DE2442995C2 - Proteasefreie Kallikreinlösungen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus gereinigtem Kallikrein und ihre Verwendung als Arzneimittel - Google Patents

Proteasefreie Kallikreinlösungen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus gereinigtem Kallikrein und ihre Verwendung als Arzneimittel

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft stabile, proteasefreie und injizierbare Kallikrein-Lösungen bisher noch nicht erreichter Stabilität und Reinheit ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus gereinigtem Kallikrein sowie solche Kallikrein-Lösungen enthaltende Arzneimittel.
Bezüglich der therapeutischen Wirkung von Kallikrein ist folgendes zu sagen:
Bei Einwirkung auf körpereigenes Kininogen setzt Kallikrein die physiologisch-wirksamen Kinine (z. B. Kallidin) frei. Kallikrein-Präparate werden daher therapeutisch verwendet (E. K. Frey, H. Kraut E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke, Stuttgart, 1968, S. 150 f).
Es ist bereits bekanntgeworden, daß reines Kallikrein z. B. aus Pankreasdrüsen von Schweinen nach dem Verfahren der DE-OS 21 54 557 hergestellt werden kann. Die Anwendung an Patienten erfolgt bevorzugt oral oder durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion.
Bisher war es aber nicht möglich, über längere Zeit haltbare Injektionslösungen herzustellen. Die in Ampullen abgefüllte Kallikrein-Lösung wurde deshalb i. a. durch Gefriertrocknung zur Trockne und damit in die stabilere feste Form gebracht und das feste Kallikrein vor Gebrauch in einer geeigneten isotonischen Lösung gelöst.
Dieses Vorgehen ist umständlich und zeitraubend und hat zudem den Nachteil, daß die geringen, physiologisch wirksamen Kallikrein-Mengen nur in Anwesenheit von inerten Zusätzen als Gerüstbildner gefriergetrocknet werden können, z. B. Polyvinylpyrrolidon, Mannit Dextran, Lactose u. a.; somit werden zusammen mit dem Wirkstoff prinzipiell unerwünschte Fremdstoffe injiziert
Weiterhin konnte bisher eine Stabilisierung der Lösungen von KallikreiiM grundsätzlich dadurch erreicht werden, daß man der Kallikrein-Lösung geeignete, Kallikrein nicht hemmende Inhibitoren, zusetzte und die Proteasen-Verunreinigungen dadurch unwirksam machte. Derartige Zusätze von Fremdstoffen mit biologischer Wirksamkeit sind jedoch bei einem Arzneimittel höchst unerwünscht.
In der Praxis hat diese Methode jedoch keine ausreichende Stabilisierung erbracht. Ursache dürfte sein, daß die Proteasen-Inhibitor-Bindung grundsätzlich reversibel ist und auch bei einer sehr kleinen Dissoziationskonstanten immer eine geringe Menge freie Protease in Lösung vorhanden ist und das Kallikrein denaturieren kann. Darüber hinaus werden die meisten natürlichen Inhibitoren — wenn auch sehr langsam — durch die Proteasen abgebaut und damit unwirksam. Diese Nachteile vermeidet das erfindungsgemäße Verfahren und erst dadurch wird eine praktisch
ίο nutzbare Stabilisierung erreicht Insbesondere, wenn die Kallikrein-Lösung über eine Säule des trägergebundenen Inhibitors gegeben wird, ist das Verhältnis von Inhibitor zu restlicher Protease im unteren Teil der Säule so hoch, daß die Protease praktisch vollständig entfernt wird.
Es war deshalb erstrebenswert ein Verfahren zu finden, um über längere Zeit stabile hochreine Lösungen von Kallikrein ohne Fremdzusätze herzustellen.
Es wurde gefunden, daß man stabile, proteasefreie und injizierbare Kallikrein-Lösungen bisher noch nicht bekannter Stabilität und Reinheit durch Behandlung von reinen Kallikreinlösungen mit einem trägergebundenen wasserunlöslichen Proteaseinhibitor, der Kallikrein nicht hsmmt gewinnen kann. Es wurde weiterhin gefunden, daß auch die reinsten bisher bekanntgewordenen Präparate von Kallikrein noch Spuren an proteolytischen (eiweißspaltenden) Fermenten in einer Größenordnung < 1 % enthalten und daß überraschenderweise ein direkter Zusammenhang zwischen dem Proteasen-Gehalt verschiedener Kallikrein-Präparate und ihrer Haltbarkeit in Lösung besteht. Der Verlust an Kallikreinaktivität bei der Aufbewahrung der Lösung ist, wie wir festgestellt haben, auf eine Zerstörung des Kallikreinmoleküls durch Proteasen zurückzuführen.
Diese Proteasen-Verunreinigungen lassen sich mit den üblichen Reinigungsverfahren z. B. Ionenaustauschchromatographie nur schwierig und unter großen Verlusten an Kallikrein-Aktivität abtrennen.
Überraschenderweise ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens auf eine solch einfache und elegante Weise möglich, über einen längeren Zeitraum stabile, hochreine Kallikreinlösungen herzustellen, ohne daß Stabilisatoren zugesetzt werden müssen bzw. ohne daß das Kallikrein zuerst lyophilisiert und erst kurz vor Gebrauch zur geeigneten isotonischen Lösung gebracht werden muß.
Die Erfindung betrifft daher stabile, proteasefreie Kallikrein-Lösung, hergestellt durch Behandlung von hochgereinigtem Kallikrein in verdünnter, wäßriger
so Lösung, die 1 bis 50 000 KE/ml enthält, bei einem ph-Wert von 5,0 bis 8,0 mit einem trägergebundenen wasserunlöslichen Proteaseinhibitor, welcher Kallikrein nicht hemmt.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren solcher stabiler proteasefreien Kallikrein-Lösungen, das darin besteht, daß man hochgereinigtes, gegebenenfalls kristallisiertes Kallikrein in verdünnter, wäßriger Lösung die 1 bis 50 000 KE/ml enthält bei einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0 mit einem trägergebundenen, wasserunlöslichen und Kallikrein nicht hemmenden Proteaseinhibitor behandelt.
Die Erfindung betrifft schließlich auch noch ein Arzneimittel, das durch einen Gehalt an der erfindungsgemäßen Kallikrein-Lösung gekennzeichnet ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Kallikreinlösungen bisher noch nicht erreichter Stabilität und Reinheit stellt einen großen Fortschritt auf dem Gebiet der Pharmazie dar.
Bezüglich der beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten trägergebundenen Inhibitoren ist folgendes zu sagen:
Als Inhibitoren eignen sich dabei insbesondere natürlich vorkommende Inhibitoren mit Polypeptidstruktur z. B. ein Gemisch verschiedener Proteaseinhibitoren aus Sojabohne oder aus Kartoffel, oder der gereinigte Trypsininhibitor aus Sojabohne (Kunitz) oder gereinigte Proteaseinhibitoren aus Kartoffel oder der Ovomucoid-Inhibitor aus Hühnerei Insbesondere das ι ο Proteaseninhibitor-Gemisch aus Kartoffel ist ein leicht zugängliches Material, das sich für den erfindungsgemäßen Zweck gut eignet
Die Bindung der obengenannten Inhibitoren an wasserunlösliche Träger erfolgt nach allgemeinen, dem Fachmann bekannten Verfahren. Dabei müssen jedoch in jedem Einzelfall die optimalen Bedingungen in einer großen Zahl von Versuchen ermittelt werden.
Zum Beispiel kann man die genannten Inhibitoren oder weitere mit ähnlichen Eigenschaften nach DOS 19 07 365 an vernetzte Agarose binden, indem man diese zuvor mit BrCN aktiviert In der gleichen Weise kann man die Inhibitoren auch an andere hydroxylgruppenhaltige Träger binden, z. B. an Cellulose oder quervernetztes Dextran.
Oder man kann zunächst eine niedermolekulare Amino-Verbindung mit BrCN an einen der vorgenannten Träger binden, so daß ein Derivat mit einer freien Amino- oder Carboxyl-Gruppe entsteht, an die man den Inhibitor mittels eines wasserlöslichen Carbodiimids bindet. Als niedermolekulare Aminoverbindung verwendet man dabei z. B. 1,6-Diaminohexan oder 6-Aminocapronsäure.
Des weiteren kann man die Inhibitoren an carbonsäureanhydridhaltige Polymere binden, z. B. an ein Copolymerisat aus Tetraäthylenglykoldimetharcrylat und Maleinsäureanhydrid nach DE-OS 22 15 539 oder ein Copolymerisat aus Tetraäthylenglykoldimethacrylat, Maleinsäureanhydrid und einem hydrophilen Monomeren z. B. Methacrylsäure nach DE-OS 22 15 687.
Weitere anwendbare Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher trägergebundener Inhibitoren sind z. B. von P. Cuatrecasas und Ch. B. Anfinsen (Annual Reviews of Biochemistry, 1971) zusammenfassend beschrieben worden.
Die Behandlung des nach DE-OS 2154 557 oder anderen geeigneten Verfahren hergestellten hochgereinigten gegebenenfalls kristallisierten Kallikreins mit den trägergebundenen Inhibitoren zum Zwecke der Stabilisierung erfolgt erfindungsgemäß in verdünnter wäßriger Lösung, enthaltend 1 bis 50 000 KE/ml bei einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0. Die Lösung kann die üblichen Neutral- oder Puffer-Salze in Konzentrationen bis zu 1,0 M enthalten, z. B. Alkalimetall- oder Ammoniumchlorid, -acetate, -formiate, -carbonate, -citrate, -phosphate u.a. Zweckmäßig erfolgt die Behandlung in salzfreier oder gegebenenfalls isotonischer NaCI- oder acetathaltiger Lösung, damit die stabilisierte Lösung unmittelbar ohne Entsalzung zur Herstellung therapeutischer Präparate verwendet wer- to den kann. Die Lösung kann ferner geeignete Konservierungszusätze z. B. Äthyl-mercuri-thiosalicylat oder Benzylalkohol enthalten.
Die Behandlung der wäßrigen Kallikrein-Lösung mit dem trägergebundenen Inhibitor kann so durchgeführt *>5 werden, daß man den trägergebundenen Inhibitor in die Kallikrein-Lösung einrührt und nach einer Reaktionszeit von mindestens 10 Minuten durch Filtration oder Zentrifugation abtrennt. Günstig ist aber die Arbeitsweise, daß man den trägergebundenen Inhibitor in ein Chromatographierohr einfüllt und die Kallikreinlösung hindurchlaufen läßt
Die erforderliche Menge an trägergebundenem Inhibitor hängt ab vom verwendeten Inhibitor und dem Grad der Proteasen-Verunreinigung der zu behandelnden Lösung. Die trägergebundenen Inhibitoren lassen sich durch Behandlung mit verdünnten Säuren oder mit sauren Puffern regenerieren und mehrmals verwenden.
Der Erfolg der Behandlung der Kallikrein-Lösung mit trägergebundenen Inhibitoren zeigt sich am verringerten Proteasengehalt und der verbesserten Stabilität
Der Proteasengehalt wird gemessen durch Titration der freigesetzten Aminosäuren-Carboxylgruppen bei der Einwirkung der proteasenhaltigen Kallikreinlösung auf Casein. Man verwendet eine 6%ige Lösung von Casein (nach Hammersten, Merck 2242) in 0,1 N KCl und titriert mit 0,02 N KOH bei pH 9,5 und 300C. 1 Proteasen-Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die in 1 Minute unter den angegebenen Bedingungen 1 Mikroäquivalsnt Peptidbindung spaltet
Die Stabilitätsprüfung der Kallikreinpräparate wurde zur Verkürzung der Beobachtungszeit bei 400C durchgeführt Die Kallikreinaktivität wird durch Messung der Hydrolyse von N-Benzoyl-L-argininäthylester in der von der F.I.P. (Federation Internationale Pharmaceutique) standardisierten Ausführungsform als titrimetrischer Test bestimmt. 1 F.I.P.-Einheit ist definiert als die Kallikreinmenge, die in einer Minute bei pH 8,0 und 25°C 1 Mikromol N-Benzoyl-L-argininäthylester spaltet. Die Umrechnung in die gebräuchlichen Kallikrein-Einheiten (KE) nach der Definition von Frey, Kraut und Werle erfolgt durch Multiplikation mit dem Faktor 6,37.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Kallikreinlösungen können in an sich bekannter Weise und in an sich bekannten Dosierungen direkt als Arzneimittel eingesetzt und oral oder durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion appliziert werden. Die erfindungsgemäßen proteasefreien, stabilen Kallikreinlösungen werden zweckmäßigerweise in Ampullenform aufbewahrt.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Die F i g. 1 dieser Anmeldung enthält einen Vergleich der Haltbarkeit von verschiedenen Kallikreinpräparaten aus den nachstehenden Beispielen. Dabei wurde die Aktivität in Prozent der jeweiligen Ausgangsaktivität (= 100) in Relation mit der Lagerzeit (ausgedrückt in Tagen) gebracht. Die einzelnen Kurven bedeuten dabei folgendes:
Kurve 1:
behandeltes Kallikrein aus Beispiel Ib
Kurve 2:
behandeltes Kallikrein aus Beispiel 6
Kurve 3:
behandeltes Kallikrein aus Beispiel 5c
Kurve 4:
behandeltes Kallikrein aus Beispiel 3b
Kurve 5:
unbehandeltes Kallikrein aus Beispiel 2
Kurve 6:
behandeltes Kallikrein aus Beispiel 10
Kurve 7:
unbehandeltes Kallikrein aus
Beispielen 1 und 3 bis 10
Bei allen in den folgenden Beispielen angegebenen Kallikrein-Einheiten (KE) handelt es sich um Einheiten nach Frey, Kraut und Wehrle.
Beispiel 1
a) Bindung von Soja-Trypsin-Inhibitoren an Sepharose
10 ml Sepharose 4 B (Pharmacia), einer vernetzten Agarose, werden mit Wasser gewaschen, in 20 ml Wasser suspendiert und bei pH 11 bis 11,5 mit 550 mg BrCN in 20 ml Wasser 5 Minuten aktiviert. Es wird über eine Glasfritte abgesaugt und mit eiskalter 0,1 M NaHCC>3-Lösung kurz gewaschen. Die aktivierte Sepharose wird sofort in 30 ml kalter 0,1 M NaHCO3-Lösung suspendiert und 100 mg Soja-Trypsin-ltihibiior (reinst, Serva) zugefügt. Die Mischung wird 24 Stunden bei ca 4° C gerührt. Dann saugt man den trägergebundenen Inhibitor über eine Fritte ab und wäscht mit 0,1 M Borat pH 8,0,0,1 M Acetat pH 4,0 und Wasser.
Aus der spektrophotometrischen Bestimmung des ungebundenen Inhibitors im Filtrat und Waschwasser ergab sich eine Bindung von 94 mg.
b) Behandlung von Kallikrein mit trägergebundenem Soja-Trypsin-Inhibitor
50 mg Kallikrein mit einer spezifischen Aktivität von 1013 KE/mg und einem Proteasengehalt von 0,065 E/mg wurden in 10 ml H2O gelöst und über eine Säule (0,9 · 15 cm) enthaltend 10 ml des nach la) hergestellten trägergebundenen Inhibitors filtriert. Das Kallikrein enthaltende Filtrat wurde lyophilisiert und ergab 49 mg mit 1010 KE/mg (= 97,5% der Theorie) und einem Proteasengehalt von 0,005 E/mg.
Der Vergleich der Stabilität von Ausgangsmaterial und Produkt ist in F i g. 1 dargestellt.
In der F i g. 1 (Vergleich der Haltbarkeit von Kallikrein-Präparaten) ist auf der Ordinatenachse die jeweilige Aktivität der Kallikreinpräparate in Prozent der Ausgangsaktivität (=100) aufgetragen, während auf der Abszissenachse die Lagerzeit der Kaliikrein-Präparale in Tagen angegeben ist.
Beispiel 2
mg Kallikrein mit einer spezifischen Aktivität von KE/mg und einem Proteasen-Gehalt von 0,058 E/mg wurden in Wasser gelöst und über 22 ml eines nach la) hergestellten trägergebundenen Soja-Trypsin-Inhibitors filtriert Das Filtrat ergab nach der Gefriertrocknung 695 mg mit einer spezifischen Aktivität von 1050 KE/mg (= 95% der Theorie) und einem Proteasengehalt von 0,005 E/mg.
Beispiel 3
a) Bindung von Ovomucoid-Inhibitor an Sepharose
In analoger Weise wie unter la) beschrieben, wurden 10 ml Sepharose mit BrCN aktiviert und mit 100 mg Ovomucoid (Worthington) umgesetzt Es wurden 78 mg Ovomucoid gebunden.
b) 50 mg Kallikrein (spez. Aktivität: 1013 KE/mg; Proteasen: 0,065 E/mg) wurden in 0,02 Ammoniumacetat pH 6,0 gelöst und über eine Säule (0,9 15 cm) enthaltend 10 ml des nach 3a) hergestellten trägergebundenen Inhibitors filtriert Die Kallikrein-Ausbeute im Filtrat betrug 92% der Theorie. Eine Probe wurde über Sephadex G-25 entsalzt und lyophilisiert: spezifische Aktivität: 980 KE/mg; Proteasen: 0,008 E/mg. Zur Stabilität dieser Probe s. F i g. 1.
Beispiel 4
■"> a) Herstellung von Inhibitoren-Gemisch aus Kartoffel Gewaschene Kartoffeln werden zerkleinert und in einer Mischung von 0,95 kg Methanol, 0,375 kg destilliertem Wasser und 0,025 kg 60% Perchlorsäure je kg Kartoffel suspendiert. Ungelöstes wird
in über eine Filterpresse abgetrennt. Die Perchlorsäure wird durch Zugabe von Kaliumcarbonat bis pH 5,5 neutralisiert. Ausgefälltes Kaliumperchlorat wird abfiltriert. Das Filtrat durch Eindampfen im Vakuum konzentriert, dann dialysiert und schließ-
Ii lieh gefriergetrocknet. Man erhält ca. 450 mg Inhibitcr/k" Kartoffel.
b) Bindung von Inhibitoren-Gemisch aus Kartoffel an Sepharose
160 mg eines Inhibitoren-Präparates nach 4a) 2(i wurden in analoger Weise wie unter la) beschrieben mit 40 ml BrCN-aktivierter Sepharose umgesetzt. Es wurden 139 mg Inhibitor gebunden.
c) 50 mg Kallikrein (spez. Aktivität 1013 KE/mg; Proteasen: 0,065 E/mg) wurden in 0,05 M Ammoniumacetat pH 6,0 gelöst und über eine Säule (0,9-15 cm) enthaltend 10 ml des nach 4b) hergestellten trägergebundenen Inhibitors filtriert. Die Kallikrein-Ausbeute im Filtrat betrug 89% der Theorie. Eine entsalzte und lyophilisierte Probe hatte eine spezifische Aktivität von 1010 KE/mg und einen Proteasen-Gehalt von 0,004 E/mg.
Beispiel 5
a): Herstellung von gereinigtem Proteasen-Inhibitor aus Kartoffel
80 g eines nach Beispiel 4a hergestellten Proteaseninhibitorgemisches aus Kartoffel werden auf eine Säule (0,5 - 110 cm) enthaltend 7 1 Carboxymethyl-Sephadex C-50 in 0,01 M Ammoniumacetat pH 5,4 aufgetragen. Man wäscht anschließend zuerst mit 2 1 des Ausgangspuffers und eluiert dann mit einem linearen Konzentrationsgradienten bis 1 M Ammoniumacetat pH 5,4. Fraktionen mit hoher Inhibitor-, Wirksamkeit gegen Pankreasproteasen werden vereinigt, konzentriert, dialysiert und gefriergetrocknet Man erhält ein angereichertes Inhibitorpräparat in ca. 12% Gewichtsausbeute bezogen auf das eingesetzte Rohpräparat bzw. 55 mg/kg Kartoffel.
so b) Bindung von gereinigtem Proteasen-Inhibitor aus Kartoffel an Sepharose
In gleicher Weise wie in 4b) beschrieben, wurden 160 mg eines gereinigten Inhibitor-Präparates aus Kartoffel mit 40 ml Sepharose umgesetzt Es : wurden 146 mg des Inhibitors gebunden. .
c) In gleicher Weise wie in 4c) wurden 50 mg Kallikrein mit 10 ml des nach 56 hergestellten ; trägergebundenen Inhibitors behandelt Die Ausbeute betrug 95% der Theorie, die spezifische Aktivität 1010 KE/mg, der Proteasengehalt 0,009 E/mg.
Zur Haltbarkeit dieses Präparates vgi Fi g. 1.
Beispiel 6
Je 4 ml der nach Beispiel 1 a), 3a) und 5a) hergestellten trägergebundenen Inhibitoren wurden gemischt und mg Kallikrein analog Beispiel 4c) mit dem Gemisch behandelt Die Ausbeute betrug 96%, die spezifische
Aktivität 1000 KE/mg, der Proteasen-Gehalt 0,007. Zur Haltbarkeit dieses Kallikrein-Präparates vgl. F i g. 1.
Beispiel 7
a) Bindung von 1,6-Diaminohexan an Sepharose
100 ml Sepharose wurden mit 15 g BrCN aktiviert und dann mit 23,3 g 1,6-Diaminohexan umgesetzt. Das Produkt wurde mit Boratpuffer pH 8,5, Acetatpuffer pH 4,0 und Wasser gewaschen. Eine gefriergetrocknete Probe hatte einen N-Gehalt von 5,9%.
b) Bindung von Proteaseninhibitor aus Kartoffel an mit 1,6-Diaminohexan substituierte Sepharose
16 ml des Sepharose-Derivats nach 7a) wurden in 15 in! Wasser suspendiert und nach Zugabe von 200 mg Proteaseninhibitor aus Kartoffel (nach Beispiel 5a)) und 200 mg ÄthyI-(3-di-methyIaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (Merck) 24 Stunden bei pH 4,7 gerührt. Sodann wurde abfiltriert und mit 1 M NaCl und Wasser gewaschen. Es wurden 189 mg Inhibitor gebunden.
c) 50 mg Kallikrein wurden wie in Beispiel 4c) beschrieben mit dem nach 7b) hergestellten trägergebundenen Inhibitor behandelt. Die Ausbeute betrug 93% der Theorie, die spezifische Aktivität 995 KE/mg, der Proteasengehalt 0.011 E/mg.
Beispiel 8
a) Bindung von Proteaseninhibitor aus Kartoffel an mit 6-Aminocapronsäure substituierte Sepharose 16 ml mit 6-Aminocapronsäure substituierte Sepharose (CH-Sepharose) wurden wie in Beispiel 7b) beschrieben mit 200 mg Proteaseninhibitor aus Kartoffel umgesetzt: Es wurden 195 mg Inhibitor gebunden.
b) 50 mg Kallikrein wurden wie in Beispiel 4c) beschrieben mit dem nach 8a) hergestellten trägergebundenen Inhibitor behandelt Die Ausbeute betrug 92% der Theorie, die spezifische Aktivität 988 KE/mg, der Proteasengehalt 0,0095 E/mg.
Beispiel 9
a) Herstellung eines Copolymerisats aus Tetraäthylenglykoldimethacrylat, Methacrylsäure und Maleinsäureanhydrid
60 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 30 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 300 ml Acetonitril gelöst Diese Lösung wird in 1 1 Benzin (Kp 100—14O0C), welches 5 g eines Gemisches von Glycerin-mono- und dioleat enthält, suspendiert und 22 Stunden bei 6O0C polymerisiert.
Die Polymerperlen werden abfiltriert dreimal in Benzol und zweimal in Petroläther (Kp 30 -500C) suspendiert und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 94 g
Schüttvolumen: 44 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 5,5 ml/g
Spezifische Oberfläche: 6,6 m2/g
Säuregehalt nach Verseifung
der Anhydridgruppen: 4,3 m Äqu/g
b) Bindung von Proteaseninhibitor aus Kartoffel
10 g eines Copolymerisats nach Beispiel 9a) wurden mit 100 ml Aceton gewaschen und anschließend in 880 ml Wasser suspendiert Es wurden 40 ml 0,1 M Triethylamin zugefügt und genau 1 Minute mit 0,1 M Essigsäure pH 6,2 eingestellt Dann wurde 1,0 g Proteaseninhibitor aus Kartoffel nach Beispiel 5a) zugefügt und der pH auf 6,2 gehalten. Nach 24 Stunden wurde der trägergebundene Inhibitor abfiltriert, mit 0,1 M Borat pH 8,5,0,1 M Acetat pH 4,0 und Wasser gewaschen.
Es wurden 280 mg Inhibitor gebunden.
c) 50 mg Kallikrein wurden wie in Beispiel 4c) beschrieben mit 10 ml des nach 9b) hergestellten trägergebundenen Inhibitors behandelt Die Ausbeute betrug 88% der Theorie, die spezifische Aktivität 1005 KE/mg, der Proteasengehalt 0,011 E/mg.
Die Ergebnisse der Behandlung von Kallikrein mit den verschiedenen trägergebundenen Inhibitoren sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt
10
15
20
25
30
Tabelle
Ergebnis der Behandlung von Kallikrein mit trägergebundenen Inhibitoren
Beispiel Ausgangsmaterial KE/mg Protease-E/mg
Behandeltes Kallikrein Ausbeute % KE/mg
Proteasen-E/mg
1013
1080
0,065
0,058
97,5
92
89
95
96
93
92
88
95 1010
980
1010
1010
1000
995
988
1005
1050
0,005
0,008
0,004
0,009
0,007
0,011
0,0095
0,011
0.005
10. Vergleichsbeispiel
Chromatografie von hochgereinigtem Kallikrein
an DEAE-sephadex A-50
100 mg Kallikrein mit einer spezifischen Aktivität von 1013KE/mg und einem Proteasengehalt von 0,065 E/mg wurden in 50 ml Natnumacetatpuffer pH 5,0,12 mS/cm gelöst und über eine Säule 2,5 ■ 40 cm mit DEAE-Sephadex A-50 im gleichen Puffer gegeben. Die Säule wurde nachgewaschen mit 300 ml Natriumacetat pH 5,0, 14 MS/cm und eluiert mit einem linearen Gradienten aus je 300 ml Natriumacetat pH 5,0, 14mS/cmbzw.0,5 M.
Die aktiven Fraktionen des Eluats (210 ml) wurden vereinigt, durch Ultrafiltration auf 20 ml konzentriert, über eine Säule von Sephadex G-25 entsalzt und gefriergetrocknet.
Ausbeute:
Proteasengehalt:
61 mgmitl320KE/mg = 79%
0,014 E/mg
ίο Die Stabilität dieses Präparates ist in Fig. 1 dargestellt.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Stabile, proteasefreie Kallikreinlösung, hergestellt durch Behandlung von hochgereinigtem, gegebenenfalls kristallisiertem Kallikrein in verdünnter, wäßriger Lösung, die 1 bis 50 000 KE/ml enthält, bei einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0 mit einem trägergebundenen, wasserunlöslichen Proteaseinhibitor, welcher Kallikrein nicht hemmt
2. Verfahren zur Herstellung der stabilen, proteasefreien Kallikreinlösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man hochgereinigtes, gegebenenfals kristallisiertes Kallikrein in verdünnter, wäßriger Lösung, die 1 bis 50 000 KE/ml enthält, bei einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0 mit einem trägergebundenen, wasserunlöslichen und Kallikrein nicht hemmenden Proteaseinhibitor behandelt
3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Kallikreinlösung gemäß Anspruch 1.
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