DE2614865A1

DE2614865A1 - Serumalbuminpraeparate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2614865A1
Application number: DE19762614865
Authority: DE
Inventors: Rudolph Reckel
Original assignee: Ortho Diagnostic Systems Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1975-04-08
Filing date: 1976-04-06
Publication date: 1976-10-21
Also published as: JPS51123817A; FI55345C; AT357270B; US4046871A; ATA252976A; FR2307269B1; DK146576A; FI760934A; NO760914L; IL49358A; FI55345B; SE7602536L; GB1537871A; IL49358A0; FR2307269A1

Description

".Serumalbuminpräparate, Verfahren zu ihrer Herstellung und • ihre Verwendung"

Priorität: 8. April 1975, V.St.A., Nr. 566 641

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

In der Serologie ist es äußerst wichtig, Kenntnis über die Anwesenheit von bestimmten Antikörpern zu haben. Beispielsweise kann es bei Bluttransfusionen von entscheidender Bedeutung sein, über die Anwesenheit von bestimmten Antikörpern Bescheid zu wissen. Durch nicht entdeckte Antikörper können fatale Transfusionsreaktionen hervorgerufen werden. Ist beispielsweise die Antikörperkonzentration so gering, daß die Antikörper von den Zellen absorbiert werden und keine Agglutination hervorgerufen

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wird, so wird dies häufig fälschlicherweise als Verträglichkeit interpretiert, während in Wirklichkeit eine sensibilisierende Injektion stattgefunden hat. Bei einer zweiten Transfusion, die 1 Woche bis 10 Tage später verabfolgt wird, kann dann eine fatale Reaktion auftreten. Auch wenn die Reaktion nicht fatal verläuft, so kann sie die normale Lebensdauer der übertragenen, nicht verträglichen Zellen verkürzen und weitere Transfusionen notwendig machen. Derartige Probleme lassen sich vermeiden, wenn man über die Anwesenheit von allen oder der meisten Antikörper aufgrund eines noch empfindlicheren Mach-" weises für Antikörper Kenntnis hat.

Seit etwa 30 Jahren werden Serum- oder Plasmaalbumine in der Blutgruppenserologie als Hilfsmittel zum Nachweis von einigen Antikörpern im Blutserum herangezogen, die sich einem Nachweis entziehen, wenn das zu untersuchende Blutserum mit einer isotonischen lösung oder einer Kochsalzlösung von roten Blutkörperchen in Kontakt gebracht wird. Die Agglutinationsreaktionen von roten Blutkörperchen wurden eingeteilt in (1) solche, die in konstanten Medien mit einem geringen Gehalt an Proteinen oder Dielectrika, wie isotonischen Salzlösungen, und (2) solche, die in konstanten Medien mit einem hohen Gehalt an Proteinen oder Dielectrika auftreten. Antikörper, die unter den erstgenannten Bedingungen reagieren, werden in die IgM-Klasse der.Immunglobuline eingeteilt, während Antikörper, die unter den letztgenannten Bedingungen reagieren, zur IgG-Klasse gehören. Die Fähigkeit des Proteins, die spezifische Aggluti-

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nation zu fördern, wurde theoretisch so erklärt, daß es die Dielektrizitätskonstante des Mediums erhöht, wodurch das j-Potential der Zellen verringert und der durchschnittliche inter-

Abstand
zelluläre/unter den Abstand verkürzt wird, der von den IgG-Antikörpermolekülen zur Agglutination überbrückt werden muß. Im Nachweismedium wird als Protein Säugetier-Serumalbumin, insbesondere Rinder-Serumalbumin verwendet, da Rinderblut in großen Mengen zugänglich ist. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß übliche Rinder-Serumalbuminlösungen recht unterschiedliche Eigenschaften in bezug auf eine Erhöhung der Dielektrizitätskonstante von V/asser aufweisen und somit auch die beim Nachweis von Antikörpern erforderliche Agglutination in unterschiedlicher Weise fördern. Dieses unterschiedliche Verhalten läßt sich nicht unbedingt durch Verwendung höherer Albuminkonzentrationen vermeiden. Außerdem ist die potenzierende Wirkung von üblichen Rinder-Serumalbuminlösungen nicht.ausreichend, so daß bestimmte Antikörper übersehen werden.

Es wurden deshalb Versuche unternommen, die potenzierende Wirkung durch Modifikation von Albuminpräparaten zu verbessern. Jedoch wurden dabei nicht durchwegs bessere Präparate erhalten. Jones u. Mitarb. (Nature, Bd. 224, (1969) S. 519) behandelten Albumin mit Äthanol, wodurch Aggregate erhalten wurden, deren Molekülgröße offensichtlich ein Vielfaches von natürlichen Albuminmolekülen betrug. Es wurde berichtet, daß mit Alkohol behandelte Albuminpräparate eine höhere potenzierende Wirkung aufweisen. Jedoch erwiesen sich Albumin-

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Präparate, die mit Hilfe von Äthanol hergestellte Albuminaggregate enthielten, nicht als geeignete potenzierende Medien, was vermutlich auf die reversible Fatur der Aggregate und daraus herrührende Schwierigkeiten bei der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zurückzuführen ist. Obgleich die vergrößerten Teilchen von Jones "Polymere" genannt wurden und auch von anderen Autoren aus Zweckmäßigkeitsgründen so bezeichnet werden, gilt es allgemein als gesichert, daß diese Produkte Aggregate und keine wirklichen Polymere sind, da sie sich mit Mercaptoäthanol, Harnstofflösungen oder unter extremen pH-Bedingungen leicht, in die Monomeren verwandeln lassen. Jones behandelte ferner Serumalbumin mit ΪΤ,Ν'-ρ-Phenylen-bis-maleinimid, das an der SuIfhydry!gruppe reagiert und Disulfid-dimere bildet. Jedoch stellte es sich heraus, daß derartige Präparate die potenzierende Wirkung von Albumin nicht signifikant verbessern. Y/eiterhin wurden polymere Materialien, wie Dextran, Polysaccharose oder Polyvinylpyrrolidin zugesetzt. Jedoch erwiesen sich diese modifizierten Produkte nicht als geeignet. Aufgabe der Erfindung ist es somit, serologische Präparate zur Verfügung zu stellen, die eine höhere und gleichmäßige potenzierende Wirkung aufweisen, bei Transport und Lagerung stabil sind und sich ohne Schwierigkeiten herstellen lassen.

Erfindungsgemäß .werden verbesserte, serologische Albuminpräparate zur Verfügung gestellt, die im Vergleich zu herkömmlichen Albuminpräparaten eine größere potenzierende Wirkung

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beim Antikörpernachweis aufweisen. Die potenzierende Wirkung dieser Präparate tritt gleichmäßig und zuverlässig auf. Die erfindungsgemäßen Serumalbuminpräparate enthalten als wesentlichen Bestandteil ein oder mehrere Serumalbuminpolymere. Diese Polymere sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Der hier verwendete Ausdruck "Albumin" kann im Zusammenhang mit monomeren oder polymeren Produkten verwendet werden und bezieht sich auf Serumalbumin von Säugetieren. Die Polymerbestandteile der Serumalbuminpräparate der Erfindung bestehen aus kovalent gebundenen Polymeren, bei denen die monomeren Einheiten durch Peptid- oder Amidbindungen (-NHCO-) aneinander gebunden sind. Die Peptidbindung wird zwischen einer Aminogruppe eines Albuminmoleküls und einer Carboxylgruppe eines weiteren Albuminmoleküls gebildet. Diese Bindung läßt sich von anderen Peptidbindungen die im Molekül bereits vorhanden sind, nicht unterscheiden. Die Polymeren der erfindungsgemäßen Serumalbuminpräparate können bis zu 15 Albumineinheiten oder mehr enthalten. Im allgemeinen enthalten sie aber etwa 2 bis 8 Monomereinheiten, Die Stellungen der Amino- und Carboxylgruppen in den Albuminmolekülen, die an der Bildung von Peptidbindungen teilnehmen, ist nicht beschränkt. Es kommen vermutlich lineare und vernetzte Bindungen vor. Dimere, Trimere und lineare höhere Polymere können durch die allgemeine Formel I wiedergegeben werden:

H₂N-AIb^CONH-AIbZ_nCONH-AIb-COOH (I)

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~ ⁶ - 26H865

In dieser Formel ist η eine ganze Zahl (O oder 1 für Dimere und Trimere bzw. größer als 1 für höhere Polymere). "Alb" bedeutet jeweils den Rest eines Serumalbuminraoleküls, das durch die allgemeine Formel II

H₂F-AIb-COOH (II)

wiedergegeben werden kann.

Die Serumalbuminpräparate der Erfindung haben im Vergleich zu herkömmlichen Präparaten eine wesentlich stärkere poten-■ zierende Wirkung bei der Agglutinationsreaktion von Immunoglobulinen der IgG-Klasse. Somit stellen diese Präparate ein hochempfindliches Mittel zum Nachweis von Antikörpern dar, mit dem es möglich ist, die Anwesenheit von Antikörpern nachzuweisen, die mit herkömmlichen, die Agglutination potenzierenden Präparaten nicht nachgewiesen werden konnten. Die Präparate der Erfindung sind auch wertvolle Verdünnungsmittel zur Herstellung von verbesserten Antiseren, die zur Bestimmung von Blutgruppen und Bluttypen geeignet sind. Ferner eignen sich die Präparate als Verdünnungsmittel für Suspensionen von roten Blutkörperchen bei der Serum/Albumin- und/oder Albumin/ Albumin-Titration zum Antikörpernachweis.

Die serologischen Albuminpräparate der Erfindung enthalten, wie bereits erwähnt, ein Albuminpolymer im Gemisch mit einer physiologischen oder isotonischen Lösung. Die Präparate der

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Erfindung können als Albuminkomponente ein einzelnes Polymer, ein Polymergemisch oder ein Gemisch aus Monomeren und Polymeren enthalten. Gute serologische Reaktionen ergeben sich bei der Verwendung eines Gemisches aus einem Monomeren und Polymeren, die bei der Polymerisation von monomerem Albumin erhalten werden. Derartige bei der Polymerisation erhaltene Gemische aus Monomeren und Polymeren können als "polymerisierte Albumin"-Lösung bezeichnet werden. Serologische Präparate, die derartige Gemische in physiologischen Lösungen enthalten, stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar.

Im allgemeinen beträgt der Gesamtalbumingehalt von Präparaten für diagnostische Zwecke etwa 10 bis etwa 35 Gewichtsprozent. Bevorzugte Präparate enthalten etwa 16 bis etwa 26 Gewichtsprozent Gesamtalbumin. Unter "Gesamtalbumin" ist der Albuminanteil· in Gewichtsprozent ohne Rücksicht auf die monomere oder poiymere Natur des Produkts zu verstehen. Al·s Träger für das Albumin werden übliche physiologische Kochsalzlösungen oder isotonische Lösungen verwendet.

In der bevorzugten Ausführungsform, die ein Gemisch aus Monomeren und Polymeren betrifft, sind die Polymeren oder das Polymerengemisch in einer Menge von mindestens 20 Gewichtsprozent, bezogen auf den Gesamtalbumingehalt des Präparats, enthalten. Präparate mit besseren Eigenschaften enthalten etwa 46 bis etwa 70 Gewichtsprozent Polymeranteil, aber auch Präparate mit einem Polymeranteil von etwa 28 bis etwa 45 Gewichtsprozent

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sind bevorzugt. Beispielsweise besteht eines der letztgenannten Präparate aus einem Gemisch aus einem Monomer und folgenden Polymeren: Monomer 55 bis 72 Gewichtsprozent, Dimer 15 bis 23 Gewichtsprozent, Trimer 5 bis 8 Gewichtsprozent, Tetramer 1 bis 4- Gewichtsprozent, Pentamer und höhere Polymere 5 bis 15 Gewichtsprozent. Im allgemeinen beträgt das Gewichtsverhältnis von Monomer zu Polymer etwa 7:3 bis etwa 1:9· Es können auch Polymere hergestellt werden, bei denen ein wesentlicher Teil der Polymeren einen höheren Polymerisationsgrad als das Octamer aufweist. Besonders bevorzugte serologische Präparate werden aber erhalten, wenn ein wesentlicher Teil der Polymeren als Trimere und Te träniere vorliegen.

Die. serologischen Albuminpräparate der Erfindung sind im pH-Bereich von etwa 6,5 bis 8,0 klare, gefärbte Lösungen. Die Viskosität, die Dielektrizitätskonstante und andere Eigenschaften hängen davon ab, ob ein einzelnes Polymer, ein Polymergemisch oder ein Gemisch aus Monomeren und Polymeren vorliegt. Ferner werden diese Eigenschaften durch die Natur der einzelnen Polymeren beeinflußt. Im allgemeinen beträgt die relative Viskosität (Wasser als Standard) mehr als etwa 2 und höchstens etwa 25. Die Leitfähigkeit von in destilliertem Wasser auf 1:10 verdünnten Lösungen bei O⁰C beträgt etwa 5 x 10 S/cm bis etwa 7 x 10"⁴" S/cm².

Die Polymeren sind echte Polymere, bei denen die monomeren Albumineinheiten durch kovalente Peptid- oder Amidbindungen

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miteinander verbunden sind. Diese Produkte unterscheiden sich von Albuminaggregaten, die häufig bei der Behandlung von Albumin mit kaltem Alkohol oder beim Altern von Albumin gebildet werden und die sich in unabhängige Monomere zurückverwandeln können. In der Literatur werden Makromoleküle, die bei der Behandlung von Albumin mit kaltem Alkohol oder beim Altern von Albumin entstehen, sowohl als "Polymere" als auch als "Aggregate" bezeichnet. Derartige Produkte zeigen bei physikalischen Bestimmungen, wie der elektrophoretischen Mobilität, Molekulargewichte, die scheinbar ein Mehrfaches des ursprünglichen Albumins betragen. Jedoch sind diese Aggregate durch sekundäre Bindungen, wie Y/asserstoffbrückenbindungen gebildet. Somit ist die Bildung dieser Aggregate reversibel, was sich leicht nachweisen läßt; vgl. Dunker u. Mitarb., J.Biol, Chem., Bd. 224 (1969), S. 5074; und Fairbanks u. Mitarb. Biochem., Bd. 10 (1971), S. 2606. Gemäß den dort beschriebenen Verfahren werden die Albuminlösungen mit 2-Mercaptoäthanol behandelt, wodurch die nicht kovalent gebundenen "Polymeren" oder Aggregate in Monomere umgewandelt werden. Durch Elektrophorese der Natriumdodecylsulfat-Komplexe der mit Mercaptoäthanol behandelten Lösungen an einer Polyacrylamidsäule wird die tatsächliche monomere oder polymere Natur der Verbindungen ermittelt. Ferner kann dieses Verfahren (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese) auch zur Bestimmung des Molekulargewichts der einzelnen Komponenten verwendet werden. Dabei wird die Mobilität

Länge des Gels vor

_ Strecke der Proteinwanderung dem Färben

- _{länge des Gels nach dem} x Strecke der Färb-

Färben , »_A«*<* stoff wanderung 609843/0833

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von bekannten Proteinen gegen ihr Molekulargewicht aufgetragen. Anschließend wird das Molekulargewicht der zu untersuchenden Polymeren durch Extrapolation aus dieser Kurve bestimmt. Die erfindungsgemäßen polymerisierten Albuminlösungen, die nach dem nachstehend erläuterten Verfahren erhältlich sind, erweisen sich bei der vorgenannten Untersuchung als echte Polymere, die nicht durch Behandlung mit 2-Mercaptoäthanol oder Harnstoff in die Monomeren zurückverwandelt werden können. Die Polymeren der Erfindung zeigen dabei je nach den speziellen Polymeren entsprechende Eigenschaften.

Die Polymeren der Erfindung sind auch von Dimeren zu unterscheiden, die durch Behandlung von Albumin mit einem Reagenz, wie Fjii'-p-Phenylen-bis-maleinimid erhalten werden. Dieses Reagenz reagie-rt mit der Sulfhydrylgruppe des Albumins.

Die serologischen Serumalbuminpräparate der Erfindung lassen sich herstellen, indem man zunächst Serumalbumin mit einem Reagenz zur Bildung von Peptidbindungen unter Bildung eines Polymers oder Polymergemisches polymerisiert und das Polymer, das ein einzelnes Polymer, ein Polymergemisch oder vorzugsweise ein Gemisch aus verschiedenen Polymeren mit dem Monomer enthält, gev/innt. Dieses Polymer wird zur Herstellung der gewünschten serologischen Präparate in einer physiologischen Lösung gelöst. Serologische Präparate, die ein Gemisch aus Polymeren mit nicht polymerisiertem Albumin enthalten, lassen sich leicht herstellen, indem man Albumin gemäß dem nachstehend erläuterten Verfahren

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polymerisiert, die Reaktion beim gewünschten Polymerisationsgrad abbricht, das Reaktionsgemisch zur Fällung des Gemisches aus monomerem und polymerem Albumin fraktioniert und zu einer physiologischen Lösung rekonstituiert, wie nachstehend näher erläutert wird.

Die Polymerisation und die Herstellung der Polymeren läßt sich durchführen, indem man Serumalbumin mit einem Reagenz zur Bildung von Peptidbindungen gründlich vermischt. Dabei findet eine Umsetzung zwischen einem Albuminmolekül und dem Reagenz unter Bildung eines Zwischenprodukts und eine anschließende Umsetzung des Zwischenprodukts mit einem weiteren Albuminmolekül statt, wodurch dimeres Albumin gebildet wird. Dieses dimere Albumin reagiert anschließend in ähnlicher V/eise unter Bildung von Trimeren, Tetrameren und höheren Polymeren von Albumin. Die Anfangsreaktion zur Bildung des Dimeren (n in der allgemeinen Formel I ist O) kann durch folgendes Reaktionsschema wiedergegeben werden, wobei "Reagenz" ein Reagenz zur Bildung von Peptidbindungen bedeutet:

II Reagenz _v H_oN-Alb-C00-Reagenz II _v

(in)

H₂N-AIb-CONH-AIb-COOH + (Reagenz-HgO,Nebenprodukt) (IV) ' (V)

Das Dimere der allgemeinen Formel IV kann dann mit einem Reagenzmolekül unter Bildung eines Zwischenprodukts der allgemeinen Formel VI

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HgN-Alb-COFH-Alb-COO-Reagenz (VI)

reagieren, das wiederum mit einem weiteren Albuminmolekül unter Bildung eines Trimeren (n in der allgemeinen Formel I ist 1) reagiert. Dieses Verfahren kann zur Bildung von höheren Polymeren wiederholt werden. Zusätzlich zu den Polymeren entsteht bei jeder Stufe aus dem Reagenz ein Nebenprodukt, dessen genaue Beschaffenheit vom Reagenz abhängt. Jedoch enthält das Nebenprodukt die Elemente Wasser.

Zwei Gruppen von zur Synthese von Amiden übliche Reagenzien sind zur Herstellung von polymerisiertem Albumin besonders 'wertvoll. Diese amidbildenden Reagenzien sind: (1) Die 3-H-Isoxazoliumsalze gemäß Woodward u. Mitarb., J. Am. Chem. Soc, Bd.83 (1961), S. 1010 und (2) die Carbodiimide gemäß Sheehan u. Mitarb., J. Am. Chem. Soc, Bd. 77 (1955), S. 1067 sowie die US-PSen 2 938 892 und 3 098 693. Es können auch andere Reagenzien zur Bildung von Peptidbindungen verwendet werden. Vorzugsweise werden die nachstehend beschriebenen Reagenzien verwendet, die sich nach den vorgenannten Literaturstellen herstellen lassen. Es eignen sich auch andere Reagenzien und/oder Mittel zur Bildung von Peptidbindungen dazu, die Polymeren der Erfindung herzustellen. Jedoch sind die vorgenannten Reagenzien zur Herstellung der serologischen Präparate der Erfindung besonders bevorzugt.

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Das Kation des als Reagenz zur Bildung von Peptidbindungen verwendeten 3~H-Isoxazoliumsalzes läßt sich durch die allgemeine Formel VII wiedergeben

(VII)

in der Q- vorzugsweise einen aromatischen Rest, wie einen gegebenenfalls substituierten Phenylrest, Q₂ ein Wasserstoffatom oder einen niederen Alkylrest und Q₅ einen niederen Alkylrest bedeutet. Unter der Bezeichnung "3-H-Isoxazolium" ist zu verstehen, daß der Substituent in der 3-Stellung ein Wasserstoffatom ist. Als Anion kann ein unabhängiges Ion oder eine interne anionische Gruppe vorliegen. Beispiele für unabhängige Anionen sind Fluoroborat, Sulfonat, nieder-Alkylphosphonat, Methosulfat und A'thosulfat. Ein Beispiel für eine interne anionische Gruppe liegt beispielsweise vor, wenn Q₁ eine sulfonatsubstituierte Phenylgruppe bedeutet. Unter dem Ausdruck "niederer Alkylrest" sind Alkylresiß mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen zu verstehen, wie die Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, Amyl- und Hexylgruppe. Spezielle Beispiele für Isoxazoliumsalze sind N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat, N-Methyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat, N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-fluoroborat, N-Methyl-5-phenylisoxazolium-fluoroborat, N-(n-Propyl)-5-phenylisoxazolium-3¹-sulfonat und N-(n-Propyl)-5-phenylisoxazoliumfluoroborat.

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Bei der Verwendung von 3-H-Isoxazoliumsalzen als Peptidreagenzien kann der "Reagenz"-Anteil in den Zwischenprodukten der allgemeinen Formeln III und YI folgendermaßen wiedergegeben werden:

^0

Q2 CONHQ₃

somit läßt sich das Zwischenprodukt der allgemeinen Formel III folgendermaßen wiedergeben.

H₂N-AIb-COO-C

C (IHa)

Q₂. CONHQ,

Das als Nebenprodukt gebildete ß-Aroylamid läßt sich durch die allgemeine Formel Va wiedergeben: '

" H ■■■■■' frr S

Q₁-C-CH-CONH-Q₃ ^(Ta ι

Carbodiimide zur Verwendung als Peptidreagenzien lassen sich durch die allgemeine Formel VIII wiedergeben

R-K=C-N-R' (VIII)

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in. der E. und E.' jeweils einen Rest bedeuten, bei dem das an das Stickstoffatom gebundene Kohlenstoffatom ein aliphatisches Kohlenstoffatom ist. Beispiele für die Reste R und R¹ sind Alkylreste mit 2 bis 12, vorzugsweise 2 bis 6, Kohlenstoffatomen, Cyclohexyl-, Benzyl-, Phenäthyl-, nieder-Alkylmorpholinyl-, Di-nieder-alkylaminoalkyl-, Hydroxy-nieder-alkyl-, nieder-Alkylpiperidyl-, Phenyl- und Morpholinoreste sowie Salze mit Säuren und quaternäre Ammoniumsalze. Wasserlösliche Carbodiimide werden besonders bevorzugt. Carbodiimide mit tertiären Aminogruppen können durch Bildung von Additionssalzen mit Mineralsäuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, Schwefelsäure, •Salpetersäure, Phosphorsäure, niederen Alky!sulfonsäuren und Phosphonsäuren wasserlöslich gemacht werden. Ferner können sie auch durch Quaternisierung mit einem entsprechenden Quaternisierungsmittel wasserlöslich gemacht werden. Beispiele für entsprechende Mittel sind niedere Alkyltosylate, -halogenide und -sulfate, wie Methyltosylat, Methylbromid, Methyljodid, Äthyltosylat, Methylsulfat, ithylsulfat und Benzylbromid.

Besonders bevorzugte Reagenzien sind: 1-Ä'thyl-3-(3-dimethylamino· propyl)-carbodiimid-hydrochlorid, 1-Cyelohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat, 1-Cyclohexyl^-(4-diäthylaminocyclohexyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat, 1-Cyclohexyl-?-(ß-diäthylaminoäthyl)-carbodiimid, 1-Xthyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-hydrochlorid und 1-Äthyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-^ulfat. ■

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Bei Verwendung eines Carbodiimids als Peptidreagenz kann der "Reagenz"-Anteil in den Zwischenprodukten der allgemeinen Formeln III und YI folgendermaßen wiedergegeben werden:

J ■ ■ MHR' ' KR

Somit läßt sich das Zwischenprodukt der allgemeinen Formel III folgendermaßen wiedergeben:

.-NHR¹

HpN-AIb-COO-CC^ (IHb)

^*NR

Der dabei als Nebenprodukt gebildete Harnstoff läßt sich durch die Formel Vb wiedergeben.

R-NHCO-NH-R¹ (Vb)

Die Polymerisation läßt sich durchführen, indem man eine wäßrige Albüminlösung, vorzugsweise eine verdünnte wäßrige Lösung mit einem Reagenz zur Ausbildung einer Peptidbindung bei einem pH-Wert von etwa 4»5 bis etwa 6,0 bei !Temperaturen von etwa 2. bis etwa 60⁰C gründlich vermischt. Dabei tritt eine Umsetzung unter Bildung von polymerisiertem Albumin ein. Im allgemeinen entsteht ein Gemisch mit verschiedenen polymeren Produkten. Wenn die Polymerbildung das gewünschte Ausmaß erreicht hat, wird eine basische Stickstoffverbindung bei Temperaturen im Bereich vpn 0 bis 3O⁰C zugesetzt, um das überschüssige

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Reagenz zu entfernen und die Polymerisationsreaktion abzubrechen. Die auf diese Weise erhaltenen polymeren Produkte können nach üblichen Verfahren gewonnen und anschließend als Polymerengemisch oder nach Auftrennung in die einzelnen Polymeren verwendet werden. Ferner lassen sich aus diesen Polymeren, wie nachstehend erläutert, die serologischen Albuminpräparate der Erfindung herstellen.

Bei der Durchführung der Polymerisation kann das Molverhältnis von Peptidreagenz zu Albumin von etwa 1:1 bis etwa 60:1 je nachdem, ob ein Isoxazoliumsalz oder ein Carbodiimid als Reagenz verwendet wird, variieren. Bei der Verwendung eines Isoxazoliumsalzes beträgt das Verhältnis von Reagenz zu Albumin vorzugsweise etwa 30:1 bis etwa 60:1, während bei der Verwendung eines Carbodiimids dieses Verhältnis vorzugsweise etwa 1:1 bis etwa 30:1 beträgt.

Die genaue Albuminkonzentration in der als Ausgangslösung verwendeten wäßrigen Albuminlösung ist nicht kritisch und kann etwa 1,5 bis etwa 20 Prozent betragen. Vorzugsweise wird eine verdünnte Lösung mit einer Konzentration von etwa 1,5 bis etwa 4 Prozent verwendet. Das Peptidreagenz wird vorzugsweise in einer wäßrigen Lösung verwendet. Die genaue Konzentration ist nicht kritisch. Im allgemeinen wird nur eine solche Wassermenge verwendet, die ausreicht, um das Reagenz in Lösung zu bringen.

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Die bei der Polymerisation verwendete Albuminlösung kann aus kristallinem Albumin hergestellt werden. Es ist jedoch zweckmäßiger, diese lösungen aus höherkonzentrierten Albuminlösungen herzustellen, die sich nach üblichen Verfahren gewinnen lassen oder im Handel erhältlich sind. Im allgemeinen wird Rinder-Serumalbumin bevorzugt, da Einderblut leicht zugänglich ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Polymerisation wird eine konzentrierte wäßrige Lösung eines Peptidreagenz unter Rühren bei Temperaturen im Bereich von etwa 2 bis etwa 40 C zu einer verdünnten Albuminlösung gegeben, die vorher mit einer verdünnten Mineralsäure, wie Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, auf einen pH-Wert von etwa 5,2 bis etwa 5»6 eingestellt worden ist. Anschließend an die Zugabe wird das Gemisch so lange gerührt, wie es zur gewünschten Polymerbildung erforderlich ist. Das Ausmaß der Polymerbildung wird bestimmt, indem man dem Reaktionsgemisch Proben entnimmt und diese Proben der Polyacrylamidelektrophorese unterwirft.

Die Polyacrylamid-Diskelektrophorese (B.J. Davis, Annals N".Y. Acad.Sci., Bd. 121 (1964), S. 404 bedient sich des Vorteils, daß die Porengröße der Gele an die molekularen Abmessungen der Proteine herankommt, so daß eine Trennung sowohl durch Größen- als auch durch Ladungsunterschiede erreicht wird. Bei diesem Trenn- und Analysenverfahren werden die Proben elektrophoretisch in Polyacrylamidgel-Säulen, die senkrecht zwischen

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Elektroden aufweisenden, oberen und unteren Pufferbehältern angeordnet sind, getrennt. Die Gelsäulen weisen eine obere Zone auf, in der die elektrophoretische Konzentration der Probe stattfindet. Ferner weisen sie eine untere Zone auf, in der die Trennung abläuft. Nach der elektrophoretischen Trennung können die einzelnen, nach entsprechender Färbung als getrennte scheibenartige Zonen nachweisbaren Proteinkomponenten quantitativ bestimmt werden.

Wenn der gewünschte Polymerisationsgrad erreicht ist, können die Polymeren nach üblichen Verfahren gewonnen und/oder abgetrennt werden. Ist es jedoch erwünscht, das polymerisierte Albumin in serologischen Präparaten für diagnostische Zwecke zu verwenden, so· wird die Umsetzung mit einer basischen Stickstoffverbindung abgebrochen. Dieser Abbruch ist wesentlich, wenn die Präparate zum Antikörpernachweis verwendet werden, da es sich herausgestellt hat, daß Präparate, bei denen die Reaktion nicht abgebrochen worden ist, eine unspezifische Agglutination hervorrufen und somit den spezifischen Antikörpernachweis beeinträchtigen.

Entsprechende basische Stickstoffverbindungen zum Reaktionsabbruch sind Glycin und aridere Aminosäuren bzw. deren Derivate wie Alanin, Valin, Isoleucin und ε-Aminocaproamid, sowie Ammoniumchlorid. Es können zwar auch andere basische Stickstoffverbindungen, wie Arylamine, beispielsweise Äthylamin und Propylamin, aromatische oder heterocyclische Amine

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verwendet werden, jedoch ist es wünschenswert bei der Herstellung von Polymeren, die für serologische Reaktionen verwendet werden, die Einführung von fremdartigen Gruppen zu vermeiden. Im allgemeinen entspricht die Menge der zugesetzten basischen Stickstoffverbindung etwa der Menge des ursprünglich zugesetzten Peptidreagenz. Auf diese Weise wird nicht nur ein Abbruch der Polymerisation, sondern auch eine Beseitigung an überschüssigem Reagenz gewährleistet.

Die polymeren und monomeren Albuminprodukte können aus dem polymerisieren Reaktionsgemisch, dessen Reaktion abgebrochen worden ist, durch Ausfällen gewonnen werden. Die Albuminprodukte können gegebenenfalls in die Einzelbestandteile getrennt und anschließend in Y/asser oder physiologischer Kochsalzlösung gelöst werden..Serologische Albuminpräparate der Erfindung für diagnostische Zwecke lassen sich herstellen, indem man die Albuminprodukte fällt, aus dem Reaktionsgemisch abtrennt und in einer physiologischen Lösung löst. Dabei wird im allgemeinen zunächst der pH-Wert des polymerisieren Albumin-Reaktionsgemisches mit einer Mineralsäure innerhalb eines Bereichs, von 4,5 bis etwa 7,0 eingestellt. Anschließend wird bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa -20 C Alkohol zugesetzt, wodurch das gewünschte polymerisierte Albuminprodukt, das -ein Gemisch aus Polymeren mit nicht polymerisiertem Albumin enthält, ausfällt. Die Fällung beginnt, wenn die Alkoholkonzentration etwa 25 Prozent beträgt. Bei einer Alkoholkonzentration von etwa 40 Prozent ist die Fällung im wesentlichen vollständig. Beispiele für entsprechende Alkohole zur Durchführung der "

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Fällung sind Methanol, Äthanol, Isopropanol und andere mit Wasser mischbare Alkohole. Vorzugsweise wird bei einem pH-Wert von etwa 5,0 eine ausreichende Menge Alkohol zugegeben, um das Reaktionsgemisch auf eine Alkoholkonzentration von etwa 40 Prozent zu bringen, wobei die Temperatur im Bereich von etwa -5 bis etwa -10⁰C gehalten wird. Der Niederschlag wird nach üblichen Verfahren, vorzugsweise durch Zentrifugation, aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt und gewonnen. Anschließend kann er in einer 10 bis 35 prozentigen isotonischen, wäßrigen Kochsalzlösung gelöst werden. Das erhaltene serologische Albuminpräparat ist eine klare, gefärbte Lösung mit den vorerwähnten Eigenschaften.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Niederschlag nach üblichen Verfahren, beispielsweise durch Gelfiltration, in die Einzelbestandteile zu trennen. Bei der Herstellung von serologischen Albuminpräparaten, die ein einzelnes Polymer enthalten, wird ein 1 bis 20 prozentiges, wäßriges Albumingemisch auf eine mit Sephadex G—200 (vernetztes Dextran der Firma Pharmacia Co., Uppsala, Schweden) beschickte Säule aufgesetzt und in die einzelnen Polymeren getrennt. Die gewünschten Polymeren können anschließend in physiologischer Kochsalzlösung gelöst, durch analytische Ultrafiltration zu 20 bis 30 prozentigen isotonischen Lösungen eingeengt und serologisch untersucht werden.

Die auf diese Weise erhaltenen Präparate eignen sich für verschiedene serologische Anwendungszwecke, wo bisher nicht

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polymerisierte Albuminlösungen verwendet wurden. Die Präparate der Erfindung stellen diagnostische Hilfsmittel dar, deren Empfindlichkeit und Fachweisfähigkeit weit größer sind, als es bisher für möglich gehalten wurde. Die Präparate sind nicht nur bei hohen Verdünnungen der zu untersuchenden Medien ungewöhnlich empfindlich, sondern es hat sich auch herausgestellt, daß sie das Prozonisierungsphänomen verringern. Das Auftreten der Prozonisierung, d.h. das Unvermögen von Antikörpern mit hohem Agglutinintiter das Antigen zu agglutinieren, ist offensichtlich unerwünscht. Somit sind Kachweismedien, bei denen diese Erscheinungen nur in vermindertem Umfang auftreten, von hohem Wert. Somit eignen sich die Präparate der Erfindung als potenzierende Mittel bei klinisch signifikanten Antikörpersystemen. Zusätzlich zu ihrem Wert als potenzierende Medien und Antikörpernachweismedien sind die Präparate immer dann wertvoll, wenn ein Verdünnungsmittel für Serum oder rote Blutkörperchen erwünscht ist. Außerdem zeichnen sich die Präpars,te der Erfindung durch eine hohe Stabilität bei Transport und Lagerung aus.

Die vorstehend erläuterten Präparate können für spezifische diagnostische Untersuchungen unter Verwertung immunologischer Prinzipien eingesetzt werden.

Beispielsweise können die Präparate zur Verbesserung des Antikörpernachweises durch rote Blutkörperchen bei Hämagglutinierungsreaktionen verwendet werden. Bei einer typischen Ver-

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fahrensweise werden 2 prozentige Suspensionen von roten Blutkörperchen, die Antigen enthalten, in den erfindungsgemäßen Präparaten mit einem Gehalt an polymerem Albumin hergestellt und zur Titration von Testseren verwendet, indem man 1 Tropfen der Suspension von roten Blutkörperchen in ein Reagenzglas gibt, das 2 Tropfen Testserum oder eine entsprechende Verdünnung davon enthält. Das Gemisch wird 1 Stunde im Wasserbad bei 37°C inkubiert, zentrifugiert (im allgemeinen 1 Minute bei 1000 U/min) und anschließend auf die Agglutinierung untersucht.

Die Präparate können auch zum Nachweis von Antikörper-sensibilisierten Erythrozyten verwendet werden. Gemäß einer typischen Verfahrensweise werden dabei 2 Tropfen des Präparats mit einem Gehalt an polymerem Albumin mit 1 Tropfen einer 4- bis 6 prozentigen, vorher mit Antikörpern sensibilisierten Erythrozytensuspension vermischt. Das Gemisch wird zentrifugiert und anschließend auf den Agglutinationsgrad untersucht.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

500 ml einer 2 prozentigen wäßrigen Rinder-Albuminlösung (Albumingehalt mindestens 98 Prozent, 90 Prozent Monomer und 10 Prozent dimeres Aggregat) werden mit 14 ml 0,1 η Salzsäure versetzt. Der pH-Wert nach der Salzsäurezugabe beträgt 5,4. Die erhaltene Lösung wird unter Rühren bei Räumtemperatur mit 5 ml einer

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0,588 m Lösung von 1-Äthy1-3-(3-dimethy!aminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (Verhältnis von Carbodiimid zu Albumin 20:1) versetzt. Anschließend wird weitere 60 Minuten gerührt. Man erhält polymerisiertes Rinder-Serumalbumin im Reaktionsgemisch. Sodann wird das Reaktionsgemisch zum Abbruch der Polymerisation bei Raumtemperatur unter Rühren mit 5 ml einer 0,588 m Glycinlösung versetzt und 15 Minuten weitergerührt. Anschließend werden j>P ml 0,1 η HCl zugesetzt, um den pH-Wert auf etwa 5,0 einzustellen. Hierauf werden 32 ml Methanol (vorher auf O⁰C abgekühlt) unter Rühren innerhalb von etwa 30 Minuten zugesetzt, wobei die Temperatur des Reaktionsgemisches auf etwa -2 bis -5°C gehalten wird. Nach Beendigung der Zugabe rührt man etwa 15 Minuten weiter, wobei das polymerisiert^ Albumin ausfällt. Der

30 minütiges Zentrifugieren Niederschlag wird durch / bei 9000 ü/min in einer RC 2 Sorvall-Zentrifuge gewonnen. Man erhält 20,4 g polymerisiertes Rinder-Serumalbumin. Dieses Produkt wird mit einem·möglichst geringen Volumen an destilliertem Wasser zu einer 30,3 prozentigen Lösung von polymerisiertem Rinder-Serumalbumin rekonstituiert.

0,7 ml der 30,3 prozentigen polymerisierten Rinder-Serumalbuminlösung werden mit 0,3 ml einer 0,9 prozentigen Matriumchloridlösung versetzt, wodurch man eine 22 prozentige serologische Lösung von polymerisiertem Rinder-Albumin erhält. Bei der Polyacrylamid-Diskelektrophorese (7 prozentiges Gel bei pH-Wert 7,2) dieser Lösung ergeben sich folgende Konzentrationen an monomerem und polymerem Albumin: 71 Prozent" Monomer, 21,2 Prozent Dimer, 4,8 Prozent Trimer," 1,1 Prozent Tetramer und 1,9 Prozent höhere Polymere.

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Bei der Serumalbumintitration von Rh-positiven Zellen mit Anti-Rh -Serum in Gegenwart der 22 prozentigen serologischen Lösung von polymerisiertem Rinder-Albumin ergibt sich eine Agglutination bei einer 1/2O48-Verdiinnung des Anti-Rh -Serums

Beispiel 2

Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 werden 250 ml einer 16,9 prozentigen wäßrigen Rinder-Serumalbuminlösung bei Raumtemperatur durch Zusatz von 3 ml 1,On HCl auf den pH-Wert 5,4 eingestellt. Anschließend werden unter Rühren 20 ml einer 0,24 8 m Lösung von 1-Äthyl~3-<3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (Verhältnis von Oarbodiimid zu Albumin 8:1 )zugesetzt. Sodann wird v/eitere 60 Minuten gerührt. Man erhält polynerisiertes Rinder-Serufiialbumin. Luroli Zusatz von 20 ml einer 0,248 m Glycinlösung γ/ird die Polymerisation abgebrochen. Anschließend wird der pH-Wert durch Zusatz von 5 ml 1,0 η HCi auf 5,0 eingestellt. Nach Abkühlen des Gemisches v/erden 197 ml vorgekühltes Methanol zugesetzt, wobei die Temperatur zwischen -2 und -5°C gehalten wird. Polymerisiertes Rinder-Serumalbumin fällt aus. Der Niederschlag wird gemäß Beispiel 1 gewonnen und in destilliertem Wasser gelöst. Man erhält 96 ml einer 24»1 prozentigen Lösung von polymerisiertem Rinder-Serumalbumin vom pH-Wert 7,5. Bei der Polyacrylamid-Ge!elektrophorese zeigt die Lösung folgende Zusammensetzung: 32,6 Prozent Monomer, 18,6 Prozent Dimer, 12,6 Prozent Trimer, 9,7 Prozent Tetramer und 26,5 Prozent höhere Polymere.

Eine 22 prozentige serologische Lösung von polymerisiertem

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Albumin wird durch Vermischen des vorgenannten Produkts mit einer natriumchloridlösung gemäß Beispiel 1 hergestellt. Diese Lösung wird zur Serumalbumintitration von Rh-positiven Zellen mit Anti-Rh -Serum verwendet. Agglutination tritt bei einer Verdünnung des Anti-Rh -Serums von mehr als 1/2048 ein, während die maximale Verdünnung bei der Agglutination in Gegenwart einer 22 prossntigen nicht polymerisieren Albumin-Kontrollösung 1/512 beträgt.

Beispiel 3

Auf ähnliche Weise werden 10 ml einer 1,5 prozentigen wäßrigen Lösung von Rinder-Serumalbumin durch Zusatz von 0,1 η HCl auf den pH-^ert 5₅6 bis 5_S4 eingestellt«, Me erhaltene Lösung wird mit O₅β El einer O₅23 in Lösung von N-Athyl-5-phenylisosazolium-3^! -sulfciiat (Verhältnis von Isoxazoliumsulfonat zu Albumin GQiI) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird etwa 60 Minuten 'bei Raumtemperatur gerührt. Man erhält polymerisiert es Rinder-Serumalbumin. Anschließend wird die Reaktion durch Zusatz einer zum Isoxazoliumsulfonat äquivalenten Glycinmenge und anschließendes Rühren abgebrochen. Das polymerislerte Albumingemisch zeigt bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese folgende Zusammensetzung: 77 Prozent Monomer, 15,5 Prozent Dimer, 5,2 Prozent Trimer und 1,8 Prozent Tetramer und höhere Polymere.

Beispiel 4

Dieses Beispiel erläutert polymerisierte Rinder-Albuminpräparate mit verschiedenen Monomer- und Polymeranteilen sowie

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(1) die Hemmung der Prozonisierung und (2) die erhöhte Fähigkeit zum Antikörpernachweis von antigenhaltigen roten Blutkörperchen bei hohen Seruanrerdünnungen, wenn die polyaerisierten serologischen Albuminpräparate als potenzierende Mittel bei der Hämagglutinationsreaktion verwendet werden.

Gemäß Beispiel 1 werden polymerisierte Rinder-Serumalbuminpräparate hergestellt. Die Monomer- und Polymeranteile dieser Präparate sind in Tabelle I angegeben.

	Tabelle I	Dimer	Trimer	Tetramer	höhere
		21,3	7,2	3,6	Polymere
Albuminpräparat		21,1	7,0	2,4	—
A	Monomer- und Polymeranteile in Gewichtsprozent	21,6	5,9	2,0	10,0
B	Monomer	18,5	6,0	2,8	-
C	67,9	20,1	5,1	1,5	9,9
D-	59,5		6,0
E	70,5
62,8
67,3

Wie vorstehend beschrieben, werden serologische Präparate mit einem Gesamtalbumingehalt von 22 Prozent und den vorgenannten Monomer- und Polymeranteilen in physiologischer Kochsalzlösung hergestellt. Die Präparate werden zu Serumalbumintitrationen von Anti-D (Anti-Rb^) verwendet. Für diese Titrationen werden 2 prozentige Suspensionen von Erythrozyten mit einem Gehalt an D(+)-Antigen in den einzelnen 22 prozentigen Lösungen von polymerisiertem Rinder-Serumalbumin mit den vorgenannten Monomer-

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und Polymeranteilen hergestellt. Zur Kontrolle werden 2 prozentige Suspensionen von roten Blutkörperchen mit einem Gehalt an D(+)-Antigen in 22 prozentigem nicht polymerisiertem Rinder-Serumalbumin entsprechend dem Verfahren zur Herstellung der polymerisierten Präparate hergestellt. Diese antigenhaltigen Präparate werden zur Titration τοη vorher hergestellten Verdünnungen von Anti-D-Serum in normalem AB-Serum verwendet. Die Titrationen werden ausgeführt, indem man 2 Tropfen Serum in ein Reagenzglas gibt und 1 Tropfen des Präparats mit einem Gehalt an D(+)-Antigen zusetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde in einem Wasserbad bei 37 C inkubiert, anschließend 1 Minute bei 1000 U/min zentrifugiert und anschließend auf die erfolgte Agglutination untersucht. Die Ergebnisse bei geringen Verdünnungen, bei denen sich eine Hemmung der Prozonisierung ergibt, wenn polymerisiert e Serumalbuminpräparate verwendet werden, sind in Tabelle II zusammengestellt.

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Tabelle II

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Albuminreagenz aus

Reaktivität bei geringer Verdünnung

Reziproker Wert der Anti-D-Ver 124 dunnung

Präparat A Kontrolle

Präparat B Kontrolle

Präparat C Kontrolle

Präparat D Kontrolle

Präparat E Kontrolle

O	O
O
O	O
O	O

+ Agglutination von 3 bis 7 auf einer siebenteiligen Skala * Schwache Agglutination von ^ 1 bis 2; 0 keine Agglutination.

Ergebnisse, die bei Titrationen unter Verwendung von polymerisierten Serumalbuminpräparaten erhalten werden und einen verbesserten nachweis bei starken Verdünnungen belegen, sind in Tabelle III zusammengestellt.

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Tabelle III

Reaktivität bei starker Verdünnung Reziproker Wert der Anti-D-Verdünnung Albuminreagenz aus 1024 2048

Präparat A Kontrolle

Präparat B Kontrolle

Präparat C Kontrolle

Präparat D Kontrolle

Präparat E + +

Kontrolle 0 0

*	0
0	0
*	*
0	0
*	0
0	0
₊	0
0	0

Beispiel 5

Dieses Beispiel erläutert die verstärkte Fähigkeit zum Nachweis von mit Antikörpern sensibilisierten Erythrozyten bei Verwendung von polymerisierten serologischen Albuminpräparaten bei Hämagglutinationsreaktionen.

Dabei werden lösungen ύοϊι polymerisiertem Albumin mit den in Beispiel 4 angegebenen Monomer/Polymer-Verhältnissen zur Herstellung von Präparaten in physiologischer Kochsalzlösung hergestellt. Die Albuminkonzentration variiert dabei von 20 bis 30 Gewichtsprozent. Zur Kontrolle werden zwei getrennte Lösungen von nicht polymerisiertem Rinder-Serumalbumin (nicht polymerisierte Proben ITr. 1 und 2) im gleichen Konzentrationsbereich

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hergestellt. Zur Bestimmung der potenzierenden Wirkung werden 2 Tropfen der Albuminlösungen und 1 Tropfen von Coombs-Kontrollreagenz (mit Antikörper-Globulin Überzogene Erythrozyten) vermischt und 15 Sekunden bei 3400 U/min zentrifugiert. Anschließend wird der Agglutinationsgrad bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Albuminreagenz aus

Tabelle IV

Reaktivität mit Anti-D-sensibilisierten roten Blutkörperchen

Gesamtalbuminkonzentration 28 26 24 22

■Präparat C Präparat D Präparat E

nicht poly- · merisiert Nr. 1

nicht polymerisiert Nr. 2

+	*
*	*
*	*
0	0
0	0

Beispiel 6

Auf folgende Weise werden polymerisierte Rinder-Albuminpräparate mit einem Monomer/Polymer-Verhältnis von Präparat D von Beispiel 4 in ihre Bestandteile getrennt.

4»5 ml -eines 26,6 prozentigen polymerisieren Albuminpräparats iftrden mit 10,5 ml Puffer (0,1 n TriehydroxyaethylaminoBiethan- hydrochlorid mit 1,0 m Natriumchlorid und Thimerosal (1:10 000)

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vom pH-Wert 8,0 vermischt. 10 ml dieses Gemisches werden auf eine mit Sephadex G-200 (vernetztes Dextran der Firma Pharmacia Co.) beschickte Säule der Abmessungen 2,5 x 93 cm (456 ml) aufgesetzt. Das Gemisch wird mit einer Mischung aus 0,1 m Trishydroxymethylaminomethan-hydroehlorid und 1,0m Natriumchlorid vom pH-Wert 8 bei einer Fließgeschwindigkeit von 18 ml pro Stunde bei 5 C eluiert. Dabei werden die einzelnen Monomerund Polymerbestandteile erhalten.

Das Molekulargewicht der Bestandteile wird durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Dabei wird die Mobilität er-• mitteIt. Aus einer mit Hilfe von Polymeren bekannten Molekulargewichts aufgestellten Eichkurve wird anschließend das Molekulargewicht festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle "V zusammengestellt.

Albuminbestandteil

Tabelle V	Moleku]	Largei
Mobilität	68	000
0,598	150	000
0,321	220	000
0,205	250	000
0,145	365	000 .
0,026

Monomer Dimer Trimer Tetramer Pentamer

Für die Eichkurve wurden folgende Eichsubstanzen verwendet: Monomeres Ovalbumin, Mobilität 0,727, Molekulargewicht 43 000; menschliches Transferrin, Mobilität 0,468, Molekulargewicht 90 000; monomeres Rinder-Serumalbumin (2 χ kristallisiert), Beweglichkeit 0,564, Molekulargewicht 69 000.

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Beispiel 7

Dieses Beispiel erläutert die verbesserte Fähigkeit zum Antikörpernachweis von Albuminpräparaten aus verschiedenen Polymerbestandteilen von Albumin, die gemäß Beispiel 6 durch Fraktionierung eines polymerisierten Gemisches erhalten worden sind. Die Arbeitsgänge werden bei einem Gesamtalbumingehalt von 10 Prozent durchgeführt, d.h. weit unterhalb der bevorzugten Konzentrationen, was die verstärkte Potenzierung durch polymere Bestandteile zeigt.

Aus den einzelnen Bestandteilen, sowie aus nicht fraktionierten, polymerisierten und nicht polymerisierten Albuminlösungen als Kontrollösungen werden serologische Präparate mit einem Albumingehalt von 10 Prozent in isotonischer Lösung hergestellt. Die Albuminlösungen werden jeweils mit roten Blutkörperchen mit einem Gehalt an D(+)-Antigen versetzt, so daß Präparate erhalten werden, die eine 2 prozentige Suspension von roten Blutkörperchen enthalten. Die Präparate werden gemäß Beispiel 4 bei Serumalbumnimtitrationen verwendet, um ihre potenzierende Wirkung auf die Anti-Rh -Kh (Anti-D-D)-Agglutination zu bestimmen.

Die Agglutination läßt sich bei Verdünnungen von 1/32 beobachten, wenn die Albuminkomponente ein Dimeres oder Trimeres ist. Liegt die Albuminkomponente als Tetramer mit einem Gehalt an höheren Polymeren vor, so beträgt die entsprechende Verdünnung 1/512. Bei Albumin in Form eines nicht fraktionierten, polymerisierten Gemisches beträgt die entsprechende Verdünnung 1/128. Bei Ver-

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Wendung eines Monomeren, das durch Fraktionierung eines polymerisierten Gemisches erhalten worden ist, oder bei Verwendung •von nicht'polymerisiertem Albumin läßt sich keine Agglutination beobachten, auch wenn das Anti-D-Serum unverdünnt eingesetzt wird.

Beispiel 8 wie

Auf ähnliche/Weise in den Beispielen 1 und 2 werden 2500 ml einer 16,9 prozentigen wäßrigen Lösung von Rinder-Serumalbumin, deren pH-Wert auf etwa 5,4 eingestellt worden ist, unter Rühren mit einer 0,248 m wäßrigen lösung von 1-Cyclohexyl^-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Rühren etwa 2 Stunden fortgesetzt. Man erhält polymerisiertes Rinder-Albumin. Durch Zusatz von 200 ml Glycinlösung wird die Reaktion abgebrochen. Anschließend wird der pH-Wert mit verdünnter Salzsäure auf 5»0 eingestellt. Sodann wird das Gemisch abgekühlt. Hierauf wird vorgekühltes Methanol zugesetzt, um das polymerisierte Albumingemisch auszufällen. Die Feststoffe werden abfiltriert und in physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Das erhaltene Präparat läßt sich erfolg-, reich als potenzierendes Mittel bei Hämagglutinationsreaktionen einsetzen.

Beispiel 9

Auf ähnliche Weise wie in den Beispielen 1, 2 und 3 werden folgende polymerisierte Albuminpräparate hergestellt:

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Durch Umsetzung einer wäßrigen 12 prozentigen Rinder-Seruraalbuminlösung mit 1-Cyclohexyl-3-(4-diäthylaminocyclohexyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat wird ein polymerisiertes Albumingemisch hergestellt, das etwa 25 Gewichtsprozent Monomer und etwa 75 Gewichtsprozent eines Gemisches, das im wesentlichen aus dem Dimeren, Trimeren, Tetrameren, Pentameren, Hexameren, Heptameren und Octameren besteht.

Durch Umsetzung einer wäßrigen, 10 prozentigen Rinder-Serumalbuminlösung mit 1-Cyclohexyl-3-(ß-diäthylaminoäthyl)-carbodiimid-hydrochlorid wird ein polymerisiertes Albumingemisch .hergestellt, das etwa 17 Gewichtsprozent Monomer und etwa 83 Gewichtsprozent eines Polymergemisches aus Bestandteilen mit 2 bis etwa 15 Albumineinheiten besteht.

Durch Umsetzung einer wäßrigen, 4 prozentigen Rinder-Serumalbuminlösung mit 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid wird ein polymerisiertes Albumingemisch hergestellt, das etwa 10 Gewichtsprozent Monomer und etwa 90 Gewichtsprozent eines Polymergemisches mit 2 bis etwa 8 Albumineinheiten enthält.

Durch Umsetzung einer wäßrigen, 4 prozentigen Rinder-Serumalbuminlösung mit H-Propyl-5-phenylisoxazolium-3'-aulfonat wird ein polymerisiertes Albumingemisch hergestellt, das etwa 50 Gewichtsprozent Monomer und etwa 50 Gewichtsprozent eines Polymergemisches mit hauptsächlich 2 bis etwa 6 Albumineinheiten enthält.

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Durch Umsetzung einer wäßrigen, 3 prozentigen Rinder-Serumalbuminlösung mit H-Äthyl-5-phenylisoxazoliujra.-f luoroborat wird ein polymerisiertes Albumingemisch hergestellt, das etwa 45 Gewichtsprozent Monomer und etwa 55 Gewichtsprozent eines Polymergemisches mit einem hohen Anteil an Trimerem und Tetramerem enthält.

Die weiteren Arbeitsgänge werden auf ähnliche Weise wie in den Beispielen 1 und 2 durchgeführt. Dabei können die Polymergemische nach Einstellen des pH-Werts durch Fällung der Albumine mit Alkohol behandelt, die ausgefällten Albumine abgetrennt und 'gewonnen und anschließend in physiologischer Kochsalzlösung gelöst werden. Dadurch erhält man serologische Präparate mit einem G-esamtalbumingehalt τοη 15, 25 und 35 Prozent.

Beispiel 10

Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 6 lassen sich aus einer Lösung von polymerisiertem Rinder-Albumin einzelne Polymere erhalten. Die einzelnen Polymere werden getrennt in physiologischer Kochsalzlösung dispergiert, wodurch man diagnostische Präparate mit einem Polymergehalt von 24 Prozent erhält. Die Präparate können zur Potenzierung der Hämagglutinationsreaktion verwendet werden.

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Claims

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Patentansprüche

/1 .J Serologisches Albuminpräparat, enthaltend mindestens ein Polymer von Serumalbumin, wobei die einzelnen Albumineinheiten dieses Polymers durch kovalente Peptidbindungen aneinander gebunden sind.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch, gekennzeichnet, daß das Polymer 2 bis etwa 8 Albumineinheiten enthält.

. 3. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gesamtalbumingehalt etwa 10 bis etwa 35 Gewichtsprozent beträgt.

4. Polymerisiertes Serumalbuminpräparat mit einem Gehalt an monomerem und polymerem Serumalbumin, wobei die Polymeren 2 bis etwa 8 Albumineinheiten enthalten und im polymeren Albumin die Albumineinheiten durch kovalente Peptidbindungen miteinander verbunden sind.

5. Präparat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Gesamtalbumingehalt des Präparats etwa 10 bis etwa 35 Gewichtsprozent beträgt.

6. Präparat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Monomer/Polymer-Verhältnis etwa 7:3 bis etwa 1:9 beträgt.

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7. Präparat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Polymeranteil im Albumin etwa 46 bis etwa 70 Prozent beträgt.

8. Präparat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Polymeranteil im Albumin etwa 28 bis etwa 45 Prozent beträgt.

9. Verfahren zur Herstellung eines serologischen Albuminpräparats, das ein Gemisch aus monomeren! und polymer em Serumalbumin enthält, wobei der Polymergehalt des Präparats mindestens 20 Gewichtsprozent des Gesamtalbumins ausmacht und die einzelnen Albumineinheiten dieses Polymers durch kovalente Peptidbindungen (-NHCO-) aneinander gebunden sind, dadurch g ekennzeichnet, daß man

(1) eine wäßrige Albuminlösung bei Temperaturen von etwa 2 bis etwa 60⁰C und einem pH-Wert von etwa 4,5 bis etwa 6,0 zur Polymerisation des Albumins mit einem Peptidbindungen ausbildenden Reagenz aus der Gruppe 3-H-Isoxazoliumsalze und Carbodiimide in engen Kontakt bringt,

(2) zum Abbruch der Polymerisationsreaktion bei Temperaturen von etwa 0 bis etwa 30⁰C eine basische Stickstoffverbindung zusetzt,

(3) den pH-Wert durch Zusatz einer entsprechenden Säuremenge auf etwa 4,5 bis etwa 7,0 bringt,

(4) Alkohol zusetzt, um das polymerisierte Albumingemisch auszufällen und

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(5) das ausgefällte, polymerisierte Albumingemisch gewinnt und in einer physiologischen Lösung löst.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein 3-H-Isoxazoliumsalz mit einem Kation der allgemeinen Formel

in der Q-| einen gegebenenfalls durch eine SuIfonatgruppe substituierten Phenylrest, Qp ein Wasserstoffatom oder einen niederen Alkylrest und Q~ einen niederen Alkylrest bedeutet, oder

(b) als Garbodiimid eine Verbindung 'der allgemeinen Formel verwendet

R-N=C=N-R¹

in der mindestens einer der Reste R und R¹ einen Rest bedeutet, bei dem das an das Stickstoffatom gebundene Kohlenstoffatom ein aliphatischen Kohlenstoffatom ist und in der R und R¹ einen niederen Alkylrest mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen Cyclohexyl-, Cyclopentyl-, Hydroxy-nieder-^ Alkyl-, Phenyl-, Benzyl-, Phenäthyl-, nieder-Alkylmorpholinyl-, Di-nieder-Alkylaminoalkyl-, Piperidyl-, Morpholinorest, -. ein entsprechendes Salz mit einer Mineralsäure, nieder-Alkylsulfonsäure oder nieder-Alkylphosphonsäure oder ein

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sich vom nieder-Alkylmorpholinyl-, Di-nieder-Alky!aminoalkyl-, Piperidyl- oder Morpholinorest ableitendes c[uaternäres nieder-Alkyltosylat, Halogenid oder Sulfat bedeutet.

11. Verfahren zum Fachweis von mit Antikörpern sensibilisierten Erythrozyten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension von roten Blutkörperchen gründlich mit einem serologischen Albuminpräparat vermischt, das mindestens ein Polymer von Serumalbumin enthält, wobei in diesem Polymer die Albumineinheiten durch kovalente Peptidbindungen aneinander gebunden •sind.

.12. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man

(1) eine Erythrozytensuspension und ein serologisches Albuminpräparat, das mindestens ein Polymer von Serumalbumin enthält, wobei die Albumineinheiten in diesem Polymer durch kovalente Peptidbindungen aneinander gebunden sind, gründlich vermischt und

(2) dieses Gemisch mit einem Antikörper enthaltenden Serum gründlich vermischt.

13. Polymeres Serumalbumin mit 2 bis etwa 8 monomeren Albumineinheiten, wobei die monomeren Albumineinheiten durch kovalente Peptidbindungen (-IiHCO-) aneinander gebunden sind.

14. Polymer nach Anspruch 13, dadurch gekenh-

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zeichnet, daß es jeweils 3 monomere Albumineinheiten aufweist.

15. Polymer nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß es jeweils 4 monomere Albumineinheiten aufweist.

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OFHGINAL INSPECTED