DE2431450C2

DE2431450C2 - Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung oder in vitro-Erhaltung von Zellen

Info

Publication number: DE2431450C2
Application number: DE2431450A
Authority: DE
Inventors: Jacques Jean-Joseph St. Louis Mo. Delente
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1973-07-02
Filing date: 1974-07-01
Publication date: 1986-10-16
Also published as: GB1448176A; FR2236004A1; US3997396A; NL7408821A; JPS5036684A; NL179923B; IL45168A0; JPS554395B2; CA1107211A; FR2236004B1; DE2431450A1; BE817119A; NL179923C; IL45168A; IT1015692B; CH593339A5; AU7066174A; ZA744208B

Description

darin beschriebenen Bedingungen handelt es sich aber nicht um aerobe Kultivierungsbedingungen. Bei diesem bekannten Verfahren wird ein Nährmedium als Sauerstoffträger verwendet Bei der angegebenen Fließgeschwindigkeit von 5 mm/min und einer Sauerstofflös-Iichkeit in einem solchen Medium von 3 μg/ml ist die Sauerstoffversorgung für die erhaltene Zellenkultur von 2,17 χ ΙΟ⁸ Zellen jedoch unzureichend. Das schaffen nur 7xlO-¹⁵g Sauerstoff/min/Zelle. Der Sauerstoffbedarf der aeroben Zelle liegt im allgemeinen im Bereich von 2,8 χ 10- ^M bis 2,6 χ 10- » g Sauerstoff/min/Zelle. Daher werden bei dem bekannten Verfahren nur etwa 1/4 bis 1/14 des Sauerstoffbedarfs der produzierten Zellen zur Verfügung gestellt, abhängig vom jeweiligen Sauerstoffbedarf der eingesetzten Zellen. Zwar ist während der Anfangsstufen des Zellwachstums ein aerobes Wachstum erreichbar, das Gesamtverfahren ermöglicht jedoch kein Wachstum von Zellen unter aeroben Bedingungen.

Aus der DE-OS 21 28 744 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung bekannt, mit deren Hilfe es möglich ist, Zellen unter kontrollierten Bedingungen und unter Sauerstoffbegasung zu kultivieren durch Inkubieren einer Suspension der Zellen in einem Zellkulturmedium unter Zellenwachstums- oder Zellenerhaltungs-Bedingungen von pH und Temperatur unter Anwendung einer nichttoxischen, sauerstoffdurchlässigen Membran, über die Sauerstoff zugeführt wird.

Bei diesem bekannten Verfahren werden die Zellen in das Innere eines verhältnismäßig großen Behälters eingebracht, wobei der pH-Wert und der Sauerstoffparhaldruck dadurch gesteuert werden, daß man den Behälter in einen Inkubator einbringt und Sauerstoff in das Innere des Inkubators einführt. Der O₂ durchquert die sauerstoffdurchlässige Behälterwand und gelangt so in das Innere des Behälters. Bei der Kultivierung von Zellen nach diesem bekannten Verfahren reichert sich jedoch in der zirkulierenden Flüssigkeit Milchsäure in einem solchen Ausmaß εη, daß der gewünschte pH-Wert nicht mehr durch Herabsetzung der Kohlendioxidzufuhr aufrechterhalten werden kann. Daher muß bei diesem bekannten Verfahren stets ein Teil des zirkulierenden Nährmediums durch frisches Nährmedium ersetzt werden, das nicht durch die Zellenstoffwechselprodukte verunreinigt ist.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung oder in vitro-Erhaltung von Zellen zu entwickeln, bei dem die vorstehend geschilderten Nachteile nicht auftreten, das insbesondere unter aeroben Bedingungen in großtechnischem Maßstab kontinuierlich durchgeführt werden kann.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst werden kann, daß die wachsenden Zellen mit der Außenwand einer Hohlfasermembran in Berührung gebracht werden, an die sie dann gebunden werden. In diesem Zustand werden sie in dem flüssigen Nährmedium inkubiert, während gleichzeitig kontinuierlich Sauerstoff zugeführt wird, indem man einen Sauerstoffträger durch das Innere der Hohlfasermembran pumpt. Auf diese Weise gelangt der Sauerstoff durch die sauerstoffdurchlässige Hohlfasermembran hindurch zu den zu kultivierenden Zellen, wo er die angestrebten aeroben Bedingungen aufrechterhält und bewirkt, so daß die Zellen ihre normale differenzierte Form behalten (vgl. die in dem weiter unten folgenden Beispiel 1 unter dem Abschnitt »Zellenkultivierung« mitgeteilten Ergebnisse von Vergleichsversuchen).

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung oder in vitro-Erhaltung von Zellen durch Inkubieren einer Suspension der Zellen in einem Zellkulturmedium unter Zellenwachstums- oder Zellenerhaltungs-Bedingungen von pH und Temperatur unter Anwendung einer nichttoxischen, sauerstoffdurchlässigen Membran, über die Sauerstoff zugeführt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß einerseits

a) die Suspension der Zellen mit der Außenwand einer nichttoxischen sauerstoffdurchlässigen Hohlfasermembran in Berührung gebracht wird, wobei die Zellen an diese Wand der Hohlfasermembran gebunden werden, und

b) die gegenüberliegende Wand der Membran mit in-•ermittierenden Stoßen eines gasförmigen Sauerstoffträgers in Berührung gebracht wird, wobei der Durchgang des Sauerstoffs durch die Membran bewirkt, der Sauerstoff mit den an der anderen Seite der Membran gebundenen Zellen in Berührung gebracht und der Sauerstoff in einer solchen Konzentration zugeführt wird, die ausreicht, um aerobes Wachstum zu erhalten

oder andererseits

a) die Suspension mit der äußeren Wand einer nichttoxischen, sauerstoffdurchlässigen, kontinuierlichen Hohlfasermembran, die offene Enden hat, in Berührung gebracht wird, wobei diese offenen Enden für die Suspension unzugänglich sind und wobei die Zellen an diese äußere Wand der Hohlfasermembran gebunden werden, und

b) Luft mit pulsierendem Fluß durch das Innere dieser Hohlfasermembran geleitet wird, wobei der Durchgang des Sauerstoffs durch die Membran bewirkt, der Sauerstoff mit dem an der anderen Seite der Membran gebundenen Zellen in Berührung gebracht und der Sauerstoff in einer solchen Konzentration zugeführt wird, die ausreicht, um aerobes Wachstum zu erhalten.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist-es möglich, Zellen, insbesondere Wirbeltierzellen, speziell Säugetierzellen, in vitro, d. h. losgelöst vom Wirt, in großtechnischem Maßstab kontinuierlich unter aeroben Wachstumsbedingungen zu vermehren oder zu erhalten.

Bei den erfindungsgemäß kultivierten Zellen handelt es sich vorzugsweise um normale Säugetierzellen, die insbesondere pituitäre Zellen darstellen, speziell um Humanzellen.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist außerhalb der Hohlfaser ein Nährmedium vorgesehen, das durch die Faserwand hindurch in die Hohlfaserkerne fließt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine kontinuierliche und gleichmäßige Sauerstoffzufuhr zur Versorgung der Zellen, wodurch eine aerobe in vitro-Fortpflanzung oder in vitro-Erhaltung in der gewünsch-

aifht um r/4 ΓΊβ

aerobe Wachstum wird zweckmäßig zugeführt durch Verwendung eines gasförmigen Trägers, der Sauerstoff in ausreichender Menge enthält, um den Sauerstoffbedarf der Zellen zu decken.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen aseptisch an eine Wand oder (äußere oder innere^ Oberfläche der Hohlfasermem-

bran gebunden, indem die Zellen, die in einem Zellkulturmedium suspendiert sind, mit der Hohlfasermembran in Berührung gebracht werden. Zu diesem Zweck wird in der Regel ein Nährmedium für die Zellen verwendet, es kann aber auch ein Medium verwendet werden, das kein Nährmedium darstellt, aber physiologisch verträglich ist, wie z. B. eine physiologische Kochsalzlösung. Nach dem Binden (und gewünschtenfalls während des 3indens) der Zellen an die Oberfläche der Hohlfasermembran wird Sauerstoff den Zellen zugeführt, indem die entgegengesetzte Seite der Membran mit einem Sauerstoffträger in Berührung gebracht wird. Gleichzeitig werden die Zellen in einem Zellenkultur-Nährmedium inkubiert Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen an die äußere Wand der Hohlfascnr.err.brane gebunden, die vorzugsweise an beiden Enden offen ist Hierdurch ist es möglich, kontinuierlich den Strom eines Sauerstoffträgers durch den Hohlkern der Faser zu leiten. Der kontinuierliche Durchgang des Sauerstoffträgers durch den Kern einer kontinuierlichen Hohlfaser kann durchgeführt werden, indem der Sauerstoffträger durch die Faser in gleichmäßigen Mengen geleitet wird oder indem der Sauer stoff träger durch die Faser pulsiert Pulsieren wird bevorzugt, um eine optimale Verteilung des Sauerstoffs an allen Zellen zu erhalten und die Kanalisierung des Sauerstoffes zu vermindern. Alternativ kann die kontinuierliche Hohlfaser an einem Ende geschlossen sein. Bei dieser Prozedur wird der Sauerstoffträger in den Kern der Faser geleitet und Sauerstoff diffundiert durch die Wand und wird auf diese Weise mit den Zellen in Berührung gebracht Eine Prozedur und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens wird im Fließdiagramm der Zeichnung veranschaulicht Nach der Zeichnung besteht der Reaktor 1 aus einem Behälter 2, der viele Hohlfasern 3 enthält, die longitudinal in der Kammer angeordnet sind, mit oberen Enden 4, die in die Kammer 5, die sich oberhalb der Dichtung 9 befinden, hineinreichen. Das Nährmedium wird aus dem Vorratsbehälter 10 durch Pumpe 11 zum Reaktor bei Einlaß 12 in den Behälter 2 außerhalb der Fasern gepumpt und kann aus dem Behälter durch Auslaß 13 entfernt werden und Pumpe 14 kann mit einer Fließgeschwindigkeit arbeiten, die niedriger ist als die der Pumpe 11, so daß weniger Medium durch den Auslaß 13 entfernt wird als durch den Einlaß 12 eintritt, was dazu führt, daß durch die Faserwand der Oberschuß eindringt und durch die Hohlfaser fließt Der Reaktor wird mit Sauerstoff versorgt indem Luft vom Zylinder 16, der Luft und 3% Kohlendioxyd enthält durch Pumpe 17 und Leitung 18 zur Kammer 5 des Behälters 2 gepumpt wird, so daß die Luft an den offenen Enden 4 der Hohlfasern eintritt Ein Pulsator 19 ist mit Leitung 18 verbunden. Der Pulsator 19 besteht aus einer Kammer 20, die ein Diaphragma 21 enthält das die oberen und unteren Teile der Kammer voneinander trennt und Luftbewegung zwischen ihnen verhindert Der obere Teil des Pulsators ist mit einem Ventil 22 verbunden, das so angeordnet sein kann, daß Zutritt zum Vakuum oder zu einer Luftdruckquelle geschaffen wird, und das durch ein Solenoid elektrisch mit einem Zähler 23 verbunden ist Wenn das Ventil 22 zur Luftquelle hin geöffnet wird, wird das Diaphragma abwärts ausgedehnt um im wesentlichen den unteren Teil der Kammer 20 zu füllen, um eine Luftquelle zu schaffen, die in die Kammer 5 eintritt und durch die Hohlfasern fließt Die Kammer 20 und das Diaphragma 21 sind vorzugsweise so ausgelegt daß ein ausreichendes Volumen in der Welle ist um leicht das innere Gesamtvolumen der Hohlfasern in den Reaktoren zu überschreiten, so daß die Luftwelle im wesentlichen alle Materialien aus den Kernen der Fasern entfernen kann. Das Diaphragma kann aus Kautschuk oder anderem geeigneten Material hergestellt sein. Die Luft und das andere Material verläßt die Fasern durch ihre unteren Enden 7 und Kammer 8 über Leitung 24, um den Kessel 25 zum Überlaufen zu bringen. Da die Flüssigkeit in die Faser durch Diffusion oder weil mehr Flüssigkeit in den Reaktor gepumpt wurde als durch den Auslaß 13 entfernt wurde, eingedrungen sein kann, wird Flüssigkeit im allgemeinen entfernt und über Leitung 24 geschickt, um Kessel 25 zum Überlaufen zu bringen. Leitung 24 ist auch durch das Ventil 26 mit dem Zylinder 16 verbunden, aber hiermit wird nur der Zweck verfolgt, den Zylinder als Sauerstoffquelle zur Kalibrierung zu verwenden, und Ventil 28 ist normalerweise geschlossen. Der Kessel 25 ist mit einem Vorratsbehälter 27 verbunden und mit Instrumenten 28 und 29 versehen, um ph- und Sauerstoffmessungen an den Instrumenten 30 und 31 vorzunehmen. Der Reaktor ist mit Mitteln zur Temperaturkontrolle durch Kontrolleinrichtung 32 verbunden. Der Kühler 33 schafft Kühlung für die Vorratsbehälter 10, 15 und 27. Die beschriebene Vorrichtung kann beispielsweise mit einer 5 ml/Min. Luftfließgeschwindigkeit arbeiten und mit einem Einlaß von flüssigem Medium von 0,4 ml/Min, und einem Auslaß durch Auslaß 13 von 0,1 ml/Min. Diese verlassen 0,3 ml/Min, flüssiges Medium, um in die Fasern einzudringen, und 5 ml/Min. Gase gehen ab. Außer durch die Dichtungen 6 und 9 werden die Fasern gegeneinander in der Nähe ihrer Enden durch eine harzartige Verbindung verschlossen, um Materialbewegung aus den Zwischenräumen der Fasern in die Kammern 5 und 8 zu verhindern. Die Teile der Vorrichtung können natürlich in ihrer Größe schwanken. Ein Reaktor von einer Gesamtlänge von 25 cm mit einer Faserlänge von etwa 20 cm kann jedoch verwendet werden, wobei etwa 15 cm der Faser für Zellenwachstum zur Verfügung stehen. Ein derartiger Reaktor kann einen Gesamtdurchmesser von etwa 5 cm haben mit einem Behälter 2, der einen Außendurchmesser von 2,38 cm und einen inneren Durchmesser von 1,9 cm aufweist Der Behälter kann etwa 1000 Fasern von 360 Mikrometer Außendurchmesser und 200 Mikrometer Innendurchmesser für ein wirksames Hohlkern-Gesamtvolumen von etwa 63 ml enthalten. Der Pulsator 19 hat ein Innenvolumen von etwa 28 ml und das Diaphragma kann etwa 8 ml des unteren Teiles der Kammer verdrängen, so daß die Welle geeignet ist, um die Fasern leer zu fegen. Die Welle ergibt einen Differentialdruck von 0,21—0,35 kg/cm². Der Puls kann bei verschiedenen Frequenzen arbeiten, beispielsweise in einem Zyklus von 10 Sek. bei Vakuum und von 10 Sek. bei Luftdruck mit Wiederholung des Zyklus. Der Zyklus kann gewünschtenfalls variiert werden unter Verwendung einer verschiedenen Dauer für die Luftdruck- und Vakuumphasen des Pulsators und der Pulsator kann auch arbeiten, um irreguläre Luftwellen eher als reguläre Zyklen zu schaffen. Die Welle kann auch verschiedene Formen aufweisen, beispielsweise einen kurzen starken Anstieg beim Druck an dem sich ein langsamer Abfall anschließt oder einen regulären gemäßigten Anstieg mit gemäßigtem Abfall usw. ohne Wellencharakteristiken usw. Es ist nicht erforderlich, einen Flußabfall auf 0 zwischen den Wellen zu haben, obwohl das zu akzeptablen Ergebnissen führt. Tatsächlich kann der Fluß sogar gewünschtenfalls bei einigen Stufen der Pulsierung umgekehrt sein. Der Reaktor kann bei verschiedenen Geschwindigkeiten usw. arbei-

ten, aber beispielhafte Geschwindigkeiten sind 5 ml/ Min. Luftfluß und 0,4 ml/Min. Flüssigkeitseinlaß und 0,3 ml Flüssigkeit, die in die Fasern eindringt und an deren Enden abgeht.

Beim Verfahren der Erfindung kann ein beliebiger geeigneter Sauerstoffträger verwendet werden. Im allgemeinen ist Luft der bevorzugte Sauerstoffträger, jedoch können auch Träger, die gelösten Sauerstoff, wie Silikonpolymerisate, Hämoglobin, Fluorkohlenwasserstoffe und mit Sauerstoff beladenes Nährmedium mit den gewünschten Resultaten verwendet werden, obgleich spezielle Prozeduren oder Bedingungen dann erforderlich sein können, um den Sauerstoffbedarf zu befriedigen, um aerobes Wachstum zu erhalten. Wenn Luft oder andere geeignete Gasgemische von Stickstoff und Sauerstoff verwendet werden, ist auch bevorzugt, daß das Gas kleine Mengen an Kohiendioxyd, beispielsweise in der Größenordnung von 2—5 % enthält. Das Kohlendioxyd dient dazu, um einen Carbonatpuffer zu schaffen und trägt damit zur Aufrechterhaltung des pH des Mediums auf der anderen Seite der Membrane im gewünschten Bereich bei.

Die Zellen werden in einem Zellkulturnährmedium unter Zellwachstums-Erhaltungs-Bedingungen von pH und Temperatur inkubiert. Geeignete Zellenkulturnährmedien sind bekannt und solche können bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Kulturnährmedien enthalten typischerweise die bekannten essentiellen Aminosäuren, Vitamine, Kohlenhydrate, Mineralsäuren und vorzugsweise Blutserum. Fungizide und Bakterizide können auch in gewünschten Mengen in solchen Medien eingeschlossen sein, um das Wachstum von unerwünschten Mikroorganismen zu verhindern. Wie oben angegeben, wird der pH des Nährmediums vorteilhaft innerhalb des gewünschten Bereiches (typischerweise von 6,8—8,2) kontrolliert, indem geringe Mengen von Kohlendioxyd im Sauerstoffträger enthalten sind.

Gewünschtenfalls kann aber der pH kontrolliert werden, indem ein geeigneter Puffer, wie »HEPES«-Puffer (ein Gemisch von N-2-Hydroxyäthyl-piperazin und N'-2-Äthansulfonsäure) im Zellenkulturnährmedium selbst enthalten ist Andere geeignete Methoden zur Kontrolle des pH, wie Durchgehen des Mediums durch Ionenaustauscherharze, können auch angewandt werden.

Die Wahl der Temperatur für die Inkubierung der Zelle bleibt dem Fachmann auf dem Gebiet der Zellen- und Bindegewebekultivierung überlassen und hängt grundsätzlich von der physiologischen Temperatur der jeweiligen Zellen ab, die fortzupflanzen sind; das ist die optimale Temperatur, bei der Wachstum oder Erhaltung der Zellen stattfindet Wenn beispielsweise normale Säugetierzellen fortgepflanzt werden, wird typischerweise ein enger Temperaturbereich von etwa 35—40°C verwendet, während beispielsweise ursprünglich niedrigere oder höhere Temperaturen verwendet werden können, falls die Zellen Reptilienzellen sind.

Das Verfahren der Erfindung verwendet Hohlfasermembranen. Die Hohlfasermembranen können in beliebiger Form verwendet werden, wie beispielsweise als Bündel, in einzelnen Strängen oder in Maschenform. Die Hohlfaser muß natürlich gasdurchlässig sein, aber undurchlässig für Zellen. Die Membrane kann eine dichte Struktur haben oder eine »Loeb«-Struktur. Die Hohlfaser kann aus einem beliebigen geeigneten Material hergestellt werden, das nicht für die Zellen toxisch ist, das in geeigneter Weise zu Fasern versponnen werden kann und das ermöglicht, daß sich Zellen daran binden. Beispiele derartiger Materialien sind Polyolefine, wie Polyacrylnitril und Polystyrol, polyionische Polymerisate, Polykohlenhydrate, wie Cellulose und Cellulosederivate, beispielsweise Celluloseester, Polypeptide, wie Collagen, Silikonkautschukpolymerisate, Fluorkohlenwasserstoffpolymerisate usw. Es ist gefunden worden, daß Zellbildung an der Oberfläche der Membrane gefördert wird, wenn die Membrane eine erhöhte Oberflächenenergie besitzt, wie es durch die Anwesenheit von positiven oder negativen Ladungen evident wird. Das Binden von Zellen an eine andere geeignete Membrane kann gefördert werden, indem die Oberfläche, an die die Zellen gebunden werden sollen, mit Collagen überzogen wird.

Die optimalen Dimensionen für die Hohlfasern können schwanken und sind unter anderem von der Vorrichtung und von dem verwendeten Sauerstoffträger abhängig. Im allgemeinen liegt der Innendurchmesser der Hohlfaser im Bereich von etwa 10—300 Mikron, vorzugsweise im Bereich von 50—100 Mikron. Die Membranwand muß natürlich ausreichend dünn sein, um den gewünschten Durchgang zu ermöglichen und ausreichend dick sein, um nicht unter den angewandten Bedingungen zu zerbrechen. Geeignete Membrane haben typischerweise eine effektive Wandstärke von etwa 10 bis 100 Mikron.

Geeignete Zellen zur Fortpflanzung gemäß dem Verfahren der Erfindung sind Bindegewebszellen von Wirbeltieren, die imstande sind, sich an einer Oberfläche zu binden, zu wachsen oder zu erhalten. Natürlich können Zellen, die nicht zur Proliferation fähig sind, wie Erythrocyten, beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht verwendet werden. Beispiele von geeigneten Zellen sind diploide Zellquerschnitte, wie WI-38 menschliche Lungenfibroblaste, MRC-5 männliche menschliche Lungenfötus-Fibroblaste und DBS-FRh L-2 Rhesusaffen-Lungenfötus-Fibroblaste; primäre Zellen, wie Rinder- und menschliche Vorderhypophysenzellen, Hühnerembryo, Froschepithelzellen und Rattenleberzellen, gebildete Zellquerschnitte, wie »Hela«-menschliche Cervix (Carzinom) Zellen, Rhesusaffennierenzellen (LLC-MK₂), Baby-Nierenzellen vom syrischen Hamster (BHK-21) usw.

Es ist davon auszugehen, daß die obige Aufstellung von Zellen nur zur Veranschaulichung dient und daß andere Zellen aus anderen Quellen, einschließlich Vögel, Säugetiere, Reptilien und Amphibien einschließlich normale und abnormale Zellen nach dem Verfahren der Erfindung fortgepflanzt und erhalten werden können. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wurde die Herstellung der Zellen, die Herstellung des Inoculums und Zellenkultivierungsversuche unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

Beispiel 1
Herstellung der Zellen

Eine Kalbshypophyse, die durch Sektion eines frisch geschlachteten Tieres erhalten wurde, wurde annähernd 4 Stunden in einem Phosphat-gepufferten Salzmedium (PBS) gelagert, das folgende Zusammensetzung hatte:

Na₂HPO₄

CaCl₂

KH₂PO₄

MgCI₂x6H₂O

8,0 g
0,2 g
1,15 g
0,1g
0,2 g
0,1g

Penicillin

Streptomycin
destilliertes Wasser

100 000

Internationale

Einheiten

0,1g

900 ml

Reaktor

Die Temperatur des Mediums während der Lagerung betrug etwa 25° C. Das Vorderteil wurde von der Drüse seziert, gereinigt, um das Bindegewebe zu entfernen, und zerstückelt. Die zerstückelte Vorderdrüse wurde vorsichtig mit einer wäßrigen Lösung von Trypsin in einer Petri-Schale gemischt und das erhaltene Gemisch wurde 18 Stunden bei Zimmertemperatur unter sterilen Bedingungen stehengelassen, um die Freigabe von einzelnen Zellen an die Flüssigkeit zu erreichen. Die wäßrige Trypsinlösung wurde hergestellt, indem 10 ml PGS mit 250 000 Einheiten von getrocknetem, pulverförmigem Trypsinenzym und 0,75 ml 0,5 η Natronlauge gemischt werden. Die freigegebenen Hypophysezellen (Epithelzellen) wurden von dem übrigen Bindegewebe durch wiederholtes Zentrifugieren, Filtrieren und Waschen abgetrennt. Es wurde durch Zeilenzahlen (mit Hilfe eines Hämocytometers) festgestellt, daß die erhaltene gewaschene Zellensuspension 137 χ 10⁶ Zellen pro ml enthielt.

Herstellung des Inoculums

Um das Inoculum herzustellen, wurden 30 ml der

gewaschenen Zellensuspension auf 100 ml mit »Eagle's«-Basalmedium (EBM), das 10% Kalbfötusserum enthielt, verdünnt Die Zusammensetzung von 90% »Eagle's«-Basalmedium und 10% Kalbfötus war folgende:

mg/1

1-Argininchlorhydrat 105

1-Cystin 24

1-Histidinmonohydrochlorhydrat 31

1-Isoleucin 52

1-Lysinchlorhydrat 58

1-Leucin 52

1-Methiomin 15

1-Phenylalanin 32

1-Threonin 48

!-Tryptophan 10

1-Tyrosin 36

1-Valin 46

Cholinchlorid 1,00

Folinsäure 1,00

Isoinositol 1,00

Nicotinamid 1,00

Pantothensäure 1,00

Pyridoxal 1,00

Thiamin 1,00

Riboflavin 0,10

NaCl 6800

KCl 400

NaH₂PO₄ χ 2H₂O 150

NaHCO₃ 2000

CaCl₂ 200

MgCl₂ 200

Glukose 1000

1-Glutamin 212

Phenolharnstoff 20

Streptomycin 50

Penicillin 50 000

Internationale Einheiten

Die Kultivierung der Zellen wurde unter Verwendung eines Zellenkulturreaktors, der aus einem Bündel von 100 U-förmigen Polymerisat-Hohlfasern mit offenen Enden bestand, in einem 10-ml-Glaskolben durchgeführt Die beiden Enden der Faserbündel sind in separate Löcher eines 31öchigen Kautschukhalters eingepaßt wobei der Halter am Kolbenhals gelegen ist. Das dritte Loch des Halters ist für die Einleitung und Extraktion des Mediums vorgesehen. Das Hohlfasermaterial ist ein handelsübliches polyionisches Polymerisatmaterial. Jede Faser ist 10 cm lang und hat etwa 1/2 cm² Zellenwachstumsoberfläche. Jede Faser hat einen Innendurchmesser von 360 Mikron und eine Wandstärke von 80 Mikron, wobei die Wand eine »Loeb«-Ausbildung hat

Zellenkultivierung

Der Reaktor wurde unter Verwendung von ji-Propionlacton-Dämpfen sterilisiert und anschließend mit Phosphatpuffer gespült 8 ml oben hergestelltes Inoculum wurde in den Reaktor eingeleitet, um Zellen an die Außenwände der Fasern zu binden. Der Reaktor wurde in einen ummantelten Kohlendioxyd-Inkubator gestellt und der Inhalt wurde bei 37° C 49 Tage inkubiert Während der 49tägigen Inkubationszeit wurde ein gefiltertes Luftgemisch mit 3% Kohlendioxyd durch das Innere der Hohlfasern (mit einer Luftpumpe) gepumpt. Während der Inkubation wurde das Medium in 2tägigen Intervallen gewechselt Das abgezogene Medium wurde gesammelt und für die Analyse zurückbehalten. Nach Vervollständigung der Inkubationszeit wurde das Medium aus dem Reaktor abgezogen und ein starkes zusammenfließendes Wachstum der Zellen wurde auf den Hohlfasern beobachtet Die Zellen wurden anschließend für die mikroskopische Untersuchung durch Formaldehydfixierung und Aufbringen auf die Fasern präpariert. Es wurde durch mikroskopische Untersuchung festgestellt, daß die Zellen normal waren. Die zurückbehaltenen Medien wurden auf Milchsäure und Wachstumshormon analysiert Die Analyse zeigte, daß die zurückbehaltenen Gesamtmedien 700 Nanogramm Wachstumshormon enthielten und daß die Medien im wesentlichen frei von Milchsäure waren. Die wesentliche Abwesenheit von Milchsäure zeigt an, daß das Zellwachstum unter aeroben Bedingungen erreicht wurde.
Zur Kontrolle wurden 10 ml des oben hergestellten

so Zellen-Inoculum-Mediums in jeweils 2 »T«-Kolben gestellt und das Medium wurde in dem ummantelten Kohlendioxyd-Reaktor 49 Tage bei 37⁰C inkubiert (gleichzeitig mit dem Zellenkulturreaktor). Das Medium wurde in 2tägigen Intervallen gewechselt und das abgezogene Medium wurde gesammelt und zurückgehalten. Der Wachstumsbereich für jeden »"!"«-Kolben betrug 50 cm². Die zurückbehaltenen Medien wurden auf Wachstumshormon und Milchsäure untersucht. Die Analyse zeigte, daß die kombinierten Medien aus beiden Kolben 800 Nanogramm Wachstumshormon enthielten, (im Mittel 400 Nanogramm pro Kolben) und daß die Produktion von Milchsäure (bezogen auf Glukose) quantitativ war. Die quantitative Produktion von Milchsäure zeigte anerobe Zellenwachstumsbedingungen.

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Beispiel 2

In diesem Beispiel ist der verwendete Zellenkulturreaktor von der in der US-Patentschrift 32 28 877 beschriebenen Art. Der Reaktor besteht aus einem Bündel von 1000 kontinuierlichen Hohlfasern mit einer Gesamtaußenoberfläche von etwa 900 cm², die in einem röhrenförmigen Gehäuse enthalten sind. Die Hohlfasern sind an jedem Ende offen, um einen kontinuierlichen Fluß des Sauerstoffträgers zu ermöglichen. Ein Zelleninoculum-Medium von Schweine-Hypophysezellen (7,6 χ 10⁵ Zellen pro ml) wurde analog Beispiel 1 hergestellt. Der Zellenkulturreaktor wurde mit 33 ml Inoculummedium inoculiert, um Zellen an die äußere Oberfläche der Fasern zu binden. Die Inkubation wurde 6 Tage bei 37⁰C durchgeführt, um ein zusammenfließendes Wachstum der Zellen unter aeroben Bedingungen auf der Faser herbeizuführen. Während der 6tägigen Periode wurde Luft mit 3% Kohlendioxyd durch die Fasern pulsartig mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/ Min. (1 Puls alle 10 Sek.) geleitet Während der 6tägigen Periode wurde das Zellenkulturmedium kontinuierlich beschickt Nach anfänglicher Einleitung des Inoculums wurde der Mediumwechsel durch kontinuierliches Pumpen von Medium (EBM99 Kalbfötusi) in den Reaktor in Kontakt mit den äußeren Wänden der Fasern mit der Geschwindigkeit von 4 ml/Min, und aus dem Reaktor (mit Ausnahme des Mediums, das durch die Fasern abgeleitet wurde) mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/ Min. herbeigeführt. Durch diese Prozedur fließt das Medium radial durch die Zellschichten, durch die Wände der Fasern und in die Hohlkerne der Fasern. Das abgeführte Medium wurde untersucht und gefunden, daß es Wachstumhormon enthielt

Das radiale Fließen des Mediums bei der Prozedur dieses Beispieles sorgt für eine optimale Verteilung der Nährstoffe und hilft bei der Bildung von dichten Zellenschichten. Da bei radialem Fließen die kleineren Moleküle die Hohlfasermembrane leichter durchdringen als größere Moleküle, dient die Prozedur ferner dazu, große Moleküle (Kalbfötusserum, Hormone und andere Metabolite) auf der anderen Seite der Membrane zu konzentrieren.

Beispie! 3

Die allgemeine Prozedur des Beispieles 2 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß der Sauerstoffträger sauerstoffenthaltendes »Eagle's«-Basalmedium ohne Serum war, das durch das Innere der Hohlfasern mit einer Geschwindigkeit von 12 ml/Min, gepumpt wurde. Die Inkubation wurde 12 Tage durchgeführt Starkes zusammenfließendes Zellenwachstum wurde auf den Fasern beobachtet Zellenwachstum war während der ersten vier Tage aerob und danach anaerob.

Beispiel 4

Menschliche Embryo-Lungenfibroblaste (WI-38-Zellen in der 26. Generation) wurden nach der folgenden allgemeinen Prozedur der Beispiele 2 und 3 24 Tage bei 37° C in einem Zellenkulturreaktor, der aus einem Bündel von polymeren Hohlfasern in einem rechtwinkligen Gehäuse bestand. Die Fasern waren an jedem Ende offen, um einen kontinuierlichen Fluß des Sauerstoffträgers zu ermöglichen. Der pH des Zellenkulturmediums fluktuierte während der 24tägigen Inkubationszeit im Bereich von etwa 7,2 bis 7,9. Das Hohlfaserbündel hatte eine äußere Gesamtoberfläche von etwa 85 cm², von denen etwa 65 cm² der Oberfläche kontinuierlich während der 24tägigen Inkubationszeit im Medium eingetaucht waren. Die Zellen wurden an die äußeren Wände der Fasern wie in Beispiel 2 mit annähernd 58% der an die Außenwände der Fasern zu bindenden Zellen nach 18 Stunden gebunden. Die Zellendichte an den Fasern betrug nach 18 Stunden 1,56 χ 10⁴/cm² Oberfläche. Nach Vervollständigung der 18stündigen Bindungszeit wurde das Medium in und durch den Reaktor in Kontakt mit den Außenwänden der Fasern bei einer Geschwindigkeit von 4 ml/Stunde gepumpt und der Sauerstoff träger (Luft+3% CO₂) wurde durch die Fasern mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/Stunde geleitet. Um optimalen Kontakt des Mediums mit den Zellen zu erreichen, wurden die Fasern in dem Bünde! in einer ausgebreiteten Lage beibehalten und das Medium wurde in den Reaktor senkrecht zu den Fasern gepumpt. Zusammenfließendes Wachstum der Zellen an den Fasern wurde nach lOtägiger Inkubation mit einer zu beobachteten Zellendichte von 1 —1,5 χ 10⁵ erhalten. Nach der 14tägigen Inkubation betrug die Zellendichte 7,5 χ 10⁵ Zellen/cm². Die Zellen wurden weitere 10 Tage ohne Zunahme in der Zelldichte, die nach 14tägiger Inkubation erhalten wurde, gehalten. Nach 24tägiger Inkubationszeit wurden die Zellen von den Fasern durch Trypsinierung entfernt Die Zellen hatten bei der mikroskopischen Untersuchung ein normales Aussehen.
Es ist selbstverständlich, das erfindungsgemäße Verfahren unter Bedingungen durchzuführen, die passenden Sauerstoff für Zellenerhaltung oder Zellenwachstum unter aeroben Bedingungen gewährleisten. Durch Verwendung von Luft oder anderen Gasen in der Faser ist es möglich, Sauerstoff mit einer viel größeren Geschwindigkeit zu liefern (beispielsweise weist Luft 0,0029 g Sauerstoff/ml auf), verglichen mit viel niedrigeren Sauerstofflöslichkeiten in den meisten Flüssigkeiten. Auch die Diffusionsgeschwindigkeiten ist in Gasen schnell, aber viel langsamer in Flüssigkeiten. Luft ist etwa 4000mal so wirksam bei der Beschaffung von Sauerstoff als es ein mit Sauerstoff gesättigtes wäßriges System ist Andere gasförmige Systeme, die Sauerstoff enthalten, werden zweckmäßigerweise verwendet und jedes beliebige System mit einer Partialgasphase, wie ein Schaum, wird als gasförmiges System betrachtet Die Sauerstoffmenge, die im Sauerstoffträger benötigt wird, schwankt mit der Fließgeschwindigkeit und anderen Faktoren, aber Sauerstoffkonzentrationen, die größer als 50—100 Mikrogramm pro ml sind, sind allgemein geeignet Die praktischen Fließgeschwindigkeiten werden an der oberen Seite durch die Festigkeit der Fasern begrenzt und die Verwendung von hohen Sauerstoffkonzentrationen vermindert den Bedarf an hohen Fließgeschwindigkeiten. Ein gasförmiges System kann verschiedene andere Gase als Verdünnungsmittel zusammen mit Sauerstoff verwenden.

Allgemein ist es wünschenswert, daß derartige Verdünnungsmittel relativ inert sind oder mindestens nicht als solche bekannt sind, die einen starken schädlichen Einfluß auf die Zellkulturen haben und daß derartige Verdünnungsmittel nicht leicht mit Sauerstoff reagieren, um den zur Verfügung stehenden Sauerstoff aufzubrauchen. Das vorliegende Verfahren kann atmosphärische, unteratmosphärische oder überatmosphärische

Drucke verwenden und falls es aus einem bestimmten Grund wünschenswert ist bei unteratmosphärischen Drucken zu arbeiten, kann Sauerstoff bei etwa 0,2 Atmosphären verwendet werden und es ist dann nicht not-

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wendig, irgendein Verdünnungsmittel anstelle von Sauerstoff zu verwenden. Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet nicht Sauerstoff in derartig hohen Konzentrationen, daß der Tod einer erheblichen Anzahl von Zellen herbeigeführt wird. Bei der Produktion von ZeI-lfcn ist es natürlich wünschenswert, hohe Produktionsund Wachstumsgeschwindigkeiten zu erreichen, und das unter aeroben Bedingungen. Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es daher wünschenswert, Sauerstoff zu liefern, der den Maximalbedarf daran überschreitet, um aerobes Wachstum oder aerobe Erhaltung bei der maximalen Zellenproduktionsgeschwindigkeit und mit der maximalen Zellendichte, die schließlich erreicht wird, zu schaffen, und das auch bei der Langzeitkultivierung. Natürlich werden einige der Vorteile des Verfahrens definitiv erreicht, wenn das Zellenwachstum unter aeroben Bedingungen mit mehr als der passenden Sauerstoffmenge für eine akzeptable Zeit stattfindet, sogar dann, wenn anschließend etwas anaerobes Wachstum wegen der Produktion von vielen Zellschichten stattfindet, die die Sauerstoffdiffusion behindern.

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung oder in vitro-Erhaltung von Zellen durch Inkubieren einer Suspension der Zellen in einem Zellkulturmedium unter Zellenwachstums- oder Zellenerhaltungs-Bedingungen von pH und Temperatur unter Anwendung einer nichttoxischen, sauerstoffdurchlässigen Membran, über die Sauerstoff zugeführt wird, d a durch gekennzeichnet, daß

b) die gegenüberliegende Wand der Membran mit intermittierenden Stößen eines gasförmigen Sauerstoffträgers in Berührung gebracht wird, wobei der Durchgang des Sauerstoffs durch die Membran bewirkt, der Sauerstoff mit den an der anderen Seite der Membran gebundenen Zellen in Berührung gebracht und der Sauerstoff in einer solchen Konzentration zugeführt wird, die ausreicht, um aerobes Wachstum zu erhalten.

2. Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung oder in vitro-Erhaltung von Zellen durch Inkubieren einer Suspension der Zellen in einem Zellkulturmedium unter Zellenwachstums- oder Zellenerhaltungs-Bedingungen von pH und Temperatur unter Anwendung einer nichttoxischen, sauerstoffdurchlässigen Membran, über die Sauerstoff zugeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die Suspension der Zellen mit der äußeren Wand einer nichttoxischen, sauerstoffdurchlässigen, kontinuierlichen Hohlfaserrnembran, die offene Enden hat, in Berührung gebracht wird, wobei diese offenen Enden für die Suspension unzugänglich sind und wobei die Zellen an diese äußere Wand der Hohlfasermembran gebunden werden, und

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nährmedium außerhalb der Hohlfasern vorgesehen ist, das durch die Hohlfaserwände hindurch in die Hohlkerne fließt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung oder in vitro-Erhaltung von Zellen durch Inkubieren einer Suspension der Zellen in einem Zellkulturmedium unter Zellenwachstums- oder Zellenerhaltungs-Bedingungen von pH und Temperatur unter Anwendung einer nichttoxischen, sauerstoffdurchlässigen Membran, über die Sauerstoff zugeführt wird.

Die in vitro-Kultivierung von Wirbeltierzellen, d. h. die Kultivierung dieser Zellen unabhängig vom Wirtstier, ist seit langem bekannt Es wird angenommen, daß die erste derartige Kultivierung in der ersten Dekade dieses Jahrhunderts vorgenommen wurde. Sie bestand darin, daß man infektiöse Kaninchen-Lymphosarkom-Zellen im Blut kultivierte.
Trotz langjähriger Erfahrung hat diese Technik erst in den letzten Jahren eine größere Bedeutung erlangt Diese erhöhte Bedeutung ist in erster Linie bedingt durch den Bedarf an vielen Arten von Wirbeltierzellen für die humanmedizinische und tiermedizinische Forschung und Diagnose, die Kultivierung von infektiösen Materialien, wie Viren, und die großtechnische Herstellung von Hormonen und anderen biologischen Produkten. Gegenwärtig ist d^r Bedarf an Säugetierzellen besonders hoch, insbesondere an normalen Säugetierzellen, die zur Kultivierung an eine Oberfläche gebunden sein müssen im Gegensatz zur Kultivierung in einer Suspensionskultur.

Es sind bereits zahlreiche Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung oder in vitro-Erhaltung von an ein Substrat gebundenen Zellen entwickelt worden. Bei den bisher erfolgreichsten Verfahren dieser Art werden entsprechende Zellen an die innere Oberfläche von Glas- und Kunststoffröhren und von Flaschen gebunden und kultiviert Ein anderes erfolgreiches Verfahren besteht darin, daß die gewünschten Zellen an die ebene Fläche von in geeigneter Weise ausgebildeten feststehenden Flaschen gebunden und kultiviert werden. Es sind bereits viele verschiedene Arten von Zellen auf diese und andere Weise gezüchtet worden, wobei die Verfahren am erfolgreichsten sind, bei denen abnorme oder veränderte Zellen erhalten werden, d. h. Zellen, die eine abnorme oder verschiedene Anzahl von Chromosomen gegenüber Normalzellen der gleichen Species besitzen und welche die Fähigkeit haben, sich unbestimmbar oft zu regenerieren.

Diese und andere bekannte Verfahren haben jedoch verschiedene Nachteile, insbesondere bei der großtechnischen Herstellung von normalen, unveränderten Säugetierzellen. Normale Zellen besitzen nämlich im Unterschied zu abnormen Zellen die normale Anzahl von Chromosomen und regenerieren sich vor der Alterung oder vor dem Tod nur in einer vorhersagbaren Anzahl von Fällen.

Der Hauptnachteil der bekannten Verfahren bei der in vitro-Fortpflanzung von normalen Säugetierzellen ergibt sich daraus, daß es mit den bekannten Verfahren bisher schwierig war, aerobe Bedingungen zu schaffen. Wenn nämlich nicht genügend Sauerstoff an die normalen Zellen herangebracht werden kann, behalten sie nicht ihre normale differenzierte Funktion. Ein weiterer Nachteil der bekannten Verfahren zur in vitro-Fortpflanzung von an ein Substrat gebundenen Zellen — ob normal oder abnorm — besteht darin, daß es danach schwierig ist, bindegewebsähnliche Dichten auf der Substratoberfläche zu erzielen aufgrund von Froblemen, die mit der Nährstoffdiffusion innerhalb des Bindegewebes zusammenhängen. Ferner lassen sich die bisher bekannten Verfahren nicht leicht auf die großtechnische Produktion übertragen und eignen sich daher nicht, Zellen in großen Mengen wirtschaftlich herzustellen.

Vor kurzem ist ein Verfahren bekannt geworden, bei dem Hohlfasern für die Zellenkultivierung verwendet werden (vgl. »Science« [1972], Seiten 65—67). Bei den