zur Bestimmung von Gesamtcholesterin in einer flüssigen Probe, bestehend aus einem Träger, der mit einem Reagenz versehen ist, welches
a) ein System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität,
b) ein chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivitätund
c) Mittel zur Bestimmung von mindestens einem der Reaktionsprodukte (vorzugsweise Wasserstoffperoxid), die entstehen, wenn freies Cholesterin mit dem chemischen System mit Cholesterinoxidaseaktivität in Gegenwart von Sauerstoff zusammengebracht wird,
enthält Ein besonders bevorzugtes Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid umfaßt ein Reagenzsystem, umfassend eine Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit und eine Indikatorsubstanz, die in Gegenwart von Peroxid und der Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit oxidiert wird und die dabei ihre Farbe ändert Es ist auch bevorzugt, daß ein Puffermaterial, das imstande ist, einen pH-Wert zwischen 5 und 8 aufrecht zu erhalten, wenn es mit der Flüssigkeitsprobe zusammenkommt, in dem Reagenz enthalten ist Vorzugsweise enthält das Reagenz zur Bestimmung von freiem Cholesterin auch ein oberflächenaktives Mittel, das imstande ist, das gesamte in der flüssigen Probe vorhandene freie Cholesterin löslich zu machen bzw. zu soJubilisieren.
Ein bevorzugtes chemisches System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität umfaßt das En. ym Cholesterinesterhydrolase und einen Gallenenzym-Co-Faktor dazu. Das Prüfmittel kann auch eine Substanz zur Hemmung bzw. Verhinderung des Bakterienwachstums enthalten, wie Natriumazid, um das störende Wachstum von Bakterien zu verhindern.
Das Bestimmungsverfahren von Cholesterin in einer FIpssigkeitsprobe mittels der oben beschriebenen
erfindungsgemäßen Prflfvorrichtung umfaßt das Zusammenbringen der flüssigen Probe mit der Prüfvorrichtung und die Beobachtung der auftretenden (Färb) Reaktion. Es ist bevorzugt, daß die entstehende Reaktion eine vorher bestimmte Zeit ablaufen kann, bevor die
ίο auftretende Wirkung beobachtet wird. Es ist luch bevorzugt, das Gemisch der flüssigen Probe und der Prüfvorrichtung mit einer sauren Substanz zusammenzubringen, um die Entwicklung der Indikatorreaktion zu verstärken. Halbquantitative Ergebnisse werden erhal-
ten, wenn man die entstehende colorimetrische Reaktion visuell beobachtet und die Farbreaktion mit einer Standardfarbkarte vergleicht Quantitative Ergebnisse werden erhalten, wenn man die auftretende Farbreaktion instrumenten beobachtet
Unter dem Ausdruck »Bestimmung« ist sowohl der
qualitative Nachweis als auch die halbquantitative oder
quantitative Analyse zu verstehen, soweit nicht anders
angegeben.
Das der Prüfvorrichtung zugrunde liegende Verfahren beruht zum Teil auf der Tatsache, daß bei der Reaktion von freiem Cholesterin in Gegenwart von molekularem Sauerstoff und bestimmten chemischen Systemen, die Cholesterinoxidaseaktivitat besitzen, Wasserstoffperoxid gebildet wird. Der Ausdruck »Cholesterinoxidaseaktivität« der hier verwendet wird, bezieht sich auf die Katalyse von freiem Cholesterin über eine Oxidations-Reaktion, bei der Wasserstoffperoxid als Produkt entsteht Die Reaktion zwischen derartigen chemischen Systemen und freiem Choleste-
rin und die anschließend vorzugsweise angewandten Mittel zur Bestimmung des mit Hilfe des Reagenzes gebildeten Wasserstoffperoxids, kann durch die folgenden chemischen Gleichungen angegeben werden:
_ Cholesterinoxidase- ,.,„.,. , «, ,-,
Freies Cholesterin + O2 /l4-Cholesten-3-on + H2O2,
Aktivität
H2O2 + Indikator
peroxidative Wirksamkeit
oxidierter Indikator (Farbänderung).
Selbstverständlich kann freies Cholesterin auch bestimmt werden durch Bestimmung des freigesetzten 44-Cholesten-3-ons.
Es hat sich gezeigt, daß, wenn das oben angegebene System angewandt wird zusammen mit einem chemischen System, das Cholesterinesterhydrolaseaktivität besitzt, durch die Cholesterinester in freies Cholesterin umgewandelt werden können, man ein Mittel zur Bestimmung von Gesamtcholesterin erhält Der Ausdruck »Cholesterinesterhydrolaseaktivität« bezeichnet die Katalyse von Choleterinestern zu freiem Cholesterin durch Hydrolyse. Diese Katalyse kann durch die folgende Gleichung angegeben werden:
55
Cholesterinesterhydrolase- . . „,.,.· , c „ ·· .„„_
Cholesterinester » freies Cholesterin + Fettsauren.
Aktivität
Ein chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivität kann erhalten werden durch verschiedene Verfahren und in verschiedenen Formen. Üblicherweise wird ein derartiges System erhalten durch Extraktion natürlich vorkommender Substanzen wie Mikroorganismen, die durch die Folgenden beispielhaft angegeben werden können:
Verschiedene Mycobakterien wie Mycobakterium rubrum, verschiedene Nocardia wie Nocardia crythropois und verschiedene Streptomyeesstimme.
Ein besonderes chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivitat ist das Enzym Cholesterinoxidase, das erhalten worden ist durch Extraktion von Mycobakterium rubrum nach dem Verfahren, das angegeben ist in Methods in Enzymology Bd. 1, herausgegeben von Colowick und Kaplan. Ararlemie Press (New York.
1955)S,678-8|),
Die Herstellung kann kurz folgendermaßen beschrieben werden. Nasse, gepackte Zellen von Mycobakterium rubrum werden nach einem üblichen Verfahren, zum Beispiel durch Vermählen in Sand, aufgebrochen. Das vermahlene Material wird in einem Puffer, wie einem Phosphatpuffer suspendiert und zur Entfernung der unlöslichen Substanzen zentrifugiert Der Puffer, der das lösliche Protein enthält, von dem Cholesterinoxidase ein Teil ist, wird dann behandelt, um störende niedermolekulare Substanzen, z. B, durch Dialyse zu entfernen.
Ein chemisches System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität kann ebenfalls nach verschiedenen Verfahren in zahlreichen Formen erhalten werden. Üblicherweise wird ein solches System erhalten durch Extraktion von natürlich vorkommenden Substanzen wie tierischem oder menschlichem Pancreas, Leber oder Eingeweiden bzw. Gedärmen. Handelsübliches Pancreatin ist besonders geeignet Aufgrund seiner hohen proteolytischen Aktivität muß es jedoch gereinigt werden, um eine derartige Aktivität zu entfernen, wie später näher beschrieben wird.
Gemäß der vorliegenden Erfinduirg erfolgt die Bestimmung von freiem Cholesterin vorzugsweise unter Anwendung eines Mittels zur Bestimmung des unter dem Einfluß eines chemischen Systems mit Cholesterinoxidaseaktivität gebildeten Wasserstoffperoxids: Geeignet sind hierfür alle bekannten Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid in Flüssigkeiten. Eine besonders günstige Arbeitsweise umfaßt die Anwendung eines Reagenzes, umfassend eine Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit und einen Indikator, der in Gegenwart von Peroxid und der Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit oxidiert wird und der zu einer colorimetrischen Reaktion oder Farbänderung führt
Substanzen mit peroxidativer Wirksamkeit umfassen solche natürlich vorkommenden Peroxidasen wie Meerrettich-Peroxidase und Kartoffelperoxidase. Andere Substanzen mit peroxidativer Wirksamkeit bzw. peroxioativer Aktivität umfassen bestimmte organische Substanzen wie normales ganzes Blut rote Blutzellen, lyophilisiertes ganzes Blut, Urohämin, Metalloporphyrine usw. Bestimmte anorganische Substanzen sind ebenfalls geeignet wie Jodidsalze und Molybdatsalze, Eisensulfocyanat Eisentannat, Eisenferrocyanid und Kaliumchromsuifat.
Indikatorsubstanzen der oben angegebenen Art umfassen Oxidations-Reduktions-Indikatorer, mit einem Öxidations-Reduktions-Potential, das geeignet ist Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Substanzen mit peroxidativer Wirksamkeit nachzuweisen bzw. zu bestimmen. Derartige Indikatoren umfassen o-Tolidin, Syringaldazin, Vanillinazin, die Kombination von Phenol und 4-Aminoantipyrin, 2,7-Diaminofluorin, Benzidin und Derivate von Benzidin wie o-Dianisidin.
In der erfindungsgemäßen Prüfvorrichtung ist vorzugsweise ein Puffermaterial enthalten, das im Stande ist, einen pH-Wert von vorzugsweise 5 bis 8 aufrecht zu erhalten, wenn es mit der zu untersuchenden flüssigen t,o Probe zusammenkommt, Ein solcher pH-Bereich sichert die Stabilität der Bestandteile des Reagenzes, besonders, wenn das Enzym Cholesterinoxidase angewandt wird. Der günstigste pH-Bereich für den Nachweis und die Bestimmung von Cholesterin unter Anwendung von μ Cholesterinoxidase liegt bei ungefähr 6,6. Es kann ein beliebiges Puffermaterial angewandt werden, solange es den entsprechenden pH-Bereich einstellt und die Wirksamkeit des Reagenzes zum Nachweis von Gesamtcholesterin nicht stört
Ein oberflächenaktives Mittel, das im Stande ist, im wesentlichen das gesamte in der Flüssigkeitsprobe vorhandene Cholesterin löslich zu machen, ist vorzugsweise in der Prüfvorrichtung enthalten, da freies Cholesterin in bestimmten Flüssigkeiten, wie wäßrigen Lösungen, nur gering löslich ist Wenn im Reagenz e>n GaJlen-Co-Faktor enthalten ist ist ein oberflächenaktives Mittel nicht erforderlich, da der Gallen-Co-Faktor selbst als löslich machendes Mittel wirkt So braucht bei Anwendung von Cholesterinesterhydrolase und deren Gallen-Co-Faktor kein löslich machendes Mittel für das freie Cholesterin zugesetzt zu werden, wodurch sich das Reagenz vereinfacht Oberflächenaktive Mittel, die angewandt werden können, umfassen sowohl ionische als auch nichtionische oberflächenaktive Mittel und verschiedene andere Detergenzien, die als löslich machende Mittel bekannt sind. Gallensalze sind besonders geeignet Solche oberflächenaktive Mittel, die sowohl als löslich machnde Mittel für freies Cholesterin als auch als Co-Faktoren für Cholesterinesterhydrolase geeignet sind, umfassen Chol-, Glycochol-, Taurochol- und Taurodeoxycholsäure und deren Salze. Die Natriumsalze dieser Verbindungen sind besonders geeignet.
Die Bestimmung von Gesamtcholesterin umfaßt grundsätzlich das Zusammenbringen der zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe mit einer (erfindungsgemäßen Prüfvorrichtung, wie sie oben beschrieben sind, und Beobachtung der auftretenden Reaktion. Die Reaktion ist vorzugsweise eine colorimetrische Reaktion oder eine Farbänderung, die erreicht wird durch Anwendung von Indikatormaterialien, wie sie oben beschrieben sind. Das Reagenz ist erfindungsgemäß in einem Träger eingebaut z. B. durch Imprägnieren von adsorbierenden Kissen, wobei die Prüfvorrichtung entsteht. Die Vorrichtung kann z. B. in die Flüssigkeitsprobe eingetaucht werden, um das Reagenz mit der Flüisigkeitsprobe in Berührung zu bringen.
Es ist bevorzugt, daß man die Reaktion zwischen den Bestandteilen des Prüfmittels und der flüssigen Probe eine ausreichend lange Zeit ablaufen läßt, um die Entwicklung einer ausreichenden colorimetrischen Reaktion zu fördern, die zuverlässige und empfindliche Ergebnisse liefert
Diese Inkubation kann von einer so kurzen Zeit wie ungefähr 1 Minute bis zu einer längeren Zeit, z. B. über Nacht variieren. Bei Anwendung der bevorzugten Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid beträgt die Inkubationszeit üblicherweise zwischen 0,5 bis 1 Stunde und die Inkubationstemperatur 0 bis 500C, vorzugsweise ungefähr 37° C. Es hat sich gezeigt daß ;-dch die Zugabe einer sauren Substanz, z. B. von Schwefelsäure zu der Flüssigkeitsprobe die Farbentwicklung bei Anwendung der bevorzugien Prüfvorrichtung fördert
Halbquantitative Ergebnisse werden erhalten, wenn die Reaktion visuell beobachtet und mit einer Standardfarbicarte verglichen wird, die die Reaktion bei Anwendung bekannter Konzentrationen von Cholesterin zeigt
Quantitative Ergebnisse werdet« erhalten, wenn spektrophotometrische oder Reflexionsverfahren zur Besinnung der Farbreaktion angewandt werden, die dann mit einer Standardkurve verglichen wird.
Bei der vorliegenden Erfindung umfaßt der Ausdruck »chemisches Systerrf mit einer »gewissen« enzymati-
sehen Aktivität« alle chemischen Verbindungen einzeln oder in Kombination, die die angegebene enzymatische Aktivität besitzen. Es ist nicht bekannt, ob diskrete Moleküle oder Enzyme mit der gewünschten Aktivität verbunden sind, da das Reagenz hergestellt wird aus ί Auszügen natürlich vorkommender Substanzen, wobei die Auszüge die gewünschte Aktivität besitzen. Zum Beispiel kann Cholesterinoxidaseaktivität erhalten werden aus einem Auszug des Mikroorganismus Mycobakterium rubrum, und es ist nicht bekannt, ob ein einziges in Molekül oder Enzym für die Aktivität verantwortlich ist. Die Aktivität kann bestimmte Enzym-Co-Faktoren oder komplizierte Enzymsysteme umfassen. Es ist nicht erforderlich, daß Enzyme beteiligt sind, da das System mit Cholesterinoxidaseaktivität nur eine katalytische ιϊ Aktivität besitzt und kein Reagenz darstellt, das entweder bei der Reaktion verbraucht wird oder zur Bildung eines Produktes dient. So tritt die Wirkung nur als katalytische Aktivität in Erscheinung, und bei der vorliegenden Erfindung wird daher der Ausdruck ü\ chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivität angewandt. Die gleiche Situation trifft auf die Cholesterinesterhydrolaseaktivität zu. Es ist jedoch über bestimmte chemische Systeme, die diese Aktivität besitzen, Näheres bekannt. Zum Beispiel ist bekannt. i=> daß die Enzymcholesterinesterhydrolase einen Enzym-Co-Faktor erfordert, der von der Galle stammt. Diese Galleenzym-Co-Faktoren umfassen Chol-. Glycochol-, Taurochol- und Taurodeoxycholsäurcn und ihre Salze.
Es ist erforderlich, daß, wenn das Reagenz Proteine i" wie Enzyme in dem katalytischen chemischen System umfaßt, die Prüfvorrichtung im wesentlichen frei ist von proteolytischer Aktivität, d. h. frei von Substanzen, die den Abbau von Proteinen beschleunigen. Wenn eine proteolytische Aktivität vorliegt, werden die Proteine π zerstört und dadurch ihre Teilnahme an der katalytischen Aktivität verschlechtert bzw. verhindert. Der Enzym-Co-Faktor für Cholesterinesterhydrolase schützt dieses Enzym vor einer proteolytischen Zerstörung und wirkt außerdem bei der katalytischen *n Aktivität des chemischen Systems mit Cholesterinoxidase und Peroxidase sind auf diese Weise nicht geschützt. So darf, wenn die Prüfvorrichtung diese Substanzen enthält, keine proteolytische Aktivität vorhanden sein. So erfordert die Anwendung von ■«"> extrahierter Cholesterinesterhydrolase mit solchen Proteinen wie Cholesterinoxidase und Peroxidase ein Verfahren zur Herstellung eines Auszugs enthaltend Cholesterinesterhydrolase, die im wesentlichen frei ist von proteolytischer Aktivität V1
Ein solches Verfahren besteht darin, daß man eine Substanz, enthaltend Cholesterinesterhydrolaseaktivität und eine erste wäßrige Flüssigkeit, die ein anorganisches Salz in Lösung enthalten kann, zusammengibt, die entstehende flüssige und feste Phase trennt « die flüssige Phase durch eine Säule gibt, enthaltend ein Adsorbenz, das einen adsorptionsfäb'gen Diäthyiaminoäthylanteil besitzt, und eine zweite wäßrige Flüssigkeit umfassend eine anorganische Salzlösung, durch die Säule leitet wobei die anorganische Salzlösung im Stande ist die Cholesterinesterhydrolase von der Säule zu eluieren. Es hat sich gezeigt daß bei einer geeigneten Konzentration an anorganischen Salzen, Cholesterinesterhydrolase eine größere Affinität zu Adsorbenzien mit Diäthylaminoäthylanteilen besitzt als Substanzen rr.it proteoiytiseher Aktivität Ein bevorzugtes Adsorbtionsmittel ist Diäthyiaminoäthylcellulose, obwohl der Duthylaminoäthylantei! auch an ein anderes Gerüst oder anderen Träger gebunden sein kann als Cellulose. Andere Trägerteile umfassen die verschiedenen Cellulosederivate usw.
Die erste wäßrige Flüssigkeit kann ein organisches Salz in Lösung enthalten oder nicht. Sowohl die erste als auch die zweite wäßrige Flüssigkeit enthalten möglichst einen Puffer, um einen pH-Wert für die Cholesterinesterhydrolase aufrecht zu erhalten, der sich auf deren katalytische Aktivität nicht nachteilig auswirkt. Der pH-Wert des Puffers sollte zwischen 5 und 8 liegen. Das Optimum ist bei pH 6,6. Günstig ist es, wenn das anorganische Salz selbst eine derartige Pufferfunktion ausübt. Besonders ge, gncte erste und zweite Flüssigkeiten sind Kaliumphosphatlösungen mit einer Konzentration von bis zu 0,05 m bzw. zwischen 0.15 und 1.0 m. Anorganische Salzlösungen mit einer lonenstärke entsprechend den Kaliumphosphatlösungen in den oben angegebenen Bereichen können ebenfalls die ersten und zweiten wäßrigen Flüssigkeiten ausmachen. Beispiele IUr .anorganische Saizpuffer, die angewandt werden können, umfassen Acetat-, Citrat-, Tartrat- und Phthalatpuffer. Es ist auch günstig, wenn sowohl die ersten als auch die zweiten Flüssigkeiten eine Substanz enthalten, die imstande ist, Cholesterinesterhydrolase vor proteolytischer Aktivität zu schützen, wie C'hol-, Glycochol-. Taurochol- und Taurodeoxycholsäuren und deren Salze. Ein Bakterienhemmstoff kann ebenfalls in der ersten und zweiten wäßrigen Lösung vorhanden -,ein. um störendes Bakterienwachstum zu verhindern. Ein besonders geeigneter Bakterienhemmstoff ist Natriumazid.
Flüssige Proben, die erfindungsgemäß untersucht werden können, sind vorzugsweise wäßrige Lösungen, wenn das bevorzugte Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid angewandt wird. Solche flüssigen Proben umfassen Körperflüssigkeiten wie Serum, Urin, Plasma usw. sowie andere Lösungen enthaltend freies oder Gesamtcholesterin wie sie bei Labor- oder Herstellungsverfahren auftreten.
In der erfindungsgemäßen Prüfvorrichtung ist das Reagenz in einem Träger enthalten. Geeignete Träger sind imstande, die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe zu absorbieren und umfassen saugfähiges Papier, Pappe, polymere Kissen, poröse Kunststoffe usw. Das trockene Reagenz kann in einem Träger imprägniert, der Träger kann damit überzogen, es kann chemisch an den Träger gebunden, physikalisch darin eingeschlossen sein oder es kann irgendeine Kombination davon vorliegen. Der Träger kann auch mit einem Halter oder Stützglied verbunden oder auf andere Weise daran befestigt sein.
Die erfindungsgemäße Prüfverrichtung zur Bestimmung von Gesamtcholesterin ist gegenüber den bekannten Mitteln einfach und schnell. Sie ist außerordentlich geeignet zur klinischen Anwendung durch Personen mit minimalen technischen Kenntnissen und führt zu einer Erhöhung der Anzahl von Cholesterinbestimmungen, wie sie von Ärzten gefordert wird. Es ist besonders überraschend, daß es möglich war, ein wirksames Bestimmungssystem zu entwickeln, das so komplex ist wie die Prüfvorrichtung zur Bestimmung von Gesamtcholesterin. In ihrer bevorzugten Ausführungsform umfaßt diese Prüfvorrichtung die Enzyme Cholesterinoxidase, Cholesterinesterhydrolase und Peroxidase, einen Enzym-Co-Faktor und ein Oxidaiions-Reduktions-Indikatormaterial zusammen mit einem Träger. Dieses System erfordert keine mühsame Steuerung der Versuchsbedingungen, um quantitative Ergebnisse zu liefern.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Prüfvorrichtung zur Bestimmung von Gesamtcholesterin in einer flüssigen Probe, bestehend aus einem Träger, der mit einem Reagenz versehen ist, welches
a) ein System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität,
b) ein chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivitätund
c) Mittel zur Bestimmung von mindestens einem der Reaktionsprodukte, die entstehen, wenn freies Cholesterin mit dem chemischen System mit Cholesterinoxidaseaktivität in Gegenwart von Sauerstoff zusammengebracht wird,
DE2409696A 1973-03-01 1974-02-28 Prüfvorrichtung zur Bestimmung von Cholesterin Expired DE2409696C2 (de)

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Publication Number Publication Date
DE2409696A1 DE2409696A1 (de) 1974-09-19
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JP (1) JPS502594A (de)
AR (1) AR201939A1 (de)
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CA (1) CA1138312A (de)
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GB (1) GB1463133A (de)
HU (1) HU170194B (de)
IN (1) IN139877B (de)
IT (1) IT1013052B (de)
NL (1) NL181368C (de)
NO (2) NO146557C (de)
SE (1) SE390069B (de)
ZA (1) ZA74266B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2804356A1 (de) * 1977-02-03 1978-08-10 Eastman Kodak Co Verfahren zur hydrolyse von protein-gebundenen cholesterinestern

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3898130A (en) * 1974-03-18 1975-08-05 American Hospital Supply Corp Rapid enzymatic hydrolysis of triglycerides
JPS6134800B2 (de) * 1974-03-28 1986-08-09 Boehringer Mannheim Gmbh
JPS50150496A (de) * 1974-05-22 1975-12-02
JPS5214490A (en) * 1975-07-24 1977-02-03 Ono Pharmaceut Co Ltd Composite and process for total blood cholesterol determination
US4275152A (en) * 1977-02-03 1981-06-23 Eastman Kodak Company Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters
JPS5649796Y2 (de) * 1977-09-10 1981-11-20
US4414326A (en) * 1978-04-24 1983-11-08 Goldberg Jack M Diagnostic agents
US4291121A (en) * 1979-04-13 1981-09-22 Miles Laboratories, Inc. Bilirubin-resistant determination of uric acid and cholesterol
DE2924875A1 (de) * 1979-06-20 1981-01-29 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur gewinnung von cholesterinoxidase
EP0024578B1 (de) * 1979-08-23 1983-12-07 Ivan Endre Modrovich Verfahren zur Stabilisierung einer enzymatischen Lösung zur Verwendung bei der Bestimmung des Gesamt-Cholesterols, stabilisierte Lösung und Reagenzsatz dafür
DE3021519A1 (de) * 1980-06-07 1982-01-07 Schloemann-Siemag AG, 4000 Düsseldorf Anordnung eines fahrantriebes an einem schmiedemanipulator
US4409326A (en) * 1980-07-10 1983-10-11 Modrovich Ivan Endre Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum
JPS5783287A (en) * 1980-11-14 1982-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Elimination of hydrogen peroxide
DE3122917A1 (de) * 1981-06-10 1983-02-24 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Waessrige cholesterin-standardloesung und verfahren zu ihrer herstellung
US4361648A (en) * 1981-08-13 1982-11-30 Miles Laboratories, Inc. Color fixed chromogenic analytical element
DE3249743C2 (de) * 1982-02-18 1990-10-04 Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Nagoya, Aichi, Jp
DE3208253A1 (de) * 1982-03-08 1983-09-15 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur spezifischen bestimmung des cholesterins der ldl-fraktion im serum
US5047327A (en) * 1982-04-02 1991-09-10 Ivan E. Modrovich Time-stable liquid cholesterol assay compositions
US4680259A (en) * 1984-09-26 1987-07-14 Eastman Kodak Company Analytical element and method for colorimetric determination of total cholesterol
US5387431A (en) * 1991-10-25 1995-02-07 Fuisz Technologies Ltd. Saccharide-based matrix
US5456932A (en) * 1987-04-20 1995-10-10 Fuisz Technologies Ltd. Method of converting a feedstock to a shearform product and product thereof
US5171688A (en) * 1988-08-30 1992-12-15 Cholestech Corporation Self-corrected assay device
US5156954A (en) * 1989-03-08 1992-10-20 Cholestech Corporation Assay device and method using a signal-modulating compound
ATE141335T1 (de) * 1989-01-13 1996-08-15 Robert Q Maines Verfahren zur bestimmung des cholesterins, zum nachweis von gefässkrankheiten und zur anhebung des anteils an hdl-cholesterin
US5114350A (en) * 1989-03-08 1992-05-19 Cholestech Corporation Controlled-volume assay apparatus
US5340539A (en) * 1989-03-16 1994-08-23 Chemtrak, Inc. Non-instrumented cholesterol assay
US5087556A (en) * 1989-05-17 1992-02-11 Actimed Laboratories, Inc. Method for quantitative analysis of body fluid constituents
US5206148A (en) * 1989-07-24 1993-04-27 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method for assaying aliphatic alcohol, aliphatic aldehyde or ω-carboxylic acid derivatives thereof
US5238816A (en) * 1989-07-24 1993-08-24 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Omega carboxyalcohol oxidase enzyme
US5110724A (en) * 1990-04-02 1992-05-05 Cholestech Corporation Multi-analyte assay device
US5166051A (en) * 1990-08-08 1992-11-24 Genesis Labs, Inc. Membranes, membrane overlays for exclusion of erythrocytes, and method for immunoassay of whole blood analytes
SE9003496D0 (sv) * 1990-11-02 1990-11-02 Eka Nobel Ab Analysmetod
JPH0495557U (de) * 1991-01-10 1992-08-19
AU653040B2 (en) * 1991-05-17 1994-09-15 Fuisz Technologies Ltd. New thermoplastic polymeric material and process for making same
DE69220871T2 (de) 1991-10-03 1997-11-20 Bayer Ag Vorrichtung und Verfahren zur Auftrennung und Analyse von Vollblut
US5576042A (en) * 1991-10-25 1996-11-19 Fuisz Technologies Ltd. High intensity particulate polysaccharide based liquids
CA2125579C (en) * 1991-12-17 2005-06-21 Richard C. Fuisz Ulcer prevention treatment composition and method
AU666821B2 (en) * 1993-08-05 1996-02-22 Bayer Corporation Analyte detection device and process
US5346377A (en) * 1993-10-07 1994-09-13 Fuisz Technologies Ltd. Apparatus for flash flow processing having feed rate control
US5445769A (en) * 1994-06-27 1995-08-29 Fuisz Technologies Ltd. Spinner head for flash flow processing
US5582855A (en) * 1994-07-01 1996-12-10 Fuisz Technologies Ltd. Flash flow formed solloid delivery systems
US5556652A (en) * 1994-08-05 1996-09-17 Fuisz Technologies Ltd. Comestibles containing stabilized highly odorous flavor component delivery systems
US5587198A (en) * 1995-05-31 1996-12-24 Fuisz Technologies Ltd. Positive hydration method of preparing confectionery and product therefrom
ATE309544T1 (de) * 2002-04-09 2005-11-15 Cholestech Corp Verfahren und vorrichtung zur quantifizierung von lipoprotein-cholesterol hoher dichte
DE602008002825D1 (de) * 2007-01-09 2010-11-11 Cholestech Corp Vorrichtung und verfahren zur messung des ldl-assoziierten cholesterols
ES2532006T3 (es) * 2009-11-20 2015-03-23 Pharnext Nuevas herramientas de diagnóstico para la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth
CN110066850B (zh) * 2019-04-29 2022-11-15 中国石油大学(华东) 一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE173761C1 (de) * 1956-11-07 1960-12-20
US3092465A (en) * 1960-03-25 1963-06-04 Miles Lab Diagnostic test device for blood sugar
US3183173A (en) * 1963-06-10 1965-05-11 Miles Lab Test composition for detecting hydrogen peroxide
US3607093A (en) * 1968-02-15 1971-09-21 Schering Corp Devices for testing biological liquids
FR2047147A5 (de) * 1969-05-06 1971-03-12 Kyowa Hakko Kogyo Kk
DE2264847C2 (de) * 1972-05-17 1978-11-30 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin
AR195000A1 (es) * 1972-05-17 1973-08-30 Boehringer Mannheim Gmbh Procedimiento para la determinacion de colesterol

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2804356A1 (de) * 1977-02-03 1978-08-10 Eastman Kodak Co Verfahren zur hydrolyse von protein-gebundenen cholesterinestern

Also Published As

Publication number Publication date
NL7401974A (de) 1974-09-03
FR2220062B1 (de) 1979-06-15
ES437270A1 (es) 1977-02-01
IN139877B (de) 1976-08-14
BG26959A3 (de) 1979-07-12
US4186251A (en) 1980-01-29
AU6456674A (en) 1975-07-17
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DE2409696A1 (de) 1974-09-19
ES423559A1 (es) 1976-11-01
AR201939A1 (es) 1975-04-30
JPS502594A (de) 1975-01-11
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NO740693L (no) 1974-09-03
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NL181368C (nl) 1987-08-03
ZA74266B (en) 1974-11-27
CS176267B2 (de) 1977-06-30
CH589852A5 (de) 1977-07-15

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