DE2431450A1 - Verfahren zur in vitro-fortpflanzung und in vitro-erhaltung von zellen - Google Patents
Verfahren zur in vitro-fortpflanzung und in vitro-erhaltung von zellenInfo
- Publication number
- DE2431450A1 DE2431450A1 DE2431450A DE2431450A DE2431450A1 DE 2431450 A1 DE2431450 A1 DE 2431450A1 DE 2431450 A DE2431450 A DE 2431450A DE 2431450 A DE2431450 A DE 2431450A DE 2431450 A1 DE2431450 A1 DE 2431450A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- oxygen
- cell
- membrane
- hollow fiber
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/16—Hollow fibers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/10—Hollow fibers or tubes
Description
MONSANTO COMPANY
St.- Louis, Missouri 63166 /USA
St.- Louis, Missouri 63166 /USA
Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung und in vitro-Erhaltung
von Zellen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung
und/oder in vitro-Erhaltung von Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Fortpflanzung von Zellen auf der Oberfläche einer
Hohlfasermembrane.
Hohlfasermembrane.
Die Kultivierung von in vitro-Wirbeltierzellen, d.h.
die Kultivierung losgelöst vom Wirtstier, ist seit langem bekannt. Es wird im allgemeinen angenommen,
daß die erste derartige Kultivierung in der ersten Dekade dieses Jahrhunderts durchgeführt wurde. Sie beinhaltete
das Wachsen von infektiösen Kaninchen-Lympho-
bufhe
Telegramme: BERGSTAPFPATENT Manchen TELEX: 0524560 BERG d
-2-
Banken: Bayerische Vereinsbank München 453100
Hypo-Bank Manchen 3892623
Postscheck München 65343-80»
409884/1334
2A3H50
sarcom-Zellen im Blut.
Trotz langer Erfahrung hat diese Technik erst in den letzten Jahren Bedeutung gewonnen. Diese Bedeutung ist
hauptsächlich bedingt durch den Bedarf an vielen Arten von WirbeltierzeIlen für die humanmediζinisehe und
tiermedizinische Forschung und Diagnose, durch die Kultivierung von infektiösen Materialien, wie Viren, und
durch die Produktion von Hormonen und anderen biologischen Produkten. Gegenwärtig ist der Bedarf an Säugetierzellen
besonders hoch, insbesondere an normalen Säugetierzellen, die zur Züchtung an einer Oberfläche
gebunden werden müssen im Gegensatz zur Züchtung in einer Suspensionskultur.
Zahlreiche Prozeduren sind zur Fortpflanzung und/oder Erhaltung von gebundenen in vitro-Zellen entwickelt
worden. Das vielleicht erfolgreichste aller dieser Verfahren beinhaltet das Binden und Züchten von Zellen
an der inneren Oberfläche von Glas- und Kunststoffröhren und von Flaschen.
Ein anderes erfolgreiches Verfahren besteht dain, daß die Zellen auf der ebenen Fläche von zweckmäßig ausgebildeten
feststehenden Flaschen gebunden und gezüchtet werden. Viele Arten von Zellen sind auf diese und andere
Weise gezüchtet worden, wobei die Methoden am erfolgreichsten sind, bei denen abnormale oder veränderte
Zellen erhalten werden, d.h. Zellen, die eine abnorme oder verschiedene Anzahl von Chromosomen gegenüber nor-
409884/1334
malen Zellen der gleichen Species besitzen und die die Fähigkeit haben, sich unbestimmbar oft zu regenerieren.
Diese und andere bisherige Verfahren haben jedoch verschiedene ernsthafte Nachteile, insbesondere bei der
Produktion von normalen, unveränderten Säugetierzellen im technischen Maßstab. Normale Zellen besitzen zum
Unterschied zu abnormalen Zellen die normale Anzahl an Chromosomen und regenerieren sich vor der Alterung oder
dem Tod nur in einer verhältnismäßig vorhersagbaren Anzahl von Fällen.
Der Hauptnachteil der bisherigen Verfahren bei der Fortpflanzung von normalen Säugetierzellen ergibt sich aus
der Tatsache, daß es mit solchen Methoden schwierig ist, aerobe Bedingungen zu schaffen.
Anders ausgedrückt, wenn nicht genügend Sauerstoff an die normalen Zellen herangebracht wLrä , behalten die
Zellen nicht ihre normale, differentierte Funktion. Ein weiterer Nachteil der bisherigen Verfahren zur Fortpflanzung
von gebundenen Zellen - ob normalen oder abnormalen - besteht darin, daß es schwierig ist, bindegewebeähnliche
Dichten auf der Züchtungsoberfläche zu erreichen aufgrund der Probleme, die zu der Nährstoffdiffusion
innerhalb des Bindegewebes gehören. Ferner lassen sich die bisherigen Verfahren nicht leicht in
den technischen Maßstab übertragen und eignen sich daher nicht dazu, Zellen in großen Mengen wirtschaftlich zu
produzieren. Von anderer Seite ist kürzlich eine Prozudur veröffentlicht worden, die Hohlfasern für die Zellen-
40988 4-/1334 -4-
kultivierung verwendet (Science (1972) Seite 65 - 67). Die dort beschriebenen Bedingungen sind aber nicht
solche, um aerobes Züchten zu erreichen. Die Veröffentlichung beschreibt die Verwendung eines Nährmediums
als Sauerstoffträger. Bei der beschriebenen Fließgeschwindigkeit von 5 mm/Min, und einer Sauerstofflöslichkeit
in einem solchen Medium, die mit 3 Mikrogramm/ml veranschlag wird, ist die SauerstoffVersorgung für die
erhaltene Zellenkultur von 2,17 χ IO Zellen unzu
—15 reichend. Das schaffen nur 7 χ 10 g Sauerstoff/Min./
Zelle. Der Sauerstoffbedarf der aeroben Zellen liegt im allgemeinen im Bereich von 2,8 χ ίο" bis 2,6 χ 10
g Sauerstoff/Min./Zelle. Daher beschafft das beschriebene Verfahren nur etwa 1/4 bis 1/14 des Sauerstoffbe
darfes der produzierten Zellen, abhängig von dem jeweiligen Sauerstoffbedarf der verwendeten Zellen. Obwohl
hierdurch etwas aerobes Wachstum während der Anfangswachstumsstufen oder im Anfangskontaktteil des Reaktors
erreicht werden könnte, so ist das in Wirklichkeit doch kein Zeichen für das Erreichen von aerobem Wachstum;
denn es ist bereits lange bekannt gewesen, nach anderen Verfahren eine begrenzte Anzahl von Zellen unter aeroben
Bedingungen zu kultivieren.
Es ist nun mit der vorliegenden Erfindung gefunden worden,
daß Zellen durch aseptisch gebundene Zellen an einer Wand einer Sauerstoff-durchlässigen Hohlfasermembrane
und durch Inberührungbringen der entgegenge-
- 4a -
409884/1334
setzten Wand der Hohlfasermembrane mit einem Sauerstoffträger fortgepflanzt werden, wobei der Sauerstoff veranlaßt
wird, durch die Membrane zu dringen und ihn mit
409884/1334
243K50
den gebundenen Zellen unter aeroben Bedingungen in Berührung
zu bringen, während gleichzeitig die gebundenen Zellen in einem Zellenkulturnährmedium gehalten werden.
Indem Sauerstoff durch die Membrane von der Seite, die der entgegengesetzt ist, an der Zellen gebunden sind,
durchgeht, ermöglicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine kontinuierliche und gewünschtenfalls
gleichmäßige Sauerstoffzufuhr, um die Zellen zu erreichen und zu versorgen, wobei aerobe Fortpflanzung der Zellen
in der gewünschten Gewebedichte erleichtert wird. Der Sauerstoff für aerobes Wachstum wird zweckmäßig zugeführt,
indem ein gasförmiger Träger verwendet wird, der in ausreichender Menge Sauerstoff enthält, um den Bedarf
daran zu decken.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen aseptisch an eine Wand oder (äußere
oder innere) Oberfläche der Hohlfasermembrane gebunden, indem die Zellen, die in einem Zellenkulturmedium suspendiert
sind, mit der gewünschten Membranwand in Berührung gebracht werden.Für die Zwecke des Bindens ist das
"Zellenkulturmedium11 typischerweise ein Nährmedium für die Zellen, jedoch kann auch ein Medium, das kein Nährmedium,
aber physiologisch verträglich ist, wie physiologische Salzlösung, gewünschtenfalls verwendet werden.
Nach dem Binden (und gewünschtenfalls während des Bindens) wird Sauerstoff den Zellen zugeführt, indem die entgegengesetzte
Seite der Membrane mit einem Sauerstoffträger
409884/ 1 334
-*" 2A3U50
in Berührung gebracht wird. Gleichzeitig werden die Zellen in einem Zellenkultur-Nährmedium inkubiert.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen an die äußere Wand der Hohlfasermembrane gebunden, die
vorzugsweise an beiden Enden offen ist. Hierdurch ist es möglich, kontinuierlich den Strom eines Sauerstoffträgers
durch den Hohlkern der Faser zu leiten. Der kontinuierliche Durchgang des Sauerstoffträgers durch
den Kern einer kontinuierlichen Hohlfaser kann durchgeführt werden, indem der Sauerstoffträger durch die
Faser in gleichmäßigen Mengen geleitet wird oder indem der Sauerstoffträger durch die Faser pulsiert.
Pulsieren wird bevorzugt, um eine optimale Verteilung des Sauerstoffs an allen Zellen zu erhalten und die
Kanalisierung des Sauerstoffes zu vermindern. Alternativ kann die kontinuierliche Hohlfaser an einem
Ende geschlossen sein. Bei dieser Prozedur wird der Sauerstoffträger in den Kern der Faser geleitet und
Sauerstoff diffundiert durch die Wand und wird auf diese Weise mit den Zellen in Berührung gebracht. Eine Prozedur
und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens wird im Fließdiagramm der Zeichnung veranschaulicht.
Nach der Zeichnung besteht der Reaktor 1 aus einem Behälter 2, der viele Hohlfasern 3 enthält, die
longitudinal in der Kammer angeordnet sind, mit oberen Enden 4, die in die Kammer 5, die sich oberhalb der
Dichtung 9 befinden, hineinreichen. Das Nährmedium wird
- 7 A09884/1334
243U50
aus dem Vorratsbehälter 10 durch Pumpe 11 zum Reaktor bei Einlaß 12 in den Behälter 2 außerhalb der Fasern
gepumpt und Jann aus dem Behälter durch Auslaß 13 entfernt werden und Pumpe 14 kann mit einer Fließgeschwindigkeit
arbeiten, die niedriger ist als die der Pumpe 11, so daß weniger Medium durch den Auslaß 13 entfernt
wird als durch den Einlaß 12 eintritt, was dazu führt, daß durch die Faserwand der Überschuß eindringt und
durch die Hohlfaser fließt. Der Reaktor wird mit Sauerstoff versorgt, indem Luft vom Zylinder 16, der Luft
und 3 % Kohlendioxyd enthält, durch Pumpe 17 und Leitung 18 zur Kammer 5 des Behälters 2 gepumpt wird, so
daß die Luft an den offenen Enden 4 der Hohlfasern eintritt. Ein Pulsator 19 ist mit Leitung 18 verbunden.
Der Pulsator 19 besteht aus einer Kammer 20, die ein Diaphragma 21 enthält, das die oberen und unteren Teile
der Kammer voneinander trennt und Luftbewegung zwischen ihnen verhindert. Der obere Teil des Pulsators ist mit
einem Ventil 22 verbunden, das so angeordnet sein kann, daß Zutritt zum Vakuum oder zu einer Luftdruckquelle
geschaffen wird, und das durch ein Solenoid elektrisch mit einem Zähler 23 verbunden ist. Wenn das Ventil 22
zur Luftquelle hin geöffnet wird, wird das Diaphragma abwärts ausgedehnt, um im wesentlichen den unteren Teil
der Kammer 2O zu füllen, um eine Luftquelle zu schaffen, die in die Kammer 5 eintritt und durch die Hohlfasern
fließt. Die Kammer 20 und das Diaphragma 19 sind vor-
409884/1334
243H50 3
zugsweise so ausgelegt, daß ein ausreichendes Volumen in der Welle ist, um leicht das innere Gesamtvolumen
der Hohlfasern in den Reaktoren zu überschreiten, so daß die Luftwelle im wesentlichen alle Materialien aus
den Kernen der Fasern entfernen kann. Das Diaphragma kann aus Kautschuk oder anderem geeigneten Material
hergestellt sein. Die Luft und das andere Material verläßt die Fasern durch ihre unteren Enden 7 und Kammer
8 über Leitung 24, um den Kessel 25 zum überlaufen zu bringen. Da die Flüssigkeit in die Faser durch Diffusion
oder weil mehr Flüssigkeit in den Reaktor gepumpt wurde als durch den Ausschluß 13 entfernt wurde,eingedrungen
sein kann, wird Flüssigkeit im allgemeinen entfernt und über Leitung 24 geschickt, um Kessel 25 zum
Überlaufen zu bringen. Leitung 24 ist auch durch das
Ventil 26 mit dem Zylinder 16 verbunden, aber hiermit wird nur der Zweck verfolgt, den Zylinder als Sauerstoff
quelle zur Kalibrierung zu verwenden, und Ventil 26 ist normalerweise geschlossen. Der überlaufkessel
ist mit einem Vorratsbehälter 27 verbunden und mit Instrumenten 28 und 29 versehen, um pH- und Sauerstoffmessungen
an den Instrumenten 30 und 31 vorzunehmen. Der Reaktor ist mit Mitteln zur Temperaturkontrolle
durch Kontrolleinrichtung 32 verbunden. Der Kühler 33 schafft Kühlung für die Komponenten IO, 15 und 27.
Die beschriebene Vorrichtung kann beispielsweise mit einer 5 ml/Min. Luftfließgeschwihdigkeit arbeiten und
mit einem Einlaß von flüssigem Medium von 0,4 ml/Min.
409884/1334 - 9 -
Αθ
und einem Auslaß durch Auslaß 13 von 0,1 ml/Min. Diese verlassen 0,3 ml/Min, flüssiges Medium, um in die Fasern
einzudringen, und 5 ml/Min. Gase gehen ab. Außer durch die Dichtungen 6 und 9 werden die Fasern gegeneinander
in der Nähe ihrer Enden durch eine harzartige Verbindung verschlossen, um Materialbewegung aus den Zwischenräumen
der Fasern in die Kammern 5 und 8 zu verhindern. Die Teile der Vorrichtung können natürlich in ihrer
Größe schwanken. Ein Reaktor von einer Gesamtlänge von 25 cm mit einer Faserlänge von etwa 20 cm kann jedoch
verwendet werden, wobei etwa 15 cm der Faser für Zellenwachstum zur Verfügung stehen. Ein derartiger Reaktor
kann einen Gesamtdurchmesser von etwa 5 cm haben mit einem Behälter 2, der einen Außendurchmesser von 2,38
cm und einen inneren Durchmesser von 1,9 cm aufweist. Der Behälter kann etwa 1000 Fasern von 360 Mikrometer
Außendurchmesser und 200 Mikrometer Innendurchmesser für ein wirksames Hohlkern-Gesamtvolumen von etwa 6,3 ml
enthalten. Der Pulsator 19 hat ein Innenvolumen von etwa 28 ml und das Diaphragma kann etwa 8 ml des unteren
Teiles der Kammer verdrängen, so daß die Welle geeignet ist, um die Fasern leer zu fegen. Die Welle ergibt einen
Differentialdruck von 0,21 - 0,35 kg/cm . Der Puls kann bei verschiedenen Frequenzen arbeiten, beispielsweise
in einem Zyklus von 10 Sek. bei Vakuum und von 10 Sek. bei Luftdruck mit Wiederholung des Zyklus. Der
Zyklus kann gewünschtenfalls variiert werden unter Verwendung einer verschiedenen Dauer für die Luftdruck-
409884/1334 -lo-
243K50 AA
und Vakuumphasen des Pulsators und der Pulsator kann auch arbeiten, um irreguläre Luftwellen eher als reguläre
Zyklen zu schaffen. Die Welle kann auch verschiedene Formen aufweisen, beispielsweise einen kurzen starken
Anstieg beim Druck, an dem sich ein langsamer Abfall anschließt, oder einen regulären gemäßigten Anstieg
mit gemäßigtem Abfall usw. ohne Wellencharakteristiken usw.. Es ist nicht erforderlich, einen Flußabfall auf
0 zwischen den Wellen zu haben, obwohl das zu akzeptablen Ergebnissen führt. Tatsächlich kann der Fluß sogar
gewünschtenfalls bei einigen Stufen der Pulsierung umgekehrt sein. Der Reaktor kann bei verschiedenen Geschwindigkeiten
usw. arbeiten, aber beispielhafte Geschwindigkeiten sind 5 ml/Min. Luftfluß und 0,4 ml/Min. Flüssigkeitseinlaß und Q,3 ml Flüssigkeit,
die in die Fasern eindringt und an deren Enden abgeht.
Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger geeigneter Sauerstoffträger verwendet werden.
Im allgemeinen ist Luft der bevorzugte Sauerstoffträger,
jedoch können auch Träger, die gelösten Sauerstoff, wie Silikonpolymerisate, Hämoglobin, Fluorkohlenwasserstoffe
und mit Sauerstoff beladenes Nährmedium mit den gewünschten Resultaten verwendet werden, obgleich spezielle
Prozeduren oder Bedingungen dann erforderlich sein können, um den Sauerstoffbedarf zu befriedigen, um aerobes
Wachstum zu erhalten. Wenn Luft oder andere geeigne-
40988W1334 ~n~
243H50
te Gasgemische von Stickstoff und Sauerstoff verwendet werden, ist auch bevorzugt, daß das Gas kleine Mengen
an Kohlendioxyd, beispielsweise in der Größenordnung von 2 - 5 % enthält. Das Kohlendioxyd dient dazu, um
einen Carbonatpuffer zu schaffen und trägt damit zur Aufrechterhaltung des pH des Mediums auf der anderen
Seite der Membrane im gewünschten Bereich bei. Die Zellen werden in einem Zellkulturnährmedium unter
Zellwachstums-Erhaltungs-Bedingungen von pH und Temperatur inkubiert. Geeignete Zellenkulturnährmedien sind
bekannt und solche können bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Kulturnährmedien
enthalten typischerweise die bekannten essentiellen Aminosäuren, Vitamine, Kohlenhydrate, Mineralsäuren
und vorzugsweise Blutserum. Fungizide und Bakterizide können auch in gewünschten Mengen in solchen Medien eingeschlossen
sein, um das Wachstum von unerwünschten Mikroorganismen zu verhindern. Wie oben angegeben,wird
der pH des Nährraediums vorteilhaft innerhalb des gewünschten Bereiches (typischerweise von 6,8 - 8,2) kontrolliert,
indem geringe Mengen von Kohlendioxyd im Sauerstoffträger enthalten sind.
Gewünschtenfalls kann aber der pH kontrolliert werden, indem ein geeigneter Puffer, wie "HEPES"-Puffer (ein
Gemisch von N-2-Hydroxyäthyl-piperazin und N'-2-Äthansulfonsäure)
im Zellenkulturnährmedium selbst enthalten ist. Andere geeignete Methoden zur Kontrolle des pH, wie
- 12 40988A/1334
Durchgehen des Mediums durch Ionenaustauscherharze können auch angewandt werden.
Die Wahl der Temperatur für die Inkubierung der Zelle bleibt dem Fachmann auf dem Gebiet der Zellen- und
Bindegewebekultivierung überlassen und hängt grundsätzlich von der physiologischen Temperatur der jeweiligen
Zellen ab, die fortzupflanzen sind, das ist die optimale Temperatur, bei der Wachstum oder Erhaltung der
Zellen stattfindet. Wenn beispielsweise normale Säugetierzellen fortgepflanzt werden,wird typischerweise
ein enger Temperaturbereich von etwa 35 - 4O°C verwendet, während beispielsweise ursprünglich niedrigere
oder höhere Temperaturen verwendet werden können, falls die Zellen Reptilienzellen sind.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet Hohlfasermembrane. Die Hohlfasermembrane können in
beliebiger Form verwendet werden, wie beispielsweise als Bündel, in einzelnen Strängen oder in Maschenform.
Die Hohlfaser muß natürlich gasdurchlässig sein, aber undurchlässig für Zellen. Die Membrane kann eine dichte
Struktur haben oder eine "Loeb"-Struktur. Die Hohlfaser kann aus einem beliebigen geeigneten Material
hergestellt werden, das nicht für die Zellen toxisch ist, das in geeigneter Weise zu Fasern versponnen werden
kann und das ermöglicht, daß sich Zellen daran binden. Beispiele derartiger Materialien sind Polyolefine,
wie
/^Polyacrylnitril und Polystyrol, polyionische Polymerisa-
/^Polyacrylnitril und Polystyrol, polyionische Polymerisa-
- 13 -
40988A/1334
2A3H50
te, Polykohlenhydrate, wie Cellulose und Cellulosederivate,
beispielsweise Celluloseester, Polypeptide, wie Collagen, Silikonkautschukpolymerisate, Fluorkohlenwasserstoffpolymerisate
usw. Es ist gefunden worden, daß Zellbildung an der Oberfläche der Membrane gefördert
wird, wenn die Membrane eine erhöhte Oberflächenenergie besitzt, wie es durch die Anwesenheit von positiven
oder negativen Ladungen evident wird. Das Binden von Zellen an eine andere geeignete Membrane kann gefördert
werden, indem die Oberfläche, an die die Zellen gebunden werden sollen, mit Collagen überzogen wird.
Die optimalen Dimensionen für die Hohlfasern können schwanken und sind unter anderem von der Vorrichtung
und von dem verwendeten Sauerstoffträger abhängig. Im allgemeinen liegt der Innendurchmesser der Hohlfaser
im Bereich von etwa 10 - 300 Mikron, vorzugsweise im Bereich von 50 - 100 Mikron. Die Membranwand muß natürlich
ausreichend dünn sein, um den gewünschten Durchgang zu ermöglichen und ausreichend dick sein, um nicht
unter den angewandten Bedingungen zu zerbrechen. Geeignete Membrane haben typischerweise eine effektive
Wandstärke von etwa 10 bis 100 Mikron.
Geeignete Zellen zur Fortpflanzung gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sind Bindegewebszellen von
Wirbeltieren, die imstande sind, sich an einer Oberfläche zu binden, zu wachsen oder zu erhalten. Natürlich
können Zellen, die nicht zur Proliferation fähig sind,
- 14 -
409884/1334
243H50
wie Erythrocytes beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht
verwendet werden. Beispiele von geeigneten Zellen sind diploide Zellquerschnitte, wie Wl-38 menschliche Lungenfibroblaste,
MRC-5 männliche menschliche Lungenfötus-Fibroblaste und DBS-FRh L-2 Rhesusaffen-Lungenfötus-Fibroblsste;
primäre Zellen, wie Rinder- und menschliche Vorderhypophysenzellen, Huhnerembryo, Froschepithelzellen
und RattenleberzeIlen, gebildete Zellquerschnitte, wie
"Heia"-menschliche Cervix (Carzinom)Zellen, Rhesusaffennierenzellen
(LLC-MK2), Baby-Nierenzellen vom syrischen
Hamster (BHK-21) usw..
Es ist davon auszugehen, daß die obige Aufstellung von Zellen nur zur Veranschaulichung dient und daß andere
Zellen aus anderen Quellen, einschließlich Vögel, Säugetiere, Reptilien und Amphibien einschließlich normale
und abnormale Zellen nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung fortgepflanzt und erhalten werden können.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wurde die Herstellung der Zellen, die
Herstellung des Inoculums und die Zellenkultivierungsversuche unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Eine Kalbshypophyse, die durch Sektion eines frisch geschlachteten Tieres erhalten wurde, wurde annähernd
4 Stunden in einem Phosphat-gepufferten Salzmedium (PBS)
- 15 -
4 09884/1334
gelagert, das folgende Zusammensetzung hatte:
NaCl | 8,0 | g | g | g |
KCl | 0,2 | g | g | |
Na2HPO4 | 1,15 | g | ||
CaCl2 | 0,1 | 000 Internationale Einheiten | ||
KH2PO4 | 0,2 | g | ||
MgCl2 x 6 H2O | 0,1 | |||
Penicillin | 100 | |||
Streptomycin | 0,1 |
destilliertes Wasser 900 ml
Die Temperatur des Mediums während der Lagerung betrug etwa 25°C. Das Vorderteil wurde von der Drüse seziert,
gereinigt, um das Bindegewebe zu entfernen, und zerstückelt. Die zerstückelte Vorderdrüse wurde vorsichtig
mit einer wässrigen Lösung von Trypsin in einer Petrischale gemischt und das erhaltene Gemisch wurde 18 Stunden
bei Zimmertemperatur unter sterilen Bedingungen stehengelassen, um die Freigabe von einzelnen Zellen
an die Flüssigkeit zu erreichen. Die wässrige Trypsinlösung wurde hergestellt, indem 10 ml PGS mit 250 000
Einheiten von getrocknetem, pulverförmigem Trypsinenzym, das unter der Bezeichnung "Tryptar" von der Fa. Armour
und Co., Chicago, Illinois geliefert wird, und 0,75 ml 0,5 η Natronlauge gemischt werden. Die freigegebenen
Hypophysezellen (Epithelzellen) wurden von dem übrigen
Bindegewebe durch wiederholtes Zentrifugieren, Filtrieren und Waschen abgetrennt. Es wurde durch Zeilenzahlen
- 16 409884/1334
(mit Hilfe eines Hämocytometers) festgestellt, daß die
erhaltene gewaschene Zellensuspension 1,37 χ 10 Zellen
pro ml enthielt.
Herstellung des Inoculums
Herstellung des Inoculums
Um das Inoculum herzustellen, wurden 30 ml der gewaschenen Zellensuspension auf 100 ml mit "Eagle^"-Basalmedium
(EBM), das 10 % Kalbfötusserum enthielt, verdünnt. Die Zusammensetzung von 90 % "Eagle1s"-Basalmedlum (EBM1Q)
und 10 % Kalbfötus (Kalbfötus,o) war folgende:
mg/1
1-Argininchlorhydrat 105
1-Cystin 24
1-Histidinmonohydrochlorhydrat 31
1-Isoleucin 52
1-Lysinchlorhydrat 58
1-Leucin 52
1-Methiomin 15
1-Phenylalanin . 32
1-Threonin 48
1-Tryptophan 10
1-Tyrosin 36
1-Valin 46
Cholinchlorid 1,00
Folinsäure 1,00
Isoinositol 1,00
Nicotinamid 1,00
Pantothensäure 1,00
- 17 -
409884/1334
- iff -
Pyridoxal Thiamin Riboflavin NaCl
KCl
NaH3PO4 χ 2H2O
NaHCO3
CaCl2
MgCl2
Glukose 1-Glutamin Phenolharnstoff
Penicillin
mg/l 1,00 1,00 0,10 6800
400
150 2000 200
200 1000
212 20 50
50 000 Internationale Einheiten
Reaktor
Die Kultivierung der Zellen wurde unter Verwendung eines
Zellenkulturreaktorg, der aus einem Bündel von 100 U-förmigen Polymerisat-Hohlfasern mit offenen Enden bestand,
in einem 10 ml Glaskolben durchgeführt. Die beiden Enden der Faserbündel sind in separate Löcher eines
3-löchigen Kautschukhalters eingepaßt, wobei der Halter am Kolbenhals gelegen ist. Das dritte Loch des Halters
ist für die Einleitung und Extraktion des Mediums vorgesehen. Das Hohlfasermaterial ist ein handelsübliches
polyionisches, Polymerisatmaterial, das unter der Be-
- 18 409884/1334
"*~ 243Η50
zeichnung "Amicon X Μ-50" von der Fa. Amicon Corp.,
Lexington, Massachusetts geliefert wird. Jede Faser
ist 10 cm lang und hat etwa 1/2 cm Zellenwachstumsoberfläche. Jede Faser hat einen Innendurchmesser von
36Ο Mikron und eine Wandstärke von 80 Mikron, wobei die Wand eine "Loeb"-Ausbildung hat.
Zellenkultivierung
Der Reaktor wurde unter Verwendung von ß-Propionlacton-Dämpfen
sterilisiert und anschließend mit Phosphatpuffer gespült. 8 ml oben hergestelltes Inoculum wurde in den
Reaktor eingeleitet, um Zellen an die Außenwände der Fasern zu binden. Der Reaktor wurde in einen ummantelten
Kohlendioxyd-Inkubator gestellt und der Inhalt wurde bei 37°C 49 Tage inkubiert. Während der 49-tägigen
Inkubationszeit wurde ein gefiltertes Luftgemisch mit 3 % Kohlendioxyd durch das Innere der Hohlfasern (mit
einer Luftpumpe) gepumpt. Während der Inkubation wurde das Medium in 2-tägigen Intervallen gewechselt. Das abgezogene
Medium wurde gesammelt und für die Analyse zurückbehalten. Nach Vervollständigung der Inkubationszeit
wurde das Medium aus dem Reaktor abgezogen und ein starkes zusammenfließendes Wachstum der Zellen wurde
auf den Hohlfasern beobachtet.. Die Zellen wurden anschließend für die mikroskopische Untersuchung durch
Formaldehydfixierung und Aufbringen auf die Fasern präpariert. Es wurde durch mikroskopische Untersuchung festgestellt,
daß die Zellen normal waren. Die zurückbehal-
- 19 409884/1334
tenen Medien wurden auf Milchsäure und Wachstumshormon analysiert. Die Analyse zeigte, daß die zurückbehaltenen
Gesamtmedien 7OO Nanograram Wachstumshormon enthielten und daß die Medien im wesentlichen frei von Milchsäure
waren. Die wesentliche Abwesenheit von Milchsäure zeigt an, daß das Zellwachstum unter aeroben Bedingungen erreicht
wurde.
Zur Kontrolle wurden 10 ml des oben hergestellten Zellen-Inoculum-Mediums
in jeweils 2 "T"-Kolben gestellt und das Medium wurde in dem ummantelten Kohlendioxyd-Reaktor
49 Tage bei 37°C inkubiert (gleichzeitig mit dem Zellenkulturreaktor). Das Medium wurde in 2-tägigen
Intervallen gewechselt und das abgezogene Medium wurde gesammelt und zurückgehalten. Der Wachstumsbereich für
2
jeden "'!"'-Kolben betrug 50 cm . Die zurückbehaltenen Medien wurden auf Wachstumshormon und Milchsäure untersucht. Die Analyse zeigte, daß die kombinierten Medien aus beiden Kolben 8OO Nanogramm Wachstumshormon enthielten, (im Mittel 400 Nanogramm pro Kolben) und dass die Produktion von Milchsäure (bezogen auf Glukose) quantitativ war. Die quantitative Produktion von Milchsäure zeigte anerobe Zellenwachstumsbedingungen.
jeden "'!"'-Kolben betrug 50 cm . Die zurückbehaltenen Medien wurden auf Wachstumshormon und Milchsäure untersucht. Die Analyse zeigte, daß die kombinierten Medien aus beiden Kolben 8OO Nanogramm Wachstumshormon enthielten, (im Mittel 400 Nanogramm pro Kolben) und dass die Produktion von Milchsäure (bezogen auf Glukose) quantitativ war. Die quantitative Produktion von Milchsäure zeigte anerobe Zellenwachstumsbedingungen.
In diesem Beispiel ist der verwendete Zellenkulturreaktor von der in der US-Patentschrift 3 228 877 beschriebenen
Art. Der Reaktor besteht aus einem Bündel von lOOO
- 20 409884/1334
kontinuierlichen Hohlfasern (Amicon XM-50) mit einer
Gesamtaußenoberfläche von etwa 900 cm , die in einem röhrenförmigen Gehäuse enthalten sind. Die Hohlfasern
sind an jedem Ende offen, um einen kontinuierlichen Fluß des Sauerstoffträgers zu ermöglichen. Ein Zelleninoculum-Medium
von Schweine-HypophysezeIlen (7,6 χ
Zellen pro ml) wurde analog Beispiel 1 hergestellt. Der Zellenkulturreaktor wurde mit 33 ml Inoculummedium
inoculiert, um Zellen an die äußere Oberfläche der Fasern zu binden. Die Inkubation wurde 6 Tage bei 37°C
durchgeführt, um ein zusammenfließendes Wachstum der Zellen unter aeroben Bedingungen auf der Faser herbeizuführen.
Während der 6-tägigen Periode wurde Luft mit 3 % Kohlendioxyd durch die Fasern pulsartig mit einer
Geschwindigkeit von 5 ml/Min. (1 Puls alle 10 Sek.) geleitet. Während der 6-tägigen Periode wurde das Zellen
kulturmedium kontinuierlich beschickt. Nach anfänglicher Einleitung des Inoculums wurde der Mediumwechsel durch
kontinuierliches Pumpen von Medium (EBMgg Kalbfötus-^)
in den Reaktor in Kontakt mit den äußeren Wänden der Fasern mit der Geschwindigkeit von 4 ml/Min, und aus
dem Reaktor (mit Ausnahme des Mediums, das durch die
Fasern abgeleitet wurde) mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/Min, herbeigeführt. Durch diese Prozedur fließt
das Medium radial durch die Zellschichten, durch die Wände der Fasern und in die Hohlkerne der Fasern. Das
abgeführte Medium wurde untersucht und gefunden, daß es
- 21-
409884/1334
243H50
Wachstumhormon enthielt.
Das radiale Fließen des Mediums bei der Prozedur dieses Beispieles sorgt für eine optimale Verteilung der Nährstoffe
und hilft bei der Bildung von dichten Zellenschichten. Da bei radialem Fließen die kleineren Moleküle
die Hohlfasermembrane leichter durchdringen als größere Moleküle, dient die Prozedur ferner dazu, große
Moleküle (Kalbfötusserum, Hormone und andere Metabolite)
auf der anderen Seite der Membrane zu konzentrieren.
Die allgemeine Prozedur des Beispieles 2 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß der Sauerstoffträger Sauerstoffenthaltendes
"Eagle^"-Basalmedium ohne Serum war, das
durch das Innere der Hohlfasern mit einer Geschwindigkeit von 12 ml/Min, gepumpt wurde. Die Inkubation wurde
12 Tage durchgeführt. Starkes zusammenfließendes Zellenwachstum wurde auf den Fasern beobachtet. Zellenwachstum
war während der ersten vier Tage aerob und danach anaerob.
Menschliche Embryo-Lungenfibroblaste (WI-38-Zellen in
der 26. Generation,isoliert von L. Hayflick) wurden nach
der folgenden allgemeinen Prozedur der Beispiele 2 und 3 24 Tage bei 37°C in einem Zellenkulturreaktor, der
aus einem Bündel von polymeren Hohlfasern (Amicon XM-50
-22 -
409884/ 1 334
Polymerisat) in einem rechtwinkligen Gehäuse bestand. Die Fasern waren an jedem Ende offen, um einen kontinuierlichen
Fluß des Sauerstoffträgers zu ermöglichen.
Der pH des Zellenkulturmediums fluktuierte während der 24-tägigen Inkubationszeit im Bereich von etwa 7,2 bis
7,9. Das Hohlfaserbündel hatte eine äußere Gesamtober-
2 2
fläche von etwa 85 cm , von denen etwa 65 cm der Oberfläche
kontinuierlich während der 24-tägigen Inkubationszeit im Medium eingetaucht waren. Die Zellen wurden
an die äußeren Wände der Fasern wie in Beispiel 2 mit annähernd 58 % der an die Außenwände der Fasern zu bindenden
Zellen nach 18 Stunden gebunden. Die Zeilendich-
A O
te an den Fasern betrug nach 18 Stunden 1,56 χ 10 /cm
Oberfläche. Nach Vervollständigung der 18-stündigen Bindungszeit wurde das Medium in und durch den Reaktor
in Kontakt mit den Außenwänden der Fasern bei einer Geschwindigkeit von 4 ml/Stunde gepumpt und der Sauerstoffträger
(Luft + 3 % CO,) wurde durch die Fasern mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/Stunde geleitet.
Um optimalen Kontakt des Mediums mit den Zellen zu erreichen, wurden die Fasern in dem Bündel in einer ausgebreiteten
Lage beibehalten μηα das Medium wurde in den
Reaktor senkrecht zu den Fasern gepumpt. Zusammenfließendes Wachstum der Zellen an den Fasern wurde nach 10-tägiger
Inkubation mit einer zu beobachteten Zellendichte von 1 - 1,5 χ 10 erhalten. Nach der 14-tägigen Inkubation
betrug die Zellendichte 7,5 χ 10 Zellen/cm . Die
- 23 -
40988 W1334
Zellen wurden weitere 10 Tage ohne Zunahme in der Zelldichte, die nach 14-tägiger Inkubation erhalten wurde.
Nach 24-tägiger Inkubationszeit wurden die Zellen von
den Fasern durch Trypsinierung entfernt. Die Zellen hatten bei der mikroskopischen Untersuchung ein normales
Aussehen.
Es ist sehr vorteilhaft, das vorliegende Verfahren unter Bedingungen durchzuführen, die passenden Sauerstoff für
Zellenerhaltung oder Zellenwachstum unter aeroben Bedingungen gewährleisten. Durch Verwendung von Luft oder
anderen Gasen in der Faser ist es möglich, Sauerstoff mit einer viel größeren Geschwindigkeit zu liefern
(beispielsweise weist Luft 0,0029 g Sauerstoff/ml auf), verglichen mit viel niedrigeren Sauerstofflöslichkeiten
in den meisten Flüssigkeiten. Auch die Diffusionsgeschwindigkeiten ist in Gasen schnell, aber viel langsamer
in Flüssigkeiten. Luft ist etwa 4000 mal so wirksam bei der Beschaffung von Sauerstoff als es ein mit
Sauerstoff gesättigtes wässriges System ist. Andere gasförmige Systeme, die Sauerstoff enthalten, werden
zweckmäßigerweise verwendet und jedes beliebige System mit einer Partialgasphase, wie ein Schaum, wird als
gasförmiges System betrachtet. Die Sauerstoffmenge, die im Sauerstoffträger benötigt wird, schwankt mit der
Fließgeschwindigkeit und anderen Faktoren, aber Sauerstoffkonzentrationen,
die größer als 50 - 100 Mikrogramm pro ml sind, sind allgemein geeignet. Die praktischen
- 24 409884/1334
243H50
Fließgeschwindigkeiten werden an der oberen Seite durch die Festigkeit der Fasern begrenzt und die Verwendung
von hohen Sauerstoffkonzentrationen vermindert den Bedarf an hohen Fließgeschwindigkeiten. Ein gasförmiges
System kann verschiedene andere Gase als Verdünnungsmittel zusammen mit Sauerstoff verwenden.
Allgemein ist es wünsehenswert, daß derartige Verdünnungsmittel
relativ inert sind oder mindestens nicht als solche bekannt sind, die einen starken schädlichen
Einfluß auf die Zellkulturen haben und daß derartige Verdünnungsmittel nicht leicht mit Sauerstoff reagieren,
um den zur Verfügung stehenden Sauerstoff aufzubrauchen. Das vorliegende Verfahren kann atmosphärische, unteratmosphärische oder überatmosphärische Drucke verwenden
und falls es aus einem bestimmten Grund wünschenswert ist, bei unteratmosphärischen Drucken zu arbeiten,
kann Sauerstoff bei etwa 0,2 Atmosphären verwendet werden und es ist dann nicht notwendig, irgendein
Verdünnungsmittel anstelle von Sauerstoff zu verwenden. Das vorliegende Verfahren verwendet nicht allgemein
Sauerstoff in derartig hohen Konzentrationen, daß der Tod einer erheblichen Anzahl von Zellen herbeigeführt
wird. Bei der Produktion von Zellen ist es wünschenswert, hohe Produktions- und Wachstumsgeschwindigkeiten
zu erreichen und das unter aeroben Bedingungen zu erreichen. Beim vorliegenden Verfahren ist es daher wünschenswert.
Sauerstoff zu liefern, der den Maximalbedarf
409884/1334
" ** " 243H50
if»
daran überschreitet, um aerobes Wachstum oder aerobe Erhaltung bei der maximalen Zellenproduktionsgeschwindigkeit
und mit der maximalen Zellendichte, die schließlich erreicht wird, zu schaffen und daß bei der Langzeitkultivierung.
Natürlich werden einige der Vorteile des Verfahrens definitiv erreicht, wenn das Zellenwachstum
unter aeroben Bedingungen mit mehr als der passenden Sauerstoffmenge für eine akzeptable Zeit stattfindet,
sogar dann, wenn schließlich etwas anaerobes Wachstum wegen der Produktion von vielen Zellschichten stattfindet,
die die Sauerstoffdiffusion behindern. Es ist
daher eines der Kennzeichen der vorliegenden Erfindung, passenden Sauerstoff für aerobes Wachstum bei einer
maximalen oder hohen Zellendichte zu schaffen, wenn auch ein solches Wachstum unter einigen Bedingungen nicht
erreicht werden kann. Der Sauerstoff kann zweckmäßig in einer Konzentration geliefert werden, die ausreicht,
um den Bedarf daran zu überschreiten.
- 26 409884/1334
Claims (6)
- -J»- 243H50α?PatentansprücheTu. Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung oder in vitro-Erhaltung von Zellen, da durch gekennzeichnet, daßa) eine Suspension von Zellen in einem Zellenkulturmedium mit einer Wand einer nicht-toxischen Sauerstoffdurchlässigen Hohlfasermembrane in Berührung gebracht wird, wobei die Zellen an diese Wand der Hohlfasermembrane gebunden werden,b) die gegenüberliegende Wand der Membrane mit intermittierenden Stößen eines gasförmigen Sauerstoffträgers in Berührung gebracht wird, wobei der Durchgang des Sauerstoffes durch die Membrane bewirkt und der Sauerstoff mit den an der anderen Seite der Membrane gebundenen Zellen in Berührung gebracht wird und gleichzeitig die Zellen in einem Zellenkulturmedium unter Zellenwachstums- oder Zellenerhaltungs-Bedingungen von pH und Temperatur inkubiert werden und der Sauerstoff in einer solchen Konzentration zugeführt wird, die ausreicht, um den maximalen Sauerstoffbedarf zu überschreiten und um aerobe Bedingungen zu schaffen.
- 2. Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung und in vitro-Erhaltung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß
a) eine Suspension von Zellen in einem Zellenkulturmedium409884/1334 -27-243H50geschaffen wird,b) die Suspension mit der äußeren Wand einer nicht-toxischen. Sauerstoff-durchlässigen, kontinuierlichen Hohlfasermembrane, die offene Enden hat, in Berührung gebracht wird, wobei diese offenen Enden für die Suspension unzugänglich sind und wobei die Zellen an dieser äußeren Wand der Hohl fase rmembr ane gebunden v/erden, undc) Luft mit pulsierendem Fluß durch das Innere dieser Hohlfasermembrane geleitet wird, wobei die Durchlässigkeit des Sauerstoffes durch die Fasermembrane bewirkt wird und der Sauerstoff mit den gebundenen Zellen in Berührung gebracht wird und gleichzeitig die Zellen in einem Zellenkultur-Nährmedium unter Zellenwachstumsoder Zellenerhaltungsbedingungen von pH und Temperatur inkubiert und der Sauerstoff in einer solchen Konzentration zugeführt wird, die ausreicht, um den maximalen Sauerstoffbedarf zu decken und um aerobe Bedingungen zu schaffen. - 3. Verfahren gemäß Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen normale Säugetierzellen sind.
- 4. Verfahren gemäß Anspruch 3,dadurch g e kennze lehnet, daß die Zellen menschliche Zellen sind.- 28 -409884/13342A3H50
- 5. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch g e kennze ichnet, daß die normalen Säugetierzellen pituitäre Zellen sind.
- 6. Verfahren gemäß 'Anspruch 2/dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium außerhalb der Fasern in einer Weise vorgesehen ist, daß das Medium durch die Faserwände fließt und in die Hohlkerne.4U9884/1334Leerseite
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US05/376,038 US3997396A (en) | 1973-07-02 | 1973-07-02 | Method for the in vitro propagation and maintenance of cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2431450A1 true DE2431450A1 (de) | 1975-01-23 |
DE2431450C2 DE2431450C2 (de) | 1986-10-16 |
Family
ID=23483444
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2431450A Expired DE2431450C2 (de) | 1973-07-02 | 1974-07-01 | Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung oder in vitro-Erhaltung von Zellen |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3997396A (de) |
JP (1) | JPS554395B2 (de) |
BE (1) | BE817119A (de) |
CA (1) | CA1107211A (de) |
CH (1) | CH593339A5 (de) |
DE (1) | DE2431450C2 (de) |
FR (1) | FR2236004B1 (de) |
GB (1) | GB1448176A (de) |
IL (1) | IL45168A (de) |
IT (1) | IT1015692B (de) |
NL (1) | NL179923C (de) |
ZA (1) | ZA744208B (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2940446A1 (de) * | 1979-10-05 | 1981-04-09 | B. Braun Melsungen Ag, 3508 Melsungen | Verfahren zur zuechtung von tierischen zellen in suspensions- und monolayerkulturen in fermentationsgefaessen |
US7531351B2 (en) | 2004-06-14 | 2009-05-12 | Probiogen Ag | Liquid-gas-phase exposure reactor for cell culturing |
DE102020102420A1 (de) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Rwth Aachen | Gas-Flüssig-Reaktor zur blasenfreien Begasung einer Prozessflüssigkeit |
Families Citing this family (96)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4201845A (en) * | 1976-04-12 | 1980-05-06 | Monsanto Company | Cell culture reactor |
US4087327A (en) * | 1976-04-12 | 1978-05-02 | Monsanto Company | Mammalion cell culture process |
JPS5730472Y2 (de) * | 1976-09-22 | 1982-07-03 | ||
US4229541A (en) * | 1978-10-06 | 1980-10-21 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | In vitro cultivation of horseshoe crab amebocytes |
JPS5642584A (en) * | 1979-09-18 | 1981-04-20 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Cell cultivation method |
US4301249A (en) * | 1980-07-23 | 1981-11-17 | Merck & Co., Inc. | High titer production of hepatitis A virus |
CH651587A5 (de) * | 1980-11-18 | 1985-09-30 | Chemap Ag | Verfahren und vorrichtung zur submersen zuechtung von zellkulturen. |
JPS5876086A (ja) * | 1981-10-28 | 1983-05-09 | Ajinomoto Co Inc | 浮遊性動物細胞の培養法 |
US4537860A (en) * | 1982-12-08 | 1985-08-27 | Monsanto Company | Static cell culture maintenance system |
US4546083A (en) * | 1983-04-22 | 1985-10-08 | Stolle Research & Development Corporation | Method and device for cell culture growth |
US4764471A (en) * | 1984-01-04 | 1988-08-16 | Nabisco Brands, Inc. | Continuous bioreactor and process |
JPH06165690A (ja) * | 1984-01-27 | 1994-06-14 | Hooper Trading Co Nv | 血清不含およびミトゲン不含インタールーキン−2の試験管内での効率生産方法 |
JPH0646956B2 (ja) * | 1984-01-27 | 1994-06-22 | フ−パ−・トレ−デイング・カンパニ−・エヌ・ベ− | 血清不含およびミトゲン不含インタ−ル−キン−2の試験管内の効率生産法 |
US5180676A (en) * | 1984-06-14 | 1993-01-19 | Teijin Limited | Method of cultivating animal or plant cells |
SE439814B (sv) * | 1984-07-18 | 1985-07-01 | Karl Gustav Hesselmar | Fasthallningsanordning, for fastsettning i halrum, vilken expanderas till fasthallningsleget genom miljopaverkan |
US4804628A (en) * | 1984-10-09 | 1989-02-14 | Endotronics, Inc. | Hollow fiber cell culture device and method of operation |
CA1275273C (en) * | 1984-10-09 | 1990-10-16 | Micheal L. Gruenberg | Hollow fiber cell culture device and method of operation |
WO1986002379A1 (en) * | 1984-10-09 | 1986-04-24 | Endotronics, Inc. | Hollow fiber culture device for improved nutrient perfusion and product concentration and method of operation |
US4748124A (en) * | 1984-10-30 | 1988-05-31 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Compartmentalized cell-culture device and method |
GB8428085D0 (en) * | 1984-11-07 | 1984-12-12 | Manchester Inst Science Tech | Immobilisation of biological material |
GB8508976D0 (en) * | 1985-04-04 | 1985-05-09 | Davies G A | Reactor unit |
FR2580514B1 (fr) * | 1985-04-17 | 1989-08-18 | Lyonnaise Eaux | Ensemble composite de membranes de filtration et son utilisation dans un bioreacteur |
US4647539A (en) * | 1985-05-24 | 1987-03-03 | Endotronics, Inc. | Method and apparatus for growing cells in vitro |
US4720462A (en) * | 1985-11-05 | 1988-01-19 | Robert Rosenson | Culture system for the culture of solid tissue masses and method of using the same |
US4661455A (en) * | 1986-01-16 | 1987-04-28 | Dorr-Oliver Incorporated | Membrane cell culturing device |
US4920055A (en) * | 1986-02-04 | 1990-04-24 | American Biogenetics Corporation | Conversion of alcohols to aldehydes and hydrogen peroxide by substrate and product tolerant methanol oxidases |
JPS647278Y2 (de) * | 1986-03-10 | 1989-02-27 | ||
US4963489A (en) * | 1987-04-14 | 1990-10-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
US5266480A (en) * | 1986-04-18 | 1993-11-30 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Three-dimensional skin culture system |
US5510254A (en) * | 1986-04-18 | 1996-04-23 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Three dimensional cell and tissue culture system |
US5863531A (en) * | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
KR0142885B1 (ko) * | 1986-04-18 | 1998-07-15 | 로저 이.콜스키 | 골수의 복제방법 및 시험에서의 다른 기관의 복제방법 그리고 이들의 용도 |
US5160490A (en) * | 1986-04-18 | 1992-11-03 | Marrow-Tech Incorporated | Three-dimensional cell and tissue culture apparatus |
US5032508A (en) * | 1988-09-08 | 1991-07-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
DE3711699A1 (de) * | 1987-04-07 | 1988-11-10 | Fraunhofer Ges Forschung | Medium zur kultivierung und proliferation von epithelialen zelltypen |
US4975377A (en) * | 1987-05-14 | 1990-12-04 | Key Marc E | Cell growth chambers and method of use thereof |
US4994388A (en) * | 1988-04-15 | 1991-02-19 | Solohill Engineering, Inc. | Collagen-coated polystyrene microcarrier beads |
US5081035A (en) * | 1988-04-18 | 1992-01-14 | The University Of Michigan | Bioreactor system |
US4999298A (en) * | 1988-04-27 | 1991-03-12 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Hollow fiber bioreactor culture system and method |
EP0380610B1 (de) * | 1988-05-23 | 1995-03-29 | Regents Of The University Of Minnesota | Bioreaktor |
US5605835A (en) * | 1988-05-23 | 1997-02-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Bioreactor device with application as a bioartificial liver |
US5079168A (en) * | 1988-08-10 | 1992-01-07 | Endotronics, Inc. | Cell culture apparatus |
FR2639222B1 (fr) * | 1988-11-18 | 1995-02-24 | Cartier Claude Julien | Appareil pour traiter les desequilibres vasculaires, metaboliques et fonctionnels et les oedemes d'un membre par variations de pression d'un fluide de densite elevee autour de ce membre |
US5162225A (en) * | 1989-03-17 | 1992-11-10 | The Dow Chemical Company | Growth of cells in hollow fibers in an agitated vessel |
US4897359A (en) * | 1989-03-27 | 1990-01-30 | Bio-Response, Inc. | Apparatus for oxygenating culture medium |
US5190879A (en) * | 1990-05-08 | 1993-03-02 | Bowolfe, Inc. | Controlled environment animal isolation systems |
US5112760A (en) * | 1990-06-05 | 1992-05-12 | Centocor, Incorporated | Mass transfer membrane for oxygenation of animal cell reactors |
EP0564539A4 (en) * | 1990-12-13 | 1996-03-06 | Us Commerce | Sustained and continuous production of high titers of recombinant viral vectors and transduced target cells for use in gene therapy |
WO1995027040A1 (en) * | 1994-04-01 | 1995-10-12 | Unisyn Technologies, Inc. | Culture media additives for hollow fiber bioreactors |
DE19528871C2 (de) * | 1994-08-24 | 1997-08-14 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Begasungs-Rohrmodul mit selektiv gasdurchlässiger Schlauchmembranen und damit versehene Reaktoren für Zellkulturtechnik sowie Wirbelschicht-Reaktoren für Zellkultivierung |
US5622819A (en) * | 1995-03-28 | 1997-04-22 | Kinetic Biosystems, Inc. | Centrifugal fermentation process |
US6916652B2 (en) * | 1995-03-28 | 2005-07-12 | Kinetic Biosystems, Inc. | Biocatalyst chamber encapsulation system for bioremediation and fermentation |
US6133019A (en) * | 1995-03-28 | 2000-10-17 | Kinetic Biosystems, Inc. | Centrifugal fermentation process |
US6660509B1 (en) | 1995-03-28 | 2003-12-09 | Kinetic Biosystems, Inc. | Methods and devices for remediation and fermentation |
US20050266548A1 (en) * | 1995-03-28 | 2005-12-01 | Kbi Biopharma, Inc. | Biocatalyst chamber encapsulation system for bioremediation and fermentation with improved rotor |
US6214617B1 (en) | 1995-03-28 | 2001-04-10 | Kinetic Biosystems, Inc. | Centrifugal fermentation process |
US5702949A (en) * | 1995-06-22 | 1997-12-30 | University Of Utah Research Foundation | Culture method for multilayer growth of anchorage-dependent cells |
US20020182730A1 (en) * | 1995-07-26 | 2002-12-05 | Micheal L. Gruenberg | Autologous immune cell therapy: cell compositions, methods and applications to treatment of human disease |
US5827729A (en) * | 1996-04-23 | 1998-10-27 | Advanced Tissue Sciences | Diffusion gradient bioreactor and extracorporeal liver device using a three-dimensional liver tissue |
US6893877B2 (en) | 1998-01-12 | 2005-05-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for screening substances in a microwell array |
US6235196B1 (en) | 1998-04-23 | 2001-05-22 | Alliedsignal Inc. | Biological wastewater treatment system |
US6207448B1 (en) | 1998-09-02 | 2001-03-27 | Cedars-Sinai Medical Center | Bioreactor and related method |
US7560274B1 (en) * | 1999-05-28 | 2009-07-14 | Cellon S.A. | Culture chamber |
CA2375505A1 (en) * | 1999-06-21 | 2000-12-28 | The General Hospital Corporation | Cell culture systems and methods for organ assist devices |
WO2001055296A1 (en) | 2000-01-31 | 2001-08-02 | Kinetic Biosystems, Inc. | Methods and devices for remediation and fermentation |
US6242248B1 (en) | 2000-02-08 | 2001-06-05 | Cedars-Sinai Medical Center | Bioreactor and related method |
AU4314301A (en) * | 2000-02-09 | 2001-08-20 | Minntech Corporation | Apparatus and process for removal of carbon dioxide in a bioreactor system |
US20020151040A1 (en) | 2000-02-18 | 2002-10-17 | Matthew O' Keefe | Apparatus and methods for parallel processing of microvolume liquid reactions |
WO2001061054A2 (en) | 2000-02-18 | 2001-08-23 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Apparatus and methods for parallel processing of micro-volume liquid reactions |
US20100261159A1 (en) | 2000-10-10 | 2010-10-14 | Robert Hess | Apparatus for assay, synthesis and storage, and methods of manufacture, use, and manipulation thereof |
AU2001296809A1 (en) * | 2000-10-10 | 2002-04-22 | Biotrove, Inc. | Apparatus for assay, synthesis and storage, and methods of manufacture, use, and manipulation thereof |
US6635441B2 (en) | 2001-02-08 | 2003-10-21 | Irm, Llc | Multi-sample fermentor and method of using same |
FR2821947B1 (fr) * | 2001-03-12 | 2003-05-16 | Canon Kk | Procede et dispositif de validation de parametres definissant une image |
US20030134415A1 (en) * | 2001-09-19 | 2003-07-17 | Gruenberg Micheal L. | Th1 cell adoptive immunotherapy |
US20030134341A1 (en) * | 2001-09-19 | 2003-07-17 | Medcell Biologics, Llc. | Th1 cell adoptive immunotherapy |
EP1465979A4 (de) * | 2001-12-21 | 2007-11-14 | Organogenesis Inc | Kammer mit einstellbarem volumen für zellkultur und zur organunterstützung |
DE10203644A1 (de) * | 2002-01-30 | 2003-08-07 | Fraunhofer Ges Forschung | Kryokonservierung an textilen Geweben |
US20030175272A1 (en) * | 2002-03-07 | 2003-09-18 | Medcell Biologics, Inc. | Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy |
EP1513920A2 (de) * | 2002-05-31 | 2005-03-16 | ProBioGen AG | Kultursysteme zur sterilen kontinuierlichen kultivierung von zellen |
US8277753B2 (en) | 2002-08-23 | 2012-10-02 | Life Technologies Corporation | Microfluidic transfer pin |
US7682565B2 (en) | 2002-12-20 | 2010-03-23 | Biotrove, Inc. | Assay apparatus and method using microfluidic arrays |
CA2559171A1 (en) | 2004-03-12 | 2005-09-29 | Biotrove, Inc. | Nanoliter array loading |
US20060105453A1 (en) | 2004-09-09 | 2006-05-18 | Brenan Colin J | Coating process for microfluidic sample arrays |
US7754241B1 (en) | 2004-11-12 | 2010-07-13 | Clemson University Research Foundation | Macromonomer for preparation of a degradable hydrogel |
US9427496B2 (en) | 2005-02-18 | 2016-08-30 | Drexel University | Method for creating an internal transport system within tissue scaffolds using computer-aided tissue engineering |
ZA200602094B (en) * | 2006-01-16 | 2007-11-28 | Reliance Life Sciences Pvt Ltd | Device for culturing and transporting cells |
US8293531B1 (en) | 2007-08-31 | 2012-10-23 | Clemson University Research Foundation | Three-dimensional ex vivo system |
EP2421951B1 (de) * | 2009-04-23 | 2013-07-17 | Hemarina | Bioreaktor mit sauerstoffhaltigen Molekulen |
US8778669B2 (en) | 2009-07-22 | 2014-07-15 | Corning Incorporated | Multilayer tissue culture vessel |
EP2625264B1 (de) | 2010-10-08 | 2022-12-07 | Terumo BCT, Inc. | Verfahren und systeme für züchtung und ernte von zellen in einem hohlfaser-bioreaktorsystem mit steuerungsbedingungen |
DK2718416T3 (da) | 2011-06-06 | 2020-02-24 | ReGenesys BVBA | Ekspansion af stamceller i hulfiberbioreaktorer |
US20140017263A1 (en) | 2012-06-28 | 2014-01-16 | Clemson University | Delivery Agents for Targeted Treatment of Elastin Degradation |
US9005550B2 (en) | 2012-10-29 | 2015-04-14 | Corning Incorporated | Multi-layered cell culture vessel with manifold grips |
US9795573B2 (en) | 2013-09-24 | 2017-10-24 | Clemson University | Multi-step connective tissue stabilization method and stabilized tissue formed thereby |
WO2015073913A1 (en) | 2013-11-16 | 2015-05-21 | Terumo Bct, Inc. | Expanding cells in a bioreactor |
CA2948979A1 (en) * | 2014-05-14 | 2015-11-19 | University Of Limerick | Microfluidic devices that include channels that are slidable relative to each other and methods of use thereof |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2128744A1 (de) * | 1971-06-09 | 1972-12-28 | Max Planck Gesellschaft zur Förde rung der Wissenschaften e V , 3400 Got tingen | Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben und Behalter zur Durch fuhrung des Verfahrens |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3027305A (en) * | 1959-01-16 | 1962-03-27 | Robert R Freeman | Apparatus for the cultivation of microorganisms |
US3821087A (en) * | 1972-05-18 | 1974-06-28 | Dedrick R | Cell culture on semi-permeable tubular membranes |
-
1973
- 1973-07-02 US US05/376,038 patent/US3997396A/en not_active Expired - Lifetime
- 1973-07-02 CH CH911774A patent/CH593339A5/xx not_active IP Right Cessation
-
1974
- 1974-06-28 CA CA203,742A patent/CA1107211A/en not_active Expired
- 1974-07-01 IT IT24684/74A patent/IT1015692B/it active
- 1974-07-01 ZA ZA00744208A patent/ZA744208B/xx unknown
- 1974-07-01 FR FR7422835A patent/FR2236004B1/fr not_active Expired
- 1974-07-01 BE BE146108A patent/BE817119A/xx not_active IP Right Cessation
- 1974-07-01 JP JP7439374A patent/JPS554395B2/ja not_active Expired
- 1974-07-01 NL NLAANVRAGE7408821,A patent/NL179923C/xx not_active IP Right Cessation
- 1974-07-01 DE DE2431450A patent/DE2431450C2/de not_active Expired
- 1974-07-01 GB GB2907974A patent/GB1448176A/en not_active Expired
- 1974-07-02 IL IL45168A patent/IL45168A/en unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2128744A1 (de) * | 1971-06-09 | 1972-12-28 | Max Planck Gesellschaft zur Förde rung der Wissenschaften e V , 3400 Got tingen | Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben und Behalter zur Durch fuhrung des Verfahrens |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2940446A1 (de) * | 1979-10-05 | 1981-04-09 | B. Braun Melsungen Ag, 3508 Melsungen | Verfahren zur zuechtung von tierischen zellen in suspensions- und monolayerkulturen in fermentationsgefaessen |
US7531351B2 (en) | 2004-06-14 | 2009-05-12 | Probiogen Ag | Liquid-gas-phase exposure reactor for cell culturing |
DE102020102420A1 (de) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Rwth Aachen | Gas-Flüssig-Reaktor zur blasenfreien Begasung einer Prozessflüssigkeit |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB1448176A (en) | 1976-09-02 |
DE2431450C2 (de) | 1986-10-16 |
FR2236004A1 (de) | 1975-01-31 |
US3997396A (en) | 1976-12-14 |
NL7408821A (nl) | 1975-01-06 |
JPS5036684A (de) | 1975-04-05 |
NL179923B (nl) | 1986-07-01 |
IL45168A0 (en) | 1974-10-22 |
JPS554395B2 (de) | 1980-01-30 |
CA1107211A (en) | 1981-08-18 |
FR2236004B1 (de) | 1978-11-24 |
BE817119A (fr) | 1975-01-02 |
NL179923C (nl) | 1986-12-01 |
IL45168A (en) | 1976-10-31 |
IT1015692B (it) | 1977-05-20 |
CH593339A5 (de) | 1977-11-30 |
AU7066174A (en) | 1976-01-08 |
ZA744208B (en) | 1975-06-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2431450A1 (de) | Verfahren zur in vitro-fortpflanzung und in vitro-erhaltung von zellen | |
DE2726313C3 (de) | Verfahren zur in-vitro-Biosynthese von Hormonen, insbesondere von Insulin | |
DE3035118C2 (de) | Verfahren zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens | |
DE2319120C2 (de) | Züchten von Zellkulturen in vitro | |
DE2715821C2 (de) | Verfahren zur in vitro-Zellkultur und Zellkultur-Reaktionsgefäß zur Durchführung dieses Verfahrens | |
EP1152053B1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung eines vaskularisierten bioartifiziellen Gewebes | |
DE3601705A1 (de) | Gasblasenerzeuger und vorrichtung und verfahren zum zuechten von zellen | |
CH624713A5 (de) | ||
EP0677044A1 (de) | Verfahren zur in vivo gewinnung von inhaltsstoffen aus zellen | |
DE3504715C2 (de) | ||
DE3833925A1 (de) | Verfahren und herstellung von virus und viralem antigen und vorrichtung hierzu | |
DE2212092C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von 14 C-markierten Verbindungen | |
EP0263371A2 (de) | Verfahren und Vorrichtung zum Kultivieren von tierischen Zellen | |
CH638470A5 (de) | Verfahren zum abbau von cyanursaeure. | |
DE2551017C3 (de) | Erhaltungsmedium für Nierenzellen zur Gewinnung von Urokinase | |
DE2926847A1 (de) | Bis-(2-ammonium-2-hydroxymethyl-1,3- propandiol)-salz der (2r-cis)-(3-methyloxiranyl)-phosphonsaeure, verfahren zu seiner herstellung und dieses enthaltende arzneimittel | |
DE3504748C2 (de) | ||
DE1673307B1 (de) | Teststreifen aus saugfaehigem Material zur schnellen Erkennung fuer von Mikroorganismen gebildetem Acetylmethylcarbinol | |
EP1516045B1 (de) | Verwendung von glutaminfreien medium | |
DE60025036T2 (de) | Verfahren zur züchtung von haftenden tierischen zellen | |
DE2320885C2 (de) | Zellkultursystem und seine Verwendung | |
DE3733636C1 (de) | Verfahren zum Vermehren von Zellen,insbesondere bei der Pruefung von Behandlungssubstanzen auf Wirksamkeit | |
DE3226532A1 (de) | Verfahren zur herstellung von aspartase und verwendung derselben zur produktion von asparaginsaeure | |
DE1009583B (de) | Verfahren zur biochemischen Herstellung von 2-Keto-1-gulonsaeure | |
DE2723166C3 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharide |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: TER MEER, N., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. MUELLER, F., |
|
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition |