DE2535574A1

DE2535574A1 - Fluoreszenzloeschung mit immunologischen paaren bei immuno-analysen

Info

Publication number: DE2535574A1
Application number: DE19752535574
Authority: DE
Inventors: Moshe Schwarzberg; Edwin F Ullman
Original assignee: Syva Co
Current assignee: Syva Co
Priority date: 1974-08-12
Filing date: 1975-08-08
Publication date: 1976-03-04
Also published as: GB1526242A; SE7509028L; DE2535574C2; AU501140B2; NL185423C; SE7609841L; AU8388175A; GB1526241A; CA1042792A; FR2282115A1; SE427504B; ES440173A1; JPS5144628A; CH621873A5; IL47835A0; US3996345A; SE426746B; NL7509587A; BR7505107A; IL47835A

Description

Fluoreszenzlöschung mit immunologischen Paaren bei Immuno-Analysen

Es besteht ein laufendes Bedürfnis nach schnellen und empfindlichen Methoden zur Bestimmung von winzigen Mengen an organischen Verbindungen. Zu diesem Zweck wurde eine Anzahl von Verfahren entwickelt. Unter den gängigen Verfahren sind die Radioimmuno-Analyse, die Spinmarkierungs-Immuno-Analyse, für die Reagenzien unter der Handelsbezeichnung FRAT^ im Handel sind, die homogene Enzym-Immuno-Analyse, für die Reagenzien unter dem Handelsnamen EMIT⁰' im Handel sind und die Hämagglutination (HI). Diese Verfahren eignen sich zur Bestimmung von Substanzmengen im Bereich von 10" bis 10 Mol oder weniger.

Diese Verfahren beruhen auf der Fähigkeit eines Rezeptormoleküls, gewöhnlich eines Antikörpers, eine bestimmte räumliche und polare Anordnung eines Moleküls zu erkennen.

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Mit Ausnahme des ^magglutinations-Tests beruhen diese Verfahren darauf, ein Üeagens zur Verfügung zu stellen, das mit dem zu untersucheneieaa Molekül um den Rezeptor in Wettbewerb treten kann. Wenn msm. ixt der Lage ist, zwischen dem Reagens, das an den Rezeptor gebunden ist, und dem nichtgebundenen Reagens zu imtersciieiden, kann man die Menge der vorhandenen interessierenden Verbindung bestimmen.

Bei der Entwicklung von Immuno-Analysen ist man hinsichtlich der Zugang!ichkeit und der Eigenschaften eines geeigneten Rezeptors beschrankt* Bezüglich der anderen Reagentien und der Meßmethoden gibt es 3^ecioch mehrere verschiedene Überlegungen, ta zu einer genaueren, bequemeren oder technischen erwünschten Analyse zu kommen. Erstens ist es erwünscht, mit den verschiedenen Reagentien möglichst wenige Messungen und möglichst wenige Übertragungen durchzuführen. Zweitens sollen die Meßeinrichtungen erschwinglich sein, so daß sie für einen großen Kreis von Benutzern zugänglich sind. Drittens sollen die verwendeten Reagentien verhältnismäßig stabil sein, so daß sie gelagert und versandt werden können. Viertens soll das Verfahren nicht wesentlich durch andere Substanzen gestört werden, die zufällig in der zu untersuchenden Probe vorhanden sein können. Weitere Gesichtspunkte sind die leichte Anlernbarkeit von Laboranten, das Fehlen von gesundheitlichen Risiken, die Empfindlichkeit, die Reproduzierbarkeit und die Anwendbarkeit auf eine große Vielzahl Ton Liganden.

Die Erfindung beruht auf der Erscheinung der Energieübertragung zwischen zwei Chromophoren. Wird ein fluoreszierender Chroaphor ait Licht Bestrahlt, das durch den Chromophor

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absorbiert wird, so kann der fluoreszierende Chromophor die Energie des absorbierten Lichts wieder abgeben, indem er Licht mit einer längeren Wellenlänge aussendet, d.h. fluoresziert. Wenn ein anderer Chromophor innerhalb eines Abstande von weniger als 100 £ zur fluoreszierenden Substanz liegt und das Licht bei der Wellenlänge der Emission absorbiert, dann besteht (in Abhängigkeit von anderen Faktoren) die Wahrscheinlichkeit, daß die fluoreszierende Substanz die Energie, die sonst als Licht abgegeben würde, auf den anderen Chromophor überträgt, wodurch im Ergebnis eine "Löschung¹¹ (quenching) der fluoreszierenden Substanz erzielt wird.

In der USA-Patentschrift 3 709 868 ist ein Beispiel für eine Radioimmuno-Analyse angegeben. In der USA-Patentschrift 3 690 834 ist ein Beispiel für eine Spin-Immuno-AnaLyse angegeben. Die USA-Patentschriften 3 654 090 und 3 817 837 stellen Beispiele für Enzym-Immuno-Analysen dar. Weitere Literatur von Interesse sind die Arbeiten von Ludwig Brand und James R. Gohlke, "Fluorescence Probes for Structure", "Annual Review of Biochemistry". 41, 843-868 (1972); und Stryer, "Science", 162, 526 (1968). Weiterhin von Interesse ist die USA-Anmeldung 402 693.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis bzw. zur mengenmäßigen Bestimmung einer organischen Verbindung für die ein Rezeptor, gewöhnlich ein Antikörper, zur Verfügung steht oder hergestellt werden kann. Die organische Verbindung wird nachstehend als Ligand bezeichnet.

Bei der Durchführung der Analyse werden zwei Chromophore verwendet, die ein aus einer fluoreszierenden Substanz und

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einer "Löschsubstanz¹¹ bestehendes Paar (fluorescer-quencher pair) darstellen. Die Menge der fluoreszierenden Substanz innerhalb des Löschabstandes der Löschsubstanz wird durch die Menge des in dem zu untersuchenden Medium vorhandenen Liganden beeinflußt.

Ein Chromophor wird in kovalenter Bindung an eine Rezeptorsubstanz, die den Liganden spezifisch bindet, in das zu untersuchende Medium eingeführt. Der zweite Chromophor kann auf unterschiedliche Weise in das zu untersuchende Medium eingeführt werden:

1.) kovalent gebunden an eine Rezeptorsubstanz, die die gleiche oder eine andere ist als die Rezeptorsubstanz, die mit dem ersten Chromophor konjugiert ist, die aber in beiden Fällen sowie in Gegenwart oder Abwesenheit eines Polyliganden sich mit dem Liganden verbindet; oder

2.) kovalent gebunden an das Ligand-Analoge, wobei das Ligand-Analoge mit dem Liganden um die Rezept or sub stanz in Wettbewerb treten kann.

Die Auswahl der Einführung hängt in einem hohen Grade von der Anzahl der unabhängigen epitopen oder haptenisehen Stellen am Liganden ab.

Wenn der Ligand nur eine unabhängige epitope Stelle hat (d.h. wenn er monoepitopisch ist), so ist gewöhnlich nur ein Chromophor kovalent an einen Rezeptor als Ligand gebunden, während der andere Chromophor kovalent gebunden iat an ein

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Ligandanaloges oder an eine Kombination eines Poly-(Ligandanalogen) und des Chromophors, der !covalent an den Rezeptor als Ligand gebunden ist.

Wenn der Ligand mehrere unabhängige epitope Stellen hat (d.h. wenn er polyepitopisch ist), so können die vorstehend genannten Bindungsarten zusätzlich zu den nachstehenden verwendet werden. Bei einer Art sind die beiden Chromophore einzeln an den Rezeptor als Ligand gebunden. Bei einer weiteren Art wird der Rezeptor als Ligand aus unterschiedlichen Spezies erhalten, wobei ein Chromophor an den Rezeptor für den Ligand-Rezeptor von einer Spezies und der andere Chromophor an den Rezeptor für den Ligand-Rezeptor von der anderen Spezies gebunden ist. Die zuletzt genannte Bindungsart erweitert den Anwendungsbereich der Analyse, indem die üblichen Reagentien für eine große Vielzahl von Analysen verwendet werden können; ferner werden die Reinigungsverfahren vereinfacht, und es kann die Anwesenheit von "Aggregaten¹¹ (assemblages), die sich von den Einzelkomponenten unterscheiden, bestimmt werden.

Die einzelnen Substanzen werden in einem wäßrigen, gepufferten Medium zusammengebracht, inkubiert und mit Licht bestraüt, das von den Molekülen der fluoreszierenden Substanz absorbiert wird. Indem man das Ausmaß der Fluoreszenz nach der Inkubation über einen bestimmten Zeitraum oder nachdem das System sich dem Gleichgewichtszustand genähert hat, bestimmt, und indem man die mit einem oder mehreren bekannten Standards erhaltenen Ergebnisse vergleicht, kann man die Anwesenheit oder die Menge des Liganden bestimmen.

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Nachstehend sind einige Begriffe definiert:

Ligand: ein organisches Molekül oder "Aggregat"(assemblage), das normalerweise ein Molekulargewicht von mehr als 100 hat und das mindestens eine, normalerweise polare Funktion trägt, für die ein Rezeptor entweder von Natur aus zur Verfugung steht oder bergestellt werden kann.

Ligandanaloges: ein ein- oder mehrwertiger Rest, von dem ein wesentlicher Anteil die gleiche räumliche und polare Anordnung wie der Ligand hat, um eine oder mehrere determinierende oder epitope Stellen zu definieren, die in der Lage sind, mit dem Liganden um die Bindungsstellen eines Rezeptors in Wettbewerb zu treten; das Ligandanaloge unterscheidet sich vom Liganden durch das Fehlen eines Atoms oder einer funktionellen Gruppe an der Bindungsstelle zu einem anderen Molekül oder durch die Anwesenheit einer verbindenden Gruppe, die anstelle eines oder mehrerer Atome, die ursprünglich im Liganden vorhanden waren, eingeführt wurde. Die Ligandanaloge-Vorstufe ist die Verbindung, die zum Konjugieren eines Liganden oder eines Ligandanalogen an ein anderes Molekül, z.B. an einen Chromophor, verwendet wird.

"Aggregat* (assemblage): eine KoMnation von organischen Molekülen, die durch andere als kovalente Bindungen miteinander verbunden sind und die im allgemeinen ein Molekulargewicht von mehr als 600, gewöhnlich von mehr als 1000 und gegebenenfalls von 1.000.000 oder mehr haben können, für die der Rezeptor entweder von Natur aus zur Verfügung steht oder hergestellt werden kann; ein beispielhaftes "Aggregat" ist ein Antigen und ein Antikörper oder ein Molekül, das aus zwei getrennten Einheiten hergestellt wurde, die normalerweise

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durch schwache Bindungen, z.B.polare Bindungen oder Disulfid- -Bindungen miteinander verbunden sind und die unter den Bedingungen des Systems mit den Ausgangseinheiten im Gleichgewicht stehen.

Chromophor: ein fluoreszierendes oder löschendes Molekül; erfindungsgemäß stehen die fluoreszierende Substanz und die löschende Substanz miteinander in Beziehung. Das fluoreszierende Molekül ist ein Chromophor, das in der Lage ist, Licht mit einer Wellenlänge zu absorbieren und Licht mit einer längeren Wellenlänge zu emittieren. Das "Löschmolekül" hemmt die Fluoreszenz, wenn es sich in einem geringen Abstand, gewöhnlich von weniger als etwa 100 S, zum fluoreszierenden Molekül befindet, wobei es die Energie aufnimmt, die sonst als fluoreszierendes Licht emittiert würde. Bezüglich des Moleküls oder der Verbindung,mit der die Chromophore verbunden sind, sind die fluoreszierende Substanz und die Löschsubstanz in den meisten Fällen austauschbar, obgleich häufig eine gewisse Bevorzugung vorliegt. Deshalb werden die beiden Moleküle im allgemeinen als Chromphore und einzeln als Ch,. und Chp bezeichnet.

Ligandanaloges-Chromophor (Ligandanaloges-₂ Das Ligandanaloge ist kovalent an ein oder mehrere fluoreszierende Moleküle oder Löschmoleküle gebunden. Bei kleinen Liganden, d.h. bei solchen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 und gewöhnlich von weniger als etwa 2.000, ist das Ligandanaloge gewöhnlich mit weniger als 10 Chromophoren, üblicherweise mit 1 bis 10 Chromophoren und mit nicht mehr als etwa einem Chromophor auf ein Molekulargewicht von 1000 verbunden. Bei einem großen

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Liganden, d.h. bei einem solchen mit einem Molekulargewicht von mindestens 2000, gewöhnlich von mindestens etwa 10 000, können mehrere Chromophore kovalent an das Ligandanaloge gebunden sein. Die Zahl der vorhandenen Chromophore ist durch die Zahl begrenzt, die eingeführt werden kann, ohne daß zu viele Epitopstellen des Liganden maskiert werden, sowie ferner durch den Wunsch, eine ausreichende Anzahl von Chromophoren zur Verfügung zu haben, um eine ausreichende Löschung zu erzielen, wenn der Rezeptor-Ch«. mit dem Ligandanalogen- (Clau)-. gebunden ist.

Das Poly-(Ligandanaloge)-Poly-(Chromophor)-[Poly-(Ligandanaloge) -PoIy-(Ch^ )} -Ligandanaloge und der Chromophor werden mit einem hochmolekularen (verglichen mit dem Ligandanalogen und dem Chroaophor), wasserlöslichen, polyfunktionellen Zentral- oder KernmolekUl verbunden, um eine Vielzahl von Ligandanalogen-Gruppen und Chromophor-Gruppen zu erzeugen, die im Abstand auf der Oberfläche des Moleküls sitzen, so daß, wenn der Rezeptor-Ch. mit dem Ligandanalogen verbunden wird, einige Ch*-Gruppen innerhalb der "Löschentfernung¹¹ zu den Chg-Gruppen stehen.

Poly(Ligandanaloges): Die Gruppen des Ligandanalogen werden mit einem hochmolekularen (verglichen mit dem Ligandanalogen), wasserlöslichen, polyfunktionellen Zentral- oder Kernmolekül verbunden, so daß eine ausreichende Anzahl von Ligandanalogen Je Flächeneinheit zum Löschen zur Verfügung steht, wenn das Poly-(Ligandanaloge) mit Rezeptor-Ch^ und Rezeptor-Chg in den geeigneten Anteilen gesättigt ist.

Rezeptor-Chromophor (Rezeptor-Ch^ und Rezeptor-Ch₂): Ein Rezeptor ist ein Molekül, das in der Lage ist, eine Epitopstelle zu erkennen und sich mit dieser Stelle zu verbinden. Gewöhnlich haben die Rezeptoren Bindekonstanten von

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mehr als 10 , häufig von mehr als 10 . In den meisten Fällen sind die Rezeptoren Antikörper, obgleich auch Enzyme, Nucleinsäuren und gewisse Globuline als Rezeptoren wirken können. Erfindungsgemäß sind die Rezeptoren in den meisten Fällen Antikörper, an die eine oder mehrere, gewöhnlich mindestens 2 oder mehrere chromophore Gruppen gebunden sind.

Rezeptor-Zusammensetzung: Die Rezeptor-Zusammensetzung ist eine homogene oder heterogene Zusammensetzung, die in der Lage ist, spezifische, nicht-kovalente Bindungen mit Liganden und Ligandanalogen einzugehen, und stellt eine Zusammensetzung dar, die den Liganden-(Antiliganden) spezifisch erkennt; weiterhin erkennt sie spezifisch eine Kombination eines Antiliganden und einer Zusammensetzung, die ihrerseits wieder spezifisch den Antiliganden-(Anti-(Antiliganden)) erkennt.

Das Verfahren gemäß der Erfindung beruht auf der Verwendung von zwei Chromophoren, die ein Paar aus einer fluoreszierenden Substanz und einer Löschsubstanz bilden. Es steht eine Zusammensetzung (Rezeptor) zur Verfügung, die einen Liganden spezifisch erkennt und sich damit verbindet, mit dem einer der Chromophoren kovalent gebunden ist, und ist ferner der zweite Chromophor mit dem Ligandanalogen oder dem Rezeptor verbunden, so beeinflußt die Menge des in der Analysenlösung vorhandenen Liganden die Menge der Löschsubstanz innerhalb der Löschentfernung von der fluoreszierenden Substanz. Die Analyse kann kompetitiv durchgeführt werden, wenn das Ligandanaloge mit dem Liganden um den Rezeptor in Wettbewerb tritt, wobei das Ligandanaloge als Poly-(LigandanaLoges) oder kovalent gebunden an den Chromophor vorliegt. Die Analyse

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kann auch nicht-koapetitiv mit Liganden durchgeführt werden, die eine Vielzahl von Epitopstellen haben, wobei der jedem Chromophor zugehörige Rezeptor sich mit dem Liganden verbindet.

Je nach der besonderen Arbeitsweise und dem interessierenden Liganden können eine oder mehrere der nachstehend angegebenen Reagenszusammensetzungen im Analysenmedium verwendet werden: Ligandanaloges-Chromophor, Poly-(Ligandanaloges)-Poly-(Chromophor), Poly-(Ligandanaloges), ein oder zwei Rezeptoren und ein oder zwei Rezeptor-Chromophore. Die erste Zusammensetzung, die nachstehend in Betracht gezogen wird, ist der Ligandanaloge-Chromophor.

Ligandanaloges-Chromophor und Poly-(Ligandanaloges)-PoIy-(Chromophor)

Der Ligandanaloges-Chromophor kann in zwei Gruppen unterteilt werden. In der ersten Gruppe hat der Ligandanaloges-Chromophor ein einziges Ligandanaloges und einen einzigen Chromophor, die durch eine verhältnismäßig kurze verbindende Gruppe vereinigt sind. In diesen Fällen ist das Ligandanaloge in den meisten Fällen ein Hapten und kein Antigen, und hat gewöhnlich ein Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000, inbesondere von weniger als etwa 6.000 und häufig im Bereich von etwa 125 bis 1.000, wobei aber die verbindende Gruppe zum Chromophor nicht mitgezählt ist. In den meisten Fällen unterscheidet sich das Ligandanaloge vom Liganden dadurch, daß eine bestimmte Funktionalität durch eine Bindung, ein Wasserstoff atom durch eine Bindung oder eine kurze Kohlenstoffkette durch eine Bindung ersetzt ist (unter Bindung sollen

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sowohl Mehrfachbindungen als auch Einfahbindungen verstanden werden), um sich mit der verbindenden Gruppe zur Verknüpfung mit dem Chromophor zu vereinigen. Die verschiedenen haptenisehen oder niedrigmolekularen Liganden sind nachstehend erläutert.

Die verbindende Gruppe hat normalerweise nicht mehr als etwa 10 Atome in der Kette zwischen dem Liganden und dem Chromophor und stellt gewöhnlich entweder eine Bindung dar, oder enthält etwa 1 bis 6 Atome in der Kette. Die Atome sind in den meisten Fällen Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, insbesondere Kohlenstoff, Sauerstoff und Stickstoff. Die Funktionalitäten in der verbindenden Gruppe sind normalerweise Nicht-Oxo-Carbonyl(einschließlich Imino und Thionocarbonyl), Oxy, Amino(insbesondere tertiäre Amino oder quartäre Ammoniumgruppen) oder Kombinationen, z.B. Amido, Carbamyl und Amidino.

Die beiden Chromophore, d.h. sowohl die fluoreszierende Verbindung als auch die Löschverbindung haben normalerweise entweder eine Amino- oder Alkoholfunktion zur Umsetzung mit einer Nicht-Oxo-Carbonyl-Funktion (einschließlich der Stickstoff- und Schwefelanalogen), bzw. sie haben eine Nicht-Oxo-Carbonyl-Funktion, die mit einer Amino- oder Alkohol-Funktionalität umgesetzt werden kann.

Wenn der Ligand ein Molekulargewicht von mindestens 2000 hat, können mehrere chromophore Gruppen an den Liganden gebunden werden. Gewöhnlich liegt mindestens eine chromophore Gruppe für ein Molekulargewicht von 20.000 vor, üblicherweise mindestens eine chromophore Gruppe auf ein Molekulargewicht

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von 10.000, iind nicht; mehr als eine chromophore Gruppe auf ein Molekulargewicht von 1000, üblicherweise nicht mehr als eine chromophore Gruppe auf ein Molekulargewicht von 2000. Die Überlegungen hinsichtlich der Anzahl der mit dem Liganden konjugierten Chromophore sind vorstehend angegeben. Die verbindenden Gruppen sind die gleichen wie vorstehend beschrie ten. Gewöhnlich ist der Ligand ein antigenes Polypeptid oder Protein mit einer Vielzahl von Aminogruppen. Aktives Halogen oder Nicht-Oxo-Carbonyl (einschließlich Stickstoff- und Schwefelanaloge) können zur Konjugation verwendet werden, um eine kovalente Bindung zu bilden; es können auch Amide, Amidine, Thiono1anri.de, Harnstoffe, Guanidine und Thioharnstoffe verwendet werden.

Der Ligand und der Chromophor (Ch,. oder Chp) können mit einem Zentralmolekül-(Poly-(Ligandanalog)-Poly-(Chromophor)) verknüpft sein. Das Zentralmolekül oder das Kernmolekül kann aus mehreren Gründen mit Vorteil verwendet werden. Das Kernmolekül ist im allgemeinen ein polymeres Molekül mit verhältnismäßig hohem Molekulargewicht, normalerweise von mehr als 20.000, häufig von 60.000 und gegebenenfalls von 10 Millionen oder höher. Das Kernmolekül ist normalerweise in Wasser löslich oder in einem wäßrigen Medium dispergierbar, wobei eine stabile Dispersion erhalten wird, in der das dispergierbare Material die Absorption oder die Ausstrahlung von Licht nicht behindert. Das Kernmolekül kann ein natürlich vorkommendes Material, ein modifiziertes, natürlich vorkommendes Material oder ein synthetisches Material sein. Kernmoleküle umfassen Polypeptide, Proteine, Polysaccharide, synthetische Polymere und dergleichen. Die Natur des Zentralmoleküls kann sehr unterschiedlich sein, solange es ausreichend funktional!siert ist, um die Einführung der Liganden- und Chromophor-Moleküle zu ermöglichen.

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Brauchbare Proteine sind Albumine, Globuline, Proteoglykane und dergleichen; unter den Polysacchariden sind Amylose, Cellulose, Agarose, Dextrane oder dergleichen zu nennen, die entweder so, wie sie gewonnen werden, oder im teilweise abgebauten Zustand, verwendet werden; Beispiele für synthetische Polymere sind Polyvinylalkohol, Acrylate, deren Mischpolymerisate oder dergleichen.

Normalerweise liegt nicht weniger als etwa ein Konjugatmolekül (Ligandanaloges oder Chromophor) auf ein Molekulargewicht von 50.000 vor, üblicherweise nicht weniger als etwa ein Konjugatmolekül auf ein Molekulargewicht von 25.000 und gewöhnlich nicht mehr als etwa ein Konjugatmolekül auf ein Molekulargewicht von 1000 sowie vorzugsweise nicht mehr als etwa ein Konjugatmolekül auf ein Molekulargewicht von 2000.

Das Verhältnis zwischen Chromophor-Molekülen und Liganden liegt im allgemeinen von etwa 0,05 bis 20: 1, ©wohnlich von etwa 0,5 bis 20:1, vorzugsweise von etwa 1 bis 10:1 und insbesondere von etwa 2 bis 8:1.

Ist der Chromophor ein fluoreszierendes Molekül im Sinne der Erfindung, so liegen im allgemeinen mindestens etwa 0,5 bis 20, gewöhnlich etwa 1 bis 10 und vorzugsweise etwa 2 bis 7 fluoreszierende Moleküle je Ligandenmolekül vor. Ist der Chromophor das Löschmolekül, so beträgt die Anzahl der Löschmoleküle je Ligand im allgemeinen etwa 0,5 bis 20, üblicherweise etwa 1 bis 20 und vorzugsweise etwa 2 bis 15 je Ligandmolekül.

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Die Konjugäte zum Zentralmolekül haben die gleiche Art von verbindenden Gruppen, die zur Verbindung des Chromophors am Liganden verwendet werden. Die jeweils auszuwählende Funktionalität hängt von den verfügbaren funktionellen Gruppen am Kernmolekül ab.

Rezeptor-Chromophor

Da der Rezeptor in den meisten Fällen ein Antikörper ist, bezieht sich die Beschreibung als Beispiele für Rezeptoren auf Antikörper. Die Antikörper haben eine Anzahl von aktiven Aminogruppen, die zur kovalenten Konjugierung des Chromophors mit dem Antikörper verwendet werden können. Zweckmäßig kann der Chromophor eine Nicht-Oxo-Carbonyl-Funktionalität (einschließlich der Stickstoff- und Schwefelanalogen) oder eine aktive a-Halögencarbonyl-Funktionalität haben. Beispiele für Funktionalitäten zum Verbinden des Chromophors mit dem Antikörper sind Acylhalogenide, Mischanhydride, Imidat-Alkylester, Isöthiocyanat, Chlor-, Brom- oder Jodacetyl usw.

Die Bedingungen für die Konjugation sind mäßige Temperaturen von etwa 0 bis 40⁰C in wäfrigen Medien bei mäßigen pH-Werten. Die Konjugation von Chromophoren an Proteine ist an sich bekannt. The et al., Immunology, 18, 865 (1970); Cebra et al, J. Immunol., 95» ^30 (1965)i Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York (1968).

Die Anzahl der chromophoren Gruppen, die mit dem Antikörper konjugiert werden können, kann über einen verhältnismäßig breiten Bereich" schwanken, was von dem jeweiligen Chromophor

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abhängt. Es liegt mindestens eine chromophore Gruppe je Antikörper vor, durchschnittlich etwa 2 bis 30, gewöhnlich etwa 3 bis 25 chromophore Gruppen je Antikörper. Ist der Chromophor die fluoreszierende Substanz, so beträgt die Durchschnittszahl der chromophoren Gruppen je Antikörper etwa 1 bis 20, gewöhnlich 2 bis 15 und vorzugsweise etwa 2 bis 10. Ist der Chromophor die Löschsubstanz, so beträgt die Durchschnittszahl der chromophoren Gruppen je Antikörper gewöhnlich etwa 2 bis 30, üblicherweise etwa 3 bis 25 und vorzugsweise etwa 5 bis 25.

Es ist auch darauf hinzuweisen, daß, wenn Antikörper für einen Liganden mit mehreren Epitopstellen hergestellt werden, die Rezeptorzusammensetzung nicht homogen ist. Das heißt also, daß der Rezeptor Antikörper enthält, die verschiedene Epitopstellen erkennen. Wenn auf den Rezeptor Bezug genommen ist, so sollen darin alle Antikörper eingeschlossen sein, die in der Lage sind, sich mit beliebigen Epitopstellen des Liganden spezifisch zu verbinden.

Poly-(Ligandanaloges)

Das Poly-(Ligandanaloge) unterscheidet sich von dem Ligandanalogen-Chromophor und dem Poly-(Ligandanalogen)-PoIy-(Chromophor) dadurch, daß kein Chromophor vorhanden ist, sondern nur das Ligandanaloge. Die gleichen Arten von Kernmolekülen und der gleiche Konjugationsgrad kommen für das Poly-(Ligandanaloge) und für den Poly-(Ligandanalog)-PoIy-(Chromophor) in Frage. Das Ligandanaloge kann aber in einem viel höheren Verhältnis vorhanden sein als der zentrale Kern den Rezeptor aufnehmen kann. Obgleich also

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eine Mindset zahl von ULgandanalog-Gruppen wesentlich ist, ist die Höchstzahl eine Frage der Zweckdienlichkeit. Der wesentliche Faktor besteht darin, daß die Rezeptormoleküle, die an das Poly-(Ligandanaloge) gebunden sind, so nahekommen, daß die ChroMophore in den Lö schabst and gelangen.

Die Auswahl der Kernmoleküle hängt von einer Reihe von Umständen ab. Obgleich es nicht wesentlich ist, daß das Kernmolekül wasserlöslich ist, so ist dies in den meisten Fällen erwünscht. In/dem FeJLl soll das Kernmolekül oder die Kernzusammensetztaag in einem wäßrigen Medium stabile Dispersionen bilden. Weiterhin soll das Kernmolekül kein Licht mit der Emissionwellenlänge der fluoreszierenden Substanz absorbieren, um eine nennenswerte Löschung zu erzeugen. Drittens soll das Kernmolekül bei den Emissionswellenlängen der fluoreszierenden Substanz nicht fluoreszieren, wenn es mit dem anregenden Licht bestrahlt wird. Deshalb soll das Kernmolekül nur unterhalb etwa 520nm, vorzugsweise unterhalb etwa 45Onm in nennenswertem Umfang absorbieren.

Das Kernmolekül soll stark funktionellsiert sein, vorzugsweise mit Amino- oder Hydroxylgruppen, obgleich auch andere reaktionsfähige Funktionalitäten, z.B. die Carboxygruppe, brauchbar sind. Viertens soll das Kernmolekül bei den üblichen Lager- und Gebrauchsbedingungen stabil sein. Fünftens soll das Kernmolekül gegenüber den im Chromophor und im Liganden vorhandenen Funktionalitäten inert sein, außer gegenüber der Bindefunktional!tat. Schließlich soll das Kernmolekül die Immuno-Analyse nicht stören, beispielsweise dadurch, daß es natürlich vorkommende Rezeptoren enthält, die in den zu untersuchenden physiologischen Flüssigkeiten vorhanden sein können.

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Obgleich Moleküle mit beliebiger Größe verwendet werden können, geben sehr große Moleküle oder Zellen zu praktischen Schwierigkeiten Anlaß. Zum Beispiel kann ein sehr großes Molekül beim Durchtritt durch den Lichtstrahl des Fluorometers eine plötzliche Zunahme der Peak-Höhe ergeben. In diesem Fall müßte das erhaltene Signal über einen beträchtlichen Zeitraum gemittelt werden. Große Moleküle ergeben auch beträchtliche Streuungen; diese können aber durch ein geeignetes optisches System kompensiert werden. Vorzugsweise verwendet man in den meisten Fällen Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10 Millionen, vorzugsweise von etwa 30.000 bis 1.000.000.

Chromophor

Da in dem zu analysierenden Medium normalerweise Antikörper vorhanden sind und da Proteine Licht mit Wellenlängen bis zu etwa 310 nm absorbieren, so hat die fluoreszierende Substanz die größte Absorption gewöhnlich bei mehr als 310nm, üblicherweise bei mehr als 350nm und vorzugsweise bei mehr als etwa 400nm. Die Auswahl der fluoreszierenden Substanz wird auch durch den jeweils interessierenden Liganden bestimmt. Die fluoreszierende Substanz sollte das Licht bei einer höheren Wellenlänge als der interessierende Ligand oder das Ligandanalo^ge absorbieren. Ein hoher Extinktionskoeffizient ist erwünscht, der weit über 10, vorzugsweise über 10 und besonders vorteilhaft über 10 liegen sollte. Es sollte eine gute Quantenausbeute für die fluoreszierende Substanz im wäßrigen Medium zur Verfügung stehen. Zweckmäßig soll sich das Absorptionsmaximum der fluoreszierenden Substanz bei wechselnden Liganden nicht nennenswert ändern.

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In den vorstehend genannten Arbeiten, nämlich bei Stryer und Brand et al sind eine Reihe von verschiedenen fluoreszierenden Sub stanzen be schrieben.

Eine Gruppe von fluoreszierenden Substanzen mit einer Anzahl der vorstehend beschriebenen erwünschten Eigenschaften umfaßt die Xanthenfarbstoffe, die die Fluoresceine enthalten, welche sich vom 3»6-Bihydroxy-9-phenyl-xanthhydrol ableiten, sowie die Rosamine und Rhodamine, welche sich vom 3,6-Diamino-9-phenylxanthhydrol ableiten. Die Rhodamine und Fluoresceine haben eine 9-o-Carboxyphenylgruppe und sind Derivate des 9-o-Carboxyphenylxanthhydrols.

Diese Verbindungen sind mit Substituenten an der Phenylgruppe im Handel erhältlich; diese Substituenten können als Bindungsstelle oder als Bindungsfunktionalität verwendet werden. Beispielsweise gibt es mit Amino- und Isothiocyanatgruppen substituierte Fluoresceinverbindungen.

Eine weitere Gruppe von fluoreszierenden Verbindungen sind die Naphthylamine, die eine Aminogruppe in der α- oder B-Stellung, gewöh&icb. in der α-Stellung enthalten. Beispiele für Naphthylaminoverbindungen sind i-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, i-Anilino-8-naphthalinsulfonat und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalinsulfonat.

Andere geeignete Farbstoffe sind 3-Phenyl-7-isocyanatocumarin, Acridine, wie 9-Isothiöcyanatoacridin und Acridin-orange; N- (p- (2-Benzoxazolyl) -phenyl) -maleinimid; Benzoxadiazole, wie ^Chlor^-T-nitrobenzo-Z-oxa-i ,3-diazol und 7- (p-Methoxybenzylamino)-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol; Stilbene, wie

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4-Dimethylamino-4'-isothiocyanatostilben und 4-Dimethylamino-4'-maleinimidostilbenj N,N¹-Dioctadecyloxacarbocyanin-ptoluolsulfonat; Pyrene, wie 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfosäure und 1 -Pyrenbuttersäure, Merocyanin 540, Rose-Bengal, 2,4-Diphenyl-3(2H)-furanon, sowie andere leicht zugängliche fluoreszierende Moleküle. Diese Farbstoffe haben entweder aktive Funktionalitäten bzw. diese Funktionalitäten können leicht eingeführt werden.

Ähnliche Überlegungen wie für das fluoreszierende Molekül gelten auch für das Löschmolekül, ausgenommen, daß eine gute Fluoreszenz-Quantenausbeute nicht notwendig ist, wenn die Fluoreszenz des fluoreszierenden Moleküls gemessen wird. Ein weiterer Gesichtspunkt für die Auswahl des Löschmoleküls besteht darin, daß es bei einer Emissionswellenlänge der fluoreszierenden Substanz absorbiert. Eine gute Überschneidung der Emission der fluoreszierenden Substanz und der Absorption der Löschsubstanz ist erwünscht.

Es sei darauf hingewiesen, daß sowohl die Absorptionsals auch die Emissionseigenschaften des Farbstoffes davon abhängig sein können, ob der Farbstoff frei in Lösung vorliegt oder an ein Protein oder einen Liganden gebunden ist. Deshalb soll bei der Angabe der verschiedenen Bereiche und Eigenschaften der Farbstoffe gelten, daß es sich um den Farbstoff handelt, wie er verwendet wird und nicht um den unkonjugierten Farbstoff in einem willkürlich gewählten Lösungsmittel.. Im Überschneidungsbereich zwischen Fluoreszenz und Löschung, soll die Löschsubstanz einen Extinktionskoeffizienten in der gleichen Größenordnung oder höher als der für die Absorption des fluoreszierenden Moleküls haben.

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Ligand

Wie schon gesagt, kann der Ligand sehr unterschiedlich sein und hat normalerweise ein Molekulargewicht von mindestens 110, üblicherweise von mindestens 125, wobei das Molekulargewicht nach oben keine Grenzen hat, obwohl es gewöhnlich den Wert von 10 Millionen nicht überschreitet. In den meisten Fällen kommt es bei dem Liganden darauf an, daß ein Rezeptor angefügt werden kann oder bereits zur Verfügung steht. Normalerweise können für die meisten organischen Verbindungen mit polaren Funktionalitäten Rezeptoren hergestellt werden. Verbindungen, für die Antikörper dadurch erzeugt werden können, daß die Verbindung an eine Verbindung mit antigenen Eigenschaften gebunden wird, werden als Haptene teeichnet. Verbindungen, die ohne chemische Änderung eine Antikörperbildung hervorrufen, werden als Antigene bezeichnet (vergl. Kabat et al., Experimental Immunochemistry, Charles C.Thomas, Springfield, Illinois, 1967).

Die nichtpolymeren interessierenden Liganden haben gewöhnlich ein Molekuirgewicht von etwa 125 bis 2000. Diese Verbindungen sind sehr zahlreich und haben höchst unterschiedliche Strukturen, Funktionalitäten und physiologische Eigenschaften. Diese Verbindungen können acyclisch, alicyclisch oder heterocyclisch sein und zwar sowohl mono- als auch polycyclisch. Als Heteroatome kommen in Frage Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Halogen (Fluor, Chlor, Brom und Jod), Bor, Phosphor, Metallkationen der Gruppen 1A. und 2A des Periodensystems, Übergangsmetalle u.dgl.

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_ 21 - "'" ^J

Als Funktionalitäten kommen in Frage Alkohole, Äther, Carbonsäuren, Carbonsäureester und -amide, Amine (primäre, sekundäre, tertiäre und quartäre), Halogene, Nitrile, Mercaptoverbindungen u.dgl. Normalerweise sind die Verbindungen ausschließlich aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Halogen und Phosphor, insbesondere aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff zusammengesetzt, und wenn es sich um Salze handelt, so liegt das geeignete Metalloder Ammonium-Gegenion vor.

Heterocyclische Ringe sind beispielsweise Pyrrol, Pyridin, Piperidin, Indol, Thiazol, Piperazin, Pyran, Cumarin, Pyrimidin, Purin, Triazin, Imidazol u.dgl.

Wegen der großen Zahl der Verbindungen, die nach dem erfindungsgemäßen Analysenverfahren bestimmt werden können, werden die einzelnen Gruppen in verschiedene, häufig "willkürlich gewählte Kategorien unterteilt; die Auswahl bestimmt sich entweder nach der Anwesenheit einer bestimmten Funktionalität oder Ringstruktur oder nach einer bestimmten gemeinsamen Funktion oder nach der allgemein anerkannten Klassenzugehörigkeit.

Die a*ste Klasse von interessierenden Verbindungen umfaßt solche mit einer Aminogruppe, entweder als heterocyclischen! Glied oder als Funktionalität an einer aliphatischen Kette. Diese Verbindungen haben normalerweise ein Molekulargewicht von etwa 110 bis 800, üblicherweise von etwa 125 bis 650. In diesen Verbindungen ist eine Aminogruppe häufig durch zwei bis drei aliphatische Kohlenstoffatome von einem Benzolring getrennt.

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Die erste interessierende Verbindungsgruppe umfaßt die Alkaloide und die Metaboliten von eingenommenen Alkaloiden. Die erste Gruppe von wichtigen Alkaloiden sind die Alkaloide der Morphingruppe. Diese Gruppe enthält Morphin, Codein, Heroin, Morphinglukuronid und ähnliche Verbindungen.

Die nächste Gruppe von Alkaloiden umfaßt die Cocainalkaloide, z.B. die insbesondere als Metaboliten vorliegenden Substanzen Benzoylecgonin und Ecgonin.

Eine weitere Gruppe von Alkaloiden umfaßt die Cinchonaalkaloide, z.B. Chinin..

Die Isochinolingruppe der Alkaloide umfaßt Mesealin. Die Benzylisochinolin-Alkaloidgruppe enthält Papaverin.

Die Phthalid-Isochinolin-Alkaloidgruppe enthält Narcotin, Narcein, vmu Cotamin.

Die Indolopyridocolin-Alkaloidgruppe enthält Yohimbin und Reserpin.

Die Ergot-Alkaloidgruppe enthält Ergotamin und Lysergsäure.

Andere Gruppen von Alkaloiden sind die Strychnin-Alkaloide, Pyridinalkaloide, Plperidinalkaloide, Pyrrolizidinalkaloide u. dgl.

Die in erster lalnle interessierenden Alkaloide sind die Rauschgift©» wie Karp&fca, Cocain, Mescalin und Lyserg - säure, von denen ctt© ¥@rbiactepig selbst oder ihr Metabolit analysiert kayro> /W^s -worn, amp physiologischen Flüssigkeit abhängt^

apalyal^rfc üBfE^ewt. -soll.

Es gibt auch eine Anzahl von synthetischen Drogen, die die physiologischen Eigenschaften der natürlich vorkommenden Rauschgifte ganz oder teilweise nachahmen. Unter diesen Drogen sind zu nennen Methadon, Meperidin, Amphetamin, Methamphetamin, Glutethimid, Diphenylhydantoin sowie Drogen, die in die Kategorie der Benzdiazocycloheptane, Phenothiazine und Barbiturate fallen.

Drogen, die wegen ihrer physiologischen Eigenschaften von Interesse sind, sind beispielsweise die Catecholamine. Darunter fallen Epinephrin, Ephedrin, L-Dopa und Norepinephrin.

Andere interessierende Drogen sind die Beruhigungsmittel, wie Meprobamat, Tergitol und die Succinimide, wie Ethoxsumide.

Andere interessierende Verbindungen sind Tetrahydrocannabinol, Cannabinol und deren Derivate, in erster Linie Verbindungen, die sich von Marihuana ableiten, sowie deren synthetische Modifikationen und Metaboliten.

Eine weitere Verbindungsgruppe von großem Interesse sind die Steroide. Die Steroide umfassen Östrogene, Gestogene, Androgene, adrenocorticale Hormone, Gallensäuren, kardiotonische Glykoide, Algycone, Saponine und Sapogenine.

Eine weitere Verbindungsklasse umfaßt die Vitamine, wie Vitamin A, die B-Gruppe, z.B. Vitamin B₁, Bg und B^₂» ^E» K u.dgl.

Eine weitere Verbindungsklasse umfaßt die Zucker, und zwar sowohl die Mono- und Polysaccharide, insbesondere die Di- und die höheren Polysaccharide.

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Eine weitere Verbindungsklasse umfaßt die Prostaglandine.

Eine weitere Verbindungsklasse umfaßt die Aminosäuren, Polypeptide und Proteine. Die Polypeptide enthalten gewöhnlich etwa 2 bis 100 Aminosäureeinheiten und haben gewöhnlich ein Molekulargewicht von weniger als etwa 12.000. Größere Polypeptide werden willkürlich Proteine genannt und sind gewöhnlich aus etwa 1 bis 20 Polypeptideketten zusammengesetzt. Der Ausdruck Poly-(Aminosäure) wird als Oberbegriff für Polypeptide und Proteine verwendet. Von besonderem Interesse unter den Aminosäuren sind die Thyronine, und zwar das Tri- und Tetrajodthronln. Die erfindungsgemäß verwendeten Poly-(Aminosäuren), bei denen zwei Antikörper als Reagentien verwendet werden, haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis 10⁷, gewöhnlich von 10⁷ bis 10 . Von besonderem Interesse unter den Polypeptiden und Proteinen [Poly-(Aminosäuren)] sind Hormone, Globuline, Antigene und Stoffzusammensetzungen mit bestimmten physiologischen Aktivitäten.

Die Vielzahl der Proteine kann unterteilt werden in die Familie der Proteine mit ähnlichen strukturellen Merkmalen, der Proteine mit bestimmten biologischen Funktionen, der Proteine, die mit bestimmten Mikroorganismen in Beziehung stehen, insbesondere mit Krankheitserregern, usw.

Die nachstehend angegebenen Proteinklassen sind strukturell miteinander verwandt:

Protamine, Histone, Albumine, Globuline, Skleroproteine, Phosphoproteine, Mucoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine, Nucleoproteine, unklassifizierte Proteine, z.B. Somatotropin, Prolactin, Insulin, Pepsin.

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Proteine, die im menschlichen Plasma vorkommen und die klinisch wichtig sind, umfassen beispielsweise:

Präalbumin, Albumin, c^-Lipoprotein, cc.-saures Glykoprotein, α,,-Antitrypsin, α,.-Glykoprotein, Transcortin, 4,6S-Postalbumin, Tryptophan-armes cc.-Glykoprotein, a^-Glykoprotein, Thyroxin-bindendes Globulin, Inter-ct-Tryp sin-Inhibitor, Gc-Globulin, (Gc 1-1), (Gc 2-1), (Gc 2-2), Haptoglobin, (Hp 1-1), (Hp 2-1), (Hp 2-2), Ceruloplasmin, CldLinesterase, ^-Lipoproteine, ct₂-Makro globulin, ctp-HS-Glykoprotein, Zn-cc-p-Glykoprotein, c^-Neuramino-Glykoprotein, Erythropoietin, ß-Lipoprotein, Transferrin, Hämopexin, Fibrinogen, Plasminogen, ß2~Glykoprotein I, ß₂-Glykoprotein II, Immunoglobulin G, (IgG) oder yG-Globulin, Molekülformel: Y₂K₂ oder γ₂ A₂

Immunoglobulin A (IgA) oder γΑ-Globulin, Molekülformel:

(a₂K₂)ⁿ oder (a₂X₂)ⁿ
Immunoglobulin M (IgM) oder γΜ-Globulin, Molekülformel:

(/U₂K₂)⁵ oder (^u₂X₂)⁵
Immunoglobulin D(IgD) oder yD-Globulin (yD), Molekülformel: (S₂K₂) oder (^₂A₂)

Immunoglobulin E (IgE) oder γΕ-Globulin (γΕ), Molekülformel: (e₂ IC₂) oder (e ₂ >-₂)

freie leichte Ketten
Komplementfaktoren:

C¹I, CMq, CMr, CMs, C^!2, C'3, B₁A, a₂D, C«4, C«5, C'6, C7, C'8, C9

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Wichtige Blutklumpungsfaktoren sind:

Internationale Bezeichnung

Name

Ha III V und VI

VII VIII

XII XIII

Fibrinogen Prothrombin Thrombin Gewebe-Thromboplastin Proaccelerin, Acceleratorglobulin Proconvertin Antihämophiles Globulin (AHG) Chri stmas-Faktor, Plasma-Thromboplastinkomponente (PTC) Stuart-Prower-Faktor, Autoprothrombin III Plasma-Thromboplastin-Vorstufe (PTA)

Hagemann-Faktor Fibrinstabilisierender Faktor

Wichtige Proteinhormone sind: Peptide- und Proteinhormone

Parathyroid-Hormone (Parathormon), Thyrocalcitonin, Insulin, Glue agon, Relaxin, Erythropdetin, Melano tropin, (Melanocyten-stimulierendes Hormon, Intermedin), Somatotropin, (Wachstumshormon), Corticotropiniadrenocorticotropes Hormon), Qlyrotropin, Follikel-stimulierendes Hormon, Luteinisierendes Hormon (zwischenzellenstimulierendes Hormon), Luteomammotropes Hormon (Luteotropin, Prolactin), Gonadotropin (Choriongonadotropin).

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2Β3557Δ

Gewebehormone

Secretin, Gastrin, Angiotensin I und II, Bradykinin, menschliches Placentalactogen.

Peptidhormone von der Neurohypophyse

Oxytocin, Vasopressin, Auslösefaktoren (RF), CRF, LRF,TRF, Somatotropin-RF, GRF, FSH-RF, PIF, MIF.

Andere polymere Substanzen von Interesse sind Mucopolysaccharide und Polysaccharide.

Beispiele für antigene Polysaccharide aus Mikroorganismen sind nachstehend angegeben:

Mikroorganismus

Streptococcus pyogenes Diplococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Corynebacterium diphtheriae Actinobacillus malei;

Actinobacillus vhitemori Francisella tularensis

Pasteurella pestis Pasteurella pestis Pasteurella multocida Bruceila abortus Haemophilus influenzae Haemophilus pertussis Treponema reiteri Veillonella

Hämosensitin, gefunden in

Polysaccharid Polysaccharid Polysaccharid Polysaccharid Polysaccharid Rohextrakt

Lipopolysaccharid Polysaccharid

Polysaccharid Kapsularantigen Rohextrakt

Polysaccharid Rohextrakt

Polysaccharid Lipopolysaccharid

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Mikroorgani smus

Hämosensitin, gefunden in

Erysipelothrix Listeria monocytogenes Chromobacterium Mycobacterium tuberculosis

Klebsiella aerogenes Klebsiella cloacae Salmonella typhosa

Salmonella typhi-murium; Salmonella derby Salmonella pullorum

Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella sonnei Rickettsiae Candida alblcans Entamoeba histolytica Polysaccharid Polysaccharid Lipopolysaccharid Kochsalzextrakt von 90% der mit Phenol extrahierten Mycobakterien und Polysaccharid-Fraktion von Zellen und Tuberculin Polysaccharid Polysaccharid Lipopolysaccharid, Polysaccharid Polysaccharid

Polysaccharid

Rohextrakt, Polysaccharid Rohextrakt
Polysaccharid Rohextrakt

Eine weitere Gruppe von Verbindungen umfaßt die Antibiotika, wie Penicillin, Actinomycin, Chloromycetin u.dgl.

Einzelne Verbindungen von Interesse sind Serotonin, Spermin, und Phenylpyruvsäure.

Schließlich .können auch Schädlingsbekämpfungsmittel, wie Fungizide, Insektizide, Bakterizide und Nematozide von analytischem Interesse sein.

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Außer den Verbindungen können auch Zellen, Viren und andere biologische Aggregationen, die Antigene darstellen oder an die natürlich vorkommende Rezeptoren gebunden werden können, analysiert werden.

Die zu analysierenden Mikroorganismen können intakt, lysiert, gemahlen oder anderweitig zerkleinert sein, und die erhaltene Zusammensetzung oder ein Teil davon (z.B. der durch Extraktion erhaltene Teil) kann analysiert werden. Interessierende Mikroorganismen sind beispielsweise:

Corynebacteria

Corynebacterium diptheriae

Pneumococci

DipiE QDCus pneumoniae

Streptococci

Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarus

Staphylococci

Staphylococcus aureus

Staphylococcus albus
Neisseriae

Neisseria meningitidis Neisseria gonorrheae

Enterobacteriaciae

Escherichia coli Aerobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae

Kolibakterien

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Salmonella Typhosa Salmonella choleraesuis Salmonella typhimurium Shigella dysenteriae Snigella schmitzii Shigella arabinotarda SMgella flexneri Shlgella boydii Snigella Sonnei 253ΒΒ7Λ

Salmonellen

Shigellen

Andere Bnterobazillen

Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morgani Pseudomonas aeruginosa Alcaligenes faecelis Vibrio cholerae Proteusarten

Hämophilus-Bordetella-Gruppe Hämophilus inf luenzae,

Bordetella pertussis

Pasteurellae

Pasteurella pestis Pästeurella tulareusis

Brucellae

Bruceila melitensis Brucella abortus Bruceila suis H.ducreyi H.hemophilus H.aegypticus

H. paraiufluenzae

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2 B 3 5 B 7

Aerobe sporenbildende Bazillen Bacillus anthracis Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus cereus

Anaerobe sporenbildende Bazillen Clostridium botulinium Clostridium tetani Clostridium perfringens Clostridium novyi Clostridium septicum Clostridium histolyticum Clostridkim bifermentans Clostridium sporogenes Clostridium tertium

Mycobacteria

Mycobacterium tuberculosis hominis Mycobacterium bovis Mycobacterium avium Mycobacterium leprae Mycobacterium paratuberculosis

Actinomycetes (pilzähnliche Bakterien) Actinomyces israelii Actinomyces bovis Actinomyces naeslundii Norcadia asteroides Norcardia brasiliensis

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- 32 - . 2 5 3 5 5 ⁷ U

Spirochäten

Treponema pallidum Spirillum minus Bsponema pertenue Streptobacillus moniliformis leponema carateum Borrelia recurrentis Leptospira icterohämorrhagiae Leptospira canicola

Mycoplasmae

Mycoplasma pneumoniae

Andere Pathogene

Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopathiae Streptobacillus moniliformis Donvania granulomatis Bartonella bacilliformis

Rickettsiae(bakterienähnliche Parasiten) Rickettsia prowazekii ilickettsia mooseri Rickettsia rickettsii Rickettsia conori Rickettsia australis Rickettsia sibiricus Rickettsia akari Rickettsia tsutsugamushi Rickettsia burnetii Rickettsia quintana

Chlamydia (unklassifizierbare Parasiten, bakteriell/viral) Chlamydia-Agentien (Bezeichnung unsicher)

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'Pilze

Cryptococcus neoformans Blastomyces dermatidis Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Paracoccidioides brasiliensis Candid* albicans Aspergillus fumigatus Mucor arymbifer (Absidia corymbifera) Rhizopus oryzae

Rhizopus arrhizus Phycomycetes

Rhizopus nigricans Sporotrichiom schenkii Fonsecaea pedrosoi Fonsecaea compacta Fonseaea dermatitidis Cladosporium carrionii Phialophora verrucosa Aspergillus nidulans Madurella grisea Madurella mycetomi Allescheria boydii Phialosphora oeanselmei Microsporum gypseum Trichop^yton mentagrophytes Keratinomyces ajelloi Microsporum canis Trichophyton rubrum Microsporum andouini

Adenoviren Herpesviren

Herpes simplex Varicella (Hühnerpocken) Herpes Zoster (Gürtelrose) Virus B

Cytomegalovirus

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- 2535B74

Pockenviren

Variola (schwarze Pocken) Vaccinia Faxvirus "bovis Paravaccinla Molluscum contagiosum

Picornaviren

PoIiοvirus Goxsackievirus Echoviren Rhinoviren

Myxoviren

Influenza (A,B und C) Parainfluenza (1-4) Mumps-Virus Newcastle-Krankheit-Virus Masern-Virus Rinderpest-Virus Hundetollwut-Virus Atmungs-Syncyt ien-Virus Rubella-Virus

Arboviren

Östliches Pferde-Eucephalitis-Virus Westliches Pferde-Eucephalitis-Virus Sindbis-Virus Chikungunya-Virus Semliki-Fore st-Virus Myora-Virus St.Louis-Encephalitis-Virus Calif02ri.scb.es Encephalitis-Virus Colorado-Tickfleber-Virus Gelbfieber-Virus Dengue-Virus

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2 5 3 B B 7

Reoviren

Reovirus-Typen 1-3

Hepatitis

Hepatitis-A-Virus Hepatitis-B-Virus

Tumorviren

Rauscher-Leukämie-Virus Gross-Virus Maloney-Leukämie-Virus Friend-Leukämie-Virus Mäuse-Mammatumor-Virus Vo-ge-Qeukose-Virus Rous-Sarkom-Virus Polyoma-Virus Simia-Virus-40 Papilloma-Virus

Mikroorganismen-Präparate sind beispielsweise: Streptococcus-pyogenes-Protein, Pasteurella-pe sti s-Proteintoxin, Clostridium-tetani-Toxoid Clostridium-perfringens-a-Lecithinase Escherichia-coli-Filtrate Treponema-reiteri-Proteinextrakt Corynebacterium-diphtheriae-Toxin und -Toxoid Mycobacterium-tuberculoisis-Protein M.-tuberculosis-Gytoplasma M.-tuberculosis-Kulturfiltrat und Tuberculin Mycoplasma-pneumoniae-"Rohe s"-Antigen

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Immunoanalyse

Die Immunoanalysen gemäß der Erfindung beruhen auf dem Grad der Löschung, der in einer Lösung auftritt, in welcher fluoreszierende Moleküle mit Licht bestrahlt werden, das durch die fluoreszierende Substanz absorbiert wird (vorzugsweise innerhalb des Absorptionspeaks) als Funktion der Menge des Liganden im Medium. Die Anzahl der Moleküle der fluoreszierenden Substanz und der Löschsubstanz, die einander bis auf eine Entfernung angenähert werden, bei der eine Löschung auftreten kann, steht mit der Menge des im Analysenmedium vorhandenen Liganden in Beziehung.

Die Analyse kann mit Rezeptoren für den Liganden-(Antiliganden) durchgeführt werden, der mit dem Chromophor-(Antiligand)-Chromophor konjugiert ist oder mit einem Rezeptor für den Antiliganden-(Anti-(Antiligand)), der mit dem Chromophor-(Anti-(Antiligand)-Chromophor) konjugiert ist. Aus den nachstehend noch angegebenen Gründen hat die zuletzt genannte Methode (Doppelrezeptormethode) verfahrensmäßige Vorteile und bietet Analysenmöglichkeiten, die bei der Einzelrezeptormethode nicht gegeben sind. Bei der Doppelrezeptormethode wird der Rezeptor-Chromophor indirekt an den Liganden gebunden, und zwar durch ein Rezeptor-(Antiligand)-Zwischenprodukt, das nun einen zusätzlichen Freiheitsgrad bei der Auswahl der Reagentien bietet.

Bei der Durchführung der Analyse und der Anwendung der einzelnen Rezeptormethode hat das Ligandenalog-Reagens das Ligandanaloge entweder direkt (kovalent) an einen Chromophor, an ein Ligandanalog-(Ch₂)_x oder ein Poly-(Ligandanalog)-poly(Chp) gebunden oder indirekt (über ein

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Rezeptor-Ch.·,) an einen Chromophor (Ch₂) gebunden. Die Analyse wird dann so durchgeführt, daß man im Analysenmedium den an Ch₂ gebundenen Liganden, den Rezeptor-Ch,. und die unbekannte Substanz miteinander vereinigt. Bezüglich der Reihenfolge der Zugabe sind mehrere Alternativen möglich. Soll das Ligandanaloge indirekt mit Ch₂ verbunden werden, so können der Rezeptor-Ch,. und der Rezeptor-Ch₂ stufenweise oder praktisch gleichzeitig zugesetzt werden.

Zweckmäßig werden der Rezeptor-Ch,. und der Rezeptor-Chu als kombiniertes Einzelreagens im richtigen Verhältnis verwendet. Auf diese Weise kann das Verhältnis zwischen zwei üblichen Rezeptoren sorgfältig eingestellt werden, und die Rezeptoren können dem Analysengemisch exakt zugesetzt werden. Bas Gemisch kann ein trockenes, lyophilisiertes Gemisch oder eine wäßrige, normalerweise gepufferte (pH 5-10; gewöhnlich 6,5 - 8,5) Lösung in jeder gewünschten Konzentration sein.

Die Konzentrationen der interessierenden Liganden sind im

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allgemeinen etwa 10 bis 10 , üblicherweise etwa

10 bis 10"¹² molar, am häufigsten etwa 10 bis 10"¹⁰ molar. Die Konzentrationen der Reagentien stehen mit der interessierenden Konzentration des Liganden in Beziehung.

Das Medium ist normalerweise wäßrig und enthält etwa 0 bis 40, gewöhnlich etwa 0 bis 20 Volumprozent eines polaren organischen Lösungsmittels. Beispiele für polare organische Lösungsmittel sind Äthylenglykol, Äthanol, Carbitol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid u. dgl.

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Vorzugsweise ist das wäßrige Medium praktisch frei von ■ anderen polaren Lösungsmitteln. Das Medium ist normalerweise im pH-Wert-Bereich von etwa 5 bis 10, vorzugsweise von etwa 6,5 bis 8,5 und insbesondere von etwa 7 bis 8,5 gepuffert. Es können unterschiedliche Puffersubstanzen verwendet werden, z.B. Borat, Phosphat, Carbonat, Barbitursäure, Tris und ähnliche. Die jeweils verwendete Puffersubstanz ist nicht erfindungswesentlich» doch kann bei bestimmten Analysen eine Puffersubstanz der anderen vorzuziehen sein. Die Pufferkonzentration liegt normalerweise im Bereich von etwa 0,005 bis 0,5 molar, gewöhnlich von etwa 0,01 bis etwa 0,1 molar.

Während der Analyse werden normalerweise mäßige Temperaturen angewendet, die im allgemeinen von etwa 0 bis 45°C, üblicherweise von etwa 15 bis 40°C reichen. Die jeweils gewählte Temperatur wird durch Zweckmäßfekeitserwägungen bestimmt sowie durch den Einfluß der Temperatur auf den Wirkungsgrad der Fluoreszenz und durch die Bindekonstante des Rezeptors mit dem Liganden. Die Analyse verläuft besser bei niedrigeren Temperaturen, da sowohl der Wirkungsgrad der Fluoreszenz als auch die Bindungskonstanten besser sind.

Aus Gründen der Einfachheit werden die einzelnen Rezeptoranalysen in solche unterteilt, bei denen der Ligand kovalent an den Chromophor gebunden ist, und in solche, bei denen der Ligand indirekt durch einen Rezeptor an den Chromophor gebunden ist.

Die erste Analyse wird mit solchen Zusammensetzungen durchgeführt, bei denen der Chromophor kovalent mit dem Liganden verbunden ist. Wie schon gesagt, kann ein einziger Chromophor

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mit einem einzigen Ligand verbunden sein oder, wenn man ein Kernmolekül verwendet, kann eine Vielzahl von Liganden mit einer Vielzahl von chromophoren Gruppen verbunden sein. Mit großen Liganden, z.B. Proteinen kann aber auch eine Vielzahl von chromophoren Gruppen an den Liganden gebunden sein.

Der Ligandanalog-Chromophor liegt gewöhnlich in einer Konzentration vor, die nicht größer ist als das 100-fache der höchsten Konzentration und die nicht geringer ist als das 0,01-fache der niedrigsten Konzentration des interessierenden Konzentrationsbereiches; üblicherweise liegt diese Konzentration im Bereich von der höchsten interessierenden Konzentration bis nicht weniger als dem 0,1-fachen der niedrigsten interessierenden Konzentration; vorzugsweise liegt diese Konzentration innerhalb einer Größenordnung oder innerhalb eines Faktors von 10 der niedrigsten interessierenden Konzentration.

Die Rezeptor-Chromophor-Konzentration wird dann durch Zusatz des Rezeptors bestimmt, und zwar in einer Menge, die ausreicht, um eine mindestens 10%igen Löschung, vorzugsweise eine mindestens 20%ige Löschung sowie eine Löschung von bis zu 100%, gewöhnlich von etwa 20 bis 80% und vorzugsweise von etwa 50 bis 80% zu erhalten. Die Menge an Rezeptor-Chromophor steht mit der Bindungskonstante, der interessierenden Konzentration, die die Konzentration des Ligand-Chromophors beeinflußt, der Empfindlichkeit des Instruments sowie mit anderen Faktoren in Beziehung.

Obgleich der mit dem Liganden verbundene Chromophor eine Löschsubstanz sein kann, ist der mit dem Liganden verbundene

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2 B 3 h 5 71,

Chromophor in den meisten Fällen eine fluoreszierende Substanz. Dies ist nicht eine Sache der Durchführbarkeit, sondern eine Sache der Zweckmäßigkeit. In den meisten Fällen ist der Rezeptor ein Antikörper, d.h. ein komplexes Proteingemisch, das den Antikörper für den Liganden sowie andere Antikörper und Proteine enthält. Wird die Antikörper-Zusammensetzung mit dem Chromophor markiert, so wird ein beträchtlicher Anteil des Chromophors an ein anderes Protein gebunden als den Antikörper für den Liganden (Antiligand). Wenn also die fluoreszierende Substanz an den Rezeptor gebunden ist, würde dies zu einer starken Untergrundfluoreszenz im Analysenmedium führen. Wenn andererseits eine verhältnismäßig reine Probe des Antiliganden zur Verfügung steht, so besteht das bevorzugte Verfahren darin, den Liganden an die Löschsubstanz anstatt an die fluoreszierende Substanz zu binden.

Die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Substanzen zu dem zu analysierenden Medium ist nicht erfindungswesentlich. Es können die unbekannte Substanz und der Ligananalog-Chromophor gleichzeitig mit dem Rezeptor-Chromophor kombiniert werden, oder die Substanzen können nacheinander zugegeben werde* Vorzugsweise wird die unbekannte Substanz mit dem Rezeptor-Chromophor kombiniert und eine ausreichende Zeit inkubiert, um annähernd das Gleichgewicht zu erhalten. Deshalb vermindern sich die verfügbaren Bindungsstellen des Rezeptors proportional zu der Menge der im Analysenmedium vorhandenen unbekannten Substanz. Dann kann der Ligandanalog-Chromophor zugesetzt und inkubiert werden, worauf die Lösung in ein Fluorometer übertragen wird und die Intensität der Fluoreszenz dadurch bestimmt wird, daß eine Anregung mit Licht bei einer Wellenlänge oder bei Wellenlängen, die durch die fluoreszierende Substanz absorbiert werden, vorgenommen wird.

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Die Inkubationszeiten hängen von der Temperatur, der Bindungskonstante des Rezeptors und den Konzentrationen der im Analysenmedium vorhandenen Substanzen ab. Normalerweise betragen die Inkubationszeiten mindestens etwa 5 Sekunden und vorzugsweise nicht mehr als etwa 6 Stunden; sie liegen gewöhnlich im Bereich von etwa 30 Sekunden bis zwei Stunden, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 30 Minuten. Die Inkubationstemperaturen liegen im allgemeinen zwischen etwa 15 und 40°C.

"Verwendet man eine Reihe von Lösungen mit bekannten Ligandenkonzentrationen, so kann man eine Standardkurve anfertigen, auf der die Fluoreszenz oder die prozentuale Löschung mit der Konzentration des Liganden in Beziehung gesetzt werden. Die Fluoreszenz eines Analysenmediums mit einer unbekannten Substanz kann dann direkt mit der Konzentration der unbekannten Substanz im Analysenmedium in Beziehung gesetzt werden.

Bei einer zweiten Ausführungsform, bei der der Ligand indirekt mit einem Chromophor verbunden ist, wird der Antiligand in zwei Teile geteilt, wovon der eine Teil mit der fluoreszierenden Substanz und der andere Teil mit der Löschsubstanz konjugiert wird. Diese Ausführungsform setzt voraus, daß entweder der Ligand mehrere determinierende oder epitopische Stellen hat oder, wenn der Ligand nur eine oder zwei epitopische Stellen hat, ein Poly-(Ligandanalog) hergestellt werden muß. Das heißt also, daß der Ligand nur wenige, gewöhnlich etwa 1 bis 2 Antikörper gleichzeitig unterbringen kann. Wie schon gesagt, wird das Poly(Ligandanaloge) durch Konjugation eines Ligandanalogen an ein Kernmolekül mit hohem Molekulargewicht hergestellt.

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Bei dem Test, bei dem der Ligand kovalent mit dem Chroinohor konjugiert ist, zeigt sich das Ergebnis als gleichmäßige Kurve, wobei sich die Fluoreszenz von einer Ligandenkonzentration von 0 bis auf einen maximalen Fluoreszenzwert erhöht. Ein ähnliches Ergebnis beobachtet man, wenn man das Poly-(Ligandanaloge) verwendet, um den Liganden sowie den Rezeptor und die fluoreszierende Substanz bzw. den Rezeptor und die LösdBubstanz zu bestimmen. Mit einem Antigen, das mehrere determinierende Stellen hat, wobei der zu analysierenden unbekannten Substanz nur eine Rezeptor-Löschsubstanz und eine Rezeptor-fluoreszierende Substanz zugesetzt werden, ist die Fluoreszenz maximal bei einer Antigenkonzentration von Null, und nimmt ab mit zunehmender Antigenkonzentration, bis ein Minimum erreicht ist, worauf sie wieder zu einer maximalen Intensität ansteigt.

Der Grund für dieses doppelte Ergebnis ist klar. Nach Zusatz des Antigens werden die Löschsubstanz und die fluoreszierende Substanz an der Oberfläche des Antigens zusammengebracht, so daß eine gewisse Löschung auftritt. Mit zunehmender Antigenkonzentration werden die beiden Rezeptoren in immer größer werdendem Umfang an der Oberfläche cfes Antigens zusammengebracht, wodurch die Löschung zunimmt. Bei einer gewissen Konzentration erreicht jedoch die Löschung ein Maximum, d.h. die Fluoreszenz erreicht ein Minimum. Mit zunehmender Antigenkonzentration nimmt die Menge des an ein Antigen gebundenen Rezeptors ab, so daß auch der Grad der Löschung abnimmt. Schließlich ist bei einer hohen Antigenkonzentration die Menge des an ein Antigen gebundenen Rezeptors unzureichend, um eine

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Löschung zu erzeugen. Wenn man also eine Antigenanalyse durchführt, so ist es notwendig, die Analyse bei zwei verschiedenen Antigenverdünnungen durchzuführen. Auf diese Weise kann man feststellen, ob man sich auf dem abfallenden oder auf dem ansteigenden Zweig der Kurve befindet.

Die Konzentration an Poly-(Ligandanalogem), bezogen auf verfügbares Ligandanaloges liegt innerhalb der gleichen Bereiche, wie sie für den kovalent an den Chromophor
gebundenen Liganden angegeben wurden.

Führt man die Analyse mit zwei konjugierten Rezeptoren, z.B. Antikörpern durch, so wird das Antigen gewöhnlich
in Gegenwart von etwa 0,1 bis 1 mg/ml eines Proteins,
z.B. Albumin, mit den Antikörpern kombiniert und über einen ausreichenden Zeitraum inkubiert, der allgemein etwa
5 Sekunden bis 6 Stunde* gewöhnlich etwa eine halbe
Minute bis zwei Stunden, vorzugsweise 1 bis 30 Minuten, beträgt. Die Temperatur liegt im Bereich von etwa 15
bis 40°C. Die Überlegungen, die die Inkubationszeit
bestimmen, wurden bereits vorstehend erörtert.

Bei einem Poly-(Ligandanalogem) werden die beiden konjugierten Antikörper mit der zu analysierenden unbekannten Substanz kombiniert und inkubiert, worauf das Poly-(Ligandanaloge) zugesetzt und das Gemisch weiter inkubiert wird. Die vorstehend angegeben Zeiten und Temperaturen gelten auch für diese Analysenmethode.

Dann wird die Probe in ein Fluorometer gebracht, worauf die Fluoreszenz durch Anregung mit Licht mit einer geeigneten Wellenlänge bestimmt wird. Die Fluoreszenz

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-44- 2 β 3 ξ :;⁹ ^

kann auf die fluoreszierende Substanz oder auf die Löschsubstanz zurückgehen, was von dem gemessenen Wellenlängenband abhängt. Die Analyse kann manuell oder automatisch durchgeführt werden.

Das vorliegende Verfahren kann leicht zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen in menschlichen physiologischen Flüssigkeiten abgewandelt werden, wobei ein zweistufiges Verfahren und Rezeptor-Chromophore (Ch^ und Ch₂) für gamma-Globulin, z.B. menschliches gamma-Globulin, verwendet werden. Man kann aufgrund des unterschiedlichen Molekulargewichts leicht zwischen der Aggregation von Antikörpern oder anderen Rezeptor-Holekülen, die an ein Antigen gebunden sind, und den Antikörpern oder anderen Rezeptoren, die frei in der Lösung vorliegen, unterscheiden.

Je nach dem, ob man die Anwesenheit oder die Abwesenheit eines Antigens oder eines Antikörpers in einer menschlichen physiologischen Flüssigkeit, z.B. Blut, bestimmen will, setzt man das komplementäre Material zu, gewöhnlich in einem nennenswerten Überschuß über die maximale interessierende Konzentration. Will man beispielsweise die Anwesenheit von Antikörpern in Serum gegenüber einem bestimmten Antigen bestimmen, so setzt man das Antigen der physiologischen Flüssigkeit zu und trennt die Komponenten ab, deren Mölekuirgewichte größer als das Molekulargewicht des Antikörpers sind (> 160.000), z.B. durch Zentrifugieren. Nach der Abtrennung des Niederschlages von der überstehenden Flüssigkeit wird der Niederschlag wieder dispergiert und erfindungsgemäß auf die Anwesenheit von

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-45- 2S^z'i-

menschlichem gamma-Globulin untersucht. Nur in Gegenwart eines Antigens liegt menschliches gamma-Globulin ίπΐγ Niederschlag vor. Deshalb zeigt die Anwesenheit von menschlichem gamma-Globulin im Niederschlag die Anwesenheit von Antikörpern gegenüber dem Antigen im Serum an.

Das zvelstufige Verfahren kann zur Bestimmung einer großen Anzahl von Antigenen und Antikörpern angewendet werden, wobei die gleichen Rezeptor-Chromophore verwendet werden. Das Verfahren ermöglicht eine direkte Bestimmung von Antikörpern für spezifische Antigene. Antigene können indirekt durch Zusatz von Antikörpern zu der Flüssigkeit, die vermutlich das Antigen enthält,-bestimmt werden, wobei anschließend auf Anwesenheit von Antikörpern im Niederschlag nach der Trennung von gebundenen und ungebundenen Antikörpern geprüft wird.

Die Doppelrezeptormethode ist eine homogene Methode, die die Bestimmung von Haptenen, Antigenen und Anti-Liganden ermöglicht, insbesondere wenn der Ligand ein polyepitopisches Antigen ist.

Bei der einfachsten Ausführungsform zum Nachweis eines Liganden wird der Ligand mit einem Chromophor, insbesondere einer fluoreszierenden Substanz, konjugiert, worauf der Anti-Ligand und der Anti-(Antiligand)-Chromophor, insbesondere die Löschsubstanz, der Analysenlösung zugesetzt wird. Auf diese Weise kann man eine größere Anzahl von Löschmolekülen an den Liganden binden, wobei die Löschwahrscheinlichkeit verbessert wird. Tatsächlich wird durch den Anti-Liganden die Anzahl der Löschmoleküle, die an den Liganden gebunden werden können, erhöht.

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ORIQiNAL INSPECTED

-⁴⁶ - 2R3;,:;7&

Die Konzentration der Reaktionsteilnehmer geht parallel zu der der analogen Reagentien für die Einzelrezeptormethode, wobei der Anti-(Antiligand)-Chromophor in einem molaren Überschuß über den Anti-Liganden vorliegt, wobei das Molverhältnis im allgemeinen zwischen etwa 1,5 bis 10:1 liegt. Falls gewünscht, können einzelne F , -Einheiten anstatt des intakten IgG verwendet werden.

Bei der nächsten Ausführungsform werden die beiden Chromophore indirekt an den Liganden gebunden. Bei dieser Arbeitsweise werden nur Anti-Ligand und Anti-(Antiligand)-Ch^ und Anti-(Antiligand)-Ch2 verwendet. Jedoch wird vor der Einführung dieser Reagentien ein Teil des Anti-Liganden mit dem Anti-(Antiligand)-Ch₁ und ein anderer Teil mit dem Anti-(Antiligand)-Ch₂ kombiniert, um eine Bindung zu erzeugen. Zweckmäßig ist der Anti-(Antiligand) monofunktionell, z.B. F^. Der Anti-(Antiligand)-Ch^ und -Chgf die an den Antiliganden gebunden sind,- liefern die vergleichbaren Reagentien für den Rezeptor-Ch^ bzw. den Rezeptor-Ch^. Es können ähnliche Verhältnisse zwischen Anti-(Antiligand)-Chromophoren und Antiligand angewendet werden, wie schon angedeutet.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Antiliganden von zwei verschiedenen Arten, z.B. Säugetierarten, wie Schafen und Kühen, verwendet. In diesem Fall sind die epitopischen oder haptenischen Stellen für die beiden Antiliganden für den gleichen Liganden verschieden. Bei der Bezeichnung des Antiliganden aus zwei verschiedenen Quellen setzt man vor den Antiliganden einen Kleinbuchstaben, z.B. a-(Antiligand). Auf diese Weise brauchen der Antiligand und der Anti-(Antiligand)-Chromophor nicht vorher kombiniert zu werden. Die Verhältnisse zwischen

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ο ς Ί " ·: - 47 - '"■'

den einzelnen Reagentien liegen parallel wie bei den analogen Reagentien für die vorstehend beschriebenen Analysen.

Die Chromophor-Reagentien sind Anti-(a-Antiligand)-Ch^ und Anti-Cb-AntiligandJ-Chp. Es ist also Ch^ nur mit einem a-(Antiliganden) und Ctu nur mit einem b-(Antiliganden) assoziert.

Diese Methode ermöglicht die Bestimmung von "Aggregaten" (assemblages) in Lösung, wobei sich die Glieder des Aggregats durch mindestens eine Epitopstelle unterscheiden. Man kann einen a-(Antiliganden) für ein Glied des Aggregats und einen b-(Antiliganden) für ein anderes Glied des Aggregats herstellen. Die Löschsubstanz und die fluoreszierende Substanz werden erst zusammengebracht, wenn die beiden Glieder miteinander verbunden sind.

Antiliganden von zwei verschiedenen Quellen können ebenfalls mit einem Liganden verwendet werden, um zu vermeiden, daß man den Antiliganden zuvor mit dem Anti-(Antiligand)-Chromophor kombinieren muß. Dies gilt auch in Fällen, in denen eine kovalente Bindung zwischen zwei Einheiten auftritt, die unabhängig voneinander existieren können, d.h. die eine chemische Reaktion eingehen.

Die Reagentien können in getrennten Ampullen oder als trockenes, lyophilisiertes Gemisch oder als wäßrige, normalerweise gepufferte (pH-Wert = 5-10, gewöhnlich 6,5 - 8,5)Lösung in jeder beliebigen Konzentration vorliegen. Vorzugsweise wird der Anti-(a-Antiligand) nicht mit einem a-(Antiligand) in Lösung als Reagens längere Zeit vor Gebrauch kombiniert. Zweckmäßig können die beiden Antiliganden und die beiden Anti-(Antiliganden) kombiniert werden.

-48- 2 B??:.: H

Ein besonderer Vorteil der Verwendung des Doppelrezeptors besteht darin, daß das gleiche Paar von (Anti-(Antiligand)-Chromophoren) ohne Rücksicht auf den Liganden verwendet werden kann, wobei nur die Paare der Antiliganden sich mit dem Liganden ändern.

Zur Bestimmung der Antikörper für ein bestimmtes Antigen führt man die Analyse so aus, als ob man das Antigen bestimmen würde, ausgenommen, daß man eine bekannte Menge Antigen dem Analysenmedium zusetzt. Jeder beliebige, in der unbekannten Substanz vorhandener Antikörper vermindert die Menge des Anti-(Antiligand)-Chromophors, der an das Antigen gebunden ist, und vermindert auf diese Weise das Ausmaß der Löschung, die in Abwesenheit des Antikörpers auftreten würde. Der Antiligand würde natürlich von einer anderen Art abstammen (nicht von einem Säugetier) als der zu bestimmende Antikörper.

Die nachstehenden Beispiele sollen lediglich zur Erläuterung der Erfindung dienen.

Im nachfolgenden experimentellen Teil sind alle Temperaturen in Grad C angegeben, falls nichts anderes gesagt ist. Alle Teile beziehen sich auf das Gewicht, falls nichts anderes gesagt ist. Alle Pufferlösungen sind wäßrige Pufferlösungen. Alle Symbole haben ihre normale Bedeutung, wenn nichts anderes gesagt ist.

Es werden folgende Symbole verwendet:

IgG » gamma-Globulin;
IgG(x) « Anti-xj

R « Tetramethylrhodamin; Beispiel: RlgG(x) = Tetramethylrhodami.n, konjugiert an Anti-x;

6 09810/0936 DRIGHNAL INSPECTED

2 B 3

F = Fluorescein; Beispiel: FlgG(x) Fluorescein,

konjugiert an Anti-x; und hlgG = menschliches gamma-Globulin.

Beispiel 1

Fluorescein-Isothiocyanat (FITC )-Kon,iugat an 0 -Aminoäthylmorphin (FLUMO'S')

A. Fluoresceinamin (0,5 g) (Sigma, Isomer I, rein nach der Dünnschichtchromatographie, CH^OH/CHCl, = 1:3) wurde in 20 ml trockenem Aceton (über wasserfreiem KpCO-,) getrocknet, gelöst und bei Raumtemperatur zu 3ml Thiophosgen in 5 ml Aceton unter starkem Rühren (Ί/2 Stunde) zugetropft. Das Rühren wurde noch 1 Stunde fortgesetzt, und der erhaltene Niederschlag, der mit Hilfe eines Eisbades auf 5° abgekühlt wurde, wurde schnell durch einen feinen Sinterglastrichter filtriert. Der Niederschlag wurde mit 3ml trockenem Aceton und dann mit 5 x 5 ml ON HCl gewaschen, während er mit einer Spatel zerdrückt wurde, bis er vollständig nach Tiefrot umgeschlagen hatte. Anschließend wurde er über Nacht unter Vakuum (über 80%iger KOH) getrocknet. Das erhaltene Isothiocyanat war rein (nach der Dünnschichtchromatographie, 50% CH,OH/DMF).

B. 100 mg 0 -Aminoäthylmorphin werden in 5 ml Aceton gelöst und einem Gemisch aus 20 ml Aceton, 5 ml Wasser und 0,07 ml Triäthylamin zugesetzt. Dieser Lösung wird eine Lösung von 100 mg FITC in 5 ml Aceton unter Rühren über einen Zeitraum von 15 Minuten zugetropft. Das Rühren

B09810/0936 ^_Tt=n

ORlOlNAL INSPECTED

- 50 - I Λ Λ : . *

wird noch 80 Minuten fortgesetzt, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zutropfen von verdünnter Triäthylaminlösung in Aceton (1,4 ml/10 inl Aceton) auf 9,5 eingestellt wird. Dann wird das Aceton mit Hilfe eines Drehverdampfers bei Raumtemperatur teilweise entfernt. Das Produkt wird ausgefällt, indem CO₂ bei gleichzeitiger Zugabe von H₂O (bis 10 ml) durch die Lösung geleitet wird, bis der pH-Wert auf 6 bis 6,5 fällt. Der Niederschlag wird schnell durch einen Sinterglastrichter filtriert und mit rJUCO^-Lösung (2ml, pH-Wert = 6,0) gewaschen. Die Ausbeute beträgt 60 mg. Das Filtrat und die Waschwässer werden vereinigt, wobei beim nochmaligen Durchleiten von CO₂ in der vorstehend beschriebenen Weise eine zweite Fraktion erhalten wird. Ausbeute 27 mg. Das Produkt wird über Nacht iinter Vakuum bei 80° über P?°5 getrocknet. Die Gesamtausbeute beträgt 87 mg. Das Produkt zeigt bei der Dünnschichtchromatographie (50% Methanol in Dimethylformamid) einen einzigen Fleck bei Rf = 0,45.

Beispiel 2

Reinigung und Markierung von Morphin-Antikörper (igG(m)) mit Tetramethvlrhodamin-Isothiocyanat (TRITC)

A. (a) Herstellung des Morphin-Immunoadsorbens

Mit Cyanogenbromid aktivierte Sepharose 4B, gekuppelt mit Hexamethylendiamin (8-10 /U Mol/1ml gepacktes Gel) wurde nach den Anweisungen des Herstellers (Pharmacia, Upsala) hergestellt. Das feuchte Gel (2,5 ml) wurde in Boratpuffer

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(10ml, O,1n, pH = 8,8) suspendiert, worauf das gemischte Anhydrid von O -Carboxymethylmorphin und ChI or ameisensäureisobutylester (0,1 mMol, großer Überschuß) in DIiF (2ml) in der Kälte (0°) zugesetzt und das Gemisch 3 Stunden reagieren gelassen wurde. Das Gel wurde abfiltriert und nacheinander mit HpO (500 ml), ü,1m Boratpuffer, pH = 9,0 (500 ml), H₂O (500 ml) verdünnter HCl + 0,1 m NaCl, pH = 2,5 (1500 ml) und Η_£0 (1000 ml) gewaschen. Nach Beendigung der Waschungen konnte kein Morphin nachgewiesen werden. Die Abschätzung des gebundenen Morphins wurde nach einer Hydrolysemethode mit verdünnter Essigsäure durchgeführt (Failla et al., Anal. Biochem., 52, 363 (1973))· Das UV-Spektrum wurde mit dem von 0 -Carboxymethylmorphin verglichen. Das gebundene Morphinäquivalent betrug 5,05/U Mol/1ml gepacktes Gel.

(t>) Reinigung des Morphin-Antikörpers

Das Morphin-Sepharose-Konjugat (2,5 ml) wurde in eine Kolonne mit einem Außendurchmesser von etwa 6,3 mm gepackt und nacheinander mit jeweils 100 ml Boratpuffer, 0,1 m, pH = 9,0; HpO; verdünnter HCl, pH = 1,5; HpO und dem gleichen Boratpuffer gewaschen. Gelagerte IgG-Lösung vom Schaf (7 ml, 2,18 χ 10 M Bindestellen) wurde auf die Kolonne aufgebracht, worauf mit Boratpuffer (0,1 m, pH = 9,0) gewaschen wurde, bis kein Protein mehr im Ausfluß nachgewiesen werden konnte (durch UV-Analyse). Die gesamte Antimorphinaktivität wurde in der Kolonne zurückgehalten, wie durch eine Morphin-Spinmarkierungsmessung festgestellt wurde (vergl. USA-Patentschrift 3 690 834). Es wurde

6U9810/0Ö3Ü

nochmals mitGlycin-HCl-Puffer (0,1 η, pH = 4,0) gewaschen, wobei kein Protein eluiert wurde. Dann wurde der Antikörper mit Glycin-HCl-Puffer (0,1 n, pH = 1,5) eluiert, wobei Fraktionen von 3 ml bei Raumtemperatur in Röhrchen gesammelt wurde, die 1ml 1n-Boratpuff er mit einem pH-Wert von 9,0 enthielten. Fast der gesamte Antikörper wurde in drei Fraktionen gesammelt, die vereinigt und 24 Stunden gegen 0,1 n-Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7»5 dialysiert wurden ( 2 X 2000 ml). Die Antimorphinaktivität der isolierten Fraktion wurde mit Morphin-Spinmarkierungssubstanz bestimmt, wobei 70% der ursprünglich gebundenen Antimorphinaktivität gefunden wurden. Diese Fraktion war 100%ig rein (bestimmt als Antimorphin-Aktivitäts-Titerwert, verglichen mit dem Proteingehalt, ermittelt aus dem UV-Spektrum bei 280 mn).

B. (a) Reinigung des Horphinantikörpers durch Sephadex-Chromatographie

Die Antimorphin-IgG(m)-Lösung (2ml, etwa 50 mg/ml Gesamtprotein) wurde auf einer Sephadex-G-200-Kolonne ( 2 χ 30 cm) mit 0,01 m phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 getrennt (Strömungsgeschwindigkeit 1ml/ 10min). Das IgG trennte sich sauber vom IgM und dem Albumin, und es wurden Fraktionen von 2 bis 3 ml gesammelt. Das erhaltene IgG zeigte kein Albumin bei der Celluloseacetat-Elektrophorese (Tris-Barbiturat-Puffer, pH = 8,8, η = 0,1); es handelte sich um 32 - 35 %iges antimorphinreiches IgG* Die Ausbeute hing von der Schnittbreite des gesammelten IgG-Peaks ab und betrug gewöhnlich 50% der gesamten, auf die Kolonne aufgebrachten Antimorphinaktivität. Die gesammelte IgG-Fraktion wurde gegen 0,01 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 dialysiert.

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ORfQiNAL INSPECTED

(b) Behandlung von Rinderserumalbumin (RSA) mit dem Immunoadsorbens

RSA wurde mit CNBr-aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia) nach den Anweisungen des Herstellers aktiviert (es wurde ein 50%iger Überschuß an RSA über den empfohlenen Wert verwendet). 5 ml der über Sephadex chromatographierten igG-Lösung (20 mg/ml) wurden auf die RSA-Immunoadsorbens-Kolonne ( 1 χ 15 cm) aufgebracht und mit 0,01 m Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 eluiert. Das gesammelte Protein fand sich in 20 ml Flüssigkeit und wurde durch UV-Analyse auf seinen Proteingehalt und durch eine Spinmarkierungsmethode auf seine Antimorphinaktivität untersucht. Das Protein wurde zu 70% und die Antimorphinaktivität zu 90 - 92% wiedergewonnen.

(c) Antimorphin (IgG(m)) markiert mit TRITG (RlgG(m))

Zu einer Lösung von IgG(m) (7 mg/0,5 ml) in 0,01 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 wird kristallines Kaliumcarbonat unter Rühren bei Raumtemperatur gegeben, bis der pH-Wert auf 10,0 bis 10,5 ansteigt. Dann wird TRITG (Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat) (15 - 1000/Ug) gelöst in Aceton (3-30 /ul) zugesetzt und das Rühren wird noch drei Stunden fortgesetzt. Der pH-Wert fällt zunächst auf 9,0, bleibt dann konstant und wird, falls erforderlich, durch vorsichtige Zugabe von kristallinem Kaliumcarbonat auf 9,0 bis 9,5 gehalten. Das Reaktionsgemisch wird dann auf eine Sephadex-G-25(M)-Kolonne ( 1 χ 15 cm) mit 0,01 m Phosphatpuffer, pH = 7,5 aufgebracht; die zuerst eluierte

6098 10/0936 .QBKaWAL

- 54 - 2 5 3b r- 7

gefärbte Bande, die von den anderen Banden vollständig getrennt ist, wird in 10 bis 15 Minuten gesammelt. Die Trennung wird zweimal wiederholt, um eine vollständige Entfernung des freien Farbstoffes zu gewährleisten. Wenn sich ein Niederschlag bildet, wird dieser durch Zentrifugieren vor der Trennung auf Sephadex entfernt. Die nachstehende Tabelle zeigt die Herstellung von Konjugaten mit verschieden starkem Markierungsgrad nach der vorstehend angegebenen Arbeitsweise:

Protein Konzentration Farbstoff F/P* Wiederge- (% Antimorphin) mg/G,5ml (TRITC) (M/M) wonne Aktivi-

^Ug tat, %

IgG (45) 7,1

IgG (45) ' 7,1

IgG (45) 7,1

* F/P = Farbstoff/Protein

Beispiel 3

Mit Fluoreso-ein-Isothiocyanat (FITC) markierter Morphin-Antikörper (FlgG(m))

(a) Konjugationsverfahren

Vier 1ml-Fraktionen eines durch Affinitätschromatographie gereinigten Morphin-Antikörpers (3,06 mg Protein/ml) (vergl. Beispiel 2) in 0,01 m Phosphatpuffer mit einem

15	0,9	86
50	2,2	89
150	4,4	75
400	15-16	75
750	20-23	70

609810/0936

pH-Wert von 7,5 wurden mit kristallinem Natriumcarbonat (Na₂CO-Z) auf 9,5 gebracht. Den vier Antikörperfraktionen wurden bei Raumtemperatur unter Rühren 10, 20, 30 bzw. 50 ,ul einer Acetonlösung von FITC (2mg/300/ul) zugesetzt. Nach drei Stunden wurden die vier Reaktionsgemische vereinigt, dann in 8 gleiche Teile geteilt, wovon jeder durch eine Sephadex-G-25-Kolonne ( 1 χ 15 cm), die mit 0,01 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 ins Gleichgewicht gesetzt worden war, hindurchgeleitet wurde. Die Eluierung mit der gleichen Pufferlösung ergab als erstes gefärbtes Band das Konjugat, das frei von nicht umgesetztem Farbstoff war.

(b) Abtrennung des FITC-Kon.jugats auf einer DEAE-Cellulose- Kolonne

(vergl. H.Goldman,"Fluorescent Antibody "Methods", Academic Press ed., 1968, Seiten 104-107). Das FITC-Antimorphin-Konöugat wurde auf eine DEAE-Cellulosekolonne (1x3 cm), die mit 0,01 m -Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3 ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgebracht. Die Eluierung mit der gleichen Pufferlösung und mit zunehmender NaCl-Konzentration ergab Fraktionen mit zunehmendem Färbstoffgehalt. Der Färbstoffgehalt (F/P) der einzelnen Fraktionen wurde nach dem Wells-Nomogramm bestimmt (vergl. A.F. Wells, C.E.Miller und il.K.Nadel, Appl. Microbiol, 14, 271 (1966)). Die Antimorphinaktivität wurde wie üblich mit einer Morphin-Spinmarkierungssubstanz bestimmt. Es wurden folgende Fraktionen erhalten:

_{ΙΝ&Μ=ι/ιΈ}0

	- i?b -	253557/,
Fraktion Nr.	Protein mg	F/P , M/M
1	1,75	1,5
2	1,3	3,0
3	1,15	6,0
4	1,42	9,0
	Beispiel 4

Reinigung des Antikörpers für menschliches gamma-Globulin (IgGChIgG)) und Konjugation mit FITC (FlgG(hlgG)) und TRITC .(RlgG(hlgG))

(a) Reinigung des Antikörpers für menschliches IgG durch Affinitätschromatographie

2g Sepharose-4B wurden mit 18 mg menschlichem gamma-Globulin (hlgG) gekuppelt, wie es im Handbuch des Herstellers (PharmecLa, Upsala) angegeben ist. Dann wurde Kaninchen-Antiserum (50ml) zu hlgG (5mg Antikörper/ml) (igG(hlgG)) von Antibodies Incorporated erhalten. Ss wurde eine Säule (1x3 cm) des vorstehend beschriebenen Sepharose-hlgG-Konjugats mit 0,01m Boratpuffer bei einem pH-Wert von 8,0 hergestellt. Das Antiserum wurde durch die Kolonne geleitet, worauf diese mit der gleichen Pufferlösung gewaschen wurde, bis kein Protein mehr im Ausfluß nachgewiesen werden konnte. Die Kolonne wurde dann nochmals mit 0,1 m Glycin-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 5,0 gewaschen. Der Antikörper wurde dann mit 0,1m Glycin-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 2,5 eluiert. Es wurden Fraktionen von 3ml gesammelt und sofort mit 0,5 m Boratpuffer (pH-Wert 9,0) neutralisiert. Das Gesamtvolumen der so gesammelten

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2 β ·3.--,.

Antikörperlösung betrug 30ml. Die Antikörperlösung wurde über Nacht gegen 0,05 m Phosphatpuffer (pH-Wert = 8,0) dialysiert, dann mit "Aquacide" konzentriert und nochmals dialysiert. Das Endvolumen betrug 11 ml, und der Protein-Antikörper-Gehalt betrug 3,76 mg/ml (bestimmt aus dem Absorptionsspektrum bei 280 nni). Der Antikörper wurde zu 83 % wiedergewonnen.

(b) Herstellung von FIgG(hlgG)

(i) Die vorstehend angegebene Antikörperlösung (1ml) in 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 wurde mit kristallinem Na₂CO, auf einen pH-Wert von 9,5 gebracht. Dann wurden 100/Ug FITC in 10 /ul Aceton bei Raumtemperatur zugesetzt, und das Gemisch wurde 3 Stunden gerührt. Das Konjugat wurde dann auf Sephadex-G-25 (M) ( 1 χ 10 cm), das mit 0,05m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war, getrennt. Das Konjugat wurde in einem Volumen von 1,5 ml gesammelt. Es hatte ein Färbstoff/Protein-Verhältnis F/P von 4,3 (Mol/Mol); die Menge betrug 2,05 mg/ml (bestimmt nach dem Wells-Nomogramm).

(c) Herstellung von RlgG(hlgG)

(1) Die vorstehend beschriebene Antikörperlösung (1ml) in 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 wurde mit kristallinem Na₂CO, auf einen pH-Wert von 9,5 gebracht. Dann wurde 0,5 mg TRITC in Aceton (20-30/ul) bei Raumtemperatur zugesetzt, und das Gemisch wurde 3 Stunden gerührt. Es bildete sich ein Niederschlag, der abzentrifugiert und verworfen wurde. Das Konjugat wurde dann

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- 58 - 2 B.3 O :■ ^: /:

zweimal auf einer Sephadex-G-25-Kolonne (1 χ 10cm), die mit 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war, getrennt. Das Produkt wurde in einem Volumen von 2 ml gesammelt und hatte ein Farbstoff/Protein-Verhältnis von 10; seine Menge betrug 0,7 mg/ml (bestimmt aus dem Absorptionsspektrum bei 280 und 516 nm).

(2) Die mit DEAE-Cellulose abgetrennte IgG-Fraktion ( 27,6 mg/ml) von Kaninchen-Antiserum zu hlgG (6,4 mg Antikörper/ ml) wurde von Antibodies Inc. erhalten. Die obige Proteinlösung (0,5 ml) wurde mit kristallinem Na₂CO-, auf einen pK-Wert von 9,5 gebracht, worauf 3mg TRITC in 50yul Aceton und 0,5 ml H₂O unter Rühren in der Kälte (4°) zugesetzt wurden. Nach 3 Stunden bildete sich ein Niederschlag, der abfiltriert wurde. Die erhaltene violette Lösung wurde nacheinander zweimal auf einer Sephadex-G-25(M)-Kolonne ( 2 χ 30 cm), die mit 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war, getrennt. Das erhaltene Konjugat enthielt 0,1mg Antikörper/ml und hatte ein Farbstoff/Protein-Verhältnis von 12-15 (Mol/Mol) (aus dem Absorptionsspektrum errechnet).

Beispiel 5

Konjugation von menschlichem gamma-Globulin (hlgG) an Fluorescein (FhIgG)

Ein mg HIgG (menschliches IgG), gelöst in 0,4 ml 0,1m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5, wurde mit kristallinem Na₂CO₃ auf einen pH-Wert von 9,5 gebracht.

6 098 10/0936

- ⁵⁹ - 253557/,

10/ul einer Lösung von FITC (70/Ug) in Aceton wurden unter Rühren zugesetzt und 3 Stunden bei Raumtemperatur vermischt. Die erhaltene Lösung wurde zweimal auf einer Sephadex-G-25 (H)-Kolonne (1 χ 15 cm), die mit 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war, getrennt. Die eluierte FITC-hlgG-Konjugat-Lösung hatte eine Konzentration von 0,58 mg/ml und ein Farbstoff/ Protein-Verhältnis von 5,5 (Mol/Mol) (nach dem Wells-Nomogramm bestimmt).

Beispiel 6 i-Iorphin, an Rinderserumalbumin konjugiert (RSA-44m)

3,43 g 0 -Carboxymethylmorphin und 1,^1 ml Chlorameisensäureisobutylester wurden in 30 ml DtIF bei 0° miteinander kombiniert. Die erhaltene klare Lösung wurde dann einer gerührten Lösung von 2,88 g RSA und 13 g NaHCO, in 600 ml Wasser bei 0° zugesetzt. Der Zusatz erfolgte mit Hilfe einer Injektionsspritze, deren Nadel unter die Oberfläche der Lösung gehalten wurde. Die Lösung wurde in einem kalten Raum über Nacht gerührt.

Nach dem Hindurchleiten der Lösung durch eine große Sephadex-rKolonne wurde der Ausfluß mit Dow HFD/1 über Nacht auf 60ml konzentriert und lyophilisiert, wobei eine Ausbeute von 3,1 g erhalten wurde. Durch UV-Analyse des Produktes konnte nachgewiesen werden, daß es durchschnittlich etwa 44 Morphingruppen enthielt.

SUBB 1 0/Q93B

- 60 - 2 5 3 '-,! < 7 Λ

Um die Wirksamkeit der auf der Fluoreszenzlöschung beruhenden Tests als Verfahren zur Bestimmung eines Liganden zu zeigen, wurden eine Anzahl von verschiedenen Tests unter Anwendung verschiedener Arbeitsweisen durchgeführt.

Der erste Test ist eine Analyse auf Morphin und Codein, wobei das Fluorescein-Isothiocyanat-Konjugat zu 0 Aminoäthy!morphin (FLUMO'S¹) verwendet wurde.

Zuerst wurde eine Anzahl von Antikörper-Konjugaten mit unterschiedlichem Markierungsgrad bezüglich Rhodamin mit FLUMO¹S' kombiniert, um die maximale Löschung festzustellen. Das FLUMO'S' lag in einer Konzentration von 1,83 x 10~⁹ Mol in 0,05 m Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 vor. Die relative Floreszenzintensitat bei

F_mnv = 516 - 518 nm wurde durch Abfahren des Spektrums max

von 490 bis 530 nm aufgezeichnet; die Anregungslinie lag bei 462 - 464 nm, und die Spalte wurden mit einem Empfindlichkeitsknopf eingestellt, um den Peak auf der Skala eines Perkin-Elmer-Model-I'IPF-2A-Fluoreszenz-Spektrophotometers zu halten. Die Spektrophotometerzelle mit einer Weglänge von 1 cm und einem Volumen von 3 ml wurde in eine Doppelspiegelanordnung eingebaut. Der konjugierte Antikörper wurde mit FLUMO¹S' bei Raumtemperatur in Pyrex-Gläsern 30 bis 40 Minuten inkubiert, bevor die Fluoreszenz gemessen wurde.

Das Farbstoff/Protein-Verhältnis (Mol/Mol) für die !Conjugate betrug 0,9, 2,2, 4,4, 15-16 und 20-22. Die Ergebnisse für die relative Wirksamkeit (die Hälfte der maximalen Löschung in %, geteilt durch die entsprechende Anzahl von Bindungsstellen-Äquivalenten) waren 6,16,4, 24, 51,4 bzw. 31,5.

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- 61 - 2 B ?> ί ^:*. - L

Bei der Durchführung des Tests wurde folgende Reagentien verwendet: FLUMO'S': 1,38 χ 10~⁷ Mol; RlgG(m) F/P = 30, 4,58 χ 10"⁷ Mol; Boratpuffer 0,05 m pH = 8,0; Standard-Morphinlösungen (1,5 x 10 - 1,5 x 10"' Mol). Die Inkubation erfolgte in Glasröhrchen.

Arbeitsweise:"gleiche Mengen an RlgG(m) (40/ul) wurden mit 0,05 m Boratpuffer, pH = 8,0 (2940-2990/ul) verdünnt und bei Raumtemperatur mit zunehmenden Mengen Morphin (5-10/ul der Standard-Morphinlösungen) eine Stunde inkubiert. Dann wurden 10/ul FLUMO¹S' zugesetzt und das Gemisch wurde eine weitere Stunde inkubiert. Das Endvolumen in jedem Röhrchen betrug 3ml. Die Endkonzentration an FLUMO¹S¹ betrug 4,6 χ 10""¹⁰ Mol und die von RlgG(m) 6,1 χ 10~^y Mol, bezogen auf Bindungsstellen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle als Zunahme der Bluoreszenzintensität in %, bezogen auf die mögliche maximale Fluoreszenz angegeben (FLUMO¹S' ohne löschenden Antikörper).

Morphin (Molarität)

2,5x10 5x10"⁹ 2,5x10 5x10"⁸ 2,5x10 5x10"⁷ 2,5x10 5x10"⁶

-9

-8

-7

-6

Tabelle	Signal	Ϊ	% von F
intensität
27	33,33
28	34,5
29,5	36,4
35	43,2
38	46,9
54	66,6
60	74
74	91,3
78	96,3

BÜ98 1 0/0936

Die Untersuchung wurde mit Codein anstelle von Morphin v/iederholt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

	Tabelle II	# von F
Codein	Signal	max
(Molarität)	intensität	32,9
0	27	37,2
2,5x10"⁹	30,5	43,9
5x1Ο"⁹	36	62,2
2,5x10"⁸	51	70,7
5x1Ο"⁸	58	91,5
5x1Ο"⁷	75	97,5
2,5x1O~^b	80

Der Versuch wurde wiederholt, wobei statt des mit Rhodamin markierten Morphin-Antikörpers (RlgG(m)) mit einem Farbstoff /Pro te in-Verhältnis von 30 (Mol/Mol) ,RIgG (m) mit einem Farbstoff/Protein-Verhältnis von 22 verwendet wurde. Die nachstehenden Ergebnisse wurden unter Verwendung von Morphin erhalten.

Tabelle III

Morphin(Molarität)	Signalintensität	# ^{νοη F}max
0	24,5	29,9
2,5x1Ο"¹⁰	26,0	31,7
5X10-¹⁰	26,5	32,3
2,5x1Ο"⁹	28,0	34,1
5x1Ο'⁹	29,0	35,4
1x10"⁸	33,5	40,8
2,5x10"⁸	40,0	48,8
5x10"⁸ ■ ...	45,5	55,5
1x1Ο"⁷	53,0	64,6
2,5x1Ο"⁷	63,0	76,8
5x1Ο"⁷	68,0	82,9

6098 10/0936

1x10"^b 72,5 88,4

2,5x1O~⁶ 80,0 97,5

5x10~⁶ 82,0 100

Bei der nächsten Untersuchung wurde ein Polyligand, nämlich Morphin, konjugiert an Rinderserumalbumin, verwendet, wobei durchschnittlich 44 Morphineinheiten je Albumin vorlagen. Bei einem ersten Test wurde der Polyligand als synthetisches Protein verwendet, wobei der Polyligand mehrere Horphin-Epitopstellen hatte. In einer zweiten Testreihe wurde der Polyligand zur Bestimmung von Morphin oder Codein verwendet. In beiden Analysen ist keiner der Chromophore kovalent an die interessierende Spitopstelle gebunden,sondern jeder Chromophor wird durch den Antikörper gebunden. Es liegt also eine unregelmäßige Bindung des Antikörpers an Morphin am Polyliganden vor. Bei den interessierenden Konzentrationen wurde in einer hier nicht erwähnten Untersuchung gefunden, daß eine optimale Löschung erhalten wurde, wenn das Verhältnis zwischen Löschsubstanz (als Rezeptor-Löschsubstanz) zur fluoreszierenden Substanz (als Rezeptor-fluoreszierende Substanz) etwa 5:1 betrug.

Beim ersten Test, bei dem das Poly-(LigandaiBLoge) bestimmt wurde, wurde eine Reihe von Teströhrchen vorbereitet, von denen jedes 6,4 x10 Hol,(bezogen auf Bindungsstellen) Antimorphin mit einem Färbstoff/Protein-Verhältnis (Fluorescein/Antikörper) von 9 sowie 3,47 x10~ Hol (bezogen auf Bindungstellen), Antimorphin mit einem Farbstoff/Protein-Verhältnis (Rhodamin/Antikörper) von etwa 22 enthielt; diese lagen in einem 0,05m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 vor, der auch 1,2x10" Hol Rinder-gamma-Globulin enthielt. Es wurden wechselnde Mengen des mit Morphin

6UH810/ÜÜ36

2 5 λ ο

konjugierten Rinderserumalbumins (etwa 44 Morphineinheiten je Albumin) (0,012 - 1,2 /ug) jedem der Röhrchen in Mengen von 5-10 /ul zugesetzt, so daß das Endvolumen 0,5 ml betrug; dann wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Die Fluoreszenz wurde in jedem Röhrchen gemessen und als prozentualer Anteil der maximal möglichen Fluoreszenz (wenn kein mit'Morphin konjugiertes RSA vorhanden ist) ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

	Tabelle IV
44m-RSA	^{56 VOn F}max
ug(zügesetzt)
0	100
0,012	84,5
0,024	72
0,048	64,5
0,084	61
0,12	66
0,24	74
0,48	83
1,20	92

Für die Analyse von Codein wurde die nachstehend angegebene Arbeitsweise angewendet. Es wurden das gleiche Antimorphin-Fluorescein(FIgG(m)) und Antimorphin-Rhodamin (RlgG(m)) wie oben angewendet, wobei 30/ul des FlgG(m) (2,64x10 Mol) und 30 /ul des RlgG(m) (1,44x10 Mol) in einer Reihe von Teströhrchen mit,0,05 m Phosphatpuffer, pH = 8,0, der 1,5x10"⁶ Mol Rinder-gamma-Globulin(390-430/ul) enthielt, verdünnt. Dann wird Codein in zunehmenden Konzentrationen

609810/U936

"³ - 1,5x10"^u Mol) zugesetzt (10-40/ul), und das Gemisch wird 0,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Jedem der Röhrchen werden dann 10/ul (0,24 /Ug) des zuvor verwendeten Morphin-Rinderserum-Albumin-Konougats zugesetzt, und die Röhrchen werden nochmals 1 Stunde inkubiert. Das Endvolumen in jedem Röhrchen betrug 0,5 ml. Dann wurde die Fluoreszenz jedes Röhrchens bei 518 nm aiigezeich.net und als prozentualer Anteil der maximal möglichen Fluoreszenz (wenn kein Morphin-RSA-Konjugat vorhanden ist) ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Tabelle V

Codein (Mol)

3x10
6x10

-9 -9

1,2x10 3x1Ο"⁸ 6x1Ο"⁸ 1,2x10 3x10

-8

-7

6x10

-7

1, 2x10 3x10"⁶

-6

% von F

max

49

51

54

56,5

62

70,5

81

90,5

94,5

100

Die beiden nächsten Untersuchungen beziehen sich auf ein natürliches Protein, nämlich menschliches gamma-Globulin. Bei der ersten Untersuchung wurde menschliches gamma-Globulin-Fluorescein (FhIgG) mit einem Färbstoff/Protein-Verhältnis von 5,5 zur Bestimmung des menschlichen gamma-Globulins verwendet. Es wurde eine Reihe von Teströhrchen

BQ98 1 0/0936

vorbereitet, von denen jedes 100 /ul oder 0,017 mg/ml Anti-(menschliches gamma-Globulin)-Rhodamin-Konjugat (RlgG(hlgG) mit einem Farbstoff/Protein-Verhältnis von 12-15 in 0,05 m Phosphatpuffer, pH = 8,0 (330-380/ul) enthielt; es waren auch 0,6 mg/ml RSA vorhanden. Es wurden dann immer größere Mengen an menschlichem gamma-Globulin (15-35/ul) zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Lösung wurden dann 30/ul FhIgG in einer Konzentration von 0,014 mg/ml zugesetzt. Das Endvolumen in jedem Fall betrug 0,5 ml. Die Endkonzentration an

_Q

FhIgG war 5,4x10 Mol, während die Konzentration an

—10

menschlichem gamma-Globulin zwischen 4,84x10 und 6,45x10" Mol lag. Nach einer zweiten Inkubationsperiode von 30 Minuten wurde die Fluoreszenz der Röhrchen bei 522 nm als prozentualer Anteil der maximal möglichen Fluoreszenz aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Tabelle VI ■

HIgG (Mol)	^% ^{νοη F}max
0 4,84x10 ^IU 8,06x1Ο"¹⁰	28 33 36
1,13x1Ο"⁹ 1,61x1Ο"⁹	38 46
3,22x10"⁹	68
4,84x1Ο"⁹	81
8,06x10"⁹	91
1,13x10"⁸	93
1,61x1Ο"⁸	95,5
3,22x1Ο"⁸	96
6,45x10~⁸	98

6 0 98 10/0936

Als nächstes wurde menschliches gamma-Globulin unter Verv/endung des Anti-(menschliches gamma-Globulin)-Fluorescein-Konjugats (FlgG(hlgG)) und des Anti-(menschliches gamma-Globulin)-Rhodamin-Konjugats (RlgG(hlgG)) bestimmt. Das Fluoresceinkonjugat hat ein Farbstoff/Protein-Verhältnis von 4,3, das Rhodamin-Konjugat ein solches von 10. Alle Reagentien wurden mit 0,05 m Phosphatpuffer, pH = 8,0, der 0,6 mg/ml Rinderserumalbumin enthielt, verdünnt. Es wurde ein Reihe von Teströhrchen vorbereitet, von denen jedes 400/ul der angegebenen Pufferlösung enthielt. Jedem Röhrchen wurden 30/ul FlgG(hlgG) in einer Konzentration von 2,7/Ug/ml sowie 30/ul RlgG(hlgG) in einer Konzentration von 35/Ug/ml zugesetzt. Der Inhalt der Röhrchen wurde vermischt und mit zunehmenden Mengen an menschlichem gamma-Globulin versetzt (Lösungsvolumina 40 /ul) und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fluoreszenz in den Röhrchen wurde dann bestimmt und als prozentualer Anteil der Gesamtfluoreszenz in Abwesenheit von menschlichem gamma-Globulin ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

	Tabelle VII
menschliche s	IgG % von F_mov
(Mol)	max
3x10"¹¹	100
6x10"¹¹	95,7
1,2x10"¹⁰	93,2
1,8x10 ^IU	89,5
2,4x10"¹⁰	86,5
3X10"¹⁰	82,2
6x10"¹⁰	70,5
1,2x10"⁹	60,7

B U ö «10/ü a 36

1,8x1 (Γ⁹ 62

2,4x10~⁹ 68,1

3x1 (Γ⁹ 69,3

6x10"⁹ 79

1,2x10"⁸ 87,7

1,8χ10~⁸ 88,3

2,4x10"⁸ 93,8

Aus der Tabelle VII ergibt sich, daß bei zunehmender Konzentration an menschlichem gamma-Globulin die Fluoreszenz auf ein Minimum abfällt und dann wieder zunimmt. Deshalb ist es bei einer unbekannten Substanz notwendig, zwei Verdünnungen durchzuführen, um festzustellen, um welchen Teil der Kurve es sich handelt.

Die vorstehend angegebenen Ergebnisse zeigen die extreme Empfindlichkeit und den weiten Anwaüungsbereich des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens. Wendet man die Erscheinung der Fluoreszenzlöschung an, so kann man eine große Vielzahl von verschiedenen Verbindungen, sowohl von Haptenen als auch von Antigenen, direkt bestimmen. Es können üeagentien verwendet werden, bei denen das Hapten oder Antigen kovalent mit dem Chromophor verbunden ist. Andererseits, wenn die interessierende Verbindung eine Vielzahl von Epitopstellen enthält, können Gemische von Antikörpern verwendet werden, wobei ein Teil der Antikörper mit dem fluoreszenzlöschenden Molekül und ein Teil der Antikörper mit dem fluoreszierenden Molekül verbunden ist. In diesem Fall sind zur Herstellung der Reagentien Derivate des Liganden nicht erforderlich, d.h. wenn ein natürlich vorkommender Rezeptor zur Verfügung steht oder der Ligand ein Antigen ist.

6088 1 0/UB36

-69- 25

Weiterhin können Reqgentien mit einer Vielzahl von Hapten- oder Antigen-Holekülen, die an ein Kernmolekül gebunden sind, hergestellt werden. Das Kernmolekül kann entweder an einen Chromophor und einen Antikörper, der mit dem anderen Glied des aus fluoreszierender Substanz und löschender Substanz bestehenden Paar konjugiert ist, oder mit dem Antikörpergemisch verbunden sein, wie vorstehend angedeutet wurde. Die Analyse ist verhältnismäßig schnell, und je nach den Konzentrationen sind verschiedene Inkubationszeiten erforderlich. Weiterhin können die üblichen Fluorometer verwendet werden, die verhältnismäßig billig und leicht ablesbar sind.

Es können natürlich zahlreiche Änderungen und Abwandlungen vorgenommen werden, ohne daß der Rahmen der Ansprüche verlassen wird.

- Patentansprüche -

609810/0936

ORiQiNAL INSPECTED

Claims

253^74

Patentansprüche

Verfahren zinn Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Liganden in einer Analysenlösung mit einer unbekannten Substanz, von der vermutet wird, daß sie den Liganden enthält,

dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Liganden, der mindestens eine Epitopstelle hat, zwei Chromophore, und Chp, die ein aus einer fluoreszierenden Substanz

und einer fluoreszenzlöschenden Substanz bestehendes Paar bilden, als Reagentien verwendet, wobei in der Analysenlösung die Menge der fluoreszierenden Substanz, die in die Löschentfernung der fluoreszenzlöschenden Substanz gebracht wird, durch die Anwesenheit des Liganden beeinflußt wird, daß man

(A) in einem wäßrigen, gepufferten Medium zur Herstellung einer Analysenlösung miteinander kombiniert:

(1) die unbekannte Substanz;

(2) eine Quelle von Ch , wobei das Ch. kovalent an

1 '

eine erste Rezeptorzusammensetzung gebunden ist, die in der Lage ist, sich spezifisch und nichtkovalent mit dem Liganden zu verbinden;

(3) eine Quelle von Ctu, wobei das Cfcu entweder (a) kovalent an eine zweite Rezeptor-Zusammensetzung gebunden ist, die in der Lage ist, sich spezifisch und nicht-kovalent an den Liganden zu binden, oder (b) kovalent oder nicht-kovalent an ein Ligandanaloges gebunden ist, wobei das Ligandanaloge

609810/0936

ein ein- oder mehrwertiger Rest ist, von dem ein beträchtlicher Anteil eine oder mehrere Epitopstellen aufweist, die in der Lage sind, mit dem Liganden um die Bindungsstellen des Rezeptors in Wettbewerb zu treten;

(B) die Analysenlösung eine ausreichende Zeit inkubiert, damit mindestens ein Teil der Rezeptor-Zusammensetzung mit mindestens einem Teil eines vorhandenen Liganden kombinieren kann;

(G) die inkubierte Analysenlösung mit Licht von einer Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums der fluoreszierenden Substanz bestrahlt; und

(D) den Grad der Fluoreszenz der Analysenlösung im Vergleich zu einer Analysenlösung mit einer bekannten Menge Ligand mißt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite Rezeptor-Zusammensetzung der gleiche Antiligand sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Rezeptor-Zusammensetzung eine Kombination eines Antiliganden von einer ersten Art und einem Anti-(erster Antiligand), konjugiert mit Ch^, und daß die zweite Rezeptor-Zusammensetzung einen Antiliganden von einer zweiten Art und einem Anti-(zweiter Antiligand), konjugiert mit Chp darstellen.

6 09810/0836
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Molekulargewicht von etwa 110 bis 2000 aufweist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand eine Poly-(Aminosäure) mit einer Vielzahl von Epitopstellen und mit einem Molekulargewicht von mindestens etwa 10000 ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Molekulargewicht von mehr als etwa 2000 hat und eine Vielzahl von Epitop stellen aufweist, und daß die Quellen für Ch.. und Ch₂ die erste und die zweite Rezeptor-Zusammensetzung darstellen, die kovalent an Ch₁ bzw. Chp gebunden sind.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ligand ein Serumprotein verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Serumprotein ein Globulin verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Serumprotein ein Albumin verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Serumprotein ein Lipoprotein verwendet.
11. Verfahren nah Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Serumprotein ein Glykoprotein verwendet.

6098 1 0/U936

" ^{5 " 253557A
12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Serumprotein einen Komplementfaktor verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Serumprotein einen Blutverklumpungsfaktor verwendet.
14. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand mindestens einen Teil eines Mikroorganismus darstellt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand einen Teil der Mikroorganismusmembran darstellt.
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Virus darstellt.
17. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand eine Poly-(Aminosäure) mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10.000 darstellt.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein "Aggregat" (assemblage) eines Antigens und eines Antikörpers für dieses Antigen darstellt.
19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Rezeptor-Zusammensetzungen Antikörper darstellen, daß das wäßrige Medium etwa 0 bis 20 Volumprozent eines inerten polaren organischen Lösungsmittels enthält, daß das wäßrige Medium im pH-Bereich von etwa 5 bis 10 gepuffert ist, daß die zugesetzte Menge des Rezeptors ausreicht, um eine Löschung von etwa 20 bis 80 % zu erzielen und daß die Analysenlösung bei einer Temperatur im Bereich von etwa 0 bis 45°C inkubiert wird.

609810/0936

- 74 - 253 5a'4
20. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Liganden in einer Analysenlösung mit einer unbekannten Substanz, von der vermutet wird, daß sie den Liganden enthält, dadurch gekennzeichnet, daß/bei einem Liganden, der eine oder mehrere Epitopstellen hat, zwei Chromophore, und CiLp, die ein aus einer fluoreszierenden Substanz

und einer fluoreszenzlöschenden Substanz bestehendes Paar bilden, als Reagentien verwendet, wobei einer der Chromophoren, Ch., an den Rezeptor für den Liganden gebunden ist, um den Rezeptor-Ch. zu bilden, wobei der Rezeptor Bindestellen aufweist, die in der Lage sind, sich spezifisch an die Epitopstellen des Liganden zu binden, wobei der andere der Chromophore, Chp, an den Rezeptor für den Liganden zur Bildung des Rezeptor-Chp oder an das Ligandanaloge gebunden ist, wobei entweder ein einzelnes Ligandanalges kovalent an einen oder mehrere Chromophore gebunden ist, um das Ligandanalogezu bilden, worin χ durchschnittlich mindestens

eins beträgt, oder eine Vielzahl von Ligandanalogen und Chromophoren darstellt, die kovalent an ein polyfunktionalisiertes Kernmolekül gebunden sind, um den Poly-(Ligandanalog)-Poly-(Chp) zu bilden, worin das Ligandanaloge ein ein- oder mehrwertiger Rest ist, von dem ein beträchtlicher AnIeLl eine oder mehrere Epitopstellen aufweist, die in der Lage sind, mit dem Liganden um die Bindung s stell en des Rezeptors in Wettbewerb zu treten; und

worin die Menge der fluoreszierenden Substanz innerhalb der Löschentfernung der fluoreszenzlöschenden Substanz mit der Menge des in der Analysenlösung vorhandenen Liganden in Beziehung steht, daß man ferner

609810/0936

(A) in einem wäßrigen, gepufferten Medium zur Herstellung einer Analysenlösung miteinander kombiniert:

(1) die unbekannte Substanz;

(2) den Rezeptor-Ch,.; und

(3) eine Quelle von Ch_?, die in der Lage ist, sich innerhalb der Löschentfernung an den Rezeptor-Ch,. zu binden, und zwar als:

(a) Ligandanalog-^_x

(b) Poly-(Ligandanalog)-poly-(Chp);

(c) Poly-(Ligandanalog) und Rezeptor-Chpj

wobei das Poly-(Ligandanaloge) mehrere Ligandanaloge enthält, die kovalent an ein polyfunktionalisiertes Kernmolekül gebunden sind; oder

wenn der Ligand mehrere Epitopstellen aufweist,

(d) Rezeptor-Ch₉;

C.

(B) die Analysenlösung eine ausreichende Zeit inkubiert, damit mindestens ein Teil des Rezeptors mit mindestens einem Teil eines vorhandenen Liganden kombinieren kann;

(G) die inkubierte Analysenlösung mit Licht von einer Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums der fluoreszierenden Substanz bestrahlt; und

(D) den Grad der Fluoreszenz der Analysenlösung im Vergleich zu einer Analysenlösung mit einer bekannten Menge Ligand mißt.

B09810/UÜ3

- 76 - 253 5 ·:⁷-'
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Molekulargewicht von etwa 110 bis 2000 hat und daß der Rezeptor ein Antikörper ist.
22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand eine Poly-(Aminosäure) mit einer Vielzahl von Epitopstellen ist und ein Molekulargewicht von mindestens etwa 10.000 hat.
23. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Molekulargewicht von mehr als etwa 2.000 hat und eine Vielzahl von Epitopstellen aufweist, daß der Rezeptor ein Antikörper ist und daß die Ctu-Quelle ein Rezeptor-Chp ist.
24. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Liganden in einer Analysenlösung mit einer unbekannten Substanz, von der vermutet wird, daß sie den Liganden enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Liganden, der eine Epitopstelle hat, zwei Chromophore, Ch. und Chp, die ein aus einer fluoreszierenden Substanz und einer fluoreszenzlöschenden Substanz bestehendes Paar bilden, verwendet, wobei einer der Chromophoren, Ch. an den Rezeptor für den Liganden gebunden ist, um den Rezeptor-Ch^ zu bilden, wobei der Rezeptor eine Bindestelle hat, die in der Lage ist, sich spezifisch an die Epitopstelle des Liganden zu binden, wobei der andere der Chromophoren kovalent an das Ligandanaloge gebunden ist, um das Ligandanaloge-Chp zu bilden, wobei

609810/0936 ORIGWAL INSPBDTED

2Γ-·ι - - .· B ■·.■■■

das Ligandanaloge einen einwertigen Rest darstellt, von dem ein beträchtlicher Anteil eine Epitopstelle bildet, die in der Lage ist, mit dem Liganden um eine Bindungsstelle des Rezeptors in Wettbewerb zu treten; und

wobei die lienge der fluoreszierenden Substanz innerhalb der Löschentfernung mit der Henge des in der Analysenlösung vorhandenen Liganden in Beziehung steht; daß man ferner

(A) in einem wäßrigen gepufferten Medium bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 10 zur Herstellung der Analysenlösung miteinander kombiniert:

(1) die unbekannte Substanz;

(2) den Rezeptor-Ch ·

(3) den Ligandanalog-Chp;

wobei die Konzentrationen an Rezeptor-Ch^ und Ligandanalog-Chp so gewählt sind, daß eine 20 bis 8O^oige Löschung der Fluoreszenz in Abwesenheit des Liganden eintritt;

(B) die Analysenlösung bei einer Temperatur von etwa 0

bis 45⁰C eine ausreichende Zeit inkubiert, damit mindestens ein Teil des vorhandenen Rezeptors mit mindestens einem Teil eines vorhandenen Liganden kombinieren kann;

(C) die inkubierte Analysenlösung mit Licht von einer Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums der fluoreszierenden Substanz bestralit; und

609810/0936

ORiGaMAL INSPECTED

- 78 - 2535ί "Π

(D) den Grad der Fluoreszenz der Analysenlösung im Vergleich zu einer Analysenlösung mit einer bekannten Menge Ligand mißt.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Molekulargewicht von etwa 110 bis 2000 hat und ein Arzneimittel oder eine Droge mit einem Benzolring darstellt, der durch zwei bis drei aliphatische Kohlenstoffatome von einer Aminogruppe getrennt ist.
26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Steroid darstellt.
27. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Liganden in einer Analysenlösung mit einer unbekannten Substanz, von der vermutet wird, daß sie den Liganden enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Liganden, der eine Vielzahl von Epitopstellen hat, zwei Chromophore, Ch^ und Chp, die ein aus einer fluoreszierenden Substanz und einer fluoreszenzlöschenden Substanz bestehendes Paar bilden, verwendet, wobei einer der Chromophoren, Ch₁, an den Rezeptor für den Liganden gebunden ist, um den Rezeptor-Ch.. zu bilden, wobei dieser Rezeptor Bindestellen hat, die in der Lage sind, sich spezifisch an die Epitopstellen des Liganden zu binden, wobei der andere der Chromophore mit dem Rezeptor für den Liganden verbunden ist, um den Rezeptor-Cfcu zu bilden;

wobei die Menge der fluoreszierenden Substanz in Löschentfernung zur fluoreszenzlöschenden Substanz mit der Menge des in der Analysenlösung vorhandenen Liganden in Beziehung steht;

B09810/0936

ORIQiNAL INSPK)TED

daß man ferner

(A) in einem wäßrigen gepufferten nedium bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5 bis 10 zur Herstellung einer Analysenlösung miteinander kombiniert:

(1) die unbekannte Substanz;

(2) den Rezeptor-Ch,.;
den

(B) die Analysenlösung bei einer Temperatur im Bereich von etwa O bis 45°C eine ausreichende Zeit inkubiert, damit mindestens ein Teil des vorhandenen Rezeptors mit mindestens einem Teil eines vorhandenen Liganden kombinieren kann;

(C) die inkubierte Analysenlösung mit Licht von einer Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums der fluoreszierenden Substanz bestrahlt; und

(D) den Grad der Fluoreszenz der Analysenlösung im Vergleich zu einer Analysenlösung mit einer bekannten Menge Ligand mißt.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ligand eine Poly-(Aminosäure) mit einem Molekulargewicht von mindestens 10.000 verwendet.
29. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Liganden in einer Analysenlösung mit einer unbekannten Substanz, von der vermutet wird, daß sie den Liganden enthält, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem Liganden, der eine oder mehrere Epitopstellen hat, zwei Chromophore, Ch₁ und Chp, die ein aus einer fluoreszierenden Substanz und

ÖÜÖ8 1 0/Ü936

ORIQtNAL INSPECTED

25 3 !i .-.V.'.

einer fluoreszenzlöschenden Substanz bestehendes Paar bilden, verwendet, wobei einer der Chromophore, Ch,, an den Rezeptor für den Liganden gebunden ist, um den Rezeptor-Ch^ zu bilden, wobei der Rezeptor Bindestellen hat, die in der Lage sind, sich spezifisch an die Epitopstellen des Liganden zu binden, wobei der andere der Chromophore an den Rezeptor für den Liganden gebunden ist, um den Rezeptor-Cho zu bilden;

worin die Menge der fluoreszierenden Substanz in Löschentfernung zur fluoreszenzlöschenden Substanz mit der Menge des in der Analysenlösung vorhandenen Liganden in Beziehung steht, daß man ferner

(A) in einem wäßrigen gepufferten Medium mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 5 bis 10 zur Herstellung einer Analysenlösung miteinander kombiniert:

(1) die unbekannte Substanz;

(2) den Rezeptor-Ch..;

(3) Poly-(LigandarBLog) und Rezeptor-Ch₂, worin das Ligaiidanaloge ein ein- oder mehrwertiger Rest ist, von dem ein beträchtlicher Anteil ein oder mehrere Epitopstellen aufweist, die in der Lage sind, mit dem Liganden um die Bindungsstellen des Rezeptors in Wettbewerb zu treten und wobei mehrere Ligandanaloge des Poly-(Ligandanalogen) kovalent an ein polyfunktionalisiertes Kernmolekül gebunden sind;

10/0936 O*/G*NAL

2 R:^:; >

(B) die Analysenlösung bei einer Temperatur im Bereich von etwa O bis 45 C eine ausreichende Zeit inkubiert, damit mindestens ein Teil des vorhandenen Rezeptors mit mindestens einem Teil des vorhandenen Liganden kombinieren kann;

(C) die inkubierte Analysenlösung mit Licht von einer Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums der fluoreszierenden Substanz bestrahlt; und

(D) den Grad der Fluoreszenz der Analysenlösung im Vergleich zu einer Analysenlösung mit einer bekannten Menge Ligand mißt.
30. Verfahren nach Anspruch 29» dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand eine Spitopstelle hat und sein Molekulargewicht im Bereich von etwa 110 bis 2000 liegt.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Arzneimittel oder eine Droge mit einem Benzolring darstellt, der durch zwei bis drei aliphatische Kohlenstoffatome von einer Aminogruppe getrennt ist.
32. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Steroid darstellt.
33. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das polyfunktionalxsierte Kernmolekül eine Poly-(Aminosäure) mit einem Molekulargewicht von mindestens 30.000 ist.

609810/U936 ORIGtNAL INSPECTED

- 82 - 25 3£5 //.
34. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Liganden oder eines Antiliganden in einer Analysenlösung mit einer unbekannten Substanz, von der vermutet wird, daß sie den Liganden oder den Antiliganden enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Liganden bzw. Antiliganden mit einer Vielzahl von Epitopstellen einen Anti-(Antiliganden) verwendet, von dem ein Teil an Ch,. und ein Teil an Chp gebunden ist, wobei Ch^ und Chp ein aus einer fluoreszierenden Substanz und einer fluoreszenzlöschenden Substanz bestehendes Paar bilden;

daß man mit der unbekannten Substanz (1) den Antiliganden zur Bestimmung des Liganden, oder (2) den Liganden zur Bestimmung des Antiliganden kombiniert;

daß man den an den Liganden gebundenen Antiliganden vom ungebundenen Antiliganden trennt;

daß man in einer wäßrigen gepufferten Analysenlösung den gebundenen Antiliganden mit dem Anti-(Antiliganden) kombiniert;

daß man die Analysenlösung mit Licht von einer Yfellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums der fluoreszierenden Substanz bestrahlt; und

daß man den Grad der Fluoreszenz der Analysenlösung im Vergleich zu einer Analysenlösung mit einer bekannten Menge Ligand oder Antiligand mißt.

SG9810/Q936
35. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Liganden in einer Analysenlösung mit einer unbekannten Substanz, von der vermutet wird, daß sie den Liganden enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Liganden, der eine Vielzahl von Epitopstellen hat, einen a-(Antiliganden) , einen b-(Antiliganden), einen Anti-(a-(Antiliganden)-Ch,. und einen Anti-(b-(Antiliganden)-Ch₂ verwendet, worin a und b eine von verschiedenen Arten abstammende Quelle für den Antiliganden darstellen und Ch^ und Ch₂ ein aus einer fluoreszierenden Substanz und einer fluoreszenzlöschenden Substanz bestehendes Paar bilden, worin die Menge der fluoreszierenden Substanz innerhalb Löschentfernung der fluoreszenzlöschenden Substanz mit der Menge des in der Analysenlösung vorhandenen Liganden in Beziehung steht, daß man ferner

(A) in einem wäßrigen gepufferten Medium zur Herstellung einer Analysenlösung miteinander kombiniert:

(1) die unbekannte Substanz;

(2) den a-(Antiliganden);

(3) den b-(Antiliganden);

(4) den Anti- (a-(Antiligand) -Ch,,; und

(5) den Anti-(b-(Antiligand)-

(B) die Analysenlösung eine ausreichende Zeit inkubiert, damit mindestens ein Teil der Antiliganden und der Anti-(Antiliganden) mit dem Liganden bzw. dem Antiliganden kombinieren kann;

(C) die inkubierte Analysenlösung mit Licht von einer Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums der fluoreszierenden Substanz bestrahlt; und

(D) den Grad der Fluoreszenz der Analysenlösung im Vergleich zu einer Analysenlösung mit einer bekannten Menge Ligand mißt.

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ORIQiNAL INSPECTED

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36. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Antiliganden für einen Liganden in einer Analysenlösung mit einer unbekannten Substanz, von der vermutet wird, daß sie den Antiliganden enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man einen (Antiligand)-Ch,. und einen (Antiligand)-Ch₂ verwendet, worin Ch. und Ch₂ ein aus einer fluoreszierenden Substanz und einer fluoreszenzlöschenden Substanz bestehendes Paar bilden,

worin der in der unbekannten Substanz vorhandene Antiligand das durch die fluoreszenzlöschende Substanz verursachte Ausmaß der Löschung der fluoreszierenden Substanz vermindert; daß man ferner

(A) in einem wäßrigen gepufferten Medium zur Herstellung einer Analysenlösung miteinander kombiniert:

(1) die unbekannte Substanz;

(2) den Liganden, wenn dieser polyepitopisch ist oder das Poly-(Ligandanaloge), wenn der Ligand monoepitopisch ist;

(3) den (Antiligand)-Ch₁; und

(4) den (Antiligand)-Ch₂;

(B) die Analysenlösung mit Licht von einer Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums der fluoreszierenden Substanz bestrahlt; und

(C) den Grad der Fluoreszenz der Analysenlösung im Vergleich zu einer Analysenlösung mit einer bekannten Menge Antiligand mißt.

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37. Eine Kombination aus Anti-ta-AntiligancQ-Ch. und Anti-(b-Antiligand)-Chp» worin a und b Antiliganden aus zwei verschiedenen Tierarten für den gleichen Ligand darstellen, wobei der Ligand mehrere Epitopstellen hat und wobei Ch^ und Chp ein aus einer fluoreszierenden Substanz und einer fluoreszenzlöschenden Substanz bestehendes Paar bilden.
38. Eine Kombination nach Anspruch 37_} gekennzeichnet durch a-(Antiligand) und b-(Antiligand).

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