DE2600383C3

DE2600383C3 - Analyseverfahren und -vorrichtung zur Bestimmung wenigstens einer primären und einer sekundären Aminosäure in einem Flüssigkeitsprobenstrom

Info

Publication number: DE2600383C3
Application number: DE2600383A
Authority: DE
Inventors: Peter Edgar Takoma Park Hare, Md. (V.St.A.)
Original assignee: Durrum Instrument Corp Palo Alto Calif (vsta)
Current assignee: Durrum Instrument Corp Palo Alto Calif (vsta)
Priority date: 1975-06-25
Filing date: 1976-01-07
Publication date: 1979-07-19
Also published as: US3933430A; DE2600383B2; GB1512228A; JPS524894A; DE2600383A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Analyseverfahren nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 7.
Primäre und sekundäre Aminosäuren, die aus einer einzigen chromatografischen Trennsäule ausgewaschen werden, lassen sich mit Hilfe von Fluoreszenz quantitativ ermitteln. Eine entsprechende Anordnung ist in einem Aufsatz von Felix und Terkelsenmit dem Titel »Total Fluorometric Amino Acid Analysis using

ίο Fluorescamine« (»Fiuorometrische Aminosäuren-Gesamtanalyse unter Verwendung von Fluorescamin«) in Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 15, Nr. 1, Juli 1973, beschrieben. Die gleiche Anordnung ist auch in einem weiteren Aufsatz der gleichen Verfasser mit dem

)5 Titel »Determination of Hydoxyproline in Fluorometric Amino Acid Analysis with Fluorescamine« (»Bestimmung von Hydroxyprolin in der fluorometrischen Aminosäurenanalyse mit Fluorescamin«) in Analytical Biochemistry, Vol.56, Nr.2, Dezember 1973, Seite 610,

4(i beschrieben. Bei den durch die Verfasser beschriebenen Versuchen wurden Standardaminosäurengemische vermittels Stp.ndardpufferlösungen aus chromatografischen Trennsäulen ausgewaschen. Das Fluorescamin wurde der Lösung zugesetzt, bevor diese einem Fluoreszenz-

■r> messer zugeführt wurde. Wenn der Probenstrom eine sekundäre Aminosäure enthält, wird ein Oxidationsmittel, nämlich N-Chlorosuccinimid (abgekürzt: NCS) vor Reaktion mit dem Fluorescamin zugeseizt. Durch dieses Oxidationsmittel wird die sekundäre Aminosäure

)» umgewandelt, so daß sie nach Reaktion mit dem Fluorescamin vermittels des Fluoreszenzmessers anzeig- und meßbar ist.

Die sekundären Aminosäuren wie z. B. Prolin und 4-Hydroxy-Prolin in dem nacheinander eluierten Pro-

">"> benstrom müssen in eine andere Form umgewandelt werden, um durch Reaktion mit herkömmlichen Fluoreszenzmitteln wie z. B. Fluorescamin oder O-Phthalaldehyd, anzeig- und meßbar gemacht zu werden. Eine Umwandlungstechnik besteht darin, diese mit einem

«> Oxidationsmittel, nämlich N-Chlorosuccinimid zur Reaktion zu bringen, wie in den vorgenannten beiden Aufsätzen dargestellt ist. Das Oxidationsmittel wirkt sich jedoch bekanntlich nachteilig auf die quantitative Anzeige der primären Aminosäuren im Probenstrom

i' > aus. Aus diesem Grunde wird das Oxidationsmittel dem Probenstrom erst dann zugesetzt, wenn dieser die sekundäre Aminosäure führt, wobei das Oxidationsmittel in diesem Zeitpunkt »impulsartig« in den Proben-

strom eingespritzt wird.

Ein Nachteil dieses Vorgehens ist darin zu sehen, daß die impulsartige Oxidationsmittelabgabe zu einer plötzlichen Durchsatzsteigerung durch d?n Fluoreszenzmesser führt Dadurch wird nämlich wiederum eine erhebliche Basislinienverlagerung in den aufgezeichneten Chromatogrammen hervorgerufer·, wie im einzelnen aus den vorgenannten Aufsätzen ersichtlich ist Zum Ausgleich dieser Basislinienverlagerungen sind komplizierte elektronische Schaltungen erforderlich. Die Basislinienverlagerungen selbst führen zu einer Verfälschung des Analyseergebnisses, indem auch die Impulsdauer bei der Eichung nicht einwandfrei berücksichtigt werden kann. Das gleiche Problem ergibt sich bei anderen fluor ometrischen Meßvorrichtungen, bei denen ein Oxidationsmittel während des Vorhandenseins nur einer sekundären Aminosäure impulsartig eingeführt wird.

Es ist bereits bekannt, am Detektor eine chromatografischen Trenneinrichtung, mit der die Trennung von Gasmischungen, insbesondere Kohlenwasserstoffmischungen, bezweckt wird, einen konstanten Durchsatz aufrechtzuerhalten, indem der schwankende Ausgangsgasstrom aus einer Trennsäule in der Ausgangsleitung durch die Zugabe einer Hilfsgasströmung über ein Ventil, eine Hilfssäule sowie Hilfsleitungen zu einer konstanten Gasströmung in der zu einem Detektor führenden Leitung ergänzt wird. Das Problem der Basislinienverlagerungen, das bei einer Bestimmung wenigstens einer primären und einer sekundären Aminosäure auftritt, bei der nur während des Vorhandenseins der sekundären Aminosäure ein flüssiges Oxidationsmittel zugesetzt wird, besteht bei dieser bekannten Einrichtung nicht

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Analyse verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Gattung zu schaffen, bei denen das Auftreten von Basislinienverlagerungen vermieden ist.

Ein diese Aufgabe lösendes Verfahren besteht erfindungsgemäß aus den in dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1 angegebenen Maßnahmen.

Möglichkeiten zur vorteilhaften weiteren Ausgestaltung dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 6 angegeben.

Eine die Erfindungsaufgabe lösende Vorrichtung weist erfindungsgemäß die in dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 7 genannten Merkmale auf.

Eine solche Vorrichtung läßt sich durch das in dem Patentanspruch 8 gekennzeichnete Merkmal vorteilhaft weiter ausgestalten.

Das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung ermöglichen die Vermeidung von Basislinienverlagerungen in der Fluoreszenzanzeige in einer bestimmten Reihenfolge auftretender primärer und sekundärer Aminosäuren, bei denen nur sie sekundäre Aminosäure mit einem Oxidationsmittel versetzt wird, um sie durch Reaktion mit dem Fluoreszenzmittel anzeigbar zu machen.

Da der Probenstrom den Detektoi in einem gleichmäßigen Durchsatz durchsetzt, werden Basislinienverlagerungen vermieden. Auf der Abstromseite der vorbestimmten Stelle wird ein Detektorreagenz zugesetzt, das an dieser Stelle quantitativ mit primärer und sekundärer Aminosäure reagiert und diese anzeigbar macht. Zum Zwecke der Fluoreszenzmessung ist eine Quelle für ein fluoreszenzerregendes Mittel auf der Abstromseite des Schaltventils mit der Probenleitung verbunden.

Das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung werden im nachfolgenden der Einfachheit halber anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels erläutert

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Vorrichtung und

F i g. 2 zeigt zwei vermittels einer derartigen Vorrichtung erhaltene Chromatogramme von primären und ι υ sekundären Aminosäuren aus einer einzigen, fortlaufend ausgewaschenen Probe, wobei die Chromatogramme keine Basislinienverlagerung zeigen.

Wie bereits oben ausgeführt erscheinen primäre und

sekundäre Aminosäure in bekannter Reihenfolge in dem

is Flüssigprobenstrom, wobei die Anzeigbarkeit der primären Aminosäure durch Reaktion mit einem

Oxidationsmittel herabgesetzt und die Anzeigbarkeit

der sekundären Aminosäure durch Reaktion mit dem gleichen Reagenz verbessert ist Zur Anzeige wird eine fluorometrische Messung ausgeführt

Ein übliches Gemisch von primären und sekundären Aminosäuren mit Standardpufferlösungen wird unter konstantem Druck einer chromatografischen Trennsäule U zugeführt so daß sich ein vorbestimmter : "ι Durchsatz durch die Trennsäule ergibt Die Aminosäuren werden in einer bestimmten Reihenfolge aus der Säule eluiert und bilden einen Probenstrom, der in einem konstanten Durchsatz die zu einem herkömmlichen Fluorometer 13 führende Probenleitung 12 so durchsetzt Das Fluorometer 13 ist mit einem Aufzeichnungsgerät 14 gekoppelt In der Probenleitung befinden sich Verzögerungsglieder in der Form von Verzögerungsschlangen 16 und 18, vermittels welcher eine ausreichend hohe Verweilzeit vorgegeben wird. Eine r. Quelle 19 eines unter Druck stehenden Umsetzreagenz für die sekundäre Aminosäure und eine Quelle 20 eines unter Druck stehenden inerten, flüssigen Verdünnungsmittels, wie z. B. Wasser, sind an ein gemeinsames Schaltventil 21 angeschlossen, das seinerseits an einer M) ausgewählten Stelle 22 mit der ProbenUitung 12 verbunden ist

Das Schaltventil 21 führt in einer ersten Stellung nur Flüssigkeit von der Quelle 19, und in einer zweiten Stellung nur Flüssigkeit von der Quelle 20 zu. Vermittels 4'. einer hier nicht dargestellten äußeren Stellvorrichtung, die entweder von Hand oder auch selbsttätig betätigbar ist, kann abwechselnd Flüssigkeit von Quelle 19 oder Quelle 20 in die Probenleitung 12 zugeführt werden.

Die Umschaltung zwischen den beiden Quellen 19 in und 20 kann auch durch jede andere, äquivalent arbeitende Ventilvorrichtung, wie z. B. getrennte, synchron geschaltete Absperrventile mit zusammengeschalteter Auslaßseite, erfolgen.

Die Quellen 19 und 20 werden auf genau gleichem r> Überdruck gehalten, so daß durch das Schaltventil 21 stets der gleiche Flüssigkeitsdurchsatz abgegeben wird, unabhängig davon, ob Flüssigkeit von Quelle 19 oder Quelle 20 zugeführt wird Die Einstellung eines gleichen Überdrucks kann beispielsweise vermittels von einer <<<> gemeinsamen Quelle geliefertem Gas erfolgen. Andererseits läßt sich der Überdruck auch durch eine beiden Quellen gemeinsame Pumpe erzeugen.

Ein fluoreszenzerregendeF Reagenz wird durch einen Vie'weg-Schieber 17 in gleichförmigem Durchsatz in h> die Probenleitung 12 eingeführt. Zur Auirechterhaltung eines gleichförmigen Durchsatzes kann auch hier wie oben beschrieben ein geregelter, gleichförmiger Überdruck dienen. Wenn das fluoreszenzerregende Mittel

einen alkalischen pH-Wert zur Anzeige erforderlich macht, wie z. B. Fluorescamin, wird eine alkalische Pufferlösung über den Vierweg-Schieber 17 in gleichförmigem Durchsatz von einer Quelle 24 einer unter Druck stehenden Pufferlösung zugeführt.

Entsprechend dem vorgeschlagenen Analyseverfahren werden die in bekannter Reihenfolge in der Flüssigprobe enthaltenen primären und sekundären Aminosäuren kontinuierlich zur Anzeige gebracht, wobei Basislinienverlagerungen im aufgezeichneten Chromatogramm vermieden werden. Ein Gemisch aus primären und sekundären Aminosäuren wird in konstantem Durchsatz in bestimmter Reihenfolge aus der chrornatografischen Trennsäule 11 eluieri. Bei einem Standardaminosäurengemisch stellen die primären Aminosäuren die ersten vier eluierten Aminosäuren dar. Während des Durchgangs dieser Aminosäuren durch die Stelle 22 der Probenleitung 12 fließt inertes, flüssiges Verdünnungsmittel in konstantem Durchsatz durch das Schaltventil 21 in die Probenleitung 12 zu. Der konstante Zufluß wird dabei wie oben beschrieben vermittels eines konstanten Überdrucks aufrecht erhalten. Der Probenstrom wird dann am Vierweg-Schieber 17 vermittels einer von der Quelle 24 zugeführten Pufferlösung (wie z. B. Lithiumborat) auf einen alkalischen pH-Wert eingestellt, wenn ein solches für die Wirkung des fluoreszenzerregenden Mittels erforderlich ist Das letztere, wie z. B. Fluorescamin, wird durch den Vierweg-Schieber 17 kontinuierlich von der Quelle 23 aus in die Probenleitung 12 eingeführt. Die Verzögerungsschlange 18 führt zu einer ausreichend hohen Verweilzeit, während welcher die Reaktion zwischen den Aminosäuren und dem Fluorescamin erfolgen kann. Anschließend durchläuft der Probenstrom das Fluorometer 13, wobei das Meßergebnis vermittels des Aufzeichnungsgeräts 14 aufgezeichnet wird.

Unmittelbar vor dem Eintreten der ersten sekundären Aminosäure, typischerweise Prolin, in den Probenstrom wird das Schaltventil 2i betätigt und schaltet damit von dem Verdünnungsmittel aus Quelle 20 auf das Oxidationsmittel aus Quelle 19, um. Dabei tritt anstelle des flüssigen Verdünnungsmittelzusatzes der Zusatz an Oxidationsmittel.

Die Verzögerungsschlange 16 gibt eine ausreichend lange Verweilzeit vor, während welcher Prolin mit dem von der Quelle 19 gelieferten Oxidationsmittel oxidieren kann. Nach dem Durchgang der sekundären Aminosäure Prolin wird das Schaltventil 21 wiederum in sei/>» Anfangsstellung zurückgeschaltet, so daß die Zufuhr an Oxidationsmittel, wie z. B. N-Chlorosuccinimid, unterbrochen und die Zufuhr an inertem, flüssigem Verdünnungsmittel wieder aufgenommen wird. In jedem Falle wird der Meßbereich des Fluorometers 13 in einem gleichförmigen Durchsatz von Flüssigkeit durchsetzt, so daß sich demzufolge auch keine Basislinienverlagerung im aufgezeichneten Chromatogramm ergibt

Das erfindungsgemäße Analyseverfahren ist anwendbar auf Flüssigprobenströme jeder Art, die wenigstens zwei Substanzen enthalten, wobei die Anzeigbarkeit der ersten Substanz durch Reaktion mit einem Umsetzreagenz behindert, und die Anzeigbarkeit der zweiten Substanz durch Reaktion mit dem gleichen Umsetzreagenz verbessert ist Insbesondere ist das Verfahren anwendbar auf andere fluorometrische Meßanordnungen zur quantitativen Ermittlung von primären und sekundären Aminosäuren, auch wenn bei diesen andere fluoreszenzerregende Mittel, wie z. B. O-Phthalaldehyd und andere Oxidations- oder Umsetzmittel, verwendet werden. Bei einigen Anordnungen kann auf die Verwendung von Pufferlösung von der Quelle 24 verzichtet werden.

Das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung sind im nachfolgenden anhand eines praktischen Ausführungsbeispiels noch weiter veranschaulicht

Beispiel

Eine das in F i g. 2 dargestellte Standardeichgemisch von neun Aminosäuren enthaltende Probe wurde durch eine chromatografische Trennsäule Ii mit den Abmessungen 2 mm χ 30 cm durchgeleitet, die mit Kationenaustauscherharz gefüllt war. Die Elution des Probenstroms erfolgte mit einer Pufferlösung, die 0,2 η Natriumzitrat enthielt, einen pH-Wert 3,25 aufwies und unter Druck durch die Säule durchgeleitet wurde. Es stellte sich ein konstanter Probenstromdurchsatz von 6 ml/h ein. Zu diesem Zweck stand die Säule unter einem Luftdruck von 28 at, der von einer Druckluftquelle geliefert wurde. Wie in F i g. 2 dargestellt, bestanden die ersten vier aus der Säule eluierten Aminosäuren aus den primären Aminosäuren, nämlich Aspartinsäure, Threonin, Serin und Glutaminsäure. Das in der Quelle 20 unter einem Druck von 7 at stehende Verdünnungsmittel Wasser wird während dieser Eluieningsphase in einem Durchsatz von 6 ml/h durch das Schaltventil 21 in die Probenleitung 12 zugeführt Unmittelbar vor Ankunft der sekundären Aminosäure Prolin an der Stelle 22 wurde das Schaltventil 21 umgeschaltet, wodurch die Wasserzufuhr aus Quelle 20 gesperrt und statt dessen Oxidationsmittel von Quelle 19 zugeführt wurde, wobei es sich um eine Lösung 10~³ Mol N-Chlorosuccinimid in Wasser handelte. Dieser Umschaltzeitpunkt ist mit »START« in der Zeitachse (Abszizze) des Chromatogramms von Fig.2 bezeichnet Die Quelle 19 stand dabei unter dem gleichen Überdruck wie das Wasser, so daß sich der gleiche Durchsatz von 6 ml/h ergab. Die Verzögerungsschlange 16 hatte eine Länge von ca. 3 m, so daß sich angenähert eine Verweilzeit von 30 Sekunden ergab, die zur Oxidation der sekundären Aminosäuren ausreichte. Die Verzögerungsschlange 18 hatte eine Länge von etwa 9 m und lieferte die gleiche Verweilzeit für die Reaktion von Fluorescamin und Aminosäuren.

Das in der Quelle 23 unter einem Druck von 3,5 al stehende fluoreszenzerregende Mittel wurde in einem Durchsatz von 3 ml/h zugesetzt und bestand aus Fluorescamin in einer Konzentration von 30 mg aul 100 ml Azeton.

Nach Durchgang des Prolins wurde an dem in F i g. 2 mit »STOP« bezeichneten Zeitpunkt das Schaltventil 21 wiederum betätigt und die Zufuhr von NCS von dei Quelle 19 unterbrochen und gleichzeitig wiederum Wasser von der Quelle 20 im gleichen Durchsatz wie zuvor zugeführt Die übrigen, in der Reihenfolge eluierten Aminosäuren waren entsprechend Fig.2 Glyzin, Alanin, Zystin und Valin. Die beiden dargestellten Chromatogramme wurden gleichzeitig aufgezeichnet, wobei die obere Kurve mit den größerer Amplitudenausschlägen mit einer Empfindlichkeit vor 0—10 mV, und die untere Kurve mit einer Empfindlich keit von 0—100 mV für das angelegte Signal aufgenommen worden ist Beide Kurven wurden ausgehend vor ein und demselben Signal aufgezeichnet

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Analyseverfahren zur Bestimmung wenigstens einer primären und einer sekundären Aminosäure in bekannter Reihenfolge nacheinander in einem sich ständig mit im wesentlichen gleichförmiger Geschwindigkeit zu einer Detektorzone fortbewegenden Flüssigkeitsprobenstrom, wobei durch Reaktion mit einem Oxidationsmittel, das dem Probenstrom erst dann, wenn dieser die sekundäre Aminosäure führt, zugesetzt wird, die Anzeigbarkeit der primären Aminosäure herabgesetzt und die der sekundären Aminosäure gefördert wird, dadurch gekennzeichnet, daß dem in dem Strömungsweg (12) befindlichen Probenstrom ein inerter flüssiger Verdünnungsmittelstrom in einem vorbestimmten Durchsatz zugesetzt wird, solange der Probenstrom keine sekundären Aminosäuren enthält, und daß der Verdünnungsmittelstrom bei Auftreten der sekundären Aminosäuren an einer bestimmten Stelle (22) des Strömungswegs unterbrochen und gleichzeitig das flüssige Oxidationsmittel mit dem gleichen Durchsatz an der Stelle (22) wie der Verdünnungsmittelstrom zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem Probenstrom auf der Abstromsei-Ie der bestimmten Stelle (22) kontinuierlich ein quantitativ mit der primären und der sekundären Aminosäure in dem Probenstrom reagierendes, die Aminosäuren erkennbar machendes Detektorreagenz zugesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Detektorreagenz ein fluoreszenzerregendes Reagenz eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die primäre und sekundäre Aminosäure durch aufeinanderfolgende Elution aus einer chromatographischen Trennsäule (11) hintereinander in den Probenstrom eingeführt werden.

5. Verfahren nach Anspiiich 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zufuhr von inertem Verdünnungsmittelstrom und Oxidationsmittel durch ein Ventil oder miteinander gekoppelte, synchron schaltbare Ventile (21) gesteuert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zufuhr von Oxidationsmittel unterbrochen und die Zufuhr von inertem Verdünnungsmittel wiederaufgenommen wird, wenn der Probenstrom an der bestimmten Stelle (22) wiederum die primäre Aminosäure enthält.

7. Vorrichtung zur Bestimmung wenigstens einer primären und einer sekundären Aminosäure in bekannter Reihenfolge nacheinander in einem sich Händig mit im wesentlichen gleichförmiger Geschwindigkeit zu einer Detektorzone fortbewegenden Flüssigkeitsprobenstrom, mit einem Behälter mit Flüssigkeitsproben, der die in bekannter Folge abzugebende primäre und sekundäre Aminosäure enthält, einer unter vorbestimmtem Druck stehenden Quelle eines flüssigen Oxidationsmittels, das dazu dient, die Anzeigbarkeit der sekundären Aminosäure zu verbessern, einer Detektorvorrichtung und einer den Flüssigkeitsprobenbehälter mit dem Detektor verbindenden Probenleitung sowie einem Schaltventil zum abwechselnden Verbinden jeweils eines zweier Zuströmwege mit der Probenleitung, dadurch gekennzeichnet, daß der andere Zuströmweg des Schaltventils (21) an eine Quelle

(20) eines inerten flüssigen Verdünnungsmittels angeschlossen ist, die unter dem gleichen vorbestimmten Druck steht wie die Quelle (19) des flüssigen Oxidationsmittels, und daß der Abströmweg des Schaltventils (21) an einer Stelle (22) zwischen dem Behälter (11) und der Detektorvorrichtung (13) in die Probenleitung mündet, so daß dieser abwechselnd und synchron gesteuert flüssiges Verdünnungsmittel oder Oxidationsmittel zuführbar ist

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch eine auf der Abstromseite des Schaltventils

(21) an die Probenleitung (12) angeschlossene Quelle (23) für zur Detektoranzeige der primären und der sekundären Aminosäure dienendes Detektorreagenz.