DE2535574C2

DE2535574C2 - Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Liganden durch Fluoreszenzlöschung

Info

Publication number: DE2535574C2
Application number: DE2535574A
Authority: DE
Inventors: Moshe Palo Alto Calif. Schwarzberg; Edwin F. Atherton Calif. Ullman
Original assignee: Syva Co
Current assignee: Syva Co
Priority date: 1974-08-12
Filing date: 1975-08-08
Publication date: 1986-01-16
Also published as: NL185423C; JPS5144628A; GB1526242A; IL47835A0; SE7509028L; US3996345A; SE7609841L; SE427504B; AU501140B2; ES440173A1; AU8388175A; BR7505107A; IL47835A; GB1526241A; SE426746B; CA1042792A; FR2282115A1; FR2282115B1; DE2535574A1; JPS6018940B2

Description

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem Liganden, der eine Vielzahl von Epitopstellen hat. Chi unter Bildung von Rezeptor-Chi und Ch₂ unter Bildung von Rezeptor-Ch2 an den Rezeptor für den Liganden gebunden sind; und daß man

(A) in einem wäßrigen gepufferten Medium bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5 bis 10 zur Herstellung einer Analysenlösung miteinander kombiniert;

(1) die unbekannte Substanz;

(2) denRezeptor-Ch,;

(3) den Rezeptor-Ch₂;

(B) die Analysenlösung bei einer Temperatur im Bereich von etwa 0 bis 45° C eine ausreichende Zeit inkubiert, damit mindestens ein Teil des vorhandenen Rezeptors mit mindestens einem Teil eines vorhandenen Liganden kombinieren kann;

(C) die inkubierte Analysenlösung mit Licht von einer Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums der fluoreszierenden Substanz bestrahlt; und

(D) den Grad der Fluoreszenz der Analysenlösung im Vergleich zu einer Analysenlösung mit einer bekannten Menge Ligand mißt

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Liganden mit einer Vielzahl von Epitopstellen einen a-(Rezeptor), einen b-(Rezeptor), einen Anti- (a-(Rezeptor))-Ch| und einen Anti- (b-Rezeptor))-Ch₂ verwendet, worin a und b von verschiedenen Arten abstammende Quellen für den Rezeptor darstellen, und daß man die unbekannte Substanz mit dem a-(Rezeptor), dem b-(Rezeptor), dem Anti-(a-Rezeptor))-Chi und dem Anti-(b-(Rezeptor))Ch2 kombiniert

15. Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis und zur Bestimmung eines Antigens bzw. Antikörpers mit einer Vielzahl von Epitopstellen in einer Analysenlösung, dadurch gekennzeichnet,

(A) daß man (1) zur Bestimmung des Antigens den Antikörper oder (2) zur Bestimmung des Antikörpers das Antigen nut der unbekannten Substanz kombiniert;

(B) daß man den an das Antigen gebundenen Antikörper vom ungebundenen Antikörper trennt;

(C) daß man in einer wäßrigen gepufferten Analysenlösung den gebundenen Antikörper mit einem Anti-Antikörper, von dem ein Teil an Chi und ein Teil an Ch₂ gebunden ist, wobei Chi und Ch₂ ein aus einer fluoreszierenden Substanz bzw. aus einer fluoreszenzlöschenden Substanz bestehendes Paar von Chromophoren bilden, kombiniert;

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(D) daß man die Analysenlösung mit Licht von einer Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums der fluoreszierenden Substanz bestrahlt und

(E) daß man den Grad der Fluoreszenz der Analysenlösung im Vergleich zu einer Analysenlösung mit einer bekannten Menge Antigen oder Antikörper mißt

16. Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis und zur Bestimmung eines Antikörpers in einer Analysenlösung, dadurch gekennzeichnet daß man

(A) in einem wäßrigen gepufferten Medium zur Herstellung einer Analysenlösung miteinander kombiniert:

(1) die unbekannte Substanz;

(2) das Antigen, wenn dieses polyepitopisch ist oder das Poly-(Antigen-Analoge), wenn das Antigen monoepitopisch ist;

(3) den (Antikörper)-Chi; und

(4) den (Antikörper)-Ch₂;

(B) die Analysenlösung mit Licht von einer Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums der fluoreszierende 3 Substanz bestrahlt; und

(C) den Grad der Fluoreszenz der Analysenlösung im Vergleich zu einer Analysenlösung mit einer bekannten Menge Antikörper mißt

17. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Kombination aus Anti-(a-Rezeptor))-Chi und Anti-(b-Rezeptor))-Ch₂ darstellt, worin a und b Rezeptoren aus zwei verschiedenen Tierarten für den gleichen Liganden, welcher mehrere Epitopstellen hat darstellen.

Es besteht ein laufendes Bedürfnis nach schnellen und empfindlichen Methoden zur Bestimmung von winzigen Mengen an organischen Verbindungen. Zu diesem Zweck wurde eine Anzahl von Verfahren entwickelt. Zu den gängigen Verfahren zählen die Radioimmuno-Analyse, die Spinmarkierungs-Immuno-Analyse, die homogene Enzym-immuno-Analyse und die Hämagglutina- tion (Hl). Diese Verfahren eignen sich zur Bestimmung von Substanzmengen im Bereich von 10-* bis 10-'⁰MoI oder weniger.

In der US-Patentschrift. 37 09 868 ist ein Beispiel für eine Radioimmuno-Analyse angegeben. In der US-Pa tentschrift 36 90 834 ist ein Beispiel für eine Spin-Im- miino-Analyse angegeben. Die US-Patentschriften 54 090 und 38 17 837 stellen Beispiele für Enzym-Immuno-Analysen dar. Weitere Literatur von Interesse sind die Arbeiten von Ludwig Brand und James R. Gohl ke, »Fluorescence Probes for Structure«, »Annual Re view of Biochemistry«, 41,843—868 (1972); und Stryer, »Science«, 162,526(1968).

Diese Verfahren beruhen auf der Fähigkeit eines Rezeptormoleküls, gewöhnlich eines Antikörpers, eine be- stimmte räumliche und polare Anordnung eines Moleküls zu erkennen.

Mit Ausnahme der Hämagglutinations-Tests beruhen diese Verfahrens darauf, ein Reagens zur Verfügung zu

stellen, das mit dem zu untersuchenden Molekül um den Rezeptor in Wettbewerb treten kann. Wenn man in der Lage ist, zwischen dem Reagens, das an den Rezeptor gebunden ist, und dem nichtgebundenen Reagens zu unterscheiden, kann man die Menge der vorhandenen interessierenden Verbindung bestimmen.

Aus der DE-OS 22 30 075 ist die Verwendung von Rezeptoren für Fluoreszenz- Immunoassays bekannt, wobei die >m Rezeptor (einem Protein) auftretende Eigenfluoreszenz ausgenützt wird. Die zu bestimmende Verbindung wird so modifiziert oder derivatisiert, daß sie eine fluoreszenzlöschende Substanz bildet, die mit der zu bestimmenden Verbindung um den Rezeptor in Konkurrenz tritt. In dem Maße, wie sich die derivatisierte Verbindung mit dem Rezeptor verbindet, erfolgt eine Fluoreszenzlöschung. Durch Messung der Fluoreszenz im Medium kann man die Menge der interessierenden Verbindung bestimmen. Bei diesem Verfahren treten jedoch sehr hohe Untergrundintensitäten auf, da das gesamte Protein, das nicht an die Huoreszenzlöschende Substanz gebunden ist, emittiert Da immer nur ein kleiner Teil der Lichtintensität des emittiere den Proteins gelöscht wird, besteht das Problem, daß zwei große Zahlen voneinander subtrahiert werden müssen, um eine kleine Zahl zu erhalten. Dies führt zu großen Unsicherheiten. Weiterhin kann die Eigenfluoreszenz von Proteinen sehr stark schwanken.

Aus der Literaturstelle Clinica Chimica Acta, Vol. 48, 1973, S. 109—111 ist ferner ein Verfahren zur Bestimmung von Liganden bekannt, bei welchem Rezeptoren verwendet werden, welche mit einem fluoreszierenden Chromophor kovalent verbunden sind. Es können hierbei sowohl Antigene als auch Antikörper bestimmt werden. Dieses bekannte Verfahren arbeitet jedoch nicht nach dem Prinzip der spezifischen Fluoreszenzlöschung.

Bei der Entwicklung von Immuno-Analysen ist man hinsichtlich der Zugänglichkeit und der Eigenschaften eines geeigneten Rezeptors beschränkt. Bezüglich der anderen Reagentien und der Meßmethoden gibt es jedoch me'.rere verschiedene Überlegungen, um zu einer genaueren, bequemeren oder technischen erwünschten Analyse zu kommen. Erstens ist es erwünscht, mit den verschiedenen Reagentien möglichst wenige Messungen und möglichst wenige Übertragungen durchzuführen. Zweitens sollen die Meßeinrichtungen erschwinglieh sei;;, so daß sie für einen großen Kreis von Benutzern zugänglich sind. Drittens sollen die verwendeten Reagentien verhältnismäßig stabil sein, so daß sie gelagert und versandt werden können. Viertens soll das Verfahren nicht wesentii-h durch andere Substanzen gestörl werden, die zufällig in der zu untersuchenden Probe vorhanden sein können. Weitere Gesichtspunkte sind die !eichte Anlernbarkeit von Laboranten, das Fehlen von gesundheitlichen Risiken, die Empfindlichkeit, die Reproduzierbarkeit und die Anwendbarkeit auf eine große Vielzahl von Liganden.

Die Erfindung beruht auf der Erscheinung der Energieübertragung zwischen zwei Chromophoren. Wird ein fluoreszierender Chromophor mit Licht bestrahlt, das durch den Chromophor absorbiert wird, so kann der fluoreszierende Chromophor die Energie des absorbierten Lichtes wieder abgeben, indem er Licht mit einer längeren Wellenlänge aussendet, d. h. fluoresziert. Wenn ein anderer Chromophor innerhalb eines Abstandes von weniger als 100 A zur fluoreszierenden Substanz liegt und das Licht bei der Wellenlänge der Emission absorbiert, dan.i besteht (in Abhängigkeit von anderen Faktoren} die Wahrscheinlichkeit, daß die fluoreszierende Substanz die Energie, die sonst als Licht abgegeben würde, auf den anderen Chromophor überträgt, wodurch im Ergebnis eine »Löschung« (quenching; der fluoreszierenden Substanz erzielt wird.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Liganden (einer organischen Verbindung, für die ein Rezeptor, gewöhnlich ein Antikörper, zur Verfugung steht oder hergestellt werden kann) in einer Analysenlösung, bei dem

(A) der Ligand in einem wäßrigen gepufferten Medium mit einem Rezeptor, der in der Lage ist, sich spezifisch und nicht-kovalent mit dem Liganden zu verbinden, und gegebenenfalls mit einem Ligandenanalogen, das in der Lage ist, mit dem Liganden um die Bindungsstellen des Rezeptors in Wettbewerb zu treten, umgesetzt wird, wobei entweder der Rezeptor oder das Ligandenanaloge mit einem fluoreszierenden Chromophor (Chi) kovalent verbunden ist oder ein mit einem fluoreszierenden Chromophor (Ch;) kovalent vet e-iindener spezifischer Bindungspartner für den Rezeptor verwendet wird;

(B) die Analysenlösung eine ausreichende Zeit inkubiert wird, damit mindestens ein Teil des P.ezeptors sich mit mindestens einem Teil des vorhandenen Liganden kombinieren kann;

(C) die inkubierte Analysenlösung mit Licht von einer Wellenlänge bestrahlt wird, die eine Fluoreszenz des Chromophors bewirkt; und

(D) der Grad der durch die Anwesenheit des Liganden beeinflußten Fluoreszenzemission im Vergleich zu einer bekannten Menge des Liganden bestimmt wird;

dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß einer der als Reagentien zur Lösung des Liganden hinzugefügten Reaktionspartner oder ein Teil desselben mit einem fluoreszenzlöschenden Chromophor (G12) kovalent verbunden ist, so daß der aus dem Liganden bzw. Ligandenanalogen, dem Rezeptor und gegebenenfalls Hern Bindungspartner für den Rezeptor während der Inkubation gebildete Komplex sowohl einen fluoreszierenden als auch einen fluoreszenzlöschenden Chromophor enthält.

Weitere Ausbildungen des erfindjngsgerr-äßen Verfahrens sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Einführung der Chromophore hängt in einem hohen Grad von der Anzahl der unabhängigen epitopen oder haptenischen Stellen am Liganden ab.

Wenn der Ligand nur eine unabhängige epitope Steile hat (d. h. wenn e.' monoepitopisch ist), so ist gewöhnlich nur ein Chromophcr kovalent an einen Rezepte." als Ligand gebunden, wahrend der andere Chromophor kovalem gebunden ist an ein Ligandenanaloges oder an eine Kombination eines Poly-(Ligandenanalog?n) und des Chromophors, der kovalent an den Rezeptor als Ligand gebunden ist.

Wenn der Ligand mehrere unabhängige epitope Stellen hat (d. h. w.nn er polyepitopisch ist), so können die vorstehend genannten Bindungsarten zusätzlich zu den nachstehenden verwendet werden. Bei einer Art sind die beiden Chromophore einzeln an den Rezeptor als Ligand gebunden. Bei einer weiteren Art wird der Ktzeptor als Ligand aus unterschiedlichen Spezies erhalten, wobei ein Chromophor an den Rezeptor für den Ligand-Rezeptor von einer Spezies und der andere Chromophor an den Rezeptor für den Ligand-Rezeptor von der anderen Spezies gebunden ist. Die zuletzt ge-

nannte Bindungsart erweitert den Anwendungsbereich der Analyse, indem die üblichen Reagentien für eine große Vielzahl von Analysen verwendet werden können; ferner werden die Reinigungsverfahren vereinfacht, und es kann die Anwesenheit von Komplexen, die sich von den Einzelkomponenten unterscheiden, bestimmt werden.

Die einzelnen Substanzen werden in einem wäßrigen, gepufferten Medium zusammengebracht, inkubiert und mit Licht bestrahlt, das von den Molekülen der fluoreszierenden Substanz absorbiert wird. Indem man das Ausmaß der Fluoreszenz nach der Inkubation über einen bestimmten Zeitraum oder nachdem das System sich dem Gleichgewichtszustand genähert hat, bestimmt, und indem man die mit einem oder mehreren bekannten Standards erhaltenen Ergebnisse vergleicht, kann man die Anwesenheit oder die Menge des Liganden bestimmen.

Beziehung. Das fluoreszierende Molekül ist ein Chromophor. das in der Lage ist. Licht mit einer Wellenlänge zu absorbieren und Licht mit einer längeren Wellenlänge zu emittieren. Das »Löschmolekül« hemmt die Fluoreszenz, wenn es sich in einem geringen Abstand, gewöhnlich von weniger als etwa 100 Ä, zum fluoreszierenden Molekül befindet, wobei es die Energie aufnimmt, die sonst als fluoreszierendes Licht emittiert würde. Bezüglich des Moleküls oder der Verbindung, mit der die Chromophore verbunden sind, sind die fluoreszierende Substanz und die Löschsubstanz in den meisten Fällen austauschbar, obgleich häufig eine gewisse Bevorzugung vorliegt. Deshalb werden die beiden Moleküle im allgemeinen als Chromphore und einzeln als Chi und Chj bezeichnet.

Tiu einige ocgiinc uciinici c:

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Ligand:

ein organisches Molekül, das normalerweise ein Molekulargewicht von mehr als 100 hat und das mindestens eine, normalerweise polare Funktion trägt, für die ein Rezeptor entweder von Natur aus zur Verfügung steht oder hergestellt werden kann, oder ein Komplex (s. u.).

Ligandenanaloges:

ein ein- oder mehrwertiger Rest, von dem ein wesentlicher Anteil die gleiche räumliche und polare Anordnung wie der Ligand hat, um eine oder mehrere determinierende oder epitope Stellen zu definieren, die in der Lage sind, mit dem Liganden um die Bindungsstellen eines Rezeptors in Wettbewerb zu treten; das Ligandenanaloge unterscheidet sich vom L-iganden durch das Fehlen eines Atoms oder einer funktionellen Gruppe an der Bindungsstelle zu einem anderen Molekül oder durch die Anwesenheit einer verbindenden Gruppe, die anstelle eines oder mehrerer Atome, die ursprünglich im Liganden vorhanden waren, eingeführt wurde. Die Ligandenanaloge-Vorstufe ist die Verbindung, die zum Konjugieren eines Liganden oder eines Ligandenanalogen an ein anderes Molekül, z. B. an einen Chromophor, verwendet wird.

Komplex:

eine Kombination von organischen Molekülen, die durch andere als kovalente Bindungen miteinander verbunden sine und die im allgemeinen ein Molekulargewicht von mehr als 600, gewöhnlich von mehr als 1000 und gegebenenfalls von 1 000 000 oder mehr haben können, für die der Rezeptor entweder von Natur aus zur Verfugung steht oder hergestellt werden kann; ein beispielhafter Komplex ist ein Antigen-Antikörper-Komplex oder ein Molekül, das aus zwei getrennten Einheiten hergestellt wurde, die normalerweise durch schwache Bindungen, z. B. polare Bindungen oder Disulfid-Bindungen miteinander verbunden sind und die unter den Bedingungen des Systems mit den Ausgangseinheiten im Gleichgewicht stehen.

Chromophor:

ein fluoreszierendes oder löschendes Molekül: erfindungsgemäß stehen die fluoreszierende Substanz und die löschende Substanz miteinander in

Ligaiiuefiariaioges-t^nrutnopnor

(Ligandenanaloges-(Chj),):

Das Ligandenanaloge ist kovalent an ein oder mehrere fluoreszierende Moleküle oder Löschmoleküle gebunden. Bei kleinen Liganden, d. h. bei solchen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa IO 000 und gewöhnlich von weniger als etwa 2000, ist das Ligandenanaloge gewöhnlich mit weniger als 10 Chromophoren, üblicherweise mit 1 bis 10 Chromophoren und mit nicht mehr als etwa einem Chromophor auf ein Molekulargewicht von 1000 verbunden. Bei einem großen Liganden, d. h. bei einem solchen ;nit einem Molekulargewicht von mindestens 2000, gewöhnlich von mindestens etwa 10 000, können mehrere Chromophore kovalent an das Ligandenanaloge gebunden sein. Die Zahl der vorhandenen Chromophore ist durch die Zahl begrenzt, die eingeführt werden kann, ohne daß zu viplp Fnitnnctpllpn HpC I ΊσαηΑρη maebiort iuArHon

sowie ferner durch den Wunsch, eine ausreichende Anzahl von Chromophoren zur Verfügung zu haben, um eine ausreichende Löschung zu erzielen, wenn der Rezeptor-Chi mit dem Ligandenanalogen-(Chj),gebunden ist.

Poly-(Ligandenanaloges)-Poly-(Chromophor)-

[Poly-(Ligandenanaloges)-PoIy-(Ch?)]:

Ligandenanaloge und Chromophore werden mit einem hochmolekularen (verglichen mit dem Ligandenanalogen und dem Chromophor), wasserlöslichen, polyfunktionellen Zentral- oder Kernmolekül verbunden, um eine Vielzahl von Ligandanalogen-Gruppen und Chromophor-Gruppen zu erzeugen, die im Abstand auf der Oberfläche des Moleküls sitzen, so daß, wenn der Rezeptor-Chi mit dem Ligandenanalogen verbunden wird, einige Chi-Gruppen innerhalb der »Löschentfernung« zu den Ch.2-Gruppen stehen.

Poly(Ligandanaloges):

Die Gruppen des Ligandenanalogen werden mit einem hochmolekularen (verglichen mit dem Ligandenanalogen), wasserlöslichen, polyfunktionellen Zentral- oder Kernmolekül verbunden, so daß eine ausreichende Anzahl von Ligandenanalogen je Flächeneinheit zum Löschen zur Verfügung steht wenn das Poly-(Ligandenanaloge) mit Rezeptor-Chi und Rezeptor-Ch2 in den geeigneten Anteilen gesättigt ist.

Rezeptor-Chromophor (Rezeptor-Chi und

Rezeptor-Cro):

Ein Rezeptor ist ein Molekül, das in der Lage ist, eine Epitopstelle zu erkennen und sich mit dieser Stelle zu verbinden. Gewöhnlich haben die Rezeptoren Bindekonstanten von mehr als 10\ häufig mehr als 10⁶. In den meisten Fallen sind die Rezeptoren Antikörper, obgleich auch Enzyme, Nucleinsäuren und gewisse Globuline als Rezeptoren wirken können. Erfindungsgemäß sind die Rezeptoren in den meisten Fällen Antikörpei, an die eine oder mehrere, gewöhnlich mindestens 2 oder mehrere chromophore Gruppen gebunden sind.

Rezeptor-Zusammensetzung:

Die Rezeptor-Zusammensetzung ist eine homogene oder heterogene Zusammensetzung, die in der Lage ist. spezifische, nicht-kovalente Bindungen mit Liganden und Liganueiiaiiaiogen einzugehen, und stellt eine Zusammensetzung dar, die den Liganden-(Rezeptor) spezifisch erkennt; weiterhin erkennt sie spezifisch eine Kombination eines Rezeptors und einer Zusammensetzung, die ihrerseits wieder spezifisch den Rezeptor (Anti-(Rezeptor)) erkennt. Der Rezeptor kann auch als Antiligand bezeichnet werden.

Das Verfahren gemäß der Erfindung beruht auf der Verwendung von zwei Chromophoren, die ein Paar aus einer fluoreszierenden Substanz und einer Löschsub- -lanz bilden. Es steht eine Zusammensetzung (Rezeptor) zur Verfügung, die einen Liganden spezifisch erkennt und sich damit verbindet, mit der (dem) einer der Chromophoren kovalent gebunden ist. Ist der zweite Chromophor mit dem Ligandenanalogen oder dem Rezepter verbunden, so beeinflußt die Menge des in der Analysenlnsiing vorhandenen I.iganden die Mence dor Löschsubstanz innerhalb der Löschentfernung von der fluoreszierenden Substanz. Die Analyse kann kompetitiv durchgeführt werden, wenn das Ligandenanaloge mit dem Liganden um den Rezeptor in Wettbewerb tritt, wobei das Ligandenanaloge als Poly-(Ligandanaloges) oder kovalent gebunden an den Chromophor vorliegt. Die Analyse kann auch nicht-kompetitiv mit Liganden durchgeführt werden, die eine Vielzahl von Epitopstellen haben, wobei der jedem Chromophor zugehörige Rezeptor sich mit dem Liganden verbindet.

Je nach der besonderen Arbeitsweise und dem interessierenden Liganden können eine oder mehrere der nachstehend angegebenen Reagenszusammensetzungen im Analysenmedium verwendet werden: Ligandenanaloges-Chromophor, Poly-(Ligandenanaloges)-PoIy-(Chromophor). Poly-(Ligandenanaloges). ein oder zwei Rezeptoren und ein oder zwei Rezeptor-Chromophore. Die erste Zusammensetzung, die nachstehend in Betracht gezogen wird, ist der Ligandenanaloge-Chromophor.

Ligandenanaloges-Chromophor und PoIy-(Ligandenanaloges)-Poly-(Chromophor)

Der Ligandenanaloges-Chromophor kann in zwei Gruppen unterteilt werden. In der ersten Gruppe hat der Ligandenanaloges-Chromophor ein einziges Ligandenanaloges und einen einzigen Chromophor, die durch eine verhältnismäßig kurze verbindende Gruppe vereinigt sind. In diesen Fällen ist das Ligandenanaloge in den meisten Fällen ein Hapten und kein Antigen, und hat gewöhnlich ein Molekulargewicht von weniger als etwa 10 000, insbesondere von weniger als etwa 6000 und häufig im Bereich von etwa 125 bis 1000, wobei aber die verbindende Gruppe zum Chromophor nicht mitgezählt ist. In den meisten Fällen unterscheidet sich das Ligandenanaloge vom Liganden dadurch, daß eine bestimmte Funktionalität durch eine Bindung, ein Wasserstoffatom durch eine Bindung oder eine kurze Kohlenstoffkette durch eine Bindung ersetzt ist (unter Bindung sollen sowohl Mehrfachbindungen als auch Einfachbindungen verstanden werden), um sich mit der verbindenden Gruppe zur Verknüpfung mit dem Chromophor zu vereinigen. Die verchiedenen haptenischen oder niedrigmolekularen Liganden sind nachstehend erläutert.

Die verbindende Gruppe hat normalerweise nicht mehr als etwa 10 Atome in der Kette zwischen dem Liganden und dem Chromophor und stellt gewöhnlich entweder eine Bindung dar, oder enthält etwa I bis 6 Atoiiif in der Kette. Die Atome sind in den nieiiieii Fällen Kohlenstoff. Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, insbesondere Kohlenstoff, Sauerstoff und Stickstoff. Die Funktionalitäten in der verbindenden Gruppe sind normalerweise Nicht-Oxo-Carbonyl (einschließlich Imino und Thionocarbonyl), Oxy, Amino (insbesondere tertiärc Amino oder quartärc Ammoniumgruppen) oder Kombinationen, z. B. Amido, Carbamyl und Amidino.

Die beiden Chromophore, d. h. sowohl die fluoreszierende Verbindung als auch die Löschverbindung haben normalerweise entweder eine Amino- oder Alkoholfunktion zur Umsetzung mit einer Nicht-Oxo-Carbonyl-Funktion (einschließlich der Stickstoff- und Schwefelanalogen), bzw. sie haben eine Nicht-Oxo-Carbonyl-Funktion. die mit einer Amino- oder Alkohol-Funktionalität umgesetzt werden kann.

Wenn der Ligand ein Molekulargewicht von mindestens 2000 hat. können mehrere chromophore Gruppen an den iiganden gebunden werden. Gewöhnlich liegt mindestens eine chromophore Gruppe für ein Molekulargewicht von 20 000 vor, üblicherweise mindestens eine chromophore Gruppe auf ein Molekulargewicht v>n 10 000, und nicht mehr als eine chromophore Gruppe auf ein Molekulargewicht von 1000, üblicherweise nicht mehr als eine chromophore Gruppe auf ein Molekulargewicht von 2000. Die Überlegungen hinsichtlich der Anzahl der mit dem Liganden konjugierten Chromophore sind vorstehend angegeben. Die verbindenden Gruppen sind die gleich wie vorstehend beschrieben. Gewöhnlich ist der Ligand ein antigenes Polypeptid oder Protein mit einer Vielzahl von Aminogruppen. Aktives Halogen oder Nicht-Oxo-Carbonyl (einschließlich Stickstoff- und Schwefelanaloge) können zur Konjugation verwendet werden, um eine kovalente Bindung zu bilden; es können auch Amide, Amidine, Thionoamide, Harnstoffe, Guanidine und Thioharnstoffe verwendet werden.

Der Ligand und der Chromophor (Chi oder Ch₂) können mit einem Zentralmolekül-(Poly-(Ligandenanalog)-Poly-(Chromophor)) verknüpft sein. Das Zentralmolekül oder das Kernmolekül kann aus mehreren Gründen mit Vorteil verwendet werden. Das Kernmolekül ist im allgemeinen ein polymeres Molekül mit verhältnismäßig hohem Molekulargewicht, normalerweise von mehr als 20 000. häufig von 60 000 und gegebenenfalls von 10 Millionen oder höher. Das Kernmolekül ist normalerweise in Wasser löslich oder in einem wäßrigen Medium dispergierbar, wobei eine stabile Dispersion erhalten wird, in der das dispergierbare Material die Absorption oder die Ausstrahlung von Licht nicht

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behindert. Das Kernmolekül kann ein natürlich vorkommendes Material, ein modifiziertes, natürlich vorkommendes Material oder ein synthetisches Material sein. Kernmoleküle umfassen Polypeptide, Proteine, Polysaccharide, synthetische Polymere und dergleichen. Die Natur des ZentraHoleküls kann sehr unterschiedlich sein, solange es ausreichend funktionaüsiert ist, um die Einführung der Liganden- und Chromophor-Moleküle zu ermöglichen.

Brauchbare Proteine sind Albumine, Globuline. Proteoglykane und dergleichen; unter den Polysacchariden sind Amylose, Cellulose, Agarose, Dextrane oder dergleichen zu nennen, die entweder so wie sie gewonnen werden, oder im teilweise abgebauten Zustand verwendet werden; Beispiele für synthetische Polymere sind Polyvinylalkohol, Acrylate, deren Mischpolymerisate oder dergleichen.

Normalerweise liegt nicht weniger als etwa ein Kon-Antikörper konjugiert werden können, kann über einen verhältnismäßig breiten Bereich schwanken, was von dem jeweiligen Chromophor abhängt. Es liegt mindestens eine chromophore Gruppe je Antikörper vor, durchchnittlich etwa 2 bis 30, gewöhnlich etwa 3 bis 25 chromophore Gruppen je Antikörper. Ist der Chromophor die fluoreszierende Substanz, so beträgt die Durchschnittszahl der chromophoren Gruppen je Antikörper etwa 1 bis 20, gewöhnlich 2 bis 15 und vorzugsweise etwa 2 bis 10. Ist der Chromophor die Löschsubstanz, so beträgt die Durchschnittszahl der chromophoren Gruppen je Antikörper gewöhnlich etwa 2 bis 30, üblicherweise etwa 3 bis 25 und vorzugsweise etwa 5 bis 25.

Es ist auch darauf hinzuweisen, daß. wenn Antikörper für einen Liganden mit mehreren Epitopstellen hergestellt werden, die Rezeptorzusammensetzung nicht homogen ist. Das heißt also, daß der Rezeptor Antikörper

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ein Molekulargewicht von 50 000 vor, üblicherweise nicht weniger als etwa ein Konjugatmolekül auf ein Molekulargewicht von 25 000 und gewöhnlich nicht mehr als etwa ein Konjugatmolekül auf ein Molekulargewicht von 1000 sowie vorzugsweise nicht mehr als etwa ein Konjugatmolekül auf ein Molekulargewicht von 2000.

Das Verhältnis zwischen Chromophor-Moiekülen und Liganden liegt im allgemeinen von etwa 0,05 bis 20 :1₁ gewöhnlich von etwa 0,5 bis 20 :1, vorzugsweise von etwa 1 bis 10:1 und insbesondere von etwa 2 bis 8:1.

Ist der Chromophor ein fluoreszierendes Molekül im Sinne der Erfindung, so liegen im allgemeinen mindestens etwa 0,5 bis 20, gewöhnlich etwa 1 bis 10 und vorzugsweise etwa 2 bis 7 fluoreszierende Moleküle je Ligandenmolekül vor. Ist der Chromophor das Löichmolekül, so beträgt die Anzahl der Löschmoleküle je Ligand im allgemeinen etwa 0,5 bis 20, üblicherweise etwa 1 bis 20 und vorzugsweise etwa 2 bis 15 je Ligandmolekül.

Die Konjugate zum Zentralmolekül haben die gleiche Art von verbindenden Gruppen, die zur Verbindung des Chromophors am Liganden verwendet werden. Die jeweils auszuwählende Funktionalität hängt von den verfügbaren funktioneilen Gruppen am Kernmolekül ab.

Rezeptor-Chromophor

Da der Rezeptor in den meisten Fällen ein Antikörper ist, bezieht sich die Beschreibung als Beispiele für Rezeptoren auf Antikörper. Die Antikörper haben eine Anzahl von aktiven Aminogruppen, die zur kovalenten Konjugierung des Chromophors mit dem Antikörper verwendet werden können. Zweckmäßig kann der Chromophor eine Nicht-Oxo-Carbonyl-Funktionalität (einschließlich der Stickstoff- und Schwefelanalogen) oder eine aktive λ-Halogencarbonyl-Funktionalität haben. Beispiele für Funktionalitäten zum Verbinden des Chromophors mit dem Antikörper sind Acylhalogenide, Mischanhydride, Imidat-Alkylester, Isothiocyanat Chlor-, Brom- oder Jodacetyl usw.

Die Bedingungen für die Konjugation sind mäßige Temperaturen von etwa 0 bis 40° C in wäßrigen Medien bei mäßigen pH-Werten. Die Konjugation von Chromophoren an Proteine ist an sich bekannt The et al. Immunology, 18,865 (1970); Cebra et al, J. Immunol., 95, 230 (1965); Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York (1968).

Die Anzahl der chromophoren Gruppen, die mit dem auf den Rezeptor Bezug genommen ist, so sollen darin alle Antikörper eingeschlossen sein, die in der Lage sind, sich mit beliebigen Epitopstellen des Liganden spezifisch zu verbinden.

Poly-(Ligandenanaloges)

Das Poly-(Ligandenanaloge) unterscheidet sich von dem Ligandenanalogen-Chromophor und dem PoIy-(Ligandenanalogen)-Poly-(Chromophor) dadurch, daß kein Chromophor vorhanden ist. sondern nur das Ligandenanaloge. Die gleichen Arten von Kernmolekülen und der gleiche Konjugationsgrad kommen für das PoIy-(Ligandenanaloge) und für den Poly(Ligandenanalog)-Poly-(Chromophor) in Frage. Das Ligandenanaloge kann aber in einem viel höheren Verhältnis vorhanden sein, als der zentrale Kern den Rezeptor aufnehmen kann. Obgleich also eine Mindestzahl von Ligandenanalog-Gruppen wesentlich ist. ist die Höchstzahl eine Frage der Zweckdienlichkeit. Der wesentliche Faktor besieht darin, daß die Rezeptormoleküle, die an das PoIy-(Ligandenanaloge) gebunden sind, so nahekommen, daß die Chromophore in den Löschabstand gelangen.

Die Auswahl der Kernmoleküle hängt von einer Reihe von Umständen ab. Obgleich es nicht wesentlich ist, daß das Kernmolekül wasserlöslich ist, so ist dies in den meisten Fällen erwünscht. In jedem Fall soll das Kernmolekül oder die Kernzusammensetzung in einem wäßrigen Medium stabile Dispersionen bilde.i. Weiterhin soll das Kernmolekül kein Licht mit der Emissionswellenlänge der fluoreszierenden Substanz absorbieren, um eine nennenswerte Löschung zu erzeugen. Drittens soll das Kernmolekül bei den Emissionswellenlängen der fluoreszierenden Substanz nicht fluoreszieren, wenn es mit dem anregenden Licht bestrahlt wird. Deshalb soll das Kernmolekül nur unterhalb etwa 520 nm, vorzugsweise unterhalb etwa 450 nm in nennenswertem Umfang absorbieren.

Das Kernmolekül soll stark funktionalisiert sein, vorzugsweise mit Amino- oder Hydroxylgruppen, obgleich auch andere reaktionsfähige Funktionalitäten, z. B. die Carboxygruppe, brauchbar sind. Viertens soll das Kernmolekül bei den üblichen Lager- und Gebrauchsbedingungen stabil sein. Fünftens soll das Kernmolekül gegenüber den im Chromophor und im Liganden vorhandf nen Funktionalitäten inert sein, außer gegenüber der Bindefunktionalität Schließlich soll das Kernmolekül die Immuno-Analyse nicht stören, beispielsweise dadurch, daß es natürlich vorkommende Rezeptoren ent-

hält, die in den zu untersuchenden physiologischen Flüssigkeiten vorhanden sein können.

Obg'eich Moleküle mit beliebiger Größe verwendet werden können, geben sehr große Moleküle oder Zellen zu praktischen Schwierigkeiten Anlaß. Zjm Beispiel kann ein sehr großes Molekül beim Durchtritt durch den Lichtstrahl des Fluorometers eine plötzliche Zunahme der Peak-Höhe ergeben. In diesem Fall müßte das erhaltene Signal über einen beträchtlichen Zeitraum gemittelt werden. Große Moleküle ergeben auch beträchtliche Streuungen; diese können aber durch ein geeignetes optisches System kompensiert werden. Vorzugsweise verwendet man in den meisten Fällen Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10 Millionen, vorzugsweise von etwa 30 OCO bis 1 000 000.

Chromophor

Da in dorn zu analysierenden Medium normalerweise Antikörper vorhanden sind und da Proteine Licht mit Wellenlängen bis zu etwa 310 nm absorbieren, so hat die fluoreszierende Substanz die größte Absorption gewöhnlich bei mehr als 310 nm. üblicherweise bei mehr als 350 nm und vorzugsweise bei mehr als etwa 400 nm. Die Auswahl der fluoreszierenden Substanz wird auch durch den jeweils interessierenden Liganden bestimmt. Die fluoreszierende Substanz sollte das Licht bei einer höheren Wellenlänge als der interessierende Ligand oder das Ligandenanaloge absorbieren. Ein hoher Extinktionskoeffizient ist erwünscht, der weiter über 10, vorzugsweise über 10^J und besonders vorteilhaft über 10⁴ liegen sollte. Es sollte eine gute Quantenausbeute für die fluoreszierende Substanz im wäßrigen Medium zur Verfugung stehen. Zweckmäßig soll sich das Absorptionsmaximum der fluoreszierenden Substanz bei wechselnden Liganuen nicht nennenswert ändern.

In den vorstehend genannten Arbeiten, nämlich bei Stryer und Brand et al., sind eine Reihe von verschiedenen fluoreszierenden Substanzen beschrie¹" -n.

Eine Gruppe von fluoreszierenden '' anzen mit einer Anzahl der vorstehend beschriebenen erwünschten Eigenschaften umfaßt die Xanthenfarbstoffe, die die Fluoresceine enthalten, welche sich vom 3,6-Dihydroxy-9-phenyl-xanthhydrol ableiten, sowie die Rosamine und Rhodamine. welche sich vom 3.6-Diamino-9-phenylxanthhydrol ableiten. Die Rhodamine und Fluoresceine haben eine 9-o-Carboxyphenylgruppc und sind Derivate des 9-o-CarboxyphenylxanthhydroIs.

Diese Verbindungen sind mit Substituenten an der Phenylgruppe im Handel erhältlich; diese Substituenten können als Bindungsstelle oder als Bindungsfunktionalität verwendet werden. Beispielsweise gibt es mit Amino- und Isothiocyanatgruppen substituierte Fluoresceinverbindungen.

Eine weitere Gruppe von fluoreszierenden Verbindungen sind die Naphthylamine, die eine Aminogruppe in der x- oder /^-Stellung, gewöhnlich in der «-Stellung, enthalten. Beispiele für Naphthylaminoverbindungen sind l-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8-naphthalinsulfonat und 2-p-Toluidiny!-6-naphthalinsulfonat

Andere geeignete Farbstoffe sind 3-PhenyI-7-isocyanatocumarin. Acridine, wie 9-Isothiocyanatoacridin und Acridin-orange; N-(p-(2-Benzoxazolyl)-phenyl)-maleinimid; Benzoxadiazole. wie 4-Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-13-diazol und 7-(p-Methoxybenzylamino)-4-nitrobenzo-2-oxa-1.3-diazol: Stilbene, wie 4-Dimethylamino-4'-isothiocyanatostilben und 4-Dimethylamino-4'-maleinimidostiIben; Ν,Ν'-Dioctadecyloxacarbocyanin-p-toluolsulfonat; Pyrene, wie 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfosäure und 1-Pyrenbuttersäure, Mero-

ί cvanin 540. Rose-Bengal, 2,4-Diphcny!-3(2H)-furanon, sowie andere leicht zugängliche fluoreszierende Moleküle. Diese Farbstoffe haben entweder aktive Funktionalitäten bzw. diese Funktionalitäten können leicht eingeführt werden.

ίο Ähnliche Überlegungen wie für das fluoreszierende Molekül gelten auch für das Löschmolekül, ausgenommen, daß eine gute F'uoresze iz-Quantenausbeute nicht notwendig ist. wenn die Fluoreszenz des lluoreszierenden Moleküls gemessen wird. Ein weiterer Gesichtspunkt für die Auswahl des Löschmoleküls besteht darin, daß es bei einer Emissionswellenlänge der fluo~eszierenden Substanz absorbiert. Eine gute Überschneidung der Emission der fluoreszierenden Substanz und der AbSOr⁰IiOn der Löschsubs^t.?.^ny >**' orwünsrht.

Es sei darauf hingewiesen, daß sowohl die Absorptions- als auch die Emissionseigenschaften des Farbstoffes davon abhängig sein können, ob der Farbstoff frei in Lösung vorliegt oder an ein Protein oder einen Liganden gebunden ist. Deshalb soll bei der Angabe der versciiiedenen Bereiche und Eigenschaften der Farbstoffe gelten, daß es sich um den Farbstoff handelt, wie er verwendet wird und nicht um den unkonjugierten Farbstoff in einem willkürlich gewählten Lösungsmittel. Im Überschneidungsbereich zwischen Fluoreszenz und Löschung, soll die Löschsubstanz einen Extinktionskoeffizienten in der gleichen Größenordnung oder höher als der für die Absorption des fluoreszierenden Moleküls haben.

Ligand

Wie schon gesagt, kann der Ligand sehr unterschiedlich sein und hat normalerweise ein Molekulargewicht von mindestens 110, üblicherweise von mindestens 125, wobei das Molekulargewicht nach oben keine Grenzen hat, obwohl es gewöhnlich den Wert von 10 Millionen nicht überschreitet. In den meisten Fällen kommt es bei dem Liganden darauf an, daß ein Rezep'or angefügt werden kann oder bereits zur Verfügung Sn.ht. Normalerweise können für die meisten organischen Verbindungen mit polaren Funktionalitäten Rezeptoren hergestellt werden. Verbindungen, für die Antikörper dadurch erzeugt werden können, daß die Verbindung an eine Verbindung mit antigenen Eigenschaften gebunden wird, werden als Haptene bezeichnet. Verbindungen, die ohne chemische Änderung eine Antikörperbildung hervorrufen, werden als Antigene bezeichnet (vgl. Kabat et al.. Experimental Imrr.unochemistry, Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, 1967).

Die nichtpolymeren interessierenden Liganden haben gewöhnlich ein Molekulargewicht von etwa 125 bis 2000.

Diese Verbindungen können acyclisch, alicyclisch oder heterocyclisch sein, und zwar sowohl mono- als auch polycyclisch. Als Heteroatome kommen in Frage Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Halogen (Fluor, Chlor, Brom und ]od), Bor, Phosphor, Metallkationen der Gruppen IA und 2A des Periodensystems, Übergangsmetalle u. dgl.

Als Funktionalitäten kommen in Frage Alkohole, Äther. Carbonsäuren, Carbonsäureester und -amide, Amine, Halogene, Nitrile, Mercaptoverbindungen u.dgl. Normalerweise sind die Verbindungen aus-

schließlich aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Halogen und Phosphor, insbesondere aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff zusammengesetzt, und wenn es sich um Salze handelt, so liegt das geeignete Nt-HaIl- oder Ammonium-Gegenion vor.

Heterocyclische Ringe sind beispielsweise Pyrrol, Pyridin. Piperidin, Indoi, Thiazol, Piperazin, Pyran, Cumarin, Pyrimidin, Purin.Triazin, Imidazo! u. dgL

Eine Klasse von interessierenden Verbindungen umfaßt solche mit einer Aminogruppe, entweder als heterocyclischen! Glied oder als Funktionalität an einer aliphatischen Kette. Diese Verbindungen haben normalerweise sin Molekulargewicht von etwa 110 bis 800. üblicherweise von etwa 125 bis 650. In diesen Verbindungen ist eine Aminogruppe häufig durch, zwei bis drei aliphatische Kohlenstoffatome von einem Benzolring getrennt

Die erste interessierende Verbindungsgruppe umfaßt die Alkaloide und die Metaboliten von eingenommenen Alkaloiden, r. B. die Alkaloide der Morphingruppe, die Cocainalkaloide, die Cinchonaalkaloide, die Isochinoline, Benzylisochinoline, die Phthalid-Isochinoline, die Indolopyridocolin-Alkaloide u. dgl. Die in erster Linie interessierenden Alkaloide sind die Rauschgifte, wie Morphin, Cocain, Mescalin und Lysergsäure, von denen die Verbindung selbst oder ihr Mmbolit analysiert werden kmn, was von der physiologischen Flüssigkeit abliängt, die analysiert werden soll.

Es gibt auch eine Anzahl von synthetischen Drogen, die die physiologischen Eigenschaften der natürlich vorkommenden Rauschgifte ganz oder teilweise nachahmen. Unter diesen Drogen sind zu nennen Methadon, Meperidin, Amphetamin, Methiimphetamin, Glutethimid, Diphenylhydantoin sowie Dirogen, die in die Kategorie der Benzdiazocyciohepiane, Phenothiazine und Barbiturate fallen.

Drogen, die wegen ihrer physiologischen Eigenschaften von Interesse sind, sind beispielsweise die Catecholamine. die Beruhigungsmittel (z. IB. Meprobamat, Tergitol und die Succinimide), Tetrahyiiirocannabinol, Cannabinol und deren Derivate (in erster Linie, Verbindungen, die sich von Marihuana ableiten, sowie deren synthetische Modifikationen und Metaboliten).

Weitere Verbindungsgruppen von großem Interesse sind die Steroide, die Vitamine, die Saccharide, die Prostaglandine, die Aminosäuren, Polypeptide und Proteine.

Die Polypeptide enthalten gewöhnlich etwa 2 bis 100 Aminosäureeinheiten und haben gewöhnlich ein Molekulargewicht von weniger als etwa 12 000. Größere Polypeptide werden willkürlich Proteine genannt und sind gewöhnlich aus etwa 1 bis 20 Polypeptideketten zusammengesetzt. Der Ausdruck Poly-( Aminosäure) wird als Oberbegriff für Polypeptide und Proteine verwendet. Von besonderem Interesse unter den Aminosäuren sind die Thyronine, und zwar das Tri- und Tetrajodthronin. Die erfindungsgemäß verwendeten Poly-(Aminosäuren), bei denen zwei Antikörper ah; Reagentien verwendet werden, haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis 10⁷, gewöhnlich von IO⁷ bis 10⁶. Vor. besonderem Interesse unter den Polypeptiden und Proteinen [Poly-(Aminosäuren)] sind Hormone, Globuline, Antigene und Stoffzusammensetzungen mit bestimmten physiologischen Aktivitäten.

Proteine, die im menschlichen Plasma vorkommen und die klinisch wichtig sind, sind von besonderem Interesse. Diese umfassen beispielsweise Thyroxin-bindendes Globulin. Immunoglobulin G, A, M, D usw. (z. B. IgG oder v-G-Globulin), Komplementfaktoren und Blutklumpungsfakioren.
Wichtige Proteinhormone sind Peptid- und Proteinhormone, wie Gonadotropin (Choriongonadotropin), Peptidhormone von der Neurohypophyse, wie Oxytocin, Vasopressin und Auslösefaktoren.

Andere polymere Substanzen von Interesse sind Mucopolysaccharide und Polysaccharide, insbesondere die

ίο antigenen Polysaccharide aus Mikroorganismen, wie N'eisseria gonorrhoeae.

Eine weitere Gruppe von Verbindungen umfaßt die Antibiotika, wie Penicillin, Actinomycin, Chloromycetin u- dgL

Schließlich können auch Schädlingsbekämpfungsmittel wie Fungizide, Insektizide, Bakterizide und Nematozide von analytischem Interesse sein.

Außer den Verbindungen können auch Zellen, Viren und andere biologische Aggregationen, die Antigene darstellen oder an die natürlich vorkommende Rezeptoren gebunden werden können, analysiert werden.

Die zu analysierenden Mikroorganismen können intakt, lysiert, gemahlen oder anderweitig zerkleinert sein, und die erhaltene Zusammensetzung oder ein Teil davon (z. B. der durch Extraktion erhaltene Teil) kann analysiert werden. Interessierende Mikroorganismen sind beispielsweise Streptokokken, Staphylokokken, ChIamydien (unklassifizie; bare Parasiten, bakteriell/viral) und Chlamydien-Agentien (Bezeichnung unsicher), Herpesviren (z. B. Herpes simplex Varicella (Hühnerpokken). Herpes Zoster (Gürtelrose), Virus B und Cytomegalo^irus) und Hepatitis-Α- und -B-Virus.

Immunoanalyse

uie immunoanaiysen gemäß der trilndung beruhen auf dem Grad der Löschung, der in einer Lösung auftritt, in welcher fluoreszierende Moleküle mit Licht bestrahlt werden, das durch die fluoreszierende Substanz absorbiert wird (vorzugsweise innerhalb des Absorptionspeaks) als Funktion der Menge des Liganden im Medium. Die Anzahl der Moleküle der fluoreszierenden Substanz und der Löschsubstanz, die einander bis auf eine Entfernung angenähert werden, bei der eine Lö-

«5 schung auftreten kann, steht mit der Menge des im Analysenmedium vorhandenen Liganden in Beziehung.

Die Analyse kann mit Rezeptoren für den Liganden, der mit dem Chromophor konjugiert ist, oder mit einem Rezeptor für den Rezeptor (Anti-(Rezeptor)), der mit dem Chromophor konjugiert ist, durchgeführt werden. Aus den nachstehend noch angegebenen Gründen hat die zuletzt genannte Methode (Doppelrezeptormethode) verfahrensmäßige Vorteile und bietet Analysenmöglichkeiten, die bei der Einzelrezeptormethode nicht gegeben sind. Bei der Doppelrezeptormethode wird der Rezeptor-Chromophor indirekt an den Liganden gebunden, und zwar über den Rezeptor für den Liganden, was einen zusätzlichen Freiheitsgrad bei der Auswahl der Reagentien bietet.

Bei der Durchführung der Analyse und der Anwendung der einzelnen Rezeptormethode hat das Ligander.-analog-Reagens das Ligandenanaloge entweder direkt (kovalent) an einen Chromophor, an ein Ligandenana-1Og-(Ch:), oder ein Poly-(Ligandenanalog)-poly(Cli2)ge-

bunden oder indirekt (über ein Rezeptor-Chj) an einen Chromophor (Ch?) gebunden. Die Analyse wird dann so durchgeführt, daß man im Analysenmedium den an Chj gebundenen Liganden, den Rezeptor-Chi und die unbe-

kannte Substanz miteinander vereinigt Bezüglich der Reihenfolge der Zugabe sind mehrere Alternativen möglich. Soll das Ligandenanaloge indirekt mit Cli2 verbunden werden, so können der Rezeptor-Chi und der Rezeptor-Ch2 stufenweise oder praktisch gleichzeitig zugesetzt werden.

Zweckmäßig werden der Rezeptor-Chi und der Rezeptor-Ch; als kombiniertes Einzelreagens im richtigen Verhältnis verwendet Auf diese Weise kann das Verhältnis zwischen zwei üblichen Rezeptoren sorgfältig eingestellt werden, und die Rezeptoren können dem Analysengemisch exakt zugesetzt werden. Das Gemisch kann ein trockenes, lyophilisiertes Gemisch oder eine wäßrige, normalerweise gepufferte (pH 5—10; gewöhnlich 6,5—8,5) Lösung in jeder gewünschten Konzentration sein.

Die Konzentrationen der interessierenden Liganden sind im allgemeinen etwa 10-* bis 10-'*, üblicherweise etwa 10-* bis ΙΟ-¹² molar, am häufigsten etwa 10~⁶ bis 10-¹⁰ molar. Die Konzentrationen der Reagentien stehen mit der interessierenden Konzentration des Liganden in Beziehung.

Das Medium ist normalerweise wäßrig und enthält etwa 0 bis 40, gewöhnlich etwa 0 bis 20 Volumprozent eines polaren organischen Lösungsmittels. Beispiele für polare organische Lösungsmittel sind Äthylenglykol. Äthanol, Carbitol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid u. dgl.

Vorzugsweise ist das wäßrige Medium praktisch frei von anderen polaren Lösungsmitteln. Das Medium ist normalerweise im pH-Wert-Bereich von etwa 5 bis 10, vorzugsweise von etwa 6,5 bis 8,5 und insbesondere von etv'a 7 bis 85 gepuffert. Es können unterschiedliche Puffersubstanzen verwendet werden, z. B. Borat, Phosphat, Carbonat, Barbitursäure, Tris und ähnliche. Die jeweils verwendete Puffersubstanz ist nicht erfindungswesentlich, doch kann bei bestimmten Analysen eine Puffersubstanz der anderen vorzuziehen sein. Die Pufferkonzentration liegt normalerweise im Bereich von etwa 0,005 bis 05 molar, gewöhnlich von etwa 0.01 bis etwa 0,1 molar.

Während der Analyse werden normalerweise mäßige Temperaturen angewendet, die im allgemeinen von etwa 0 bis 45⁰C, üblicherweise von etwa 15 bis 40°C reichen. Die jeweils gewählte Temperatur wird durch Zweckmäßigkeitserwägungen bestimmt sowie durch den Einfluß der Temperatur auf den Wirkungsgrad der Fluoreszenz und durch die Bindekonstante des Rezeptors mit dem Liganden. Die Analyse verläuft besser bei niedrigeren Temperaturen, da sowohl der Wirkungsgrad der Fluoreszenz als auch die Bindungskonstanten besser sind.

Aus Gründen der Einfachheit werden die einzelnen Rezeptoranalysen in solche unterteilt, bei denen der Ligand kovalent an den Chromophor gebunden ist. und in solche, bei denen der Ligand indirekt durch einen Rezeptor an den Chromophor gebunden ist.

Die erste Analyse wird mit solchen Zusammensetzungen durchgeführt, bei denen der Chromophor kovalent mit dem Liganden verbunden ist. Wie schon gesagt, bo kann ein einziger Chromophor mit einem einzigen Ligand verbunden sein oder, wenn man ein Kernmolekül verwendet, kann eine Vielzahl von Liganden mit einer Vielzahl von chromophoren Gruppen verbunden sein. Mit großen Liganden, z. B. Proteinen kann aber auch b5 eine Vielzahl von chromophoren Gruppen an den Liganden gebunden sein.

Der Ligandenanalog-Chromophor liegt gewöhnlich in einer Konzentration vor, die nicht größer ist als das lOOfache der höchsten Konzentration und die nicht geringer ist als das 0,01 fache der niedrigsten Konzentration des interessierenden Konzentrationsbereiches; üblicherweise liegt diese Konzentration im Bereich von der höchsten interessierenden Konzentration bis nicht weniger als dem 0,1 fachen der niedrigsten interessierenden Konzentration; vorzugsweise liegt diese Konzentration innerhalb einer Größenordnung oder innerhalb eines Faktors von 10 der niedrigsten interessierenden Konzentration.

Die Rezeptor-Chromophor-Konzentration wird dann durch Zusatz des Rezeptors bestimmt und zwar in einer Menge, die ausreicht, um eine mindestens 10%ige Löschung, vorzugsweise eine mindestens 20%ige Löschung sowie eine Löschung von bis zu 100%, gewöhnlich von etwa 20 bis 80% und vorzugsweise¹, jn etwa 50 bis 80% zu erhalten. Die Menge an Rezeptor-Chromophor steht mit der Bindungskonstante, der interessierenden Konzentration, die die Konzentration des Ligand-Chromophors beeinflußt, der Empfindlichkeit des Instruments sowie mit anderen Faktoren in Beziehung.

Obgleich der mit dem Liganden verbundene Chromophor eine Löschsubstanz sein kann, ist der mit dem Liganden verbundene Chromophor in den meisten Fällen eine fluoreszierende Substanz. Dies ist nicht eine Sache der Durchführbarkeit, sondern eine Sache der Zweckmäßigkeit. In den meisten Fällen ist der Rezeptor ein Antikörper, d. h. ein komplexes Proteingemisch, das den Antikörper für den Liganden sowie andere Antikörper und Proteine enthält. Wird die Antikörper-Zusammensetzung mit dem Chromophor markiert, so v/ird ein beträchtlicher Anteil des Chromophors an ein anderes Protein gebunden als den Antikörper für den Liganden (Antiligand). Wenn also die fluoreszierende Substanz an den Rezeptor gebunden ist, würde dies zu einer starken Untergrundfluoreszenz im Analysenmedium führen. Wenn andererseits eine verhältnismäßig reine Probe des Antiliganden zur Verfügung sfht, so besteht das bevorzugte Verfahren darin, den Liganden an die Löschsubstanz anstatt an die fluoreszierende Substanz zu binden.

Die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Substanzen zu dem zu analysierenden Medium ist nicht erfindungswesentlich. Es können die unbekannte Substanz und der Ligandenanalog-Chromophor gleichzeitig mit dem Rezeptor-Chromophor kombiniert werden oder die Substanzen können nacheinander zugegeben werden. Vorzugsweise wird die unbekannte Substanz mit dem Rezeptor-Chromophor kombiniert und eine aus. eichende Zeit inkubiert, um annähernd das Gleichgewicht zu erhalten. Deshalb vermindern sich die verfügbaren Bindungsstelien des Rezeptors proportional zu der Menge der im Analysenmedium vorhandenen unbekannten Substanz. Dann kann der Ligandenanalog-Chromophor zugesetzt und inkubiert werden, worauf die Lösung in ein Fluorometer übertragen wird und die Intensität der Fluoreszenz dadurch bestimmt wird, daß eine Anregung mit Licht bei einer Wellenlänge oder bei Wellenlängen, die durch die fluoreszierende Substanz absorbiert werden, vorgenommen wird.

Die Inkubationszeiten hängen von der Temperatur, der Bindungskonstante des Rezeptors und den Konzentrationen der im Analysenmedium vorhandenen Substanzen ab. Normalerweise betragen die Inkubationszeiten mindestens etwa 5 Sekunden und vorzugsweise nicht mehr als etwa 6 Stunden; sie liegen gewöhnlich im Bereich von etwa 30 Sekunden bis zsvei Stunden, vor-

zugsweise im Bereich von 1 bis 30 Minuten. Die Inkubationstemperaturen liegen im allgemeinen zwischen etwa 15 und 40⁰C

Verwendet man eine Reihe von Lösungen mit bekannten Ligandenkonzentrationen, so kann man eine Standardkurve anfertigen, auf der die Fluoreszenz oder die prozentuale Löschung mit der Konzentration des Liganden in Beziehung gesetzt werden. Die Fluoreszenz eines Analysenmediums mit einer unbekannten Substanz kann dann direkt mit der Konzentration der unbekannten Substanz im Analysenmedium in Beziehung gesetzt werden.

Bei einer zweiten Ausführungsform, bei der der Ligand indirekt mit einem Chromophor verbunden ist, wird der Rezeptor in zwei Teile geteilt, wovon der eine Teil mit der fluoreszierenden Substanz und der andere Teil mit der Löschsubstanz konjugiert wird. Diese Ausführungsform setzt voraus, daß entweder der Ligand mehrere determinierende oder epitopische Stellen hat oder, wenn der Ligand nur eine oder zwei epitopische Steilen hat, ein PoIy-(Ligandanaiog) hergestellt werden muß. Das heißt also, daß der Ligand nur wenige, gewöhnlich etwa t bis 2 Antikörper gleichzeitig unterbringen kann. Wie schon gesagt, wird der Poly-{Ligandanaloge) durch Konjugation eines Ligandanalogen an ein Kernmolekül mit hohem Molekulargewicht hergestellt

Bei dem Test bei dem der Ligand kovalent mit dem Chromophor konjugiert ist zeigt sich das Ergebnis als gleichmäßige Kurve, wobei sich die Fluoreszenz von einer Ligandenkonzentration von 0 bis auf einen maximalen Fluoreszenz;, ert erhöht. Ein ähnliches Ergebnis beobachtet man, wenn man das Poi^v-{Ligandanaloge) verwendet, um den Liganden sowie den Rezeptor und die fluoreszierende Substanz bzw. den Rezeptor und die Löschsubstanz zu bestimmen. Mit einem Antigen, das mehrere determinierende Stellen hat, wobei der zu analysierenden unbekannten Substanz nur eine Rezeptor-Löschsubstanz und eine Rezeptor-fluoreszierende Substanz zugesetzt werden, ist die Fluoreszenz maximal bei einer Antigenkonzentration von Null und nimmt ab mit zunehmender Antigenkonzentration, bis ein Minimum erreicht ist, worauf sie wieder zu einer maximalen Intensität ansteigt.

Der Grund für dieses doppelte Ergebnis ist klar. Nach Zusatz des Antigens werden die Löschsubstanz und die fluoreszierende Substanz an der Oberfläche des Antigens zusammengebracht so daß eine gewisse Löschung auftritt. Mit zunehmender Antigenkonzentration werden die beiden Rezeptoren in immer größer werdendem Umfang an der Oberfläche des Antigens zusammengebracht, wodurch die Löschung zunimmt. Bei einer gewissen Konzentration erreicht jedoch die Löschung ein Maximum, d. h. die Fluoreszenz erreicht ein Minimum. Mit zunehmender Antigenkonzentration nimmt die Menge des an ein Antigen gebundenen Rezeptors ab, so daß auch der Grad der Löschung abnimmt. Schließlich ist bei einer hohen Antigenkonzentration die Menge des an ein Antigen gebundenen Rezeptors unzureichend, um eine Löschung zu erzeugen. Wenn man also eine Antigenanalyse durchführt, so ist es notwendig, die Analyse bei zwei verschiedenen Antigenverdünnungen durchzuführen. Auf diese Weise kann man feststellen, ob man sich auf dem abfallenden oder auf dem ansteigenden Zweig der Kurve befindet.

Die Konzentration an Poly-(Ligandenanalogem), bezogen auf verfügbares Ligandenanaloges, liegt innerhalb der gleichen Bereiche, wie sie für den kovalent an den Chromophor gebundenen Liganden angegeben wurden.

Führt man die Analyse mit zwei konjugierten Rezeptoren, z. B. Antikörpern durch, so wird das Antigen gewöhnlich in Gegenwart von etwa 0,1 bis 1 mg/ml eines Proteins, z. B. Albumin, mit den Antikörpern kombiniert und über einen ausreichenden Zeitraum inkubiert der allgemein etwa 5 Sekunden bis 6 Stunden, gewöhnlich etwa eine halbe Minute bis zwei Stunden, vorzugsweise 1 bis 30 Minuten, beträgt. Die Temperatur liegt im Be-

!0 reich von etwa 15 bis 40⁰C. Die Überlegungen, die die Inkubationszeit bestimmen, wurden bereits vorstehend erörtert

Bei einem Poiy-{Ligandenanalogem) werden die beiden konjugierten Antikörper mit der zu analysierenden unbekannten Substanz kombiniert und inkubiert, worauf das Poly-{Ligandenanaloge) zugesetzt und das Gemisch weiter inkubiert wird. Die vorstehend angegebenen Zeiten und Temperaturen gelten auch für diese Analysenmethode.

Dann wird die Probe in ein Fluorometer gebracht woraui die Fluoreszenz durch Anregung mit Licht mit einer geeigneten Wellenlänge bestimmt wird. Die Fluoreszenz kann auf die fluoreszierende Substanz oder auf die Löschsubstanz zurückgehen, was von dem gemessenen Wellenlängenband abhängt. Die Analyse kann manuell oder automatisch durchgeführt werden.

Das vorliegende Verfahren kann man leicht zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen in menschlichen, physiologischen Flüssigkeiten abgewandelt werden, wobei ein zweistufiges Verfahren und Rezeptor-Chromophore (Chi und Ch?) für gamma-Globulin, z. B. menschliches gamma-Globulin, verwendet werden. Man kann aufgrund des unterschiedlichen Molekulargewichtes leicht zwischen der Aggregation von Antikörpern oder anderen Rezeptor-Molekülen, die an ein Antigen gebunden sind, und der, Antikörpern oder anderen Rezeptoren, die frei in der Lösung vorliegen, unterscheiden,
je nachdem, ob man die Anwesenheit-jder die Abwesenheit eines Antigens oder eines Antikörpers in einer menschlichen physiologischen Flüssigkeit, z. B. Blut bestimmen will, setzt man das komplementäre Material zu, gewöhnlich in einem nennenswerten Überschuß über die maximale interessierende Konzentration. Will man beispielsweise die Anwesenheit von Antikörpern in Serum gegenüber einem bestimmten Antigen bestimmen, so setzt man das Antigen der physiologischen Flüssigkeit zu und trennt die Komponenten ab, deren Molekulargewichte größer als das Molekulargewicht des Antikörpers sind (< 160000), z.B. durch Zentrifugieren. Nach der Abtrennung des Niederschlages von der überstehenden Flüssigkeit wird der Niederschlag wieder dispergiert und erfindungsgemäß auf die Anwesenheit von menschlichem gamma-Globulin untersucht. Nur in Gegenwart eines Antigens liegt menschliches gamma-Globulin im Niederschlag vor. Deshalb zeigt die Anwesenheit von menschlichem gamma-Globulin im Niederschlag die Anwesenheit von Antikörpern gegenüber dem Antigen im Serum an.

Das zweistufige Verfahren kann zur Bestimmung einer großen Anzahl von Antigenen und Antikörpern angewendet werden, wobei die gleichen Rezeptor-Chromophore verwendet werden. Das Verfahren ermöglicht eine direkte Bestimmung von Antikörpern für spezifisehe Antigene. Antigene können indirekt durch Zusatz von Antikörpern zu der Flüssigkeit die vermutlich das Antigen enthält, bestimmt werden, wobei anschließend auf Anwesenheit von Antikörpern im Niederschlag

nach der Trennung von gebundenen und ungebundenen Antikörpern geprüft wird.

Die Doppelrezeptormethode ist eine homogene Methode, die die Bestimmung von Haptenen, Antigenen und Anti-Liganden ermöglicht, insbesondere, wenn der Ligand ein polyepitopischas Antigen ist.

Bei der einfachsten Ausführungsform zum Nachweis eines Liganden wird der Ligand mit einem Chromophor, insbesondere einer fluoreszierenden Substanz, konjugiert, worauf der Rezeptor (auch als Antiligand bezeichnet) und der Anti-(Rezeptor)-Chromophor, insbesondere die Löschsubstanz, der Analysenlösung zugesetzt wird. Auf diese Weise kann man eine größere Anzahl von Löschmolekülen an den Liganden binden, wobei die Löschwahrscheinlichkeit verbessert wird. Tatsächlich wird durch den Rezeptor die Anzahl der Löschmoleküle, die an den Liganden gebunden werden können, erhöht.

Die Konzentration der Reaktionsteilnehmer geht parallel zu der der analogen Reagentien für die Einzelrezepiörfficthode. wobei der Anti(Rezeptor)-Chromophor in einem molaren Überschuß über den Rezeptor vorliegt, wobei das Molverhältnis im allgemeinen zwischen etwa 1,5 bis 10 :1 liegt Falls gewünscht, können einzelne F,b-Einheiten anstatt des intakten IgG verwendet werden.

Bei der nächsten Ausführungsform werden die beiden Chromophore indirekt an den Liganden gebunden. Bei dieser Arbeitsweise werden nur der Rezeptor und der Anti-(Rezeptor)-Chi und der Anti-(Rezeptor)-Ch₂ verwendet. Jedoch wird vor der Einführung dieser Reagentien ein Teil des Rezeptors mit dem Anti-(Rezeptor)-Chi und ein anderer Teil mit dem Anti-(Rezeptor)-Cli2 kombiniert, um eine Bindung zu erzeugen. Zweckmäßig ist der Anti-(Rezeptor) monofunktionell. z. B. Fib. Der An«!-{Rezeptor)-Ch. und -Ch₂, die an den Rezeptor gebunden sind, liefern die vergleichbaren Reagentien für den Rezeptor-Ch| bzw. den Rezeptor-Ch2. Es können ähnliche Verhältnisse zwischen Anti-(Rezeptor)-Chr^mophoren und Rezeptor angewendet werden, wie schon angedeutet.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Rezeptoren von zwei verschiedenen Arten, z. B. Säugetierarten, wie Schafen und Kühen, verwendet. In diesem Fall sind die epitopischen oder haptenischen Stellen für die beiden Rezeptoren für den gleichen Liganden verschieden. Bei der Bezeichnung des Rezeptors aus zwei verschiedenen Quellen setzt man vor den Rezeptor einen Kleinbuchstaben, z. B. a-(Rezeptor). Auf diese Weise brauchen der flezeptor und der Anti-(Rezeptor)-Chromophor nicht vorher kombiniert zu werden. Die Verhältnisse zwischen den einzelnen Reagentien liegen parallel wie bei den analogen Reagentien für die vorstehend beschriebenen Analysen.

Die Chromophor-Reagentien sind Anti-(a-Rezeptor)-Chi und Anti-(b-Rezeptor)-Ch2. Es ist also Chi nur mit einem a-(Rezeptor) und Cti2 nur mit einem b-(Rezeptor) assoziiert.

Diese Methode ermöglicht die Bestimmung von Komplexen in Lösung, wobei sich die Glieder des Komplexes durch mindestens eine Epitopstelle unterscheiden. Man kann einen a-(Rezeptor) für ein Glied des Komplexes und einen b-(Rezeptor) für ein anderes Glied des Komplexes herstellen. Die Löschsubstanz und cie fluoreszierende Substanz werden erst zusammengebracht, wenn die beiden Glieder miteinander verbunden sind.

RezeDtoren von zwei verschiedenen Quellen können ebenfalls mit einem Liganden verwendet werden, um zu vermeiden, daß man den Rezeptor zuvor mit dem Anti-(Rezeptor)-Chromophor kombinieren muß. Dies gilt auch in Fällen, in denen eine kovalente Bindung zwisehen zwei Einheiten auftritt, die unabhängig voneinander existieren können, d. h, die eine chemische Reaktion eingehen.

Die Reagentien können in getrennten Ampullen oder als trocknes, lyophilisiertes Gemisch oder als wäßrige, normalerweise gepufferte (pH-Wert=5—10, gewöhnlich 6,5—8,5) Lösung in jeder beliebigen Konzentration vorliegen. Vorzugsweise wird der Anti-(a-Rezeptor) nicht mit einem a-(Rezeptor) in Lösung als Reagens längere Zeit vor Gebrauch kombiniert. Zweckmäßig können die beiden Rezeptoren und die beiden AnU-(Rezeptoren) kombiniert werden.

Ein besonderer Vorteil der Verwendung des Doppelrezeptors besteht darin, daß das gleiche Paar von (Anti-(Rezeptor)-Chromophoren) ohne Rücksicht auf den Liganden verwendet werden kanr. wobei nur die Paare der P-ezeptoren sich mit dem Ligasen ändern.

Zur Bestimmung der Antikörper iür ein bestimmtes Antigen führt man die Analyse so aus, als ob man das Antigen bestimmen würde, ausgenommen, dt3 man eine bekannte Menge Antigen dem Analysenmedium zusetzt. Jeder beliebige, in der unbekannten Substanz vorhandener Antikörper vermindert die Menge des Anti-(Antikörper-Chromophors), der an das Antigen gebunden ist, und vermindert auf diese Weise das Ausmaß der Löschung, die in Abwesenheit des Antikörpers auftreten würde. Der Antikörper würde natürlich von einer anderen Art abstammen (nicht von einem Säugetier) als der zu bestimmende Antikörper.
Die nachstehenden Beispiele sollen lediglich zur Erläuterung der Erfindung dienen.

im nachfolgenden experimentellen Teil sind alle Temperaturen in Grad C angegeben, falls nichts anderes gesagt ist. Alle Teile beziehen sich auf das Gewicht, falls nichts anderes gesagt ist Alle Pufferlösungen sind wäßrige Pufferlösungen. Alle Symbole haben ihre normale Bedeutung, wenn nichts anderes gesagt ist.
Es werden folgende Symbole verwendet:

IgG

igG(x)
R

gamma-Globulin;
Anti-x;

Tetramethylrhodamin;
Beispiel: RlgG(x) = Tetramethylrhodamin,

konjugiert an Anti-x;
Fluorescein;

Beispiel: FlgG(x) Fluorescein,
konjugiert an Anti-x; und
menschliches gamma-Globulin.

3e is piel 1

Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Konjugat an
O³-Aminoäthylmorphin (FLUMO'S')

A. Fluoresceinamin (0.5 g) (Sigma, Isomer I, rein nach der Dünnschichtchromatographie, CH3OH/-CHCu=I :3) wurde in 20 ml trockenem Aceton (über wasserfreiem K2CO]) getrocknet, gelöst und bei Raumtemperatur zu 3 ml Thiophosgen in 5 ml Aceton unter

b5 starkem Rühren {'/₂ S'.unde) zugetropft. Das Rühren wurde noch 1 Stunde fortgesetzt, und der erhaltene Niederschlag, der mit Hilfe eines Eisbades auf 5° abgekühlt wurde, wurde schnell durch einen feinen Sinterglastrich-

ter filtriert. Der Niederschlag wurde mit 3 ml trockenem Aceton und dann mit 5 χ 5 ml 6 N HCI gewaschen, während er mit einer Spatel zerdrückt wurde, bis er vollständig nach Tiefrol umgeschlagen hatte. Anschließend wurde er über Nacht unter Vakuum (über 80%iger KOH) getrocknet. Das erhaltene Isothiocyanat war rein (nach der Dünnschichtchromatographie, 50% CHjOH/ DMF).

B. 100 mg 0³-Aminoäthylmorphin werden in 5 ml Aceton gelöst und in einem Gemisch aus 20 ml Aceton, 5 ml Wasser und 0,07 ml Triäthylarnin zugesetzt. Dieser Lösung wird eine Lösung von 100 mg FITC in 5 m' Aceton unter Rühren über einen Zeitraum von 15 Minuten zugetropft. Das Rühren wird noch 80 Minuten fortgesetzt, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zutropfen von verdünnter Triäthylaminlösung in Aceton (1,4 ml/10 ml Aceton) auf 9,5 eingestellt wird. Dann wird das Aceton mit Hilfe eines Drehverdampfers bei Raumtemperatur teilweise entfernt. Das Produkt wird ausgefällt, indem CO₂ bei gleichzeitiger Zugabe von H₂O (bis 10 ml) durch die Lösung geleitet wird, bis der pH-Wert auf 6 bis 6,5 fällt. Der Niederschlag wird schnell durch einen Sinterglastrichter filtriert und mit H₂CO3-Lösung (2 ml, pH-Wert-6,0) gewaschen. Die Ausbeute beträgt 60 mg. Das Filtrat und die Waschwässer werden vereinigt, wobei beim nochmaligen Durchleiten von CO₂ in der vorstehend beschriebenen Weise eine zweite Fraktion erhalten wird. Ausbeute 27 mg. Das Produkt wird über Nacht unter Vakuum bei 80° über P₂Os getrocknet. Die Gesamtausbeute beträgt 87 mg. Das Produkt zeigt bei der Dünnschichtchromatographie (50% Methanol in Dimethylformamid) einen einzigen Fleck bei Rf = 0,45.

Beispiel \l

Reinigung und Markierung von Morphin-Antikörper (igG(m)) mit Tetramethyirhodiimin-isothiocyanai

(TRITC)

A. (a) Herstellung des Morphin-Immunoadsorbens

Mit Cyanogenbromid aktivierte Sepharose 4B, gekuppelt mit Hexamethylendiamin (8—10 μ Mol/l ml gepacktes Gel) wurde nach den Anweisungen des Herstellers (Pharmacia, Upsala) hergestellt. Das feuchte Gel (2,5 ml) wurde in Boratpuffer (10 ml, 0,1 n, pH =8,8) suspendiert, worauf das gemischte Anhydrid von O³-Carboxymethyimorphin und Chlorarneisensäureisobutylester (0,1 mMol. großer Überschuß) in DMF (2 ml) in der Kälte (0°) zugesetzt und das Gemisch 3 Stunden reagieren gelassen wurde. Das Gel wurde abfiltriert und nacheinander mit H₂O (500 ml), 0,1 m Boratpuffer, pH =9,0 (500 ml), H₂O (500 ml), verdünnter HCl+ 0,1 m NaCI, pH =23 (1500 ml) und H₂O (1000 ml) gewaschen. Nach Beendigung der Waschungen konnte kein Morphin nachgewiesen werden. Die Abschätzung des gebundenen Morphins wurde nach einer H ydrolysemethode mit verdünnter Essigsäure durchgeführt (Failla et al. Anal. Biochem., 52, 363 (1973)). Das UV-Spektrum wurde mit dem von 0³-Carboxymethylmorphin verglichen. Das gebundene Morphinäquivalent betrug 5,05 μ Mol/l ml gepacktes Gel.

(b) Reinigung des Morphin-Antikörpers

Das Morphin-Sepharose-Konjugat (23 ml) wurde in eine Kolonne mit einem Außendurchmesser von etwa 63 mm gepackt und nacheinander mit jeweils 100 ml Boratpuffer, 0,1m, pH =9,0; H₂O; verdünnter HCl. dH = 13; H₂O und dem gleichen Boratpuffer gewäsehen. Gelagerte IgG-Lösung vom Schaf (7 ml, 2,18 χ ΙΟ"⁴ M Bindesiellen) wurde auf die Kolonne aufgebracht, worauf der Boratpuffer (0,1 m, pH =9,0) gewaschen wurde, bis kein Protein mehr im Ausfluß nachgewiesen werden konnte (durch UV-Analyse). Die gesamte Antimorphinaktivität wurde in der Kolonne zurückgehalten, wie durch eine Morphin-Spinmarkierungsmessung festgestellt wurde (vgl. US-Patentschrift 36 90 834). Es wurde nochmals mit Glycin-HCI-Puffer (0,1 n, pH =4,0) gewaschen, wobei kein Protein eluiert wurde. Dann wurde der Antikörper mit Glycin-HCI-Puffer (0,1 n, pH= 1,5) eluiert, wobei Fraktionen von 3 ml bei Raumtemperatur in Röhrchen gesammelt wurde, die I ml I n-Boratpuffer mit einem pH-Wert von 9,0 enthielten. Fast der gesamte Antikörper wurde in drei Fraktionen gesammelt, die vereinigt und 24 Stunden gegen 0,1 n-Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,5 dialysiert wurden (2 χ 2000 ml). Die Antimorphinaktivität der isolierten Fraktion wurde mit Morphin-Spinmarkierungssubstanz bestimmt, wobei 70% der ursprünglich gebundenen Antimorphinaktivität gefunden wurden. Diese Fraktion war 100%ig rein (bestimmt als Antimorphin-Aktivitäts-Titerwert, verglichen mit dem Proteingehalt, ermittelt aus dem UV-Spektrum bei 280 nm).

B. (a) Reinigung des Morphinantikörpers durch
Sephadex-Chromatographie

Die Antimorphin-IgG(m)-Lösung (2 ml, etwa 50 mg/ ml Gesamtprotein) wurde auf einer Sephadex-G-200-Kolonne (2 χ 30 cm) mit 0,01 m phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 getrennt (Strömungsgeschwindigkeit ImI/10 min). Das IgG trennte sich sauber vom IgM und dem Albumin, und es wurden Fraktionen von 2 bis 3 ml gesammelt. Das erhaltene IgG zeigte kein Albumin bei der Celluloseacetat-

EickiiophurcSe

ι Γϊ3-ι3αι υϊϊϋΓαϊ-ϊ"ΰϊϊ\.Γ.

//=0,1); es handelte sich um 32 —35%iges antimorphinreiches IgG. Die Ausbeute hing von der Schnittbreite des gesammelten IgG-Peaks ab und betrug gewöhnlich 50% der gesamten, auf die Kolonne aufgebrachten Antimorphinaktivität. Die gesammelte IgG-Fraktion wurde gegen 0,01 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 dialysiert.

(b) Behandlung von Rinderserumalbumin (RSA)
mit dem Immunoadsorbens

RSA wurde mit CNBr-aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia) nach den Anweisungen des Herstellers aktiviert (es wurde ein 50%iger Überschuß an RSA über den empfohlenen Wert verwendet). 5 ml der über Sephadex chromatographierten IgG-Lösung (20 mg/ml) wurden auf die RSA-Immunoadsorbens-Kolonne (1x15 cm) aufgebracht und mit 0,01 m Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 73 eluiert. Das gesammelte Protein fand sich in 20 ml Flüssigkeit und wurde durch UV-Analyse auf seinen Proteingehalt und durch eine Spinmarkierungsmethode auf seine Antimorphinaktivität untersucht. Das Protein wurde zu 70% und die Antimorphinaktivität zu 90—92% wiedergewonnen.

(c) Antimorphin (IgG{m)) markiert mit
TRITC (RIgG(ITi))

Zu einer Lösung von IgG(m) (7 mg/04 ml) in 0,01 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 73 wird kristallines Kaliumcarbonat unter Rühren bei Raumtempera-

tür gegeben, bis der pH-Wert auf 10,0 bis 10,5 ansteigt. Dann wird TRITC (Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat) (15-1000 ng), gelöst in Aceton (3-30 μΐ), zugesetzt, und das Rührer, wird noch drei Stunden fortgesetzt. Der pH-Wert fällt zunächst auf 9,0, bleibt dann konstant und wird, falls erforderlich, durch vorsichtige Zugabe von kri'.tallinem Kaliumcarbonat auf 9,0 bis 9,5 gehalten. Das Seaktionsgemisch wird dann auf eine Sephadex-G--25(M)-Kolonne (1 χ 15 cm) mit 0,01 m Phosphatpuffer, pH =7,5, aufgebracht; die zuerst eluierte gefärbte Bande, die von den anderen Banden vollständig getrennt ist, wird in 10 bis 15 Minuten gesammelt. Die Trennung wird zweimal wiederholt, um eine vollständige Entfernung des freien Farbstoffes zu gewährleisten. Wenn sich ein Niederschlag bildet, wird dieser durch Zentrifugieren vor der Trennung auf Sephadex entfernt. Die nachstehende Tabelle zeigt die Herstellung von Konjugaten mit verschieden starkem Markierungsgrad nach der vorstehend angegebenen Arbeitsweise:

Protein	Konzen	Farbstoff	F/P·)	Wieder
(% Anti·	tration	(TRITC)	(M/M)	gewonnene
morphin)	mg/03 ml	μg		Aktivität.
IgG (45)	7.1	15	0.9	86
IgG (45)	7.1	50	2.2	89
IgG (45)	7,1	150	4.4	75
IrG (45)	7,1	400	15-16	75
IgG (45)	7.1	750	20-23	70

·) F/P-Farbstoff/Protein

Beispiel 3

Mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) markierter
Morphin-Antikörper (FlgG(m))

(a) Konjugationsverfahren

Vier 1 ml-Fraktionen eines durch Affinitätschromatographie gereinigten Morphin-Antikörpers (3,06 mg Protein/ml) (vgl. Beispiel 2) in 0.01 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 wurden mit kristallinem Natriumcarbonat (Na2CC<3) auf 9,5 gebracht. Den vier Antikörperfraktionen wurden bei Raumtemperatur unter Rühren 10. 20, 30 bzw. 50 μΐ einer Acetonlösung von FITC (2 mg/300 μΐ) zugesetzt. Nach drei Stunden wurden die vier Reaktionsgemische vereinigt, dann in 8 gleiche Teile geteilt, wovon jeder durch eine Sephadex-G-25-Kolonne (1 χ 15 cm), die mit 0,01 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 ins Gleichgewicht gesetzt worden war, hindurchgeleitet wurde. Die Eluierung mit der gleichen Pufferlösung ergab als erstes gefärbtes Band das Konjugat. das frei von nicht umgesetztem Farbstoff war.

(b) Abtrennung des FITC-Konjugats auf einer
DEAE-Cellulose-Kolonne

(Vgl. M. Goldman, »Fluorescent Antibody Methods«. Academic Press ed, 1968, Seiten 104-107.) Das FlTC-Äntimofphtn-Konjijgät wurde auf eine DEAE-Ceüulosekolonne (1x3 cm), die mit 0,01 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 73 ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgebracht. Die Eluierung mit der gleichen Pufferlösung und mit zunehmender NaCI-Konzentration ergab Fraktionen mit zunehmendem Farbstoffgehalt. Der Farbstoffgehalt (F/P) der einzelnen Fraktionen wurde nach dem Wells-Nomogramm bestimmt (vgl. A. F. Wells, C. E. Miller und M. K. Nadel, Appl. Microbiol., 14, 271 (1966)). Die Antimorphinaktivität wurde wie üblich mit einer Morphin-Spinmarkierungssubstanz bestimmt. Es wurden folgende Fraktionen erhalten:

10	Protein mg	F/P. M/M
Fraktion Nr.	1,75	1.5
1	1,3	3.0
2	1,15	6,0
15 3	1.42	9,0
4

Beispiel 4

Reinigung des Antikörpers für menschliches

gamma-Globulin (IgG(hlgG)) und Konjugation mit

FITC (FIgG(MgG)) und TRITC (RIgG(MgG))

(a) Reinigung des Antikörpers für menschliches IgG
durch Affinitätschromatographie

2 g Sepharose-4B wurden mit 18 mg menschlichem gamma-Giobulin (MgG) gekuppelt, wie es im Handbuch des Herstellers (Pharmacia, Upsala) angegeben ist. Dann wurde Kaninchen-Antiserum (50 ml) zu hlgG (5 mg Antikörper/ml) (IgG(MgG)) von Antibodies Incorporated erhalten. Es wurde eine Säule (1x3 cm) des vorstehend beschriebenen Sepharose-hlgG-Konjugats mit 0,01 m Boratpuffer bei einem pH-Wert von 8,0 hergestellt. Das Antiserum wurde durch die Kolonne geleitet, worauf diese mit der gleicher. Pufferlösung gewaschen wurde, bis kein Protein mehr im Ausfluß nachgewiesen werden konnte. Die Kolonne wurde dann noch-

4C mais mit 0.1 m Glycin-HCl-Puffer mit einem pH-We-t von 5,0 gewaschen. Der Antikörper wurde dann mit 0,1 m Glycin-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 2,5 eluiert. Es wurden Fraktionen von 3 ml gesammelt und sofort mit 0,5 m Boratpuffer (pH-Wert 9,0) neutralisiert.

Das Gesamtvolumen der so gesammelten Antikörperlösung betrug 30 ml. Die Antikörperlösung wurde über Nacht gegen 0,05 m Phosphatpuffer (pH-Wert = 8,0) dialysiert, dann mit »Aquacide« konzentriert und nochmals dialysiert. Das Endvolumen betrug 11 ml, und der Protein-Antikörper-Gehalt betrug 3,76 mg/ml (bestimmt aus dem Absorptionsspektrum bei 280 nm). Der Antikörper wurde zu 83% wiedergewonnen.

(b) Herstellung von FIgG(MgG)

(i) Die vorstehend angegebene Antikörperlösung (1 ml) in 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 wurde mit kristallinem Na₂CO₃ auf einen pH-Wert von 93 gebracht. Dann wurden 100 μg FITC in 10 μΐ Aceton bei Raumtemperatur zugesetzt, und das Gemisch wurde 3 Stunden gerührt Das Konjugat wurde dann auf Sephadex-G-25 (M) (1 χ 10 cm), das mit 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war, getrennt Das Konjugat wurde in einem Volumen von 1,5 m! gesammelt Es hatte ein Farbstoff/Protein-Verhältnis F/P von 43 (Mol/Mol); die Menge betrug 2,05 mg/ml (bestimmt nach dem Wells- N omogramm).

(c) Herstellung von RlgG(hlgG)

(1) Die vorstehend beschriebene Antikörperlösung (1 ml) in 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 wurde mit kristallinem NajCOj auf einen pH-Wert von 9,5 gebracht. Dann wurde 0,5 mg TRITC in Aceton (20—30 μΙ) bei Raumtemperatur zugesetzt, und das Gemisch wurde 3 Stunden gerührt. Es bildete sich ein Niederschlag, der abzentrifugiert und verworfen wurde. Das Konjugat wurde dann zweimal auf einer Sephadex-G-25-Kolonne (1 χ 10 cm), die mit 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8.0 ins Gleichgewicht gebracht worden war, getrennt. Das Produkt wurde in einem Volumen von 2 ml gesammelt und hatte ein Farbstoff/Protein-Verhältnis von 10; seine Menge betrug 0,7 mg/ml (bestimmt aus dem Absorptionsspektrum bei 280 und 516 nm).

(2) Die mit DEAE-Cellulose abgetrennte IgG-Frakiiuri (27,6 uig/mi) von Kaüiiiciieti-Aiiüseruiii zu riigG (6,4 mg Antikörper/ml) wurde von Antibodies Inc. erhalten. Die obige Proteinlösung (0,5 ml) wurde mit kristallinem Na2CC>3 auf einen pH-Wert von 9,5 gebracht, worauf 3 mg TRITC in 50 μΐ Aceton und 0,5 ml H2O unter Rühren in der Kälte (4°) zugesetzt wurden. Nach 3 Stunden bildete sich ein Niederschlag, der abfiltriert wurde. Die erhaltene violette Lösung wurde nacheinander zweimal auf einer Sephadex-G-25(M)-Kolonne (2 χ 30 cm), die mit 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war, getrennt. Das erhaltene Konjugat enthielt 0,1 mg Antikörper/ml und hatte ein Farbstoff/Protein-Verhältnis von 12—15 (Mol/Mol) (aus dem Absorptionsspektrum errechnet).

Beispiel 5

Kon'u^ffetion von menschlichen!
gamma-Globulin (hlgG) an Fluorescein (FhIgG)

Ein mg HIgG (menschliches IgG), gelöst in 0,4 ml 0,1 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5, wurde mit kristallinem NajCOj ^jf einen pH-Wert von 9.5 gebracht. 10 μΙ einer Lösung von FITC (70 μg) in Aceton wurden unter Rühren zugesetzt und 3 Stunden bei Raumtemperatur vermischt. Die erhaltene Lösung wurde zweimal auf einer Sephadex-G-25(M)-Kolonne (Ix 15 cm), die mit 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war, getrennt. Die eluierte FITC-hlgG-Konjugat-Lösung hatte eine Konzentration von 0,58 mg/ml und ein Farbstoff/Protein-Verhältnis von 5,5 (Mol/Mol) (nach dem Wells-Nomogramm bestimmt).

Beispiel 6

Morphin, an Rinderserumalbumin
konjugiert (RSA-44m)

3,43 g O³-Carboxymethylmorphin und 131 ml Chlorameisensäureisobutylester wurden in 30 ml DMF bei 0° miteinander kombiniert Die erhaltene klare Lösung wurde dann einer gerührten Lösung von 2.88 g RSA und 13 g NaHCO₃ in 600 ml Wasser bei 0° zugesetzt Der Zusatz erfolgte mit Hilfe einer Injektionsspritze, deren Nadel unter die Oberfläche der Lösung gehalten wurde. Die Lösung wurde in einem kalten Raum über Nacht gerührt

Nach dem Hindurchleiten der Lösung durch eine große Sephadex-Kolome wurde der Ausfluß mit Dow HFD/1 über Nacht auf 60 ml konzentriert und lyophilisiert, wobei eine Ausbeute von 3,1 g erhalten wurde. Durch UV-Analyse des Produktes konnte nachgewiesen werden, daß es durchschnittlich etwa 44 Morphingruppen enthielt.

Um die Wirksamkeit der auf der Fluoreszenzlöschung beruhenden Tests als Verfahren zur Bestimmung eines Liganden zu zeigen, wurden eine Anzahl von verschiedenen Tests unter Anwendung verschiedener Arbeitsweisen durchgeführt.

Der erste Test ist eine Analyse auf Morphin und Codein, wobei das Fluorescein-lsothiocyanat-Konjugat zu O^J-Aminoäthylmorphin (FLUMO'S') verwendet wurde.

Zuerst wurde eine Anzahl von Antikörper-Konjugaten mit unterschiedlichem Markierungsgrad bezüglich Rhodamin mit FLUMO'S' kombiniert, um die maximale Löschung festzustellen. Das FLUMO'S' lag in einer Koii/eriiraiioii von ■ ,S3 χ ΊΟ - Mol 111 0,05 in Büiäipuifer mit einem pH-Wert von 8,0 vor. Die relative Fluoreszenzintensität bei F_mit = 5\b — 518 nm wurde durch Abfahren des Spektrums von 490 bis 530 nm aufgezeichnet; die Anregungslinie lag bei 462—464 nm. und die Spalte wurden mit einem Empfindlichkeitsknopf eingestellt, um den Peak auf der Skala eines Perkin-F.lrner-Model-MPF-2A-Fluoreszenz-Spektrophotometers zu halten. Die Spektrophotometerzelle mit einer Weglänge von 1 cm und einem Volumen von 3 ml wurde in eine Doppelspiegelanordnung eingebaut. Der konjugierte Antikörper wurde mit FLUMO'S' bei Raumtemperatur in Pyrex-Gläsern 30 bis 40 Minuten inkubiert, bevor die Fluoreszenz gemessen wurde.

Das Farbstoff/Protein-Verhältnis (Mol/Mol) für die Konjugate betrug 0.9. 22. 4.4. 15-16 und 20-22. Die Ergebnisse für die relative Wirksamkeit (die Hälfte der maximalen Löschung in %. geteilt durch die entsprechende Anzahl von RindiingssieUen-Änuivalenten) waren 6.16.4,24.51,4 bzw. 31.5.°

Bei der Durchführung des Testes wurden folgende

•to Reagentien verwendet: FLUMO'S': 1.38χ 10~⁷ Mol; RlgG(m) F/P = 30. 4.58xlO-^; Mol: Bc atpuffer 0.05 m pH =8.0; Standard-Morphinlösungen (1.5 χ i0-^J— 1.5 χ 10-^; Mol). Die Inkubation erfolgte in Glasröhrchen.

Arbeitsweise: gleiche Mengen an RlgG(m) (40 ul) wurden mit 0.05 m Boratpuffer. pH =8,0 (2940-2990 μΐ) verdünnt und bei Raumtemperatur mit zunehmenden Mengen Morphin (5— 10 μΙ der Standard-Morphinlösungen) eine Stunde inkubiert. Dann wurden 10 μΐ FLUMO'S' zugesetzt, und das Gemisch wurde eine weitere Stunde inkubiert. Das Endvolumen in jedem Röhrchen betrug 3 ml. Die Endkonzentration an FLUMO'S' betrug 4,6 χ 10"^l0 Mol und die von RIgG(m) 6,1 χ 10~⁹ Mol, bezogen auf Bindungsstellen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle als Zunahme der Fluoreszenzintensität in %, bezogen auf die mögliche maximale Fluoreszenz angegeben (FLUMO'S' ohne löschenden Antikörper).

Tabelle I

Morphin
(Molarität)

Signalintensität

% von

0	27	33,33
2,5x10-9	28	34,5
5x10-9	29,5	36,4
2,5 XlO-⁸	35	43,2
5x10-8	38	46.9
2,5 χ 10-⁷	54	66,6
5x 10-⁷	60	74
2,5 xlO-⁶	74	913
5x ΙΟ"⁶	78	96,3

Die Untersuchung wurde mit Codein anstelle von Morphin wiederholt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Tabelle Ii

Codein
(Molarität)

Signalintensitäi

% von F_mlx

0	27	32,9
2.5x10-9	30,5	37.2
5x 10-"	36	43,9
2.5 xlO-⁸	51	62,2
5xl0-⁸	58	70,7
5x10-'	75	91,5
2,5 xlO-⁶	80	97,5

Der Versuch wurde wiederholt, wobei statt des mit Rhodamin markierten Morphin-Antikörpers (RlgG(m)) mit einem Farbstoff/Protein-Verhältnis von 30 (Mol/ Mol), RlgG(m) mit einem Farbstoff/Protein-Verhältnis von 22 verwendet wurde. Die nachstehenden Ergebnisse wurden unter Verwendung von Morphin erhalten.

Tabelle III

Morphin
(Molarität)

2,5 xlO-¹⁰

5x10-'°

2.5x10-9

5x10-9

IxIO-⁸

die interessierende Epitopstelle gebunden, sondern jeder Chromophor wird durch den Antikörper gebunden. Es liegt also eine unregelmäßige Bindung des Antikörpers an Morphin am Polyliganden vor. Bei den interessicrenden Konzentrationen wurde in einer hier nicht erwähnten Untersuchung gefunden, daß eine optimale Löschung erhalten wurde, wenn das Verhältnis zwischen Löschsubstanz (als Rezeptor-Löschsubstanz) zur fluoreszierenden Substanz (als Rezeptor-fluoresziei „·,'-

ίο de Substanz) etwa 5 :1 betrug.

Beim ersten Test, bei dem das Poly-(Ligandanalcge) bestimmt wurde, wurde eine Reihe von Teströhrchen vorbereitet, von denen jedes 6,4 χ 10-⁹ Mol (bezogen auf Bindungsstellen) Antimorphin mit einem Farbstoff/ Protein-Verhältnis (Fluorescein/Antikörper) von 9 sowie 3,47 χ 10"^a Mol (bezogen auf Bindungssteller.) Antimorphin mit einem Farbstoff/Protein-Verhältnis (Rhodamin/Antikörper) von etwa 22 enthielt; diese lagen in oinam Λ Οξ γτ> PK/mt r»Vii ι r\i if for mit ainpm nH-Wprt νΛη

1.11IbIIl Vf,Vtf III 1 1IUJLrIIUILfUMVI 1,11* k.ii.M... ** a a . . ν 1 . >w>.

8.0 vor, der auch 1,2 χ 10~⁶ Mol Rinder-gamma-Globulin enthielt. Es wurden wechselnde Mengen des mit Morphin konjugierten Rinderserumalbumins (etwa 44 Morphineinheiten je Albumin) (0,012—1,2 μg) jedem der Röhrchen in Mengen von 5— 10 μΙ zugesetzt, so daß das Endvolumen 0.5 ml betrug; dann wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Die Fluoreszenz wurde in jedem Röhrchen gemessen und als prozentualer Anteil der maximal möglichen Fluoreszenz (wenn kein mit Morphin konjugiertes RSA vorhanden ist) ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Tabelle IV

35 44m-RSA
μg (zugesetzt)

% von

Signalintensiiät	ro von F_mj>
24.5	29.9
26.0	31,7
26.5	323
28.0	34,1
29.0	35,4
33.5	40,8
40.0	48,8
45.5	55,5
53,0	64,6
63,0	76,8
68,0	82,9
72.5	88,4
80,0	97,5
82,0	100

45

50

55

0,012

0,024

0,048

0,084

0,12

0,24

0.48

UO

100
84,5
72
64,5
61
66
74
83
92

5xlO-⁸

IxIO-⁷

2,5x10-'

5xlO-⁷

1x10-6

2,5xlO-⁶

5 xlO-⁶

Bei der nächsten Untersuchung wurde ein Polyligand, nämlich Morphin, konjugiert an Rinderserumalbumin, verwendet, wobei durchschnittlich 44 Morphineinheiten je Albumin vorlagen. Bei einem ersten Test wurde der Polyligand als synthetisches Protein verwendet, wobei der Polyligand mehrere Morphin-Epitopstellen hatte. In einer zweiten Testreihe wurde der Poyligand zur Bestimmung von Morphin oder Codein verwendet. In beiden Analysen ist keiner der Chromophore kovalent an Für die Analyse von Codein wurde die nachstehend angegebene Arbeitsweise angewendet. Es wurden das gleiche Antimorphin-Fluorescein (FlgG(m)) und Antimorphin-Rhodamin (RIgG(m)) wie oben angewendet, wobei 30 μΐ des FIgG(m)(2,64 χ 10-' Mol) und 30 μΐ des RlgG(m) (1,44 χ 10"⁶ Mol) in einer Reihe von Teströhrchen mit 0,05 m Phosphatpuffer, pH = 8,0, der 1,5 χ ΙΟ-⁶ MoI Rinder-gamma-Globulin (390—430 μ!) enthielt, verdünnt. Dann wird Codein in zunehmenden Konzentrationen (l,5xl0-³— 1,5 χ 10-⁶ Mol) zugesetzt (10—40 μΐ), und das Gemisch wird 0,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Jedem der Röhrchen werden dann 10 μΐ (0,24 μg) des zuvor verwendeten Morphin-Rinderserum-Alburnin-Konjugats zugesetzt, und die Röhrchen werden nochmals 1 Stunde inkubiert. Das Endvolumen in jedem Röhrchen betrug 03 ml. Dann wurde die Fluoreszenz jedes Röhrchens bei 518 nm aufgezeichnet und als prozentualer Anteil der maximal möglichen Fluoreszenz (wenn kein Morphin-RSA-Konjugat vorhanden ist) ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Tabelle V

Codein (Mol)

% von F_n,

0	49
3x!0-⁹	51
6xlO-⁹	54
UxIO-⁸	56,5
3xlO-⁸	62
6xlO-⁸	705
UxIO-⁷	81
3 xlO-⁷	905
6xlO-⁷	945
UxIO-⁶	100
3xlO-⁶	100

wurde eine Reihe von Testrohrchen vorbereitet, von denen jedes 400 μΐ der angegebenen Pufferlösung enthielt. Jedem Röhrchen wurden 30 μΐ FlgG(higG) in einer Konzentration von 2,7 μ£/ιη1 sowie 30 μΐ RlgG(hlgG) in einer Konzentration von 35 μg/ml zugesetzt Der Inhalt der Röhrchen wurde vermischt und mit zunehmenden Mengen aa menschlichem gamma-Globulin versetzt (Lösungsvolumina 40 μΐ) und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fluoreszenz in den

ίο Röhrchen wurde dann bestimmt und als prozentualer Anteil der Gesamtfluoreszenz in Abwesenheit von menschlichem gamma-Globulin ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

15

Die beiden nächsten Untersuchungen beziehen sich auf ein natürliches Protein, nämlich menschliches gamma-Globulin. Bei der ersten Untersuchung wurde menschliches gamma-Globulin-Fluorescein (FhIgG) mit einem FarbsAoff/Protein-Verhältnis von 55 zur Bestimmung des menschlichen gamma-Globulins verwendet. Es wurde eine Reihe von Testrohrchen vorbereitet, von denen jedes 100 μΐ oder 0,017 mg/ml Anti-(menschliches gamma-G!obulin)-Rhodamin-Konjugat (RIgG(IiIgG) mit einem Farbstoff/Protein-Verhältnis von 12—15 in 0,05 m Phosphatpuffer, pH = 8,0 (330-380 μΐ) enthielt; es waren auch 0,6 mg/ml RSA vorhanden. Es wurden dann immer größere Mengen an aienschlichem gamma-Globulin (15—35 μΐ) zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Lösung wurden dann 30 μΐ FhIgG in einer Konzentration von 0.014 mg/ml zugesetzt. Das Endvolumen in jedem Fall betrug 05 ml. Die Endkonzentration an FhIgG war 5,4x10-' Mol, während die Konzentration an menschlichem gamma-Globulin zwischen 4,84 χ 10-'" und 6,45 χ Iö"⁵ Moi iag. Nach einer zweiten Inkubationsperiode von 30 Minuten wurde die Fluoreszenz der Röhrchen bei 522 nm als prozentualer Anteil der maximal möglichen Fluoreszenz aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der nächste- henden Tabelle angegeben.

Tabelle VI	% von F_m„
HIgG(MoI)	28
0	33
4,84 χ 10-^l0	36
8,06 XlO-¹⁰	38
l,13xlO-⁹	46
1.61x10-'	68
3,22x10-'	81
4,84x10-'	91
8,06x10-'	93
l,13xlO-⁸	955
1,61 xlO-⁸	96
3,22 xlO-⁸	98
6,45 xlO-⁸

50

55

Als nächstes wurde menschliches gamma-Globulin unter Verwendung des Anti-(menschliches gamma-Globulin)-Fluorescein-Konjugats (FlgG(hlgG)) und des Anti-(menschliches gamma-Globulin)-Rhodamin-Konjugats (RIgG(MgG)) bestimmt. Das Fluoresceinkonjugat hat ein Farbstoff/Protein-Verhältnis von 43. das Rhodamin-Konjugat ein solches von 10. Alle Reagentien wurden mit 0,05 m Phosphatpuffer, pH—8,0, der 0,6 mg/ml Rinderserumalbumin enthielt, verdünnt. Es

Tabelle VII

menschliches IgG (Mol)

% von F_m

3x10-"	100
6x10-"	95,7
UxIO-¹⁰	93,2
1,8x10-'°	895
2,4 xlO-¹⁰	865
3x10-'°	82,2
6x10-'°	705
Uxio-»	60,7
1,8x10-'	62
2,4xlO-⁹	68,1
3x10-9	693
6x10-9	79
UxIO-⁸	87,7
1.8x10-«	883
2,4 xlO-⁸	93.8

Aus der Tabelle VlI ergibt sich, daß bei zunehmender Konzentration an menschlichem gamma-Globulin die Fluoreszenz auf ein Minimum abfällt und dann wieder zunimmt. Deshalb ist es bei einer unbekannten Substanz notwendig, zwei Verdünnungen durchzuführen, um festzustellen, um welchen Teil der Kurve es sich handelt.

Die vorstehend angegebenen Ergebnisse zeigen die extreme Empfindlichkeit und den weiten Anwendungsbereich des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens Wendet man die Erscheinung der Fluoreszenzlöschung an, so kann man eine große Vielzahl von verschiedener Verbindungen, sowohl von Haptenen als auch von Anti· genen, direkt bestimmen. Es können Reagentien verwendet werden, bei denen das Hapten oder Antiger kovalent mit dem Chromophor verbunden ist. Andererseits, wenn die interessierende Verbindung eine Vielzah von Epitopstellen enthält, können Gemische «on Antikörpern verwendet werden, wobei ein Teil der Antikörper mit dem fluoreszenzlöschenden Molekül und eir Teil der Antikörper mit dem fluoreszierenden Molekü verbunden ist. In diesem FaI! sind zur Herstellung dei Reagentien Derivate des Liganden nicht erforderlich d. h., wenn ein natürlich vorkommender Rezeptor zui Verfügung steht oder der Ligand ein Antigen ist.

Weiterhin können Reagentien mit einer Vielzahl vor Hapten- oder Antigen-Molekiilen.die an ein Kernmole kül gebunden sind, hergestellt werden. Das Kernmole kül kann entweder an einen Chromophor und einer Antikörper, der mit dem anderen Glied des aus fluores zierender Substanz und löschender Substanz bestehen den Paar konjugiert ist, oder mit dem Antikörperge misch verbunden sein, wie vorstehend angedeutet wur

de. Die Analyse ist verhältnismäßig schnell, und je nach
den Konzentrationen sind verschiedene Inkubationszeiten erforderlich. Weiterhin können die üblichen Fluorometer verwendet werden, die verhältnismäßig billig und
leicht ablesbar sind. 5

20

25

30

35

40

45

50

55

bO

65

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Liganden in einer Analysenlösung, bei dem

(A) der Ligand in einem wäßrigen gepufferten Medium mit einem Rezeptor, der in der Lage ist, sich spezifisch und nicht-kovalent mit dem Liganden zu verbinden, und gegebenenfalls mit einem Ligandenanalogen, das in der Lage ist, mit dem Liganden um die Bindungsstellen des Rezeptors in Wettbewerb zu treten, umgesetzt wird, wobei entweder der Rezeptor oder das Ligandenanaloge mit einem fluoreszierenden Chromophor (Chi) kovalent verbunden ist oder ein mit einem fluoreszierenden Chromophor (Chi) kovalent verbundener spezifischer Bindungspartner für den Rezeptor verwendet wird;

(B) die Anaiysenlösung eine ausreichende Zeit inkubiert wird, damit mindestens ein Teil des Rezeptors sch mit mindestens einem Teil des vorhandenen Liganden kombinieren kann,

(C) die inkubierte Anaiysenlösung mit Licht von einer Wellenlänge bestrahlt wird, die eine Fluoreszenz des Chromophors bewirkt; und

dadurch gekennzeichnet, daß einer der als Reagentien zur Lösung des Liganden hinzugefügten Reaktionspartner oder ein Teil desselben mit einem flüöreszciizlöschcridcii Chromophor (Chj) kovaient verbunden ist, so daß der aus dem Liganden bzw. Ligandenanalogen, dem Rezeptor und gegebenenfalls dem Bindungspartner für den Rezeptor während der Inkubation gebildete Komplex sowohl einen fluoreszierenden als auch einen fluoreszenzlöschenden Chromophor enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der mit Chi verbundene und der mit Cli2 verbundene Rezeptor der gleiche ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kombination eines Rezeptors einer ersten Art und eines spezifischen Bindungspartners für den Rezeptor, verbunden mit Chi, und eine Kombination eines Rezeptors einer zweiten Art und eines spezifischen Bindungspartners für den Rezeptor der zweiten Art, verbunden mit Cli2, verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Molekulargewicht von etwa 110 bis 2000 aufweist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3. dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand eine PoIy-(Aminosäure) mit einer Vielzahl von Epitopstellen und mit einem Molekulargewicht von mindestens eo etwa 10 000 ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Molekulargewicht von mehr als etwa 2000 hat und eine Vielzahl von Epitopstellen aufweist und daß der erste und der zweite, mit Chi bzw. Cli2 verbundene Rezeptor die Quellen für Chi und Chj darstellen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Serumprotein, insbesondere ein Globulin, ein Albumin, ein Lipoprotein, ein Glykoprotein, einen Komplementfaktor oder einen Blutverklumpungsf aktor ist

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand mindestens ein Teil eines Mikroorganismus, insbesondere ein Teil der Mikroorganismusmembran, oder ein Virus ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Komplex aus einem Antigen und einem Antikörper für dieses Antigen ist

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Rezeptoren Antikörper darstellen, daß das wäßrige Medium etwa 0 bis 20 Volumprozent eines inerten polaren organischen Lösungsmittels enthält, daß das vorige Medium im pH-Bereich von etwa 5 bis 10 gepuffert ist, daß die zugesetzte Menge des Rezeptors ausreicht, um eine Löschung von etwa 20 bis 80% zu erzielen und daß die Änaiyseniosung bei einer Temperatur im Bereich von etwa 0 bis 45° C inkubiert wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Chi an einen Rezeptor (unter Bildung von Rezeptor-Chi) und Ch2 an einen Rezeptor (unter Bildung von Rezeptor-Chj) oder an ein Ligandenanaloges bindet, wobei entweder ein einzelnes Ligandenanaloges kovalent an einen oder mehrere Chromophore gebunden wird (unter Bildung von (Ligandenanalog-(Ch2)i, worin χ durchschnittlich mindestens 1 beträgt) oder eine Vielzahl von Ligandenanalogen und Chromophoren kovalent an ein polyfunktionaltsiertes Kernmolekül gebunden werden (unter Bildung von Poly- (Ligandenanalog)-Poly-(Ch2); und daß man die unbekannte Substanz mit dem Rezeptor-Chf und (a) dem Lägandenanalog-(Ch2)j oder (b) dem Poly-(Ligandenanatog)-Poly-(Cli2) oder (c) einem PoIy-(Ligandenanalog), umfassend mehrere Ligandenanaloge, die kovalent an ein polyfunktionalisiertes Kernmolekül gebunden sind, und dem Rezeptcr-Ch^ oder (d) (wenn der Ligand mehrere Epitopsteilen aufweist) mit dem Rezeptor-Ch2 kombiniert.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem Liganden, der eine Epitopstelle hat. Chi an den Rezeptor für den Liganden gebunden ist (unter Bildung von Rezeptor-Ch 1), während Ch2 kovalent an das Ligandenanaloge gebunden ist (unter Bildeng von Ligandenanalog-Ch₂); und daß man

(A) in eine'n wäßrigen gepufferten Medium bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 10 zur Herstellung der Analysenlösung miteinander kombiniert:

(1) die unbekannte Substanz;

(2) den Rezeptor-Chi;

(3) den Ligandanalog-Ch2;

wobei die Konzentrationen an Rezeptor-Chi und Ligandenanalog-Chi so gewählt sind, daß eine 20- bis 80%ige Löschung der Fluoreszenz in Abwesenheit des Liganden eintritt:

(B) die Analysenlösung bei einer Temperatur von etwa 0 bis 45'C eine ausreichende Zeit inkubiert, damit mindestens ein Teil des vorhandenen Rezeptors mit mindestens einem Teil eines vorhandenen Liganden kombinieren kann;