DE2654124A1 - Derivate des trypsin-kallikrein-inhibitors aus rinderorganen (bpti) mit proteasenhemmwirkung und antiphlogistischer wirkung, ihre herstellung und ihre verwendung als arzneimittel - Google Patents
Derivate des trypsin-kallikrein-inhibitors aus rinderorganen (bpti) mit proteasenhemmwirkung und antiphlogistischer wirkung, ihre herstellung und ihre verwendung als arzneimittelInfo
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- DE2654124A1 DE2654124A1 DE19762654124 DE2654124A DE2654124A1 DE 2654124 A1 DE2654124 A1 DE 2654124A1 DE 19762654124 DE19762654124 DE 19762654124 DE 2654124 A DE2654124 A DE 2654124A DE 2654124 A1 DE2654124 A1 DE 2654124A1
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Description
Derivate des Trypsin-Kallikrein-Inhibitors aus Rinderorganen (BPTI) mit Proteasenhemmwirkung und antiphloaistischer Wirkung» ihre Herstellung und ihre Verwendung
als Arzneimittel
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Derivate des Trypsin-Kallikrein-Inhibitors
aus Rinderorganen, im folaenden BPTI genannt (basic pancreatic trypsin inhibitor/Künitz/), deren
Tyrosinreste 10 und/oder 21 in ortho-Stellung zur phenolischen
Hydroxylgruppe über eine Azogruppe mit einem aromatischen oder heterocyclischen Rest verknüpft sind, und Verfahren zu
ihrer Herstellung aus dem nativen BPTI oder aus Derivaten des BPTI.
Die obengenannten aromatischen oder heterocyclischen Reste
können ein- oder mehrkernig sein und ihrerseits unsubstituiert sein oder mehrere Substituenten erster und/oder zweiter
Ordnung tragen.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Substanzen können neben dem
BPTI eine Reihe von BPTI-Derivaten,beispielsweise folgende
BPTI-Derivate,verwendet werden;
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-ς-
1. Derivate des BPTI, die partiell oder vollständig desamidiert sind
2. Derivate des BPTI, deren Tyrosinreste 10 oder 21 in o-Stellung zur phenolischen Hydroxylgruppe eine Nitro-
oder eine Aminogruppe tragen können
2.1. Derivate nach 2., die zusätzlich partiell oder vollständig desamidiert sein können
3. Desamino-Derivate des BPTI, gemäß Deutscher Patentanmeldung
P 26 19 246.1 erhältlich durch Umsatz mit Nitrosylionen liefernden Agentien in saurem Medium
oder durch Umsatz mit diazotierten heterocyclischen Aminen in saurem, neutralem oder alkalischem Medium
3.1. Derivate nach 3., die zusätzlich partiell oder vollständig desamidiert sein können
3.2. Derivate nach 3., deren Tyrosinreste 10 oder 21 in o-Stellung
zur phenolischen Hydroxylgruppe eine Nitro- oder eine Aminogruppe tragen können
3.3 Derivate nach 3.2., die zusätzlich partiell oder vollständig desamidiert sein können
4. Derivate des BPTI, deren Aminogruppen partiell oder vollständig
entweder guanyliert
oder amidiniert
oder carbamyliert
oder amidiniert
oder carbamyliert
oder acyliert, insbesondere succinyliert oder äthoxyformyliert
oder alkyliert sein können.
oder alkyliert sein können.
4.1. Derivate nach 4., die zusätzlich partiell oder vollständig desamidiert sein können.
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4.2. Derivate nach 4., deren Tyrosinreste 10 oder 21 in·o-Stellung
zur phenolischen Hydroxylgruppe eine Nitro- oder Aminogruppe tragen können.
4.3. Derivate nach 4., deren unveränderte Aminogruppen zusätzlich
partiell oder vollständig desaminiert sein können.
4.4. Derivate nach 4.1., deren Tyrosinreste 10 oder 21 in o-Stellung
zur phenolischen Hydroxylgruppe eine Nitro- oder Aminogruppe tragen können.
4.5. Derivate nach 4.1., deren unveränderte primäre Amiriogruppen
zusätzlich partiell oder vollständig desaminiert sein können.
4.6. Derivate nach 4.2., deren unveränderte primäre Aminogruppen zusätzlich partiell oder vollständig desaminiert
sein können.
4.7. Derivate nach 4.4., deren unveränderte primäre Aminogruppen zusätzlich partiell oder vollständig desaminiert
sein können.
5. Diazoniumverbindungen des BPTI, die aus Derivaten des
BPTI, deren Tyrosinreste 10 und/oder 21 in o-Stellung
zur phenolischen Hydroxylgruppe eine Aminogruppe tragen, durch Diazotierung erhalten werden können,
5.1. Derivate nach 5., die zusätzlich partiell oder vollständig desamidiert sein können.
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5.2. Derivate nach 5., die zusätzlich partiell oder vollständig desaminiert sein können.
5.3. Derivate nach 5., deren Aminogruppen partiell oder vollständig
entweder guanyliert
oder amidiniert
oder carbamyliert
oder acyliert, insbesondere succinyliert
oder äthoxyformyliert
oder alkyliert sein können.
5.4. Derivate nach 5.2., die zusätzlich partiell oder vollständig desamidiert sein können.
5.5. Derivate nach 5.3., die zusätzlich partiell oder vollständig
desamidiert sein können.
5.6. Derivate nach 5.3., deren unveränderte primäre Aminogruppe zusätzlich partiell oder vollständig desaminiert
sein können.
5.7. Derivate nach 5.6., die zusätzlich partiell oder vollständig desamidiert sein können.
Dementsprechend können die erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivate
partiell oder vollständig desamidiert sein und/oder an den Tyrosinresten 10 oder 21 in o-Stellung zur phenolischen
Hydroxylgruppe eine Nitrogruppe oder an den Tyrosinresten 10 oder 21 in o-Stellung zur phenolischen Hydroxylgruppe
eine Aminogruppe tragen. Weiterhin können die erfindungsgemäßen
Azo-BPTI-Derivate partiell oder vollständig desaminiert und/oder entweder guanyliert oder amidiniert oder carbamyliert
oder äthoxyformyliert oder alkyliert sein.
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Die erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivate sind Proteaseinhibitoren;
sie hemmen nicht nur wie BPTI Chymotrypsin, Plasmin, Trypsin und Kininogenine (Kininogenasen), sondern z.T. zusätzlich
auch Elastasen, z. B. aus Pankreas oder Granulozyten, sowie Kathepsin G, das chymotryps inartige Enzym aus Granulozyten
Weiterhin wirken sie in tierexperimentellen Modellen entzündungshemmend. Sie sind erfindungsgemäß verwendbar als Arzneimittel
zur Therapie von Erkrankungen, die ausgelöst werden entweder durch eine Überproduktion von Proteasen infolge einer
erhöhten Freisetzung aus den Zymogenen bzw. einer Ausschüttung beim Zellzerfall oder aber durch einen Mangel bzw. ein Fehlen
von natürlichen körpereigenen Inhibitoren dieser Enzyme in Organen und Gewebeflüssigkeiten. Erkrankungen mit derartiger
Ätiologie sind die verschiedenen Formen des Schocks und posttraumatische
oder postoperative Komplikationen, Störungen der Blutgerinnung, akute und chronische Entzündungsreaktionen, insbesondere
auch chronische Entzündungsreaktionen mit nekrotischen und degenerativen Bindegewebsschädigungen, wie Pankreatitis
sowie durch Immunkomplexe bedingte Vasculitiden, Glomerulonephritiden,
rheumatoide Arthritis und andere Collagenosen sowie durch Stoffwechsel bedingte Ablagerungen verursachte Arthritiden
(Gicht), aber auch degenerative Veränderungen der elastischen Elemente von Gefäßwänden (Atherosklerose) oder
der Lunge (Lungenemphysem).
Es ist bereits bekannt geworden, daß BPTI /H.Kraut, E.K.Frey, E.Werle, Z.Physiol.Chem, 189, 97 (193O)/, auch als Kunitz-Inhibitor
bezeichnet /M.Kunitz, H.H.Northrop, J.Gen.Physiol. 19, 991 (1936)/, eine Reihe von physiologisch bedeutsamen
Enzymen, wie z.B. Kininogenine (Kininogenasen) , Plasmin, Chymotrypsin und Trypsin hemmt (E.Werle in W.Brendel, G.L.Haberland:
Neue Aspekte der Trasylol-Therapie j>, 9, F.K.Schattauer-Verlag
Stuttgart-New York 1972; H.Fritz, H.Tschesche, L.J.
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Greene, E. Truscheit (Hrsg.): Proteinase Inhibitors (Bayer Symposium V), Proc. 2nd International Research Conference,
Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York 1974). BPTI wird als Aprotinin (generic name) zur Therapie und Prophylaxe von
Schockzuständen sowie zur Prophylaxe postoperativer und posttraumatischer Komplikationen eingesetzt.
Es ist weiterhin bekannt, daß die exponierten Histidin- und Tyrosin-Reste von Proteinen mit Diazoniumverbindungen zu
Azoderivaten kuppeln /H.Pauly, Hoppe-Seyler's Z.physiol.Chem.
_4_2, 517 (1904); ebenda 9±, 288 (1915); vgl. L.A.Cohen in
Ann.Rev.Biochem. 3J7» 695 (1968)/. Nach Gundlach et al. /G.
Gundlach, C.Köhne und F.Turba, Biochem.Z. 336, 215 (1962)/
werden dabei auch Lysinreste modifiziert. Zudem können, wie Versuche an Model!verbindungen zeigen, «^-Aminogruppen unter
Desaminierung reagieren /H.Zahn, B.Wollemann und O.Waschkaj
Hoppe-Seyler's Z.physiol.Chem. 294, 100 (1954)/; ebenso
wurde eine Reaktion mit den Guanidogruppen von Argininresten beobachtet /A.N.Howard und F.Wild, Biochem.J. £5, 651 (1957)/.
Die neuen Azo-BPTI-Derivate werden nun erhalten, wenn man
BPTI oder die auf Seite 2 ff. unter 1.-5. aufgeführten Derivate des BPTI mit Diazoniumverbindungen kuppelt. Für diese Kupplungsreaktionen
geeignete Derivate des BPTI sind beispielsweise die auf Seite 2 unter 2. aufgeführten Mononitro-BPTI-
v Ϋ
Derivate, die nach B.Meloun, J.Fric und F.Sorm /Europ.J.Biochem,
£, 112 (1968) / erhalten werden oder aber erfindungsgemäß
auch durch direkte Nitrierung von BPTI mit Salpetersäure, sowie die aus den obigen Mononitro-BPTI-Derivaten bzw.
aus dem ebenfalls von Meloun und Mitarbeitern beschrieben, aber auch aus dem durch direkte Nitrierung erfindungsgemäß
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zugänglichen Dinitro-BPTI-Derivat durch Reduktion der Nitrogruppen nach literaturbekannten Verfahren /M.Sokolovsky, J.
F.Riordan und B.L.Vallee, Biochem.Biophys.Res.Comm. 21_, 20
(1967)/ darstellbaren BPTI-Derivate, die in Position 10 und/ oder 21 anstelle von Tyrosin 3-Aminotyrosin enthalten. Äminotyrosyl-BPTI-Deriväte
können aber auch aus erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivaten durch Reduktion in an sich bekannter Weise
dargestellt und erneut mit Diazoniumverbindungen gekuppelt werden.
Als weitere Ausgangsprodukte für die Herstellung der erfindungsgemäßen
Azo-BPTI-Derivate können u.a. auch Desaminoderivate des BPTI dienen, die ganz oder teilweise desamidiert
sein können und/oder die an einem der beiden Tyrosinreste 10 oder 21 in ortho-Stellung zur phenolischen Hydroxylgruppe
eine Nitrogruppe tragen; sie können auch am Tyrosinrest 10 und/oder 21 in ortho-Stellung zur phenolischen Hydroxylgruppe
eine Aminogruppe enthalten. Man erhält sie gemäß deutscher Patentanmeldung P 26 19 246.1 aus BPTI oder Derivaten
des BPTI nach einem der folgenden Verfahren:
a) Umsetzung derselben in saurer Lösung mit Nitrosylionen
liefernden Agentien wie beispielsweise Alkali- oder Erdalkalinitriten, Estern der salpetrigen Säure oder gemischten
Anhydriden der salpetrigen Säure, gegebenenfalls in Gegenwart von Zusatzstoffen, beispielsweise solchen, die
die Konformation von Proteinen beeinflussen (z. B. organischen Lösungsmitteln, Detergentien oder Guanidiniumhydrochlorid)
in heterogenem oder in homogenem System und Aufarbeitung der Reaktionsgemische nach an sich bekannten
Methoden. Man erhält dabei Gemische von BPTI-Derivaten
unterschiedlichen Desaminierungsgrades, von denen ein Teil auch an den Tyrosinresten 10 und/oder 21 nitriert
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worden ist. Diese Nitrierung läßt sich zurückdrängen, wenn man während der Desaminierungsreaktion unter Schutzgas
oder Evakuierung arbeitet und/oder einen Akzeptor für Elektrophile, z. B. Phenol, zusetzt. Während der Aufarbeitung
kann die Nitrierung durch Alkalisieren des Ansatzes verhindert werden.
b) Umsetzung derselben in saurer, neutraler oder schwach alkalischer Lösung mit Diazoniumverbindungen, die man
durch Diazotierung von heterocyclischen Aminen, insbesondere von 3-Amino-1,2,4-triazol oder 5-Aminotetrazol,
erhält und Aufarbeitung des Reaktionsgemisches nach an sich bekannten Methoden. Den Reaktionsansätzen können
gegebenenfalls Zusatzstoffe, wie z. B. organische Lösungsmittel, Detergentien, Guanidiniumhydrochlorid beigegeben
werden. Man erhält dabei Gemische von BPTI-Derivaten unterschiedlichen, im Vergleich zu Variante a)
im wesentlichen geringeren, Desaminierungsgrades, aus deren Absorptionsspektren ersichtlich ist, daß weder deren
Tyrosinreste zu Azo-Derivaten noch deren primäre Aminogruppen zu Triazenen umgewandelt worden sind.
Die erfindungsgemäßen Kupplungsreaktionen mit BPTI oder
BPTI-Derivaten werden erfahrungsgemäß durch Modifikation an einigen Aminogruppen begleitet (vgl. Deutsche Patentanmeldung
P 26 19 246.1). Blockiert man vor der Kupplung die Aminogruppen des BPTI oder seiner Derivate reversibel,
so kann man die Reaktionen an den Aminogruppen verhindern; man kann die Schutzgruppen nach der Kupplungsreaktion wieder
entfernen.
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Zum vorübergehenden Blockieren der Aminogruppen ist die Citraconylierung mit Citraconsäureanhydrid besonders geeignet;
Citraconylgruppen können wieder abgespalten werden, indem man die Protein- bzw. Peptidlösungen einige Stunden im sauren
Medium stehen läßt. /H.B.F.Dixon, R.N.Perham; Biochem.J,
109, 312 (1968)/. In ähnlicher Weise eignen sich die die Anhydride der Maleinsäure /P.J.G.Butler et al.; Biochem.J. 103,
788 (1967)/ und der 2,3-Dimethy!maleinsäure /H.B.F.Dixon, R.
N.Perham; Biochem.J. 109, 312 (1968)/. Weiterhin sind Imidoester
/L.Wofsy, S.J.Singer; Biochem. 2, 104 (1963)/ sowie auch 2-Methoxy-5-nitro-tropon /H.Tamaoki et al.; J.Biochem.
62, 7 (1967)/ zum Schutz der primären Aminogruppen geeignet;
"beide Schutzgruppen lassen sich durch nilde Hydrazinolyse in schwach "basischem I-Iediun entfernen /H.L.Ludwig, R.Byrne;
J.An.Chen.Soc. 8j4, 416o (1962)/. Ebenfalls eignen sich verschiedene
aus der Peptidchenie "bekannte Schutzgruppen, vor allen vom Urethantyp, von denen die folgenden lediglich als
Beispiele ausgewählt sind: Sie sind z.T. durch nilde Asidolyse
[z.B. die t-Butylosycarbonylgruppe/Boc /R.Schvyzer, P.
Sieter, R.Kappeier; Eelv.Chim.Acta 42, 2622 (1959)/ oder die
Isobornylosyearbonylgruppe/rbc /G.Jäger, R.Geiger; liebigs
Ann.Chen. 1535 (1973)/], ζ.2. auch durch milde Alkalyse z.B.
die Fluorenylnethoxycarbonylgruppe/ΊΓΜθσ /L.A.Carpino, G.Y.
Kan; J.An.Chen.Soc. 92, 5748 (I97o)/ oder die Methylsulfonyläthoxycarccnylgruppe/Msc
/G.I.Tesser, J.C.Balvert-SeGrs; Int.
J.Peptide Protein Res. T_, 295 (1975$, z.T. durch Photolyse
,2.B. dieoC ,S^ -Dimethyl-3 , 5-dimethoxybenzyloxycarbonylgruppe/
Ddz/ C.Birr et al.; Liebigs Ann. Chem. 7_63_, 162 (1972)/ oder die
2,2I-Dinitrodiphenylmethoxycarbonylgruppe /DNBOC /A.Patchornik,
B.Amit, R.B.Woodward; J.Am.Chem.Soc. j^2, 6333 (1972)^ , teils
auch durch katalytische Hydrogenolyse - auch in Gegenwart eines schwefelhaltigen Substrates -£z.B. die 1,1'-Dimethyl-2-propinyloxycarbonylgruppe/DMPOC
/G.L.Southard, B.R.Zaborowski, J.M.Pettee; J.Am.Chem.Soc. SH, 3302 (1971) Tj abzuspalten. Als basenlabile
Schutzgruppen kommen ferner auch der Trifluoracetylrest/TFA
/R.F.Goldberger Methods Enzymol. Y\_, 317 (1967)/ sowie der
Tetrafluorsuccinylrest /V.G.Braunitzer et al.; Hoppe-Seyler's
Z.physiol.Chem 341/ 265 (1968)/ infrage.
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Weiterhin sind zum Aminogruppenschutz Carbonylverbindungen geeignet, die mit den primären Aminogruppen Schiffsche
Basen bilden, die im sauren Medium wieder leicht zu den Ausgangsstoffen zerfallen (E.Wünsch, in: Houben-Weyl,
Methoden der organischen Chemie, IV. Aufl., Bd. 15/1, S. 277'ff., Hrsg.: E.Müller et al., Georg Thieme Verlag, Stuttgart,
1974); so z.B. Benzaldehyd, 3-Methyl-5-formyl-salicylsäure oder 2-Sulfobenzaldehyd sowie ß-Dicarbony!verbindungen wie beispielsweise
Acetessigester, Acetylaceton oder Benzoylaceton.
Erfindungsgemäß kann man auch die obengenannten Mono- und
Dinitro-BPTI-Derivate in an sich bekannter Weise zu den entsprechenden
Amino-BPTI-Derivaten reduzieren und diese anschließend in an sich bekannter Weise diazotieren und die
so erhaltenen Diazoniumverbindungen des BPTI mit zur Kupplung geeigneten Verbindungen in an sich bekannter Weise umsetzen.
Zur Kupplung geeignet sind z.B. einkernige oder mehrkernige aromatische Hydroxy- oder Aminoverbindungen, die ggf. Substituenten
tragen können sowie heterocyclische Verbindungen, die ggf. Substituenten tragen können.
Erfindungsgemäße Azo-BPTI-Derivate, die noch Säureamidgruppen
enthalten, können nachträglich durch Behandeln mit Säuren, insbesondere Salzsäure, Schwefelsäure oder Trifluoressigsäure,
ganz oder teilweise desamidiert werden. Weiterhin können erfindungsgemäße Azo-BPTI-Derivate, die noch aliphatische Aminogruppen
enthalten, nachträglich - gemäß dem Verfahren der Deutschen Patentanmeldung P 26 19 246.1 - durch Umsetzung mit
nichtkuppelnden Diazoniumverbindungen in saurer, neutraler oder alkalischer Lösung oder durch Umsetzung mit Nitrosylionen
liefernden Verbindungen in saurer Lösung partiell oder vollständig desaminiert werden.
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Erfindungsgemäße Αζο-ΒΡΤΓ-Derivate, die noch aliphatische
Aminogruppen enthalten, können aber auch nachträglich entweder guanyliert oder amidiniert oder carbamyliert oder
acyliert, insbesondere succinyliert oder äthoxyformyliert oder alkyliert werden.
Erfindungsgemäße Azo-BPTI-Derivate, bei denen einer der Tyrosinreste
in Position 10 oder 21 noch modifizierbar ist, können nachträglich durch Umsetzung mit Tetranitromethan in an
sich bekannter Weise oder erfindungsgemäß durch Umsetzung mit
Salpetersäure nitriert werden.
Die erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivate werden erhalten
durch Kupplung der oben aufgeführten BPTI-Derivate mit Diazoniumverbindungen
in wäßriger Lösung, die ggf. auch organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Pyridin, Chinolin,
Dimethylformamid., Dimethylsulfoxid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid,
und/oder Zusätze, wie Salze, beispielsweise Guanidinhydrochlorid oder Lithiümchlorid, und/oder Nichtelektrolyte,
wie z.B. Harnstoff, enthalten kann.
Die Kupplungsreaktionen werden je nach der Reaktivität der Diazoniumverbindungen bei pH-Werten zwischen 1 und 12 vorzugsweise
bei pH 5 bis 11 durchgeführt, wobei Lösungen des BPTI
oder von BPTI-Derivaten in Wasser oder in den oben aufgeführten
Lösungsmitteln, die ggf. die oben angegebenen Zusatzstoffe
enthalten, mit den Diazoniumsalzlösungen vereinigt werden.
Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von Alkalimetall-
bzw. Erdalkalimetall-Oxiden, -Hydroxiden, -Carbonaten, -Hydrogencarbonaten oder tert. Aminen, wie z.B. Triäthylamin,
N-Methylmorpholin, Triäthanolamin oder Pyridin, eingestellt
und konstant gehalten. Die Umsetzungen können aber
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auch in Pufferlösungen, insbesondere Phosphat- oder Boratpuffern
durchgeführt werden. Die Umsetzungsgeschwindigkeiten können zweckmäßig über den pH-Wert des Reaktionsgemisches
gesteuert werden, wie Tab. 1 für die Umsetzung von BPTI mit der 3,5-Dichlorbenzol-diazoniumverbindung zeigt.
Abhängigkeit der Umsetzungsdauer von pH-Wert der Reaktions· lösung bei der Kupplung von 2 Äquivalenten diazotiertem
3,5-Dichloranilin mit BPTI
pH-Wert der Umsetzungsdauer
Reaktionslösung
6.0 24 Std.
7.0 5 Std.
8.0 2 Std.
9.0 ca.1 Std.
10.0 5 Min.
11 .0 ca.3 Min.
12.0 3 Min.
+) Der Endpunkt der Umsetzung wurde durch Tüpfelreaktion ermittelt, bei der eine Probe der Reaktionslösung mit
1-(2-Aminoäthylamino)-naphthalin als Kupplungspartner umgesetzt wurde.
Der Grad der Kupplung ist bei allen hier aufgeführten pH-Werten nach den angegebenen Zeiten etwa gleich.
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Während der Kupplungsreaktionen hält "man die Temperaturen der
Reaktionsgemische bei -15 C bis 30 C, vorzugsweise bei 0 C bis 100C. Unter Umständen ist es zweckmäßig, die Kupplung zunächst
bei Temperaturen zwischen 00C und 4 C durchzuführen und anschliessend
die Temperatur bis auf 25 C zu erhöhen, überschüssige
Diazoniumverbindung kann ggf. vor der Aufarbeitung des Reaktionsgemisches durch Zusetzen von z.B. von Phenol zur Reaktionslösung gebunden werden. Der Verbrauch an Diazoniumverbindung
während der Kupplungsreaktionen kann anhand von Probekupplungen mit 1-(2-Aminoäthylamino)-naphthalin durch Tüpfeln verfolgt
werden. Das molare Verhältnis von Diazoniumverbindungen zu BPTI bzw. BPTI-Derivat beträgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
1s1 bis 10:1, vorzugsweise 1:1 bis 5:1, wobei die Konzentrationen
an BPTI bzw. BPTI-Derivaten in den zur Kupplung verwendeten Lösungen bei 1-30 %, vorzugsweise bei 5-15 % liegen.
Als Azokomponenten sind zur Darstellung der erfindungsgemäßen
Azo-BPTI-Derivate ein- oder mehrkernige aromatische sowie heterocyclische Diazoniumverbindungen geeignet, die aus den
entsprechenden Aminen dargestellt werden. Diese können noch einen oder mehrere Substituenten tragen. Insbesondere sind
Derivate des Anilins geeignet, z.B. Alkylaniline, Alkoxyaniline, Halogenderivate des Anilins, Nitroaniline, Cyanoaniline, Tr ifluormethylaniline,
Acetaminoaniline, Amino-acetophenone, Aminobenzolsulfonsäuren, Anilindisulfonsäuren, Aminobenzolarsinsäuren.
Aminobenzoesäuren, Aminodiphenylather; als mehrkernige
Amine sind besonders -·* - und ß-Naphthylamin sowie
deren Derivate, z.B. Aminonaphthalinsulfonsäuren, geeignet.
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Die Diazotierung der Amine wird nach den üblichen Verfahren /R.Pütter, in "Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie",
Band 10/3, S. 1 ff., Hrsg. E.Müller unter Mitwirkung von O.Bayer, H.Meerwein und K.Ziegler, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart 1965/ durch Umsetzen mit Nitrosylionen-liefernden Verbindungen, insbesondere Natriumnitrit in mineralsaurer
Lösung oder Suspension ggf. in Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln, insbesondere von Dimethylformamid, Essigsäure
oder Propionsäure, bei Temperaturen von -20 C bis 50 C, vorzugsweise -5°C bis 20°C, oder aber mit Nitrosylschwefelsäure
bzw. Nitrosylchlorid in Essigsäure-Propionsäure-Gemischen unter Zusatz von Mineralsäure bei Temperaturen um vorzugsweise
-20° bis 0° durchgeführt. Die Zeitdauer der Diazotierung ist sehr unterschiedlich; sie hängt ab von der Löslichkeit
der Amine sowie deren Substitutionsmuster und schwankt zwischen wenigen Minuten und mehreren Stunden, überschüssige
Nitrosylionen werden nach der Diazotierung durch Umsetzen mit Amidosulfonsäure oder Harnstoff zerstört, um
eine Desaminierung der BPTI-Derivate durch Nitrosylionen, wie sie beim Durchführen der Kupplungen im saurem Milieu "
möglich ist (vgl. Deutsche Patentanmeldung P 26 19 246.1), zu verhindern.
Bei der Kupplung von BPTI oder BPTI-Derivaten mit den Diazoniumverbindungen
werden Gemische verschiedener Komponenten erhalten. Die Zusammensetzung dieser Azo-BPTI-Derivat-Gemische
kann durch die Wahl der Umsetzungsbedingungen, insbesondere über das Verhältnis von zur Kupplung eingesetztem BPTI bzw.
BPTI-Derivat und Diazoniumverbindung, den pH-Wert der Reaktionsgemische,
die Zeitdauer der Umsetzung sowie durch die obengenannten Zusätze zu den Reaktionslösungen gesteuert werden.
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Derartige Zusätze verhindern außerdem die Ausfällung der mitunter
recht schwerlöslichen Azo-BPTI-Derivate und ermöglichen
eine weitergehende Umsetzung. So reagiert BPTI z.B. mit diazotiertem 5—Amino-1H-Tetrazol auch bei Verwendung von 10
Äquivalenten Diazoniumverbindung in wäßriger Lösung nicht zum
Äzo-Derivat, während in Gegenwart von 4 m Harnstoff unter
sonst gleichen Bedingungen Kupplung zu Azo-BPTI-Derivaten
erfolgt. Die genannten Zusatzstoffe und andere niedermolekulare Substanzen lassen sich nach beendeter Kupplung z.B.
durch Ultrafiltration, Gelfiltration oder Dialyse mit acetylierten
Dialysierschläuchen abtrennen. Die Gemische von Azo-BPTI-Derivaten
können z.B. durch Chromatographie an Ionenaustauschern
fraktioniert werden.
Chromatographiert man ein Substanzgemisch, das durch Kupplung
von BPTI mit diazotiertem 3,5-Dichloranilin nach Beispiel
erhalten worden ist, an SP-Sephadex C 25, das mit 0,05 M Ammoniumacetatlösung äquilibriert worden ist, indem man zunächst
mit einem NaCl-Gradienten und darauf mit 0,5 M NH3-Lösung
eluiert, so erhält man verschiedene Fraktionen, die sich durch ihre elektrophoretische Beweglichkeit, ihre
quantitative Aminosäurezusammensetzung, ihr Absorptionsspektrum sowie durch ihr Hemmvermögen gegenüber einigen
charakteristischen Proteasen unterscheiden.
Einige der erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivate hemmen im
Gegensatz zu BPTI Elastasen aus Pankreas und Granulozyten, sowie Kathepsin G, das chymotrypsinartige Enzym aus Granuloeyten.
Gegenüber andßren Proteasen wie Chymotrypsin, Pankreäs-Kallikreinp Plasma-Kallikreis, Plasmin und Trypsin
unterscheiden sich die Hemmspektren einzelner Derivate qualitativ und/oder quantitativ von dem BPTI. Bei der Elastaseheirmung
handelt es
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■.; 809822/0391
sich nicht um die von J· Pütter und G. Schmidt-Kastner/Biochiin.Biophys.
Acta 127, 538 (1966)/ beschriebene Blockierung desfSubstrats,
die nur bei sehr hohen BPTI-Konzentrationen erfolgt, sondern um eine Hemmung des Enzyms.
Diese Elastase-Hemmwirkung ist umso überraschender, als aus
dem derzeitigen Stand der Technik folgt /D.M.Blow, C.S.Wright,
D.Kukla, A.Rühlmann, W.Steigemann und R.Huber, J.Mol.Biol. 69,
137 (1972); R.Huber, D.Kukla, W.Steigemann, J.Deisenhofer und
A.Jones in H.Fritz, H.Tschesche, L.J.Greene und E. Truscheit (Hrsg.), Proteinase Inhibitors (Bayer-Symposium V) Proc.2nd
Intern.Res.Conference, S. 484, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New
York 19 74/, daß BPTI substratartig mit seinem aktiven Zentrum (Lysin-15-Rest) in die Spezifitätstasche der hemmbaren
Enzyme eingelagert wird und damit die Enzymaktivität blockiert. Selbst wenn die Seitenkette des Lysin-15-Restes
bei allen erfindungsgemäßen Derivaten desaminiert ist, ist
nach dem derzeitigen Wissensstand nicht zu erwarten, daß sie in die relativ kleine Spezifitätstasche der Elastasen (D.
Shotton in H.Fritz und H.Tschesche (Hrsg.), Proceedings of the International Research Conference on Proteinase Inhibitors,
S. 47, Walter de Gruyter, Berlin-New York 1971) hineinpaßt.
Die erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivate sind neu. Sie
lassen sich durch chemische, physikalisch-chemische, biochemische sowie biologische Eigenschaften charakterisieren
und gegenüber bekannten Substanzen abgrenzen. Es wurden folgende Kriterien herangezogen:
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1) Aminosaurezusammensetzung
Die Aminosäurezusammensetzung wurde nach S.Moore, D.H.Spackmann,
W.H.Stein /Anal.Chem.30, 1185 (1958)/bestimmt. Für einige
charakteristische Azo-BPTI-Derivate sind in Tabelle 2 die
Werte der Aminosäure-Reste angegeben, deren Gehalt durch die erfindungsgemäßen Desaminierungs-Reaktionen verändert
wird.
2) Elektrophoretisch^ Eigenschaften (Disk-Elektrophorese)
Disk-Elektrophoresen wurden in einem 15 %igem Trenngel mit
dem Puffersystem III, wie es von O.Gabriel in Methods Enzymol.
XXII, 565 (1971) beschrieben ist, durchgeführt. Die Stromstärke betrug 3 mA pro Röhrchen; die Trennung wurde beendet,
sobald der Markerfarbstoff (Methylgrün) vollständig durch
das Gel hindurchgewandert war. -Nach der Trennung wurden die Gele in einer 0,1 %igen Lösung von Amidoschwarz in 7
%iger Essigsäure 30 Minuten lang gefärbt, überschüssiger
Farbstoff wurde anschließend mit 7 %iger Essigsäure wieder entfernt.- Figur 1 gibt charakteristische Disk-Elektropherogramme
wieder.
In der Figur 1 (siehe Anlage) sind die Elektropherogramme
folgender Substanzen gegenübergestellt:
A: BPTI
B: BPTI-Derivat nach Beispiel 44
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F: BPTI-Derivat nach Beispiel 48
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VD
■Durch Arainosäureanaiyse von einigen Azo-B?T!-Derivaten ermittelte Gehalte an charakteristischen
Amino r.liur cn ' , .
Aisc-EPTI-Derivato
hergestellt nach
Beispiel
hergestellt nach
Beispiel
Mol Amihosaure-Rest / Hol Azo-BPT!-Derivat1
Glycin2 Alanin2 Tyrosin Lysin Arginin
| cn | BPTI |
| O | 5 |
| co . | SJl |
| οΰ | 7 |
| (S3 | 9 |
| 12 | |
| O | 17 |
| u> | 19 |
| CO | 25 |
| "^ ι | 24 |
| —* | 55 |
| VD | 58 |
| I | 59 |
| 42 | |
| 44 | |
| 45 | |
| 46 | |
| 48 | |
| 5o | |
| 52 | |
| 55 | |
| 55 |
| 6,o9 | 6,oo | 5,8o | 4,o8 | 6,ol |
| 6,11 | 5,64 | 5,49 | 3,37 | 5,68 |
| 6,28 | 6, OO | 5,o6 | 3,52 | 5,87 |
| 6,56» | 6,oo | 5,29 | 3,4o | 5,8o |
| 5,75 | 5,99 | 5,25 | 2,56 | 5,11 |
| 5,7o | 6,69· | 5,47 | 5,58 | 4,52 |
| 5,67 | 7,.27« | 5,45 | 5,o9 | 5,81 |
| 5,8o | 6,o8 | 5,58 | 5,15 | 4,68 |
| 5,7o | 5,71 | 5,4o | 5,oo | 5,73 |
| 5,79 | 5,75 | 2,81 | 1,59 | 5,42 |
| 5,5o | 5,65 | 5,55 | 2,89 | 5,66 |
| 5,6o | 6,11 | 5,41 | 2,61 | 4,49 |
| 5,85 | 5,81 | 5,25 | 2,11 | 5,81 |
| 5,48 | 5,78 | 1,25* | 5,25 | 5,65 |
| 5,81 | 5,84 | 5,o2 | 5,92 | 5,8o |
| 5,66 | 5,7o | 2,46 | 5,67 | 5,58 |
| 5,65 | 5,67 | 5,22 | 5,68 | 5,65 |
| 5,75 | 5,82 | 2,45 | 5,67 | 5,95 |
| 5,77 | 5,8o | 5,2o | 5,6o | 5,9o |
| 5,58 | 5,88 | 5,oo | 5,59 | 5,79 |
| 5,72 | 6,12 | 1,36 | 3,9o | 5,59 |
| 5,74 | 5,82 | 5,67 | 3.29 | 5.85 |
1) Das Molekulargewicht der Derivate wurde zu 6511 wie für nativen BPTI angenommen
2) Der Alanin- bzw. Glycin-Gehalt dient als interner Standard. Je nach den Elutionsbedingungen bei der Aminosäureanalyse
werden unbekannte mit Ninhydrin anfärbbare Substanzen zusammen mit Glycin und/oder Alanin eluiert, die dann
höhere Glycin- und/oder Alanin-Gehalte vortäuschen.
3) Zum Vergleich wurde eine Aminosäureanalyse von BPTI mit aufgenommen. Die theoretischen Werte der betreffenden
Aminosäuren betragen: GIy und AIa = 6,0; Tyr = 4,0;
Lys = 4,0; Arg = 6,0
4) Zusätzlich wurde Nitrotyrosin zu 2,01 gefunden
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3) Absorptions-Spektren
Zur Charakterisierung der erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivate
eignen sich insbesondere die Absorptions-Spektren. In 0,1 m Trispuffer pH 9,0 und 0,1 m Natriumhydroxidlösung
finden sich charakteristische Absorptionsmaxima bei 470-500 nm und bei 325 nm, in 0,1 m Acetatpuffer pH 4,5 bei 380 nm und 325 nm,
die jedoch gelegentlich nur als Schultern ausgeprägt sind. Auch Nitrogruppen können in den Absorptions-Spektren der
Azo-Derivate von Nitro-BPTI-Derivaten erkannt werden. In den Figuren 2-4 sind die Absorptions-Spektren einiger erfindungsgemäßer
Azo-BPTI-Derivate wiedergegeben.
Figur 2 zeigt die Absorptionsspektren von BPTI und einigen erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivaten in 0,1 molarem
Acetatpuffer pH 4,5. Die Kurven 1 bis 4 der Figur 2 sind folgenden Verbindungen zugeordnet:
1. BPTI
2. Azo-BPTI-Derivat gemäß Beispiel 5'
3. Azo-BPTI-Derivat gemäß Beispiel 13
4. Azo-BPTI-Derivat gemäß Beispiel 48
Figur 3 zeigt die Absorptionspektren von BPTI und einigen erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivaten in 0,1 molarer Trispuffer
lösung, bei pH 9,0
Die Kurven 1 bis 4 der Figur 3 bedeuten:
1. BPTI
2. Azo-BPTI-Derivat gemäß Beispiel 5
3. Azo-BPTI-Derivat gemäß Beispiel 13
4. Azo-BPTI-Derivat gemäß Beispiel 48
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.U-
Fugur 4 zeigt die Absorptionsprektren von BPTI und einigen erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivaten in 0,1 molarer Natriumhydroxidlösung
.
Die Kurven 1 bis 4 der Figur 4 bedeuten:
1. BPTI
2. Azo-BPTI-Derivat gemäß Beispiel 5
3. Azo-BPTI-Derivat gemäß Beispiel 13
4. Azo-BPTI-Derivat gemäß Beispiel 48
4) Proteasen-Inhibitionssprektrum
a) Elastase-Inhibition
Für die Hemmversuche mit den erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivaten
wurde kristallisierte Pankreas-Elastase (Schwein) der Fa. Nutritional Biochemicals Corp. verwendet.
Als Substrate wurden Elastin-Kongorot/M.A. Naughton und F.Sanger, Biochem. J. IjL' 1^6 (1961)/,
lösliches Elastin/S.Keller und I.Mandl, Biochem.Med.
5_, 342 (1971)/ sowie besonders vorteilhaft Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-p-nitroanilid/J.Bieth,
B.Spiess und C.G.Wermuth, Biochem.Med. V\_, 350 (1974)/
verwendet. Das synthetische Peptidsubstrat ermöglicht eine einfache colorimetrische Bestimmung der
im Test eingesetzten Enzymaktivität. Der Elastase-Einsatz betrug im Elastin-Kongorot-Test ca. 1,1 nkat
(vgl. Enzyme Nomenclature, Recommendations /1972/ of the International Union of Pure and Applied Chemistry
and the International Union of Biochemistry, 1973, Elsevier Amsterdam—New York, S. 26-27); mit löslichem
Elastin als Substrat und ebenso mit Succinyl-L-alanyl-
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L-alanyl-L-alanin-p-nitroanilid wurden ca. 0,25 nkat.
Elastase pro Test-Ansatz, eingesetzt. Zur quantitativen
Bestimmung der Elastase-Hemmung wurden die oben angegebenen Enzym-Mengen zu der mit Inhibitorlösungen
definierter Konzentration versetzten Substratlösung gegeben. Um maximale Komplexbildung sicherzustellen,
wurden ih einigen Fällen Enzym und Inhibitor vor der
Zugabe des Substrats 15 Min. vorinkubiert. Die Hydrolyse des Substrats wurde beim Elastin-Kongorot-Test
durch Messung der Extinktion bei 492 nm der nach einer definierten Zeit gebildeten löslichen Spaltprodukte
bestimmt. Beim Test mit löslichem Elastin wurde die Hydrolyse-Rate durch photometrische Bestimmung
der nach einer definierten Zeit in Lösung gegangenen mit Ninhydrin färbbaren Spaltprodukte ermittelt.
Bei Verwendung von Succinyl-L-alanyl-L-alanin-p-nitroanilid
als Substrat wurde die Hydrolyse durch kontinuierliche Messung der Extinktion des
freigesetzten p-Nitroanilins bei 410 nm bestimmt. Die Hemmwerte (ausgedrückt in % Hemmung) wurden ermittelt,
indem man die nach Inhibitorzusatz gemessene Elastase-Restaktivität von der Aktivität der Enzymkontrolle
substrahierte. Die Hemmwerte einiger Azo-BPTI-Derivate sind in den Tabellen 3 bis 5 zusammengestellt.
Fig. 5 zeigt die Abhängigkeit der Elastasehenunung von der Menge dreier Inhibitoren.
Andere erfindungsgemäße Azo-BPTI-Derivate zeigen einen ähnlichen Hemmverlauf.
Figur 5 zeigt die prozentuale Hemmung von 0,25 nkat Pankreas-Elastase (Schwein) durch einige der erfindungsgemäßen
Azo-BPTI-Derivate (bestimmt nach J.Bieth et
al mit 15 Minuten Vorinkubation von Inhibitor und Enzym (Vgl. Tabelle 5).
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Die Kurven 1,2 und 3 der Figur 5 bedeuten:
1. Azo-BPTI-Derivat nach Beispiel 7
2. Azo-BPTI-Derivat nach Beispiel 17
3. Azo-BPTI-Derivat nach Beispiel 28
ß) Granulozyten-Elastase-Inhibitoren
Das für die Hemmteste verwendete Isoenzymgemisch wurde
nach K.Ohlsson und I.Olsson /Europ. J. Biochem. 42, 519 (1974)/ aus Humangranulozyten gewonnen. Als Substrat
ist besonders Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alaninp-nitroanilid
/J.Bieth, B.Spiess und C.G.Wermuth,
Biochem.Med. JJ_, 350 (1974)/ geeignet. Die Hemmwerte
einiger Azo-BPTI-Derivate sind in Tabelle 6 aufgenommen;
die Abhängigkeit der Hemmung von den Inhibitorkonzentrationen ist für einige Derivate in
Fig. 6 wiedergegeben.
Figur 6 zeigt die prozentuale Hemmung von 0,25 nkat Granulocyten-Elastase (Schwein) durch einige der
erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivate (bestimmt nach J.Bieth et al mit 15 Minuten Vorinkubation von
Inhibitor und Enzym (vgl. auch Tabelle 6).
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^ Prozentuale Hemmung von 1,1 η kat Pankreas-Elastase (Schwein) durch verschiedene Azo-BPTI-Derivate mit
Elastin-Kongorot als Substrat, bestimmt nach M.A. Naughton und F. Sanger/Biochem.J. 78, 156 (1961)/ mit 15 Min.
Vorinkubation (+) und ohne (-) Vorinkubation von Enzym und Inhibitor.
| O | to |
| co | Ul |
| co | |
| NX | |
| •«ν. | |
| O | |
| co | |
| Azo-BPTI-Derivat her- hergestellt nach Bei spiel |
5 | 96 | 0 | 87 | + | % Hen 25 |
mating durch | ,ug PräpE 2,5 |
irat | 29 | 2 | 30 | 5 | 19 |
| 5 | 77 | 89 | 77 | 70 | 55 | 51 | 42 | 25 | 7. | 17 | ||||
| 7 | 75 | 89 | 56 | 73 | 35 | 41 | 24 | 29 | 19 | 16 | ||||
| 9 | 92 | 92 | 60 | 71 | 45 | 62 | 31 | 33 | 17 | 12 | ||||
| 11 | 69 | 84 | 87 | 76 | 62 | 56 | 31 | 27 | 21 | 16 | ||||
| 17 | 79 | 87 | 58 | 75 | 38 | 48 | 35 | 25 | 20 | 10 | ||||
| 19 | - | - | 55 | 75 | 46 | 46 | 35 | 20 | - | - | ||||
| 27 | - | - | 89 | 82 | 42 | - 39 | 28 | - | - | - | ||||
| 28 | - | - | 91 | 82 | 54 | 43 | - | - | - | - | ||||
| 36 | 73 | 75 | 76 | 76 | 38 | 26 | - | 20 | 22 | 10 | ||||
| 38 | - | - | 63 | 53 | 51 | 34 | 34 | - | - | - | ||||
| 41 | - | - | 82 | 98 | 35 | 41 | - | 41 | 22 | 25 ΓΟ J . cn |
||||
| 42 | 85 | 90 | 60 | 72 | 35 | |||||||||
1) Berechnet nach: % Hemmung = ( 1 -
OD Test
/\oD Enzyirkontrolle
). ioo
cn
Prozentuale Hemmung " von 0,25 η kat Pankreas-Elastase (Schwein) durch verschiedene Azo-BPTI-Derivate mit löslichem
Elastin als Substrat nach S.Keller und I.Mandl/Biochem. Med. 5_, 342 (1971)/ mit 15 Min (+) bzw. ohne Vorinkubation
(-) von Enzym und Inhibitor.
| Azo-BPTI-Derivat hergestellt nach Beispiel |
+ | 5 | 46 | + | 2 | 5 | 45 | He | dur 12 |
ch ,ug ,5 '_ |
F | 5 | — | 3 | 2,5 | 3 | |
| 1 | 51 | 54 | 54 | 53 | 29 | 14 | - | - | |||||||||
| 2 | 61 | 75 | 47 | 74 | 32 | - | 22 | 16 | |||||||||
| 3 | 86 | 67 | 82 | 62 | 73 | 32 | 19 | 23 | |||||||||
| I | 4 | 74 | 84 | 65 | 83 | 58 | 40 | 37 | 40 | ||||||||
| NJ <J\ |
5 | 86 | 54 | 82 | 47 | 77 | 56 | - | - | ||||||||
| I | 6 | 55 | 83 | 23 | 80 | 22 | - | 20 | 28 | ||||||||
| 7 | 87 | 87 | 83 | 68 | 66 | 48 | 10 | 23 | |||||||||
| 9 | 95 | 74 | 73 | 72 | 48 | 39 | 33 | 29 | |||||||||
| 11 | 89 | 87 | 83 | 92 | 72 | 63 | 30 | 18 | |||||||||
| 17 | 94 | 68 | 93 | 53 | 75 | 46 | 15 | 10 | |||||||||
| 18 | 87 | 79 | 73 | 72 | 48 | 25 | 32 | 15 | |||||||||
| 19 | 91 | - | 79 | 92 | 67 | 40 | 27 | ||||||||||
| 27 | - | 94 | 78. | 35 | |||||||||||||
| O | among | Yäparat | |||||||||||||||
| 46 | 14 | ||||||||||||||||
| 28 | - | ||||||||||||||||
| 68 | 37 | ||||||||||||||||
| 55 | 32 | ||||||||||||||||
| 78 | 63 | ||||||||||||||||
| 19 | - | ||||||||||||||||
| 55 | 36 | ||||||||||||||||
| 47 | 28 | ||||||||||||||||
| 68 | 52 | ||||||||||||||||
| 82 | 45 | ||||||||||||||||
| 60 | 31 | ||||||||||||||||
| 73 | 59 | ||||||||||||||||
| 67 | 56 |
Tabel le
4 (Fortsetzung)
VO
| οσ | I |
| ο | ro |
| CD | |
| ob | |
| es | |
| UJ | |
| ίο | |
Prozentuale Hemrung von 0,25 η kat Pankreas-Elastase (Schwein) durch verschiedene Azo-BPTI-Derivate mit löslichem
Elastin als Substrat nach S.Keller und I.Mandl/Biochem. Med. 5_, 342 (197D/ mit 15 Min (+) bzw. ohne Vorinkubation
(-) von Enzym und Inhibitor.
| Azo-BPn-Derivat hergestellt nach |
+ | 50 | — | + | % Hi | atnunc | durch /Ug 12-1 ' |
Präparat | I | 83 | + | mm |
| Beispiel | _ | - | 99 | + | 50 | 82+ | 83+ | |||||
| 28 | - | 91 | 99 | 97 | 49 | 23 | 30 | |||||
| 36 | 92 | 71 | 91 | 87 | - | 26 | 28 | |||||
| 38 | 71 | 35 | 61 | - | - | |||||||
| 42 | 18 | |||||||||||
| + I | ||||||||||||
| 99 | 98 | 85 | ||||||||||
| 99 | 84 | 48 | ||||||||||
| 93 | 86 | 41 | ||||||||||
| 32 | 15 | - | ||||||||||
, Λ /AOD Test
1) Berechnet nach % Hemmung = ( 1 - -ττ-
MOO
OD Enzyrnkontrolle
: 47 bzw. 51 % Kennung
ro cn cn
Oo O
to
** Prozentuale Hemmung von 0,25 η kat Pankreas-Elastase (Schwein) durch verschiedene Azo-EPTI-Derivate mit
"^ Succinyl-Ir-alanyl-I^alanyl-Ii-alaniJn-p-nitroanilid nach J. Bieth et al./Biochem.Msd.J^» 35° (1974)/mit 15 Min. (+)
vo und ohne (-) Vorinkubation
| Azo-BPTI-Derivat hergestellt nach Beispiel |
5 | 83 | 0 | 89 | + | 2 | 5 | 65 | % Hemru 1. |
ng durch 2,5 |
.ug Präpara | b | 18 | 2, | 12 | 5 | - | 5 | 5 | |
| 1 | 81 | 85 | 58 | 61 | 31 | 37 | 16 | 10 | - | 20 | - | |||||||||
| 3 | 90 | 89 | 52 | 65 | 26 | 34 | 19 | 21 | 18 | 13 | ||||||||||
| 4 | 86 | 81 | 58 | 62 | 38 | 51 | 18 | 14 | 10 | - | ||||||||||
| 5 | 97' | 89 | 84 | 63 | 44 | 35 | 24 | 22 | 41 | 12 | ||||||||||
| I | 7 | - | - | 89 | 9O | 55 | 4O | 36 | 34 | 30 | 14 | |||||||||
| ro 00 |
9 | 97 | 97 | 92 | 91 | 71 | 66 | 40 | 31 | 43 | 17 | |||||||||
| I | 10 | - | "1- | 86 | 92 | 59 | 67 | 23 | 46 | 38 | 22 | |||||||||
| 17 | - | - | 94 | 78 | 82 | 73 | 56 | 34 | 21 | 20 | ||||||||||
| 26 | - | - | 82 | 98 | 56 | 52 | 41 | 76 | 41 | 33 | ||||||||||
| 27 | - | - | 96 | 100 | 86 | 92 | 77 | 60 | 29 | 32 | ||||||||||
| 28 | - | - | 100 | 87 | 100 | 100 | 68 | 31 | 26 | 15 | ||||||||||
| 35 | - | - | 90 | 92 | 65 | 64 | 37 | 46 | 22 | 22 | ||||||||||
| 38 | - | - | 94 | 94 | 82 | 73 | 56 | 34 | - | |||||||||||
| 39 | - | - | 92 | 89 | 71 | 68 | 47 | 40 | 16 cn | |||||||||||
| 40 | - | - | 92 | 93 | 78 | 75 | 45 | 30 | 17 f^ | |||||||||||
| 41 | - | - | 96 | 66 | 77 | 73 | 42 | - | *>-■ | |||||||||||
| 46 | 77 ΤΓ~ |
38 | 32 | - | ||||||||||||||||
1) Berechnet nach % Hemmung = ( 1 -
Test
Λ OD Enzyjmfcontrolle
).100
ta «ο
μ Prozentuale Kennung von 0,25 η kat Granulozyten-Elastase (human) durch verschiedene Azo-BPTI-Derivate mit
> Succinyl-Ii-alanyl-Ii-alanyl-^alanin-p-nitroanilid als Substrat, bestinint nach J.Bieth et al. /Biochem.Med, Vl_, 350
^j (1974)/ mit 15 Min. (+) und ohne (-) Vorinkubation von Enzym und Inhibitor
VO
VO
| Azo-BPTI-Derivat hergestellt nach Beispiel |
5( + |
56 | % Hemmur + |
ig durch 5 |
,ug Präpc 12 + |
irat 5 |
+ | 11 |
| 3 | 55 | 69 | 36 | 36 | 24 | 23 | 10 | 15 |
| 4 | 60 | 75 | 45 | 41 | 23 | 23 | 9 | 15 |
| 5 | 78 | 32 | 56 | 52 | 31 | 30 | 13 | 0 ( |
| 7 | 35 | 52 | 20 | 19 | 0 | 0 | 0 | |
| 11 | 48 | 47 | 35 | 36 | 24 | 23 | 9 | 15 |
| 17 | 70 | 67 | 45 | 39 | 29 | 31 | 15 | 11 |
| 19 | 60 | 65 | 40 | 42 | 25 | 23 | 12 | 15 |
| 27 | 81 | 60 | 54 | 42 | 36 | 36 | 19 | - |
| 28 | 96 | 73 | 93 | 33 | 91 | 24 | - | - |
| 35 | 81 | 79 | 60 | 51 | 42 ο | - | - | 19 |
| 36 | 78 | 85 | 59 | 66 | 34 | 36 | 16 | - |
| 46 | 85 | 61 | 52 | 52 | 32 | 30 | - | 15 N? |
| 47 | 62. | 80 | 52 | 51 | 37 | 37 | 18 | cn |
| 51 | 79 | 54 | 54 | 29 | 31 | - | ||
1) Berechnet nach % Häutung = ( 1 -
OD Test
/\0D Enzyrnkontrolle
CO
ro
b) Inhibition von Chymotrypsin und chymotrypsinähnlichen Enzymen
.Pankreas-Chymotrypsin-Inhibition
.Pankreas-Chymotrypsin-Inhibition
Die Chymotrypsin-Aktivität wurde fluoresze^izspektrophotometrisch
nach H.Rinderknecht und R.M.Fleming / Clinica Chim. Acta j[9, 139 (1975)/ mit einem Spektrophotometer
Leitz PM-Q II bestimmt. Die Konzentration des als Substrat
verwendeten Glutaryl-diglycyl-L-phenylalanin-ß-
naphthylamids (bezogen von der Fa. Bachern, Liestal,
-4 Schweiz) lag im Testansatz bei 6,3 xlo m; auf 3 ml
Testlösung wurden 900 ng cC-Chymotrypsin (krist. Präparat
der Novo Industri A.S.) eingesetzt. Zur Fluoreszensanregung wurde Licht der Wellenlänge ?\„ - 365 nm ver-
£iX
wendet, die Messungen wurden bei Λ_ = 415 nm durchgeführt.
Für die Bestimmung der Hemmwerte wurden Enzymlösung und Azo-BPTI-Derivatlösung 15 Min. bei 25OC" vorinkubiert
und der FluoreszenzZuwachs nach Zugabe des Substrats
15 Min. lang registriert. Man errechnete die prozentuale Hemmung nach Extrapolation der 15-Min.-Fluoreszenzwerte
aus dem Bereich des linearen Anstiegs, vor dem Ab- · knicken infolge Substatmangels nach
/\ „ Test \
_±=±1 U loo.
/\ Enzymkontrolle/
Die in Tabelle 7 für einige Azo-BPTI-Derivate aufgeführten
Hemmwerte (ausgedrückt in %) wurden auf die durch die gleiche Menge BPTI bewirkte Hemmung (= 100 %) bezogen.
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Y\ Kathepsin-G-inhibition
Die Kathepsin-G-Aktivität wurde photometrisch nach B.CW.
Hummel/Canad.J.Biochem.Ph0ysiol. 2Z» 1393 (1959)J7 in der
Ausführung von K.N.Rao und B. Lombardi/Änal. Biochem. 65,
(1975)_7 mit Benzoyl-L-tyrosinäthylester bestimmt. Pro
Test wurden 20 nkat Enzym mit den Inhibitoren 15 Minuten
vorinkubiert; nach Zugabe des Substrates wurde darauf der Anstieg der Extinktion bei 256 nm 5 Minuten lang registriert.
Die prozentualen Hemmungen wurden nach Extrapolation aus dem linearen Bereich des Anstiegs nach
% Hemmung = (1 - ) .100
Enzymkontrolle
berechnet.
.o) Kininogenasen-Inhibition Plasma-Kininogenasen-Inhibition
Die Kininogenasen-Aktivität wurde nach C.Sampaio, S.C. Wong und E. Shaw / Arch. Biochem.Biophys. 1.65/
133, (1974)/ im pH-Stat-Verfahren bestimmt, jedoch wurde als Substrat anstelle von Tosyl-L-argininmethylester-hydrochlorid
Benzyl-L-arginin-äthylesterhydrochlorid
wegen der größeren Hydrolysegeschwindigkeit verwendet. Das Gemisch der Isoenzyme wurde nach
C.Sampaio et al. /Arch. Biochem. Biophys. 165, 133 (1974)/ durch Affinitätschromatographie aus der Human-Plasmafraktion
Cohn IV-I isoliert. Die in Tabelle 7 für einige Azo-BPTI-Derivate aufgeführten Hemmwerte
wurden, Wie unter Chymotrypsin-Inhibition angegeben,
ermittelt.
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κ* ro*
Tabelle 7
Hemmung von Serin-Proteasen durch verschiedene Αζο-ΕΡΠ-Derivate,
BPTI bewirkten Hemmunqen (100 %)
verglichen mit den durch gleiche Mengen
| Bezeichnung der Substanz |
Chymotrypsin | RLr Pankreas |
togenase Plasma |
Plasmin | Trypsin |
| BPTI (vergleich | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Azo-BPTI-Derivat nach Beispiel 1 |
113 | 108 | 86 | 49 | 94 |
| 3 | 75 | 94 | 81 | 70 | 55 |
| 4 | 105 | 90 | 102 | 85 | 60 |
| 5 | 118 | 84 | 92 | 64 | 88 ' |
| 7 | 95 | 94 | 123 | 60 | 88 O^ fm |
| 9 | 93 | 73 | 88 | 49 | 56 , |
| 10 | 67 | 102 | 112 | 36 | 57 |
| 17 | 103 | 97 | 129 | 40 | 35 |
| 18 | 115 | 101 | 105 | 81 | 89 |
| 19 | 100 | 93 | 105 | 43 | 100 |
| 20 | 95 | 89 | 92 | 42 | 50 |
| 23 | 100 | 91 | 100 | 55 | 87 |
| 26 | 33 | 29 | 92 | 15 | 19 |
| 35 | 113 | 97 | 94 | 66 | |
| 38 | 98 | 84 | 53 | 38 | ςη Cn |
| 46 | 74 | 97 | 96 | 90 | 64 _a |
| 47 | 98 | 63 | 71 | 42 | loo jy |
| 51 | 100 | 95 | 79 | 90 | 100 |
-Ά-
β)
Das Testenzym wurde nach C.Kutzbach und G.Schmidt-Kastner
/ Z.Physiol.Chem. 3_5_3, 1099 (1972) / erhalten,
und die Aktivitätsbestimmungen wurden nach denselben Autoren (s.o.) durchgeführt. Die in Tabelle 7 für
einige Azo-BPTI-Derivate aufgeführten Hemmwerte wurden,
wie unter Chymotrypsin-Inhibition angegeben, ermittelt.
d) Plasmin-Inhibition
Die enzymatische Aktivität von Plasmin wurde mit Azokasein
bestimmt. Als Enzym wurde mit Urokinase aktiviertes Plasminogen benutzt, das mittels Affinitätschromatographie
/ D.G. Deutsch, E.T. Merz; J. Med. 3_' 224 (1972)/
aus Humanplasma gewonnen wurde.
Die Herstellung des Substrates und das Prinzip des Testes sind beschrieben in / P.M. Starkey, A.J. Barrett;
Biochem.J. J_55_, 255 (1976) /. - Man bereitet für jede
Bestimmung zwei Ansätze A und B mit je 0,6 CU Plasmin, gelöst in 1,0 ml Puffer (0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan,
0,05 M NaCl, eingestellt auf pH 7,2 mit HCl). In beide Ansätze kommen je 1,25 .ug BPTI bzw. BPTI-Derivate,
gelöst in 1,25 ml Puffer (s.o.); zum Vergleich dient je ein Ansatz A und B mit 1,25 ml Puffer anstelle
des Inhibitors. Man inkubiert alle Ansätze 10 Min. bei 37 C und gibt darauf je 0,45 ml einer 2 %igen Azokaseinlösung
(in Puffer, s.o.) zu. Serie A versetzt man direkt danach mit 0,3 ml 30 %iger Trichloressigsaurelosung (TCA);
Serie B wird 60 Min. bei 37°C inkubiert und darauf mit 0,3 ml TCA versetzt. Die Ansätze werden nach ca. 20 Min.
zentrifugiert; die Extinktionen der überstände werden photometrisch bei 340 nm in einer 1 cm-KÜvette bestimmt.
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-3s-
Als Maß der enzymatischen Aktivität gilt die Extinktionsdifferenz der parallelen Ansätze A und B (/\E) .
Bezeichnet man die Extinktionsdifferenz,die von Plasmin
allein hervorgerufen wird, mit //\E1nn und die in Gegenwart
von Inhibitoren gemessene Extinktionsdifferenz mitZAE,
so ergibt sich die Hemmung des Plasmins durch die Inhibitoren unter den angegebenen Bedingungen durch den
folgenden Ausdruck
folgenden Ausdruck
100
. 100 %
Δ',
00
Die in Tabelle 7 für einige Azo-BPTI-Derivate aufgeführten Hemmwerte (ausgedrückt in %) werden auf die
durch die gleiche Menge BPTI bewirkte Hemmung (= 100 %) bezoaen.
durch die gleiche Menge BPTI bewirkte Hemmung (= 100 %) bezoaen.
e) Trypsin-Inhibition
Die Bestimmung von Trypsin wurde mit Benzoyl-L-argininäthylester-hydrochlorid
als Substrat im pH-Stat-Verfahren nach R.Ruyssen (Symposium on Pharmaceutical Enzymes and
their Assay, Universitaire Pers, Ghent, Belgium 1969,
S. 110) durchgeführt. Die in Tabelle 7 für einige Azo-BPTI-Derivate eingeführten Hemmwerte, wurden, wie unter Chymotrypsin-Inhibition angegeben, ermittelt.
S. 110) durchgeführt. Die in Tabelle 7 für einige Azo-BPTI-Derivate eingeführten Hemmwerte, wurden, wie unter Chymotrypsin-Inhibition angegeben, ermittelt.
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Versuchsanordnung zum Nachweis entzündungshemmender Wirkung bei der Ratte
a) Kaolin-induzierte Entzündungsreaktion
Die Entzündungsreaktion wurde durch intraplantare Injektion
von 0,1 ml einer 10 %igen Kaolinsuspension (Bolus weiß,
fein gepulvert, Merck AG, Darmstadt) in eine Hinterpfote
von 130-160 g schweren Wistarratten induziert. Die für die Behandlung der Entzündungsreaktion verwendeten erfindungsgemäßen
Azo-BPTI-Derivate sowie BPTI wurden in 0,9 %iger Natriumchloridlösung in einer Konzentration von 10-20 mg/ml
gelöst. Die Behandlung der Versuchstiere erfolgte durch intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane oder intravenöse
Injektion von 0,5 - 1,0 ml Lösung von Azo-BPTI-Derivaten und zum Vergleich BPTI entweder prophylaktisch, d.h. vor
Setzen der Entzündungsnoxe, oder therapeutisch, d.h. nach
Setzen der Entzündungsnoxe. Die Schwellung der entzündeten Pfote, die ein Maß für die Schwere der Entzündungsreaktion
ist, wurde mit dem -Antiphlogmeter nach KEMPER (F.Kemper
und G.Ameln, Z.ges.exp.Med. 13If407-4"11 (1959)) zeitlich
verfolgt.
Zur Ermittlung der Dosis-Wirkungsbeziehungen wurde der
4 Stunden nach Setzen der Entzündungsnoxe gemessene Wert
verwendet. Das Ergebnis des Vergleiches verschiedener Azo-BPTI-Derivate mit BPTI ist in Tabelle 8 wiedergegeben.
Es sind die Dosen in mg/kg angegeben, die eine 50 %ige (ED50) bzw. 75 %ige (ED75) Hemmung der Pfotenschwellung
im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe bewirken.
Der Wirkungsvergleich der Azo-BPTI-Derivate nach den Beispielen
in Tabelle 8 zeigt, daß sie dem BPTI in ihrer entzündungshemmenden Wirkung überlegen sind (Tab. 8).
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8: Hemmung der Kaolin-induzierten Entzündungs-
der Rattenpfote durch intravenöse Behandlung mit BPTI und Azo-BPTI-Derivaten.
Die Behandlung erfolgte 15 Minuten nach Setzen der Entzündungsnoxe. Aufgezeichnet sind die Mittelwerte und
der 5 %-Vertrauensbereich.
| Bezeichnung der | erhalten nach | ED50 | ED75 |
| Substanz | Beispiel | mg/kg | mg/kg |
| BPTI | - | 33,9 (26.7-52.1) |
wird nicht erreicht |
| Azo-BPTI-Derivat | 1 | 11,7 (10.4-13.3) |
27,3
(23.4-50.0) |
| Azo-BPTI-Derivat | 2 | 9,8 ( 8.9-10.5) |
26,8
(24.0-29.3) |
| Azo-BPTI-Derivat | 3 | 6,5 ( 5.4- 7.6) |
17,4
(15.0-20.8) |
| Azo-BPTI-Derivat | 6 | 8,7 ( 7.6- 9.8) |
25,9
(21.5-34.5) |
| Azo-BPTI-Derivat | 9 | 9,8 ( 8.5-10.4) |
15,6
(13.7-17.6) |
| Azo-BPTI-Derivat | 10 | 1,8 ( 1.4- 2.2) |
3,4
( 2.8- 4.3) |
| Azo-BPTI-Derivat | 17 | 5.4 ( 5.0- 5.9) |
8.8
( 8.0- 9.9) |
| Azo-BPTI-Derivat | 19 | 7.8 ( 6.1- 9.6) |
19.5
(16.3-24.1) |
| Azo-BPTI-Derivat | 37 |
10.4
(10.1-11.1) |
15.9
(15.1-16.9) |
| Azo-BPTI-Derivat | 38 |
5.7
( 3.8- 7.2) |
12.4
( 9.8-15.6) |
| Azo-BPTI-Derivat | 44 |
9.1
( 7.8-10.4) |
20.2
(16.9-25.4) |
| Azo-BPTI-Derivat | 47 |
1,5
( 1.1- 2.1) |
4,5
( 3.1- 7.4) |
| Azo-BPTI-Derivat | 48 |
9,9
( 8.7-11.3) |
22,1
(18.2-28.7) |
| Azo-BPTI-Derivat | 49 | 2.7 ( 2.3- 3.1) |
6,4 ( 5.6- 7.4) |
| Azö-BPTI-Derivat | 51 | 3.5 ( 2.1- 4.8) |
14,3 (11.7 - 18.2) |
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Tabelle 8: (Fortsetzung)
Bezeichnung der erhalten nach edro eD-c
Substanz Beispiel mg/kg mg/kg
Azo-BPTI-Derivat 52 4,5 15,6
( 2.9-5.9) (13.0-20.2)
Azo-BPTI-Derivat 55 10,5 20,8
( 9.8-11.7) (18.5-24.4)
b) Aerosil-induzierte Entzündungsreaktion
Die Entzündungsreaktion wurde durch intraplantare Injektion von 0,1 ml einer 2 %igen Aerosilsuspension (Aerosil 200,
Degussa AG, Frankfurt) in eine Hinterpfote von 130-160 g schweren Wistarratten induziert. Die für die Behandlung der
Entzündungsreaktion verwendenten erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivate bzw. BPTI wurden in 0,9 %iger Natriumchloridlösung
in einer Konzentration von 10-20 mg/ml gelöst. Die Behandlung der Versuchstiere erfolgt durch intraperitoneale,
subkutane oder intravenöse Injektion von 0,5 - 1,0 ml Lösung von Azo-BPTI-Derivaten und zum Vergleich BPTI 15 Stunden
nach Setzen der Entzündungsnoxe. Die Schwellung der entzündeten Pfote, die ein Maß für die Schwere der Entzündungsreaktion
ist, wurde mit dem Antiphlogmeter nach KEMPER zeitlich verfolgt. Zur Ermittlung der Dosis-Wirkungsbeziehungen
wurde der 21-Stundenwert nach Entzündungsinduktion (= 6 Stunden nach Injektion der erfindungsgemäßen
Azo-BPTI-Derivate bzw. des BPTI) ermittelt. Das Ergebnis des Vergleichs verschiedener Azo-BPTI-Derivate mit
BPTI ist in Tabelle 9 wiedergegeben. Es sind die Dosen in mg/kg angegeben, die eine 30 %ige (ED30) bzw. 50 %ige (ED--)
Hemmung der Pfotenschwellung im Vergleich zu den unbehandelten Kontrol!gruppen bewirken.
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Das Ergebnis der Therapieversuche mit den Azo-BPTI-Derivaten
nach den Beispielen in Tabelle 9 zeigt die Wirksamkeit der verwendeten Azo-BPTI-Derivate in diesem experimentellen
Modell, in dem BPTI in gleicher Dosierung die Entzündungsreaktion nicht hemmt. Damit ist die Überlegenheit der Azo-BPTI-Derivate als Arzneimittel gegenüber dem BPTI nachgewiesen.
Modell, in dem BPTI in gleicher Dosierung die Entzündungsreaktion nicht hemmt. Damit ist die Überlegenheit der Azo-BPTI-Derivate als Arzneimittel gegenüber dem BPTI nachgewiesen.
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Hemmung der Aerosil-induzierten Entzündungsreaktion
der Rattenpfote durch intravenöse Behandlung mit BPTI und BPTI-Derivaten. Die Behandlung erfolgte
15 Stunden nach Setzen der Entzündungsnoxe.
Aufgezeichnet sind die Mittelwerte und der 5 %-Vertrauensbereich.
| Bezeichnung der Substanz |
erhalten nach Beispiel |
ED30 mg/kg |
ED50 mg/kg |
—. -. |
| BPTI | KEINE AKTIVITÄT | 24,7 (15.6-51.0) |
||
| Azo-BPTI-Derivat | 10 | 7,8 (5.5-13.3) |
—— | |
| Azo-BPTI-Derivat | 18 | 5,7 (4.6-7.8) |
5.6 (4.9-6.5) |
|
| Azo-BPTI-Derivat | 19 | 10.3 (6.6-14.1) |
6.5 (5.9-7.5) |
|
| Azo-BPTI-Derivat | 47 | 3.0 (2.7-3.4) |
5,6 (3.5-7.2) |
|
| Azo-BPTI-Derivat | 49 | 3.6 (3.3-4.0) |
||
| Azo-BPTI-Derivat | 50 | 1,1 (.26-2.1) |
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Die erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivate sind dem BPTI als
Arzneimittel überlegen. Von besonderem Vorteil sind ihre inhibitorischen Wirkungen auf die Elastasen aus Pankreas und
Granulozyten, die neue therapeutische Einsatzmöglichkeiten eröffnen. Pankreas-Elastase spielt eine wichtige Rolle bei
der Pankreatitis /M.C.Geokas, H.Rinderknecht, V.Swanson,
B.P.Vitron und B.J.Haverback, Clin.Res. J_6, 285 (1968)/;
Serum-Elastase bei der Atherosklerose /U.Butturini und M.Langen,
Klin.Wochenschr. ^O, 472 (1962) / und Granulozyten-Elastase
bei akuten und chronischen Entzündungen mit Bindegewebsschädigung / A.Janoff, Amer.J.Pathol. £8, 579 (1972)/,
bei Gefäßwandschädigungen /A.Janoff und J.D. Zeugs, Science
161, 702 (1968)/, bei nekrotisierenden Erkrankungen und
Degeneration von Lungengewebe, z.B. beim Emphysem /G.M.Turino,
R.M.Senior, B.D.Garg, S.Keller, NUM.Levi und I.Mandl,
Science 165, 709 (1969); H.E.Evans, M.M.Levi und I.Mandl, Amer. Rev. Respir.Dis. 101, 359 (1970) sowie A.Janoff, R.A.
Sandhaus, V.D. Hospelhorn und R.Rosenberg, Proc.Soc.Exptl.
Biol.Med. 140, 516 (1972)/. Ebenso wichtig ist die Rolle von lysosomalen Enzymen und insbesondere der Granulozyten-Elastase
bei immunologisch bedingten Entzündungsreaktionen/ M.Koono, M.Muto und H.Hayashi, Tohoku J.Exptl.Med. 9_4* 231
(1968) /, z.B. der rheumatoiden Arthritis /G.Weissmann und
J.Spilberg, Arthritis Rheumat. _1_1_, 162 (1968)/.
Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivate
in Modellen der akuten Entzündungsreaktion dem BPTI überlegen sind, da mit ihnen nicht nur in deutlich geringeren
Dosierungen die gleiche Wirkung wie mit BPTI erreicht wird, sondern die Entzündungsreaktion auch dann signifikant gehemmt
wird, wenn sie mehrere Stunden nach Setzen der Entzündungsnoxe verabreicht werden. Eine solche therapeutische
Wirkung ist mit BPTI im Koalin- und Aerosilmodell bei einmaliger Gabe nicht zu erreichen.
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-H5-
2Θ54124
Diese im Vergleich zu BPTI veränderte Wirkung und Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivate sind auf das
veränderte Hemmspektrum und andere veränderte Eigenschaften, wie größere Verweildauer und Wirkungszeit im Körper der Versuchstiere,
zurückzuführen. Die erfindungsgemäßen BPTI-Derivate sind deshalb biologisch deutlich vom BPTI abzugrenzen.
Die neuen erfindungsgemäßen Azo-BPTI-Derivate des BPTI können
aufgrund ihrer biologischen Wirksamkeit insbesondere zur Behandlung folgender Krankheiten bzw. Krankheitserscheinungen
eingesetzt werden:
1. Verschiedene Formen des Schocks, posttraumatischer und postoperativer Komplikationen
2. Störungen der Blutgerinnung
3. Akute und chronische Entzündungsreaktionen, insbesondere zur Therapie und Prophylaxe von Organschädigungen, wie
beispielsweise Pankreatitis und Strahlen-induzierte Enteritis
4. Immunkomplex-bedingte Entzündungsreaktionen, wie Immun-Vasculitis,
Glomerulonephritis und Arthritiden
5. Kollagenosen, insbesondere rheumatoide Arthritis
6. durch Stoffwechsel-bedingte Ablagerungen verursachte
Arthritiden (z.B. Gicht)
7. Degeneration der elastischen Bestandteile der Bindegewebsbestandteile
von Organen wie bei der Atherosklerose und Lungenemphysem.
Die neuen Wirkstoffe können in bekannter Weise (analog BPTI) in die üblichen Formulierungen überführt werden.
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ORIGINAL fNBPECTED
Folgende Formulierungen sind dabei bevorzugt zu nennen:
1. Lösungen für parenterale Anwendung zur i.V.-, i.m.-,
s.c.-Injektion, zur intraartikulären und intratumoralen
Injektion
2. Lösungen für intravenöse Dauerinfusion
3. Lösungen zur Anwendung als Aerosole zur Inhalation
4. Lösungen, Emulsionen, Salben, Pasten, Cremes, Lotions, Puder zur äußerlichen lokalen Anwendung
5. Kombination verschiedener Hemmstoffe, deren Wirkungsspektrum sich gegenseitig ergänzt.
Die Konzentrationen der neuen Wirkstoffe in den erfindungsgemäßen
Formulierungen bewegen sich in den Grenzen 0,01 bis 100 mg/ml Lösung, vorzugsweise zwischen 0,1 und 10 mg/ml
Lösung.
Die neuen Wirkstoffe können in üblicher Weise angewendet werden, insbesondere sind folgende Anwendungsmethoden als
bevorzugt zu nennen:
1. parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, intraartikulär,
intratumoral
2. lokal; als Aerosol
3. oral, evtl. in Magensaft-resistenten Anwendungsformen
und/oder Dünndarm-löslieh
Als Dosierungsbereich kann für die neuen erfindungsgemäßen
Verbindungen angegeben werden:
0,1 - 40 mg Wirkstoff / kg Körpergewicht, vorzugsweise 1 bis 25 mg Wirkstoff / kg Körpergewicht, die Dosierung ist
dabei vor allem abhängig von der zu behandelten Spezies sowie von der Appkikationsart.
Die erfindungsgemäßen, neuen Wirkstoffe können bei Mensch und Tier eingesetzt werden.
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mg Anilin-Oxalat (330,u Mol) wurden in 5 ml η Salzsäure ge-
löst und bei 4° eine Lösung von 25 mg Natriumnitrit (362 ,u
Mol) in 0,2 ml Wasser in die Mischung eingerührt. Nach 10
Minuten fügte man ca. 10 mg Harnstoff zu der Reaktionslösung und vereinigte nach weiteren 5 Minuten mit einer auf
4° vorgekühlten Lösung von 1 g BPTI (154 ,u Mol) in 10 ml
Wasser. Unter intensivem Kühlen und Rühren stellte man den pH-Wert des Reaktionsgemisches mit 4 η Natriumhydroxidlösung
auf 9,0 und rührte die Suspension weitere 20 Minuten unter
Kühlen. Nach Zusatz einer kleinen Menge Phenol wurde mit Essigsäure angesäuert und die klare Lösung zum Abtrennen
der Salze über Sephadex G 10 filtriert mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel. Die lyophilisierten Protein enthaltende
Eluate wurden zum Abtrennen der höhermolekularen Anteile (10 mg = 1 %) an Sephadex G 50 mit 0,1 m Essigsäure
als Elutionsmittel· chromatographiert. 720 mg orangegelbe Substanz (72 %) wurden als Lyophilisat isoliert.
Zu einer Lösung von 129 mg p-Methylanilin-hydrochlorid
(900 ,u Mol) in 5 ml 2 η Salzsäure fügte man bei 4 unter
gutem Rühren eine Lösung von 69 mg Natriumnitit (1 mMol)
in 0,2 ml Wasser hinzu. Nach 15 Minuten wurde eine kleine Menge Amidosulfonsäure in die Reaktionslösung gegeben, gefolgt
von einer gekühlten Lösung von 1 g BPTI (154 ,u Mol)
in 10 ml Wasser und einer für die Einstellung des pH-Wertes des Reaktionsgemisches auf 9 erforderlichen Menge
an 4 η Natriumhydroxidlösüng. Man rührte die entstandene rote Suspension 15 Minuten lang bei 4°, wobei ein Nieder-
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schlag ausfiel. Nun wurde eine kleine Menge Phenol in die Suspension eingetragen und nach 5 Minuten Essigsäure bis
zum Erreichen von pH 4,5. Die nun klare Lösung wurde durch Filtration über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure als EIutionsmittel
entsalzt. Nach dem Gefriertrocknen der Protein enthaltenden Eluate wurden 52 mg (5,5 %) höhermolekulare
Anteile durch Chromatographie an Sephadex G 50 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel abgetrennt. Durch Gefriertrocknen
der Hauptfraktion wurden 670 mg (67 %) gelbe Substanz
isoliert.
In die Lösung von 192 mg p-Methoxyanilin (1,54 mMol) in
20 ml 1 η Salzsäure wurde bei 4° eine Lösung von 125 mg Natriumnitrit (1,81 mMol) in 0p5 ml Wasser eingerührt.
Mach 15 Minuten setzte man eine kleine Menge Harnstoff zu
der Reaktionslösung r und nach weiteren 15 Minuten vereinigte
man sie mit einer vorgekühlten Lösung von 5 g BPTI (770/U Mol) in 30 ml Wasser und fügte 4 η Natriumhydroxidlösung
hinzu, bis der pH-Wert des Reaktionsgemisches 9,0 betrug. Wach 15 Minuten Rühren unter Eiskühlung wurde
eine kleine Menge Phenol in die Reaktionsmischung, in der sich ein Niederschlag gebildet hatte, gegeben. Nach
weiteren 5 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit Eisessig angesäuert, wobei der Niederschlag sich löste.
Zum Abtrennen der Salze wurde das Reaktionsgemisch mit 0,2 m Essigsäure als Laufmittel über Sephadex G 10
(5 χ 100 cm) filtriert; die Protein enthaltenden Fraktionen wurden lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde an Sephadex
G 50 mit 0,1 m Essigsäure als Laufmittel fraktio-
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-HV
niert. Dabei wurden eine höhermolekulare Fraktion (nach Lyophilisierung 0,19 g = 4 %) und das gelbe monomere Reaktionsprodukt
(nach Lyophilisierung 4,19 g = 84 %) isoliert.
Mol)
Zu einer Lösung von 42,5 mg p-Aminobenzoesäure (310 ,u
in 5 ml η Salzsäure fügte man unter gutem Rühren bei 4°
25 mg festes Natriumnitrit (362 ,u Mol) hinzu. Nach 10 Minuten wurde eine kleine Menge Amidosulfonsäure in die Reaktionslösung
gegeben, die nach weiteren 5 Minuten mit einer Lösung von 1 g BPTI (154 ,u Mol) in 10 ml Wasser vereinigt
wurde. Man versetzte das Reaktionsgemisch nun mit 4 η Natriumhydroxidlösung
bis zum Erreichen von pH 8,8 und rührte es 20 Minuten unter Eiskühlung. Nach Zugabe einer kleinen
Menge Phenol wurde das Reaktionsgemisch nach weiteren 5 Minuten mit Eisessig bis zur deutlich sauren Reaktion versetzt
und durch Filtration über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel entsalzt. Die höhermolekularen
Anteile - 80 mg (8 %) - wurden durch Chromatographie an Sephadex G 50 abgetrennt. Nach dem Gefriertrocknen der
Hauptfraktion erhielt man 760 mg gelb-orange Substanz
(76 %) .
In eine Lösung von 54 mg p-Sulfanilsäure (310yU Mol) in
5 ml η Salzsäure gab man unter gutem Rühren bei 4° 25 mg festes Natriumnitrit (362,u Mol). Man rührte 10 Minuten
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unter Eiskühlung, setzte dann eine geringe Menge Harnstoff zum Reaktionsgemisch und nach weiteren 5 Minuten Natriumhydroxidlösung,
bis ein pH-Wert von 6,5 erreicht worden war. Dann wurde die Lösung des Diazoniumsalzes vereinigt
mit einer gekühlten Lösung von 1 g BPTI (154,uMol) in 10
ml 1 m Kaliumcarbonat-Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,4. Man
rührte die Reaktionslösung 10 Minuten bei 4° und setzte ihr dann eine geringe Menge Phenol zu. Dann wurde durch Zutropfen
von Essigsäure ein pH-Wert von 5,5 eingestellt und zum Abtrennen der Salze über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure
als Laufmittel filtriert ( Säule» 2,2 χ 90 cm). Nach dem Gefriertrocknen der Protein enthaltenden orangefarbenen
Fraktion wurden die polymeren Anteile durch Chromatographie an Sephadex G 50 abgetrennt. Man erhielt 150 mg Polymerfraktion
(15 %) und 600 mg monomere orangefarbene Substanz (60 % Ausbeute).
Zu einer Lösung von 52 mg p-Arsanilsäure (308 ,u Mol) in·
5 ml η Salzsäure fügte man unter gutem Rühren bei 4° 25 mg Natriumnitrit (362 ,u Mol) . Nach 15 Minuten wurde eine
kleine Menge Amidosulfonsäure in die Reaktionslösung eingetragen und diese nach weiteren 5 Minuten vereinigt mit
einer gekühlten Lösung von 1 g BPTI (154 u Mol) in 10 ml Wasser. Durch Zugabe von Natriumhydroxidlösung wurde ein
pH-Wert von 8,8 eingestellt und die Reaktionslösung 15
Minuten unter Eiskühlung gerührt. Dann wurde eine kleine Menge Phenol in die Mischung gegeben und nach weiteren
5 Minuten Eisessig bis zum Erreichen von pH 5,0. Man
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entsalzte nun die Reaktionslösung durch Filtration über Sephadex G 10 - 2,2 χ 120 cm - und trennte höhermolekulare
Anteile ab durch Chromatographie der entsalzten Lösung an Sephadex G 50 mit 0,1 m Essigsäure als Laufmittel.
Man erhielt nach dem Gefriertrocknen neben 90 mg (9 %) Polymeren 690 mg (69 %) an monomerer orange-gelber
Substanz.
320 mg p-Amino-o'-carboxydiphenyläther-hydrochlorid (1,24
mMol) , erhalten durch katalytische Hydrierung von p-Nitroo'-carboxydiphenyläther
/P.F„Blicke und D.F.Smith, J.Amer.
Chem.Soc. ^J_, 1947 (1929)/, wurden in 3 ml absol. Dimethylformamid
gelöst und in feinverteilter Form durch Versetzen der Lösung mit einem Gemisch von 5 ml η Salzsäure
und 0,2 ml konz. Salzsäure ausgefällt. Nach dem Abkühlen der Suspension auf 4° wurde unter gutem Rühren eine Lösung
von 95 mg Natriumnitrit (1,36 mMol) in 0,2 ml Wasser zugefügt und das Reaktionsgemisch 20 Minuten bei 4° gerührt,
wobei alsbald eine klare Lösung entstand. Nach Minuten setzte man ca. 50 mg Harnstoff zu und stellte
den pH-Wert des Reaktionsgemisches schließlich mit 4 η Natriumhydroxidlösung auf 6,5. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit einer eiskalten Lösung von 2 g BPTI (308,u Mol)
in 15 ml eines 1 m Kaliumbicarbonat-Natriumcarbonat-Puffers,
pH 9,5 vereinigt. Man hielt die Reaktionslösung,
aus der sich bald ein Niederschlag abschied, 30 Minuten unter Rühren bei 4° und fügte schließlich Eisessig zu
bis zum Erreichen von pH 5,5. Die nun klare Lösung wurde
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zum Abtrennen der Salze über Sephadex G 10 filtriert mit 0,1 m Essigsäure als Eluans (Säule: 120 χ 2,3 cm). Aus
der beim Gefriertrocknen der Protein enthaltenden Fraktion gewonnenen gelben Substanz wurden durch Chromatographie
an Sephadex G 50 mit 0,1 m Essigsäure 140 mg
(7 %) polymere Anteile abgetrennt. Die Hauptfraktion lieferte beim Gefriertrocknen 1870 mg braun-orange Substanz
(93 %) .
In eine Lösung von 212 mg p-Aminodimethylanilin (1,55
mMol) in 2,5 ml 4 η Salzsäure tropfte man bei 4 unter gutem Rühren langsam eine Lösung von 107 mg Natriumnitrit
(1,55 mMol) in 0,25 ml Wasser. Nach 5 Minuten wurde eine kleine Menge Amidosulfonsäure zu der dunklen Reaktionslösung
gegeben und nach weiteren 2 Minuten eine auf 4° vorgekühlte Lösung von 1 g BPTI (154 ,uMol) in 10 ml
Wasser. Man setzte nun 5 η Natriumhydroxidlösung bis zum Erreichen von pH 9,5 zu der Reaktionsmischung zu und rührte
die oliv gefärbte Lösung 10 Minuten unter Eiskühlung. Dann .wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit Eisessig
auf 3,5 eingestellt und die Lösung zum Entsalzen über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure als Laufmittel
filtriert. Durch Chromatographie der Protein enthaltenden Eluate an Sephadex G 50 mit Essigsäure als Laufmittel
wurden schließlich 72 mg polymere Anteile (7 %) von der Hauptfraktion abgetrennt. Nach dem Gefriertrocknen blieben
783 mg braune Substanz (78 %) zurück.
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Aus 62 mg p-Aminoacetophenon (462 ,u Mol) wurde, wie in
Beispiel 1 beschrieben, nach dem Lösen in 5 ml 2 η Salzsäure das Diazoniumsalz hergestellt. Man stellte den pH-Wert
der Diazoniumsalzlösung mit eisgekühlter 4 η Natriumhydroxidlösung auf 4,0 und vereinigte dann das Reaktionsgemisch mit einer gekühlten Lösung von 1 g BPTI in 10 ml
Wasser. Zur Kupplung wurde die Reaktionslösung 10 Minuten bei pH 8,8 im Eisbad gerührt. Es schied sich sofort unter
Rotfärbung ein Niederschlag ab. Nach dem Versetzen mit einer kleinen Menge Phenol wurde bis zum Erreichen eines
pH-Wertes von 4,5 Eisessig in das Reaktionsgemisch gegeben und das ungelöste Material abzentrifugiert (10 Min./
3000 U) .Aus der überstehenden Lösung erhielt man nach
dem Entsalzen an Sephadex G 10 und Gefriertrocknung der Protein enthaltenden Eluate 965 mg orangefarbene Substanz,
die zum Abtrennen von höhermolekularen Anteilen (97 mg; 10 %) an Sephadex G 50 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel
chromatographiert wurde. Man erhielt durch Gefriertrocknung der Hauptfraktion 876 mg (88 %) orangefarbene
Substanz.
100 mg 3,5-Dichloranilin (615,u Mol) wurden in 0,5 ml
Eisessig gelöst und durch Zugabe von 5 ml 2 η Salzsäure unter gutem Rühren in feiner Verteilung wieder ausgefällt.
In diese Suspension wurde nach dem Abkühlen auf
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4 eine Lösung von 49 mg Natriumnitrat (71O,u Mol) in 0,2
ml Wasser eingerührt, wobei alsbald eine klare Lösung entstand. Nach 15 Minuten Rühren setzte man eine kleine Menge
Harnstoff zu dieser Lösung und vereinigte sie nach weiteren
5 Minuten mit einer auf 4° vorgekühlten Lösung von 2 g BPTI (308 ,u Mol) in 20 ml Wasser. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde nun mit eiskalter konzentrierter Natriumhydroxidlösung
auf pH 8,6 eingestellt und die alsbald' gebildete Suspension 20 Minuten unter Eiskühlung gerührt.
Dann versetzte man das Reaktionsgemisch mit einer kleinen Menge Phenol und nach 3 Minuten mit Essigsäure bis zum
Erreichen von pH 4,0. Die durch Abschleudern geklärte Lösung wurde nun zum Abtrennen der Salze über Sephadex G 10
filtriert mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel und die salzfreie gefriergetrocknete Substanz an Sephadex G 50 mit
0,1 m Essigsäure chromatographiert. Man isoliert so nach
dem Gefriertrocknen 240 mg Substanz (12 %) aus der polymeren Vorfraktion und 1520 mg (76 %) aus der Hauptfraktion
(orangefarben) .
Beispiel Π
187 mg 3,5-Dichloranilin (1,15 mMol) wurden in 0,5 ml Eisessig
gelöst und nach dem Ausfällen mit 10 ml η Salzsäure, wie in Beispiel 10 beschrieben, diazotiert. Die Diazoniumsalzlösung
wurde schließlich mit einer auf 4 vorgekühlten Lösung von 2,5 g BPTI (385,u Mol) in 75 ml 4,5 m Harnstofflösung
vereinigt und der pH-Wert des Reaktionsgemisches unter intensivem Rühren und Kühlen mit 4 η Natriumhydroxidlösung
auf 10 gestellt. Nachdem die Reaktionslösung
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15 Minuten, bei 4° gerührt worden war, setzte man eine
kleine Menge Phenol zu und nach weiteren 5 Minuten Eisessig
bis zum Erreichen von pH 4,0. Dann wurde die Lösung
durch Ultrafiltration über ein UM 2-Filter auf ein Volumen von ca* 20 ml eingeengt und durch Filtration
über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel
entsalzt. Nach dem Abtrennen der höhermolekularen Anteile
durch Chromatographie an Sephadex G 50 mit 0,1 m
Essigsäure als Laufmittel wurden durch Gefriertrocknen
der Hauptfraktion 2194 mg orangefarbene Substanz (88 %
d. Th.) erhalten.
186 ing 3,5-Dichloranilin (1,15 mMol) wurden in einer Mischung
von 0,5 ml Eisessig und 0,5 ml Propionsäure gelöst. In diese Lösung wurden 0,3 ml konzentrierte Schwefelsäure
gegeben sowie ca. 0,3 ml Wasser, um das ausgefallene Sulfat zu lösen. Nach dem Abkühlen auf -15° rührte
man 175 mg Nitrosylschwefelsäure (1 ,38 mMol) in die Mischung
ein und hielt sie unter Rühren 20 Minuten bei 0° bis -5 G.Dann wurden 60 mg Harnstoff (1 mMol) zu der
Reaktionsmischung gegeben, die nach weiteren 20 Minuten mit einer auf 4 vorgekühlten Lösung von 2,5 g BPTI (385
,u Mol) in 20 ml Wasser vereinigt wurde. Unter intensivem
Rühren und Kühlen wurde der pH-Wert der Reaktionslösung
mit 4 η Natriumhydroxidlösung auf 4,0 gestellt und im Abstand von 30 Minuten um jeweils 1 pH-Einheit erhöht.
Nach dem Erreichen von pH 9,0 wurde die Suspension mit
einer kleinen Menge Phenol versetzt und anschließend mit Eisessig bis zum Erreichen von pH 4,0 versetzt. Die nun
klare Lösung wurde durch Filtration über Sephadex G 10 mit
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0,1 m Essigsäure als Laufmittel entsalzt. Schließlich wurden
durch Chromatographie an Sephadex G 50 hochmolekulare Anteile abgetrennt. Man erhielt durch Gefriertrocknung der
Hauptfraktion 2,15 g orangefarbene Substanz (86 %).
187 mg 3,5-Dichloranilin (1,15 mMol) wurden in 0,3 ml einer
1:1 Mischung von Essigsäure und Propionsäure unter Erwärmen
gelöst. Nach dem Abkühlen auf -10° wurden 190 mg Nitrosylschwefelsäure
in die Mischung gegeben und schließlich unter gutem Rühren 0,125 ml konzentrierte Schwefelsäure.
Dabei entstand alsbald ein orangefarbener Niederschlag. Nach 15 Minuten fügte man 60 mg Harnstoff zu dem Gemisch und vereinigte
es nach Zusatz von 5 ml Dimethylsulfoxid nach weiteren 20 Minuten mit einer Lösung von 1 g BPTI in 10 ml
90 proz. Dimethylsulfoxid. Man fügte eiskalte 4 η Natronlauge
(/v 2,5 ml) zu bis zum Erreichen von pH 9,5 und
gleichzeitig ca. 20 ml Dimethylsulfoxid, so daß stets eine Dimethylsulfoxidkonzentration von ^90 % erhalten blieb. Nach
einstündigem Rühren bei 4 wurden 30 mg Phenol in die Reaktionslösung gegeben und nach weiteren 10 Minuten Salze und
das Dimethylsulfoxid durch Filtration über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel abgetrennt. Man
erhielt 695 mg einer orangefarbenen Substanz.
Aus 25 mg 3,5-Dichloranilin (154.U Mol), gelöst in 3 ml 2 η
Salzsäure wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit einer Lö-
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sung von 12,5 rag Natriumnitrit (180 ,u Mol) in 50,u Wasser
das Diazoniumsalz hergestellt. Man vereinigte diese Diazoniumsalzlösung mit der Lösung von 1 g BPTI (154 ,u Mol)
in 10 ml Wasser und rührte das Gemisch nach Zugabe von 4 η Natriumhydroxidlösung bis zum Erreichen eines pH-Wertes
von 9,0 unter Eiskühlung. Dann wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit Essigsäure auf 4,0 eingestellt
und die klare Reaktionslösung zum Abtrennen der Salze
über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigäsure als Elutionsmittel filtriert. Nach dem Gefriertrocknen der salzfreien
Protein enthaltenden Eluate wurden polymere Anteile durch Chromatographie an Sephadex G 50 mit 0,1 m Essigsäure als
Elutionsmittel abgetrennt - 37 mg (4 %)-. Durch Gefriertrocknen der Hauptfraktion erhielt man 850 mg (85 %) einer
gelben Substanz.
54 mg p-Amino-cyclohexylbenzol (308 ,u Mol) wurden in 0,25
ml Eisessig gelöst und unter Rühren durch Zugabe von 5 ml η Salzsäure feinverteilt ausgefällt. Zu der Suspension
fügte man bei 4 C unter gutem Rühren 25 mg Natriumnitrit
(362 ,u Mol) und nach 20 Minuten 30 mg Amidosulfonsäure
(309/U Mol) und vereinigte nach weiteren 5 Minuten die
klare Lösung mit einer Lösung von 1 g BPTI in 0,1 m Boratpuffer, pH 9,5. Mit 4 η Natriumhydroxidlösung wurde der
pH-Wert der Lösung auf 9,5 nachgestellt. Dabei fiel aus
der rot-gefärbten Lösung alsbald ein Niederschlag aus. Nach 15 Minuten wurde eine kleine Menge Phenol in das
Reaktionsgemisch eingetragen und dieses bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 4,5 mit Eisessig versetzt. Nach dem
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Abzentrifugieren vom Ungelösten - 10 Minuten, 3000 g wurde die überstehende Lösung durch Filtrieren über Sephadex
G 10 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel entsalzt. Aus dem salzfreien Lyophilisat wurden durch Chromatographie
an Sephadex G 50 (Säule: 2,5 χ 100 cm) mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel die höhermolekularen
Anteile (55 mg, 6 %) abgetrennt. Man erhielt 825 mg (82 %) gelb-orangefarbene Substanz.
Zu einer Lösung von 42 mg p-Amino-phenylacetamid (308 ,u Mol)
in 5 ml 2 η Salzsäure fügte man, wie in Beispiel 1 beschrieben, bei 4 C 25 mg Natriumnitrit (36O,u Mol) und vereinigte,
wie in Beispiel 1 beschrieben, die Lösung des Diazoniumsalzes mit einer Lösung von 1 g BPTI (154 ,u Mol) in 10 ml
Wasser. Die Kupplungsreaktion wurde, wie in Beispiel 1 angegeben, bei pH 9,0 durchgeführt und die dunkle Reaktionslösung durch Filtration über Sephadex G 10 entsalzt. Anschließend
wurden durch Chromatographie an Sephadex G 50 höhermolekulare Anteile (52 mg, 5 %) aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt. Beim Gefriertrocknen der Hauptfraktion
fielen 790 mg orangefarbene Substanz (79 %) an.
Zu einer Suspension von 60,5 mg 2,4,5-Trichloranilin
(308/U Mol) die durch Ausfällen des in 0,5 ml Eisessig
gelösten Anilinderivates mit 5 ml 2 η Salzsäure erhalten
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worden war, fügte man bei 4°C unter gutem magnetischen Rühren
eine Lösung von 25 mg Natriumnitrit(362 ,u Mol) in 0,1
ml Wasser, wobei alsbald eine Lösung entstand. Nach 10 Min. wurden 20 mg Harnstoff zu der Diazoniumsalzlösung hinzugefügt
und diese nach weiteren 5 Minuten mit einer Lösung
von 1 g BPTI (154 ,u Mol) in 10 ml Wasser vereinigt. Der
pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde durch Zusatz von 4 η Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt. Die Lösung färbte
sich sofort rot unter Bildung eines Niederschlages. Nach 20 Minuten Rühren im Eisbad versetzte man das Reaktionsgemisch
mit einer kleinen Menge Phenol und fügte Eisessig bis
zum Erreichen eines pH-Wertes von 4,5 zu. Die dabei erhaltene Lösung wurde durch Filtration über Sephadex G 10 mit 0,1 m
Essigsäure als Elutionsmittel entsalzt und die nach dem Gefriertrocknen der Protein enthaltenden Eluate erhaltene
Substanz zum Abtrennen höhermolekularer Anteile (89 mg, 9 %)
an Sephadex G 50 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel
chromatorgraphiert. Man erhielt schließlich aus der Hauptfraktion 726 mg orangefarbenes Lyophilisat (73 %).
Beispiel 18 .
71 mg 3,5-Bistrifluormethyl-anilin (310 ,u Mol) wurden in
250 /Ul Eisessig gelöst und durch Zugabe von 5 ml η Salzsäure
unter Rühren in feiner Verteilung wieder ausgefällt. Zu der erhaltenen Suspension fügte man bei 4 C unter gutem
Rühren eine Lösung von 25 mg (362 ,u Mol) Natriumnitrit und
erhielt so eine klare Diazoniumsalzlösung. Nach 15 Minuten Rühren unter Eiskühlüng versetzte man die Lösung mit einer
kleinen Menge Amidosulfonsäure und vereinigte sie nach weiteren 5 Minuten mit einer aus 4 C vorgekühlten Lösung
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von 1 g BPTI (154 ,u Mol) in 10 ml Wasser. Nun wurde der
pH-Wert der Lösung mit eiskalter 4 η Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt, wobei alsbald ein Niederschlag
ausfiel. Nach 15 Minuten Rühren unter Eiskühlung wurde eine kleine Menge Phenol zum Reaktionsgemisch gegeben
und dessen pH-Wert schließlich mit Eisessig auf 5,0 eingestellt. Man trennte die Substanz ab und entsalzte die
überstehende Lösung durch Gelfiltration über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel. Nach dem Gefriertrocknen
der Protein enthaltenden Eluate wurden durch Chromatographie an Sephadex G 50 80 mg Polymere (8 %) abgetrennt
und durch Gefriertrocknen der Hauptfraktion 780 mg gelbe Substanz (78 %) erhalten.
Zu der durch Versetzen einer Lösung von 44,5 mg 3,4-Dicyano-anilin
(310 ,u Mol) in 0,25 ml Eisessig mit 5 ml η Salzsäure erhaltenen Suspension fügte man bei 4 C unter
gutem Rühren eine Lösung von 25 mg Natriumnitrit (362 I1 Mol) in 0,1 m Wasser. Nach 15 Minuten wurden ca.
10 mg feste Amidosulfonsäure (103 ,u Mol) in die Reaktionslösung gegeben und diese nach weiteren 5 Minuten mit
einer auf 4°C vorgekühlten Lösung von 1 g BPTI (154 ,u Mol)
in 10 ml Wasser vereinigt. Unter gutem Kühlen und Rühren wurde 4 η Natriumhydroxidlösung bis zum Erreichen
von pH 8,8 zu der Reaktionslösung zugetropft. Dabei schied sich ein orangefarbener Niederschlag aus der Lösung
ab. Nach weiteren 20 Minuten setzte man eine kleine Menge Phenol zu der Reaktionslösung und anschließend Eisessig
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bis zum Erreichen von pH 4,0. Das ungelöste Material trennte man durch Zentrifugieren (10 Min./3000g) ab und entsalzte
die überstehende Lösung durch Filtrieren über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure als Lösungsmittel. Durch
Chromatographie des Lyophilisates an Sephadex G 50 mit 0,2 m Essigsäure als Elutionsmittel wurden 90 mg höhermolekulare
Anteile (9 %) abgetrennt. Durch Gefriertrocknen der Monomerfraktion wurden 650 mg orangefarbene Substanz (65 %) erhalten .
71 mg p-Amino-azobenzol (360,u Mol) wurden in 15 ml einer
1:2 Mischung von Propionsäure und Essigsäure gelöst, und nach dem Abkühlen auf -10 C wurde die Lösung mit 0,2 ml
konzentrierter Schwefelsäure versetzt. Bei -10°C trug man 46 mg Nitrosylschwefelsäure (362 ,xi Mol) unter Rühren in das
Reaktionsgemisch ein und setzte nach 30-minütigem Rühren bei -100C 30 mg Harnstoff (500 ,u Mol) zu. Nach weiteren
30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit einer Lösung von 1 g BPTI (154,u Mol) in 10 ml einer 4 m Harnstofflösung
vereinigt, und man stellte den pH-Wert der Lösung unter Rühren und Kühlen mit vorgekühlter 50 proz. Natronlauge auf
8,8 ein. Nach 5 Stunden wurde das Gemisch mit Eisessig bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 4,0 versetzt und mit 50
proz. Essigsäure durch Filtrieren über Sephadex G 10 entsalzt. Die polymeren Anteile (78 mg, 8 %) wurden durch
Chromatographie an Sephadex G 50 abgetrennt. Durch Gefriertrocknen der Hauptfraktion wurden 725 mg (72 %) einer braunen
Substanz erhalten.
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65 mg 3-Trifluormethyl-4-fluoranilin (360 ,u Mol) wurden
in 5 ml 2 η Salzsäure gelöst und durch Umsetzen mit einer Lösung von 27 mg Natriumnitrit (391,u Mol) in 0,25 ml
Wasser bei 4°C diazotiert. Das überschüssige Nitrit wurde nach 15 Minuten durch Zugabe von 10 mg Harnstoff zerstört
und die Diazoniumsalzlösung nach 20 Minuten mit einer Lösung von 1 g BPTI in 10 ml Wasser vereinigt. Durch Zugabe
von eiskalter 4 η Natronlauge stellte man den pH-Wert der Lösung auf 9,0 ein und beließ sie 20 Minuten bei 4 C. Dann
wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit Essigsäure auf 4 gestellt und die Salze durch Filtrieren über Sephadex
G 10 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel abgetrennt. Nach dem Gefriertrocknen der Protein enthaltenden
Fraktionen wurden polymere Anteile ( 56 mg, 6%) durch Chromatographie an Sephadex G 50 abgetrennt. Durch Gefriertrocknen
der Hauptfraktion erhielt man 802 mg (80 %) orangefarbene Substanz.
78,0 mg^-Aminopyren (360 ,u Mol) wurden unter Erhitzen in
einer Mischung von 1,5 ml Wasser und 100,ul konzentrierter
Salzsäure gelöst. Die noch heiße Lösung wurde gleichzeitig mit einer Lösung von 25 mg Natriumnitrit (362 ,uMol)
in 150,ul Wasser in eine Mischung von 5 g Eis, 1 ml Wasser
und 150,ul konzentrierter Salzsäure so eingerührt, daß ein
Überschuß an Nitrit vermieden wurde. Nach 30 Minuten wurde die Diazoniumsalzlösung mit einer Lösung von 1 g BPTI
(154 .uMol) in 5 ml Wasser vereinigt und der pH-Wert der
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Lösung durch Zugabe von 4 η Natronlauge auf 8,5 gebracht.
Man rührte das Gemisch 1 Stunde bei 4°C, verdünnte es dann mit 12 ml Eisessig und filtrierte die Reaktionslösung zum
Abtrennen der Salze und der niedrigmolekularen Begleitsubstanzen über Sephadex G 10 mit 50 proz. Essigsäure als
Eluans. Die Protein enthaltenden dunklen Fraktionen wurden
gefriergetrocknet. Anschließend wurden daraus durch Chromatographie
an Sephadex G 50 mit 50 proz. Essigsäure als Elutionsmittel die polymeren Anteile (18 mg, 2 %) abgetrennt.
Man erhielt aus der Hauptfraktion 518 mg (52 %) einer orangeroten Substanz.
78 mg Anilin-3,5-disulfonsäure (310,üg) wurden in einer
Mischung von 1 ml Eisessig und 1 ml Propionsäure unter
Erwärmung gelöst und nach dem Abkühlen auf -10°C mit o,2 ml konzentrierter Schwefelsäure versetzt. Zu der gebildeten Suspension wurden anschließend 51 mg Nitrosylschwefelsäure
unter Rühren zugefügt. Nach 15 Minuten setzte
man 60 mg Harnstoff zu der Mischung, die nach weiteren
15 Minuten mit einer Lösung von 1 g BPTI (154,u Mol) in
ml Wasser vereinigt wurde. Man versetzte die Reaktionslösung unter Kühlen bis zum Erreichen von pH 9,5 mit 4 η
Natronlauge, wobei sich ein Niederschlag abschied. Nach 2 Stünden wurde das Reaktionsgemisch mit Eisessig versetzt,
bis eine klare Lösung erhalten wurde - pH 3,5 -.
Diese Lösung wurde über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure
als Elutionsmittel entsalzt. Die Protein enthaltenden
Eluate wurden gefriergetrocknet und polymere Anteile
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durch Chromatographie an Sephadex G 50 mit 50 proz. Essigsäure
abgetrennt. Man isolierte 770 mg orangefarbene Substanz ( 77 %) .
In die Lösung von 45 mg 2,4-Difluoranilin (35O,u Mol) in
5 ml 2 η Schwefelsäure wurde bei 4°C unter Rühren eine Lösung von 25 mg Natriumnitrit (360,u Mol) in 150,ul Wasser
getropft. Nach 15 Minuten wurden ca. 60 mg Harnstoff
in das Reaktionsgemisch eingetragen. Nach weiteren 20 Minuten vereinigte man die Lösung des Diazoniumsalzes mit
einer vorgekühlten Lösung von 1 g BPTI in 10 ml 4 m Harnstofflösung und fügte dann 4 η Natronlauge bis zum Erreichen
von pH 9,0 zu, wobei sich ein orangefarbener Niederschlag aus der Lösung abschied. Nach TO Stunden fügte man
Eisessig bis zum Erreichen von pH 3,5 zu dem Reaktionsgemisch und entsalzte die nun klare Lösung durch Filtration
über Sephadex G 10 mit 1 m Essigsäure als Elutionsmittel. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden zum Abtrennen
von polymeren Nebenprodukten (85 mg,/-* 8 %) mit 0,1 m Essigsäure
an Sephydex G 50 chromatographiert. Man erhielt
nach dem Gefriertrocknen der Hauptfraktion 780 mg einer gelbroten Substanz.
44 mg 3-Chloranilin (350 ,u Mol) wurden in 5 ml 2 η Schwefelsäure
gelöst und, wie in Beispiel 24 beschrieben, durch Versetzen mit einer Lösung von 25 mg Natriumnitrit in 150,ul
Wasser bei 4 C zum Diazoniumsalz umgesetzt. Nach der Zugabe
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von ca. 50 mg Harnstoff wurde das Reaktionsgemisch 20
Minuten bei 4°C gerührt und die Lösung schließlich mit einer Lösung von 1 g BPTI in 10 ml Wasser vereinigt.
Man fügte 4 η Natronlauge zu der Reaktionsmischung, bis ein pH-Wert von 9,0 erreicht wurde und hielt die inhomogene
Mischung 10 Stunden bei 4 C. Dann wurde der pH-Wert des Gemisches mit Eisessig auf 3,5 eingestellt,
und die Salze wurden durch Filtrieren über Sephadex G 10 mit 1 m Essigsäure als Elutionsmittel abgetrennt.
Man chromatographierte die Protein enthaltenden Eluate nach dem Konzentrieren durch Gefriertrocknung zum Abtrennen
polymerer Anteile (35 mg~3 %) an Sephadex G 50 mit 1 m Essigsäure als Elutionsmittel und isolierte nach
dem Gefriertrocknen der Hauptfraktion 680 mg (68 %) einer orangefarbenen Substanz.
72 mg 2,4-Dinitroanilin (400 ,u Mol) wurden unter Erhitzen
in 0,5 ml Eisessig gelöst, die Lösung wurde auf 2 g zerstoßenes Eis gegossen und die Fällung sofort abgesaugt.
Der noch feuchte, feine, hellgelbe Rückstand wurde in eine Mischung von 0,6 ml konzentrierter Schwefelsäure
und 0,15 ml Wasser gegeben. Nach dem Abkühlen des Reaktionsgemisches auf -5 C wurde eine Lösung von 30 mg
Natriumnitrit (435 ,u Mol) in iOO,ul Wasser unter Rühren
unterhalb der Oberfläche aus einer Mikropipette langsam zufließen gelassen. Nach 5-stündigem Rühren bei -3 C wurden
60 mg Harnstoff in die Lösung eingetragen, und die Mischung wurde nach weiteren 20 Minuten mit einer Lösung
von 1 g BPTI in 10 ml Wasser vereinigt. Man versetzte das
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ίί-
Reaktionsgemisch nun mit vorgekühlter 50 prozentiger Natronlauge bis zum Erreichen von pH 8,5. Dabei fiel ein gelborange- farbener Niederschlag aus.Nach 5 Stunden wurde das
Reaktionsgemisch mit Essigsäure bis pH 3,5 angesäuert, wobei
eine klare Lösung erhalten wurde. Man filtrierte die Lösung zum Abtrennen der Salze über Sephadex G 10 mit 1 m
Essigsäure als Elutionsmittel und chromatographierte die beim Gefriertrocknen der Protein enthaltenden Eluate gewonnene
Substanz zum Abtrennen der polymeren Anteile (91 mg =9 %) an Sephadex G 50 mit 1 m Essigsäure als Elutionsmittel.
Man isolierte schließlich 782 mg (78 %) orangefarbene Substanz.
50 mg o-Nitroanilin (360 ,u Mol) wurden in 0,5 ml Eisessig
gelöst und durch Einrühren von 2 ml Wasser und o,6 ml konzentrierter Schwefelsäure als Salz gefällt. Nach dem
Abkühlen der Suspension auf -2 C wurde die Nitritlösung, wie in Beispiel 26 beschrieben, unterhalb der Oberfläche
eingerührt. Nach 2 Stunden wurde die klare Lösung mit 50 mg Harnstoff versetzt und nach 30 Minuten das Gemisch mit einer
vorgekühlten Lösung von 1 g BPTI in 10 ml Wasser vereinigt. Man setzte nun 4 η Natronlauge zu der Reaktionslösung zu,
bis ihr pH-Wert auf 9,5 angestiegen war. Nach 12 Stunden
wurde die Suspension mit Eisessig bis zum Erreichen von pH 3,0 versetzt. Man entsalzte die fast klare Lösung durch
Filtration über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel. Nach dem Einengen durch Ultrafiltrieren
über eine Diaflow UM 2-Membran wurden die Protein enthaltenden Eluate an Sephadex G 50 mit 50 prozentiger
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Essigsäure als Eluans zum Abtrennen der polymeren Anteile
chromatographiert. Man erhielt 795 mg einer orangefarbenen
Substanz (79 %).
Analog Beispiel 27 wurden 50 mg 2-Nitroanilin diazotiert,
und die erhaltene Diazoniumsalzlösung wurde mit einer Lösung von 1 g BPTI in 10 ml Wasser bei pH 9,5 zur Kupplung
vereinigt. Nach 48 Stunden wurde die Reaktionslösung durch Filtration über Sephadex G 10 entsalzt. Man chromatographierte
die Protein enthaltenden Eluate nach dem Einengen mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel an Sephadex
G 50 und erhielt 758 mg einer orangefarbenen Substanz
(76 %) .
Die Lösung von 60 mg 2,4-Dicyano-3,5-dimethylanilin-(1)
(350/U Mol) in einer Mischung von je 1 ml Eisessig und
Propionsäure wurde nach dem Abkühlen auf -5°C mit 0,2 ml
konzentrierter Schwefelsäure versetzt. Unter Rühren setzte man 51 mg Nitrosylschwefelsäure (40.1,U Mol) zum Reaktionsgemisch und rührte dieses 30 Minuten bei -5 bis -1O°C.
Dann trug man 60 mg Harnstoff in die Reaktionslösung ein
und vereinigte sie nach 20 Minuten mit einer Lösung von 1 g BPTI (154/U Mol) in 10 ml Wasser. Durch Zugabe von
vorgekühlter 4 m Natronlauge stellte man den pH-Wert
der Kupplungslösung auf 8,5, wobei alsbald ein Niederschlag
ausfiel. Nach 6 Stunden wurde solange Eisessig
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zum Kupplungsgemisch gegeben, bis eine klare Lösung erhalten wurde (pH 3,5); diese wurde zum Abtrennen der Salze
über Sephadex G 10 filtriert. Wie im Beispiel 1 beschrieben wurden die polymeren Anteile durch Chromatographie an
Sephadex G 50 mit Essigsäure als Eluans abgetrennt (107 mg = 11 %). Man erhielt schließlich 765 mg orangefarbene Substanz
(76 %) .
In die Lösung von 111 mg i-Aminobenzol-4-(sulfonamidobenzol-4'-sulfonsäure)
(35O,u Mol) in einer Mischung von jeweils 1 ml Propionsäure und Essigsäure wurden nach dem Abkühlen
0,2 ml konzentrierte Schwefelsäure und anschließend bei -5°C 63 mg Nitrosylschwefelsäure (496 ,u Mol) unter Rühren
eingetragen. Nach 20 Minuten fügte man 60 mg Harnstoff zur Reaktionslösung und vereinigte diese nach weiteren 20
Minuten mit einer Lösung von 1 g BPTI (154 ,u Mol) in 10 ml Wasser. Man stellte den pH-Wert der Kupplungslösung durch
Zugabe von vorgekühlter 4 η Natronlauge auf 9,5 und fügte nach 5 Stunden Rühren bei 4°C Eisessig bis zum Erreichen
von pH 4/0 zu dem Gemisch. Dann wurde die Reaktionslösung
durch Filtrieren über Sephadex G 10 mit 1 m Essigsäure als Elutionsmittel entsalzt. Schließlich wurden nach dem Einengen
der Protein enthaltenden Eluate die polymeren Anteile durch Chromatographie an Sephadex G 50 mit Essigsäure als
Elutionsmittel abgetrennt (72 mg; 7 %). Man isolierte schließlich 858 mg (86 %) orangefarbene Substanz als Hauptfraktion
.
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te-
Beispiel 31
60 mg 2,4-Dicyano-3,6-dimethyl-anilin (350,uMol) wurden,
wie in Beispiel 29 beschrieben, in das Diazoniumsalz übergeführt. Man vereinigte die Lösung dieses Diazoniumsalzes
mit einer Lösung von 1 g BPTI (154 u Mol) in 10 ml Wasser und versetzte die Reaktionslösung bis zum Erreichen
von pH 8,5 mit vorgekühlter 4 m Natronlauge. Nach 20 Stunden Rühren bei 4°C wurde der pH-Wert des Gemisches
mit Eisessig auf 4,0 eingestellt und die klare Lösung durch Filtration über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure
als Elutionsmittel entsalzt. Die gefriergetrockneten Protein enthaltenden Eluate wurden zum Abtrennen polymerer
Anteile an Sephadex G 50 chromatographiert. Man erhielt 753 mg (75 %) einer orangeroten Substanz als Hauptfraktion.
65 mg 2-Trifluormethyl-4-cyano-anilin (350 ,u Mol) wurden,
wie in Beispiel 30 beschrieben, bei -5 C mit Nitrosylschwefelsäure
diazotiert. Die Diazoniumsalzlösung vereinigte man mit einer Lösung von 1 g BPTI (154,u Mol) in 10 ml
Wasser und stellte den pH-Wert des Reaktionsgemisches mit 4 η Natronlauge auf 9,0. Nach 15 Stunden wurde Eisessig
zu der Reaktionslösung bis zur sauren Reaktion gegeben und das ungelöste Material abgeschleudert. Die überstehende
Lösung wurde durch Ultrafiltration mit Hilfe einer Diaflow 05-Membran auf ein kleines Volumen eingeengt und das Retentat
mit der Lösung des Zentrifugationsrückstandes in 90 proz. Essigsäure vereinigt. Die ca. 50 proz. Essigsäurelösung
wurde durch Filtration über Sephadex G 10 mit 50 proz,
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Essigsäure als Elutionsmittel entsalzt und die Protein enthaltenden Eluate nach dem Einengen durch Gefriertrocknung
zum Abtrennen der polymeren Anteile über Sephadex G 50 chromatographiert. Man erhielt 682 mg (68 %) einer
orangefarbenen Substanz als Hauptfraktion.
Aus 81 mg 5,6,7,8-Tetrahydro-naphthylamin-(1)-sulfonsäure-(4)
(360 ,u Mol) wurde analog zu Beispiel 30 mit Nitrosylschwefelsäure
die Diazoniumverbindung hergestellt. Die Lösung des Diazoniumsalzes wurde nach dem Zerstören
überschüssiger Nitrosylionen durch Harnstoffzusatz mit
einer Lösung von 1 g BPTI (154,u Mol) in 10 ml 4m Harnstofflösung
vereinigt und die Kupplung beider Komponenten bei pH 8,5 durchgeführt. Nach 3,5 Stunden versetzte man
die Reaktionslösung bis zum Erreichen von pH 3,5 mit Eisessig und filtrierte sie zum Abtrennen der Salze über
Sephadex G 10. Die Protein enthaltenden Eluate wurden lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in 10 ml 50 proz.·
Essigsäure gelöst und zum Abtrennen der polymeren Anteile über Sephadex G 50 mit 1 m Essigsäure als Elutionsmittel
chromatographiert. Man erhielt 755 mg einer orangefarbenen Substanz (75 %) als Hauptfraktion sowie 62 mg
polymere Anteile.
50 mg 5-Aminobenzimidazolon-(2) (330,u Mol) wurden unter
Erwärmen in 2 ml 60 proz. Phosphorsäure gelöst; die Lösung wurde bei 4 C unter gutem Rühren mit einer Lösung von 25 mg
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Natriumnitrit (362 ,u Mol) in 100,ul Wasser versetzt und
die Mischung 15 Minuten bei 4°C gerührt. Dann setzte
man 30 mg Harnstoff (500 ,u Mol) zu der Reaktionslösung und vereinigte sie nach weiteren 15 Minuten mit einer
vorgekühlten Lösung von 1 g BPTI in 10 ml 5m Harnstofflösung.
Durch Zugabe von 50 proz. Natronlauge stellte man den pH-Wert der Reaktionslösung auf 9,5 ein' und rührte
sie 5 Stunden bei 4°C. Dann wurde die Mischung mit Eisessig
bis pH 4,5 versetzt und zum Abtrennen des Harnstoffes und der Salze über Sephadex G 10 filtriert. Restsalze
wurden schließlich nach dem Lyophilisieren durch Dialyse im acetylierten Viskingschlauch entfernt. Das
Retentat wurde mit 50 proz. Essigsäure als Elutionsmittel über Sephadex G 50 chromatographiert. Man erhielt
695 mg (69 %) einer orangebraunen Substanz als Hauptfraktion.
61 mg 6-Amino-2,3-dihydro~1,2-benzisosulfonazolon-(3) =
6-Aminosaccharin (310 ,u Mol) wurden in einem Gemisch von 1 ml Eisessig, 1 ml Propionsäure und 0,2 ml konzentrierter
Schwefelsäure suspendiert und bei -10°C mit 50,8 mg Nitrosylschwefelsäure
(400 ,u Mol) 30 Minuten gerührt. Dann versetzte
man das Reaktionsgemisch mit ca. 60 mg Harnstoff und nach weiteren 15 Minuten mit einer Lösung von 1g
BPTI (154,u Mol) in 10 ml 4 m Harnstofflösung. Man fügte
4 η Natronlauge bis zum Erreichen von pH 9,0 hinzu und hielt das Küpplungsgemisch unter Rühren 1 Stunde bei 4°C.
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Dann wurde die Reaktionslösung über Sephadex G 10 filtriert
und zum Abtrennen der Restsalze im acetylierten Visking-Dialysierschlauch dialysiert und das Retentat
durch Ultrafiltration über ein üM-2-Filter auf ein kleines
Volumen eingeeingt. Man versetzte das partiell ungelöste Retentat mit dem gleichen Volumen Eisessig und chromatographierte
die Lösung mit 50 proz. Essigsäure als Elutionsmittel zum Abtrennen der polymeren Anteile (41 mg
4 %) an Sephadex G 50 und isolierte 830 mg (83 %) einer orangefarbenen Substanz als Hauptfraktion.
Zu der Lösung von 270 mg 5-Amino-1,H-tetrazol (3,2 mMol)
in 4,5 ml η Salzsäure wurde bei 4 C unter gutem Rühren
eine Lösung von 250 mg Natriumnitrit (3,6 mMol) in 0,5 ml Wasser zugetropft. Nach 15 Minuten fügte man 120 mg
Harnstoff ( 2 mMol) zu dem Reaktionsgemisch und vereinigte es nach weiteren 10 Minuten mit einer Lösung von 1 g
BPTI (154,U Mol) in 10 ml einer 6 m Harnstofflösung. Man
gab nun eiskalte 50 proz. Natronlauge bis zum Erreichen von pH .4,5 - 5,0 zu der Lösung und rührte sie 5 Stunden
bei 4°C. Dann fügte man 120 mg Phenol (2 mMol) zu der
Reaktionslösung und entsalzte sie nach weiteren 15 Minuten
durch Filtration über Sephadex G 10 mit 50 proz»Essigsäure als Elutionsmittel. Nach dem Einengen des salzfreien
Filtrats durch Gefriertrocknung wurden polymere Anteile (120 mg = 12 %) durch Chromatographie an Sephadex
G 50 mit 50 proz. Essigsäure als Elutionsmittel abgetrennt. Man erhielt nach dem Gefriertrocknen der
Hauptfraktion 682 mg (62 %) einer violetten Substanz.
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50 mg 3,5-Dichloranilin überführte man, wie in Beispiel
10 beschrieben, in die Diazoniumverbindung und vereinigte die erhaltene Lösung bei 4 C mit einer Lösung von 1 g
Desamido-BPTI - erhalten durch 20-tägiges Stehenlassen von BPTI in 1 η Salzsäure bei 4°C - in 15 ml Boratpuffer,
pH 9,5. Nach 1 Stunde fügte man eine geringe Menge Phenol zu der Reaktionslösung und nach weiteren 5 Minuten Essigsäure
bis zu einem pH-Wert von 3,5. Zum Entsalzen filtrierte man die Lösung über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure
als Elutionsmittel und trennte polymere Anteile aus den konzentrierten Protein enthaltenden Eluaten durch
Chromatographie an Sephadex G 50 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel ab. Man erhielt durch Gefriertrocknen der die
Monomeren enthaltenden Eluate 752 mg einer orangefarbenen Substanz (75 %) .
Zu einer Lösung von 58 mg 5-Aminotetrazol-(1,H) (675,UMoI)
in 10 ml η Salzsäure fügte man bei 4 C unter gutem Rühren eine Lösung von 52 mg Natriumnitrit (75O,u Mol) in 0,2 ml
Wasser und hielt das Gemisch 15 Minuten unter Eiskühlung. Dann wurde es mit 20 mg Harnstoff (^200,u Mol) versetzt
und die Lösung mit einer auf 4°C vorgekühlten Lösung von 2 g BPTI (308,u Mol) in 15 ml Wasser vereinigt. Man stellte
den pH-Wert der Mischung mit 4 η Natriumhydroxidlösung auf 8,6 ein und rührte die intensiv gelbe Lösung 15 Minuten
unter Eiskühlung. Nach Zusatz einer kleinen Menge Phenol wurde die Reaktionslösung zum Abtrennen der Salze über
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Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel
chromatographiert. Man isolierte durch Gefriertrocknen
der Protein enthaltenden Eluate 1,85 g farblose Substanz. Diese Substanz löste man in 20 ml 0,1 η NaOH,
kühlte die Lösung auf 4 C und vereinigte sie mit einer nach Beispiel 10 aus 100 mg 3,5-Dichloranilin dargestellten
Diazoniumsalzlösung. Man versetzte das Reaktionsgemisch mit konzentrierter Natriumhydroxidlösung bis
zum Erreichen eines pH-Wertes von 9,2, wobei sich sofort unter Rotfärbung ein Niederschlag abschied. Nach 15 Minuten
fügte man eine kleine Menge Phenol zu der Lösung und entsalzte sie durch Filtration über Sephadex G 10 mit 1 m
Essigsäure als Elutionsmittel. Das Lyophilisat wurde anschließend mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel zum
Abtrennen der höhermolekularen Anteile an Sephadex G 50 chromatographiert. Man erhielt neben 128 mg Polymeranteile
(6 %) 1560 mg der orangeroten Monomeren ( 78 %).
Zu einer Lösung von 2 g BPTI (307 ,uMol) in 800 ml Sauerstoff-freier
0,25 m Essigsäure tropfte man bei 0 - 4°C unter gutem Rühren und Aufrechterhalten einer Stickstoffatmosphäre
im Verlauf von 30 Minuten 200 ml einer 2 m Natriumnitritlösung. Dabei stieg der pH-Wert der Lösung von
3,7 auf 4,1. Nach 24 Stunden wurde das Volumen der Reaktionslösung
durch Ultrafiltration in einer Ultrafiltrationszelle (Amicon) mit Hilfe einer Diaflow-UM-05-Membran
auf 50 ml reduziert und das Retentat durch Filtration über Sephadex G 10 entsalzt. Säule: 2,5 χ 150 cm.
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Das salzfreie Lyöphilisat wurde in 15 ml Wasser gelöst,
die Lösung auf 4°C gekühlt und anschließend mit einer
nach Beispiel 10 erhaltenen Diazoniumsalzlösung aus 100 mg 3,5-Dichloranilin vereinigt. Nach der wie in Beispiel
10 durchgeführten Kupplung wurde die Reaktionslösung
durch eine Sephadex G 10-Filtration mit 50 proz. Essigsäure
als Elutionsmittel entsalzt. Höhermolekulare Anteile wurden durch Chromatographie an Sephadex G 50 mit
50 proz. Essigsäure abgetrennt. (120mg, /~>6%) . Nach dem
Gefriertrocknen der Hauptfraktion wurden 1230 mg (61 %)
orangefarbene Substanz erhalten.
1 g BPTI (154 ,u Mol) wurden in 400 ml eiskalter sauerstofffreier
0,25 m Essigsäure gelöst. Unter Durchleitung von Stickstoff
und gutem Rühren tropfte man bei 4°C im Verlaufe von
30 Min. 100 ml 2 η Natriumnitritlösung zu und hielt das Reaktionsgemisch anschließend 24 Std. bei 4°C; dabei stieg
der pH-Wert der Lösung von 3,7 auf 4,1. Der Ansatz wurde mit konz. Ammoniaklösung auf pH 9,0 gebracht und darauf in
einer Ultrafiltrationszelle (Amicon) mittels einer Diaflow-UM
05-Membran eingeengt und entsalzt. Höhermolekulare Anteile wurden mit Chromatographie an Sephadex G-50 entfernt; die
Hauptfraktion wurde lyophilisiert. 500 mg dieses Lyophilisats,
das Desaminoderivate des BPTI enthält, wurden in 10 ml Wasser gelöst und mit einer Lösung von 25 mg nach Beispiel
10 diazotierten* 3, 5-Dichloranilin vereinigt. Man stellte
den pH-Wert auf 9,0 ein, rührte den Ansatz 5 Std. bei 4°C,
gab eine kleine Menge Phenol zu und stellte den pH-Wert wieder
auf 3,5 mit Eisessig ein. Die Lösung wurde zum Abtrennen der
Salze und niedermolekularen Nebenprodukte über Sephadex G-10 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel gelfiltriert. Die
proteinhaltigen Fraktionen wurden durch Ultrafiltration auf ein
kleines Volumen eingeengt und zum Abtrennen polymerer Anteile (26 mg, 5 %) mit 50 proz. Essigsäure als Elutionsmittel
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an Sephadex G-50 chromatographiert. Man erhielt nach Gefriertrocknen
der Hauptfraktion 318 mg (63 %) orangefarbene Substanz.
1 g BPTI wurden wie in Beispiel 40 mit NaNO2 im sauren Medium
umgesetzt. Nach 24 Std. wurde der Ansatz - ohne pH-Wert-Korrektion - durch Ultrafiltration, Gelfiltration an Sephadex
G-50 und Gefriertrocknen wie in Beispiel 40 aufgearbeitet.
380 mg der Hauptfraktion, die Mononitro-Desamino-BPTI-Derivate enthält, wurden in 10 ml 4 m Harnstofflösung gelöst
und mit einer Lösung von 24 mg nach Beispiel 10 diazotiertem 3,5-Dichloranilin vereinigt. Der Ansatz wurde auf pH 9,5
gestellt, 10 Std. bei 4°C gerührt und darauf über Sephadex G-10 mit 50 proz. Essigsäure als Eluans gelfiltriert. Das
Lyophilisat der proteinhaltigen Fraktionen wurde durch Dialyse in acetylierten Visking-Schläuchen vollends entsalzt.
Dann wurde das Retentat, das ungelöste Anteile enthielt, mit dem gleichen Volumen an Eisessig verdünnt und
zum Abtrennen polymerer Anteile (25 mg, 7 %) an Sephadex G-50 chromatographiert. Man erhielt 280 mg orangefarbenes
Produkt (74 %) als Hauptfraktion.
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Beispiel 42
750 mg Azo-BPTI-Derivat (115,U Mol), erhalten nach Beispiel
11, wurden in 150 ml 0,1 m Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäurepuffer,
pH 8,0, gelöst und mit einer Mischung von 10 g Tetränitromethan und 12 ml Äthanol unter Rühren versetzt.
Man rührte die Reaktionslösung 3 Stunden bei pH 8,0 und fügte dann konz. Salzsäure bis zum Erreichen von pH
4,8 zu. Dann wurde das Volumen der Lösung durch Ultrafiltration über eine UM 2-Membran auf 10 ml reduziert und die
Lösung durch Filtration über Sephadex G 10 mit 50 proz. Essigsäure als Lösungsmittel entsalzt. Nach dem Gefriertrocknen
der Protein enthaltenden Eluate wurden durch Chromatographie an Sephadex G 50 mit 50 proz. Essigsäure die polymeren
Anteile (131 mg,»-v17 %) abgetrennt und durch Gefriertrocknen
der Hauptfraktion 555 mg (74 %) orangerote Substanz erhalten.
a) Nitrierung von BPTI mit Salpetersäure zum Mononitro-BPTI:
Die Lösung von 2,5 g BPTI (385,u Mol) in 100 ml 1 m
Essigsäure wurde nach Zugabe von 10 ml konz. Salpetersäure 24 Stunden bei 20°C und weitere 24 Stunden bei
4 0C gehalten. Dann fügte man 25 ml konz. wäßrige Ammoniaklösung
zu dem Reaktionsgemisch und engte dessen Volumen durch Ultrafiltration über ein Amicon UM 05-Membran
auf ca. 25 ml ein. Man entsalzte das Konzentrat
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nun durch Filtrieren über Sephadex G 10 mit 0,1 m Essigsäure und äquilibrierte die Protein enthaltenden
Eluate gegen 0,1 m Natriumchlorid/O,1 m Trishydroxymethyl-aminomethan-hydrochlorid-Puffer,
pH 7,2. Durch Chromatographie an CM-Sephadex nach B. Meloun, I. Fric und F. Sorm/ Europ. J. Biochem. _4, 112 (1968)/
wurden neben einer geringen Menge Dinitro-BPTI-Derivat (0,62 g) 1,2 g Mononitro-BPTI erhalten.
b) Kupplung mit diazotierten! 3,5-Dichloranilin:
Aus 58 mg 3,5-Dichloranilin (36O,u Mol) wurde, wie in
Beispiel 10 beschrieben, das Diazoniumsalz hergestellt und mit 1 g (154,u Mol) obigem Mononitro-BPTI
3 Stunden bei pH 9,5 umgesetzt. Nach dem Entsalzen der Reaktionslösung durch Filtration über Sephadex
G 10 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel wurden die polymeren Anteile (68 mg,^7 %) durch Chromatographie
an Sephadex G 50 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel abgetrennt. Durch Gefriertrocknung isolierte
man 825 mg (82 %) orangefarbene Substanz als Hauptfraktion.
Beispiel 44
Citraconylierung:
Citraconylierung:
Die Lösung von 1,3 g (0,2 mMol) BPTI in 25 ml 0,1 M Boraxlösung
wurde auf 4°C gekühlt und tropfenweise mit insgesamt 0,52 ml Citracon3äureanhydrid versetzt, wobei der
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pH-Wert des Reaktionsgeinisches konstant auf 8,0 gehalten wurde, was im Bedarfsfalle durch Zugabe von 30 %iger
NaOH erreicht wurde.
Diazotierung:
0,6 mMol 3-Amino-1-H-1,2,4-triazol wurden in 0,6 ml Eisessig
gelöst und mit einer Mischung aus 1,3 ml Phosphorsäure (ca. 80 %ig, d = 1,71) und 5 ml Eis/Wasser versetzt.
50 mg NaNO2, gelöst in 1 ml Wasser, wurden unter Rühren
zu dieser Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang gerührt, dann mit 20 mg Amidosulfonsäure
versetzt und anschließend weitere 5 Minuten gerührt.
Kupplung:
Diesen Diazotierungsansatz gab man zu der immer noch gekühlten
Lösung des citraconylierten BPTI, stellte den pH-Wert mit 30 %iger NaOH auf 7,5, rührte das Reaktionsgemisch 60 Minuten bei 4°C, trug darauf 250 mg Mono-N-Butyryltyrosin,
DCHA-SaIz ein und rührte weitere 30 Minuten .
Abspaltung der Citraconylgruppen:
Man setzte feste Zitronensäure zu bis der pH-Wert des
Reaktionsgemisches ca. 4 erreichte und stellte ihn darauf mit konz. HCl auf genau 3,5 ein. Der Ansatz blieb
danach 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen.
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265Λ124
Aufarbeitung:
Der Ansatz wurde mit soviel Eisessig versetzt, daß sich ein unterdessen abgeschiedener Niederschlag wieder auflöste.
Daraufhin wurde er über ein Gelbett von 400 ml Sephadex G 15, das mit 5 %iger Essigsäure äquilibriert
worden war, mit 5 %iger Essigsäure als Elutionsmittel gelfiltriert. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden lyophilisiert.
Das Lyophilisat wurde in 5 %iger Essigsäure erneut gelöst und unter den eben beschriebenen Bedingungen
nochmals gelfiltriert. Nach erneuter Lyophilisierung der proteinhaltigen Fraktionen erhielt man 960 mg Festsubstanz
mit einem Proteingehalt von 87 %.
1,3 g BPTI wurden wie bei Beispiel 44 citraconyliert.
0,6 mMol Aminotetrazol wurden wie in Beispiel 44 anstelle
von Aminotriazol diazotiert.
Dieser Dxazotierungsansatz wurde wie in Beispiel 44 mit dem citraconylierten BPTI in einer Kupplungsreaktion umgesetzt.
Die Abspaltung der Citraconylgruppen sowie die Aufarbeitung erfolgen wie in Beispiel 44 beschrieben. Man
erhielt als Endprodukt 820 mg Lyophilisat mit einem Proteingehalt von 89 %.
1,3 g BPTI wurden wie in Beispiel 44 citraconyliert.
0,6 mjMol Sulfanilsäuresulfanilid wurden diazotiert, indem
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man sie in 1,1 ml 0,6 M NaOH löste, mit 50 mg NaNO2,
gelöst in 1 ml Wasser, versetzte und unter Schütteln zu einer Mischung aus 1,3 ml konz. Phosphorsäure (d=
1,71) und 5 ml Eis/Wasser gab. Der Ansatz wurde 10 Minuten geschüttelt, mit 20 mg Amidosulfönsäure versetzt
und weitere 5 Minuten geschüttelt.
Die Kupplung mit dem citraconylierten BPTI, die Abspaltung
der Citraconylgruppen sowie die Aufarbeitung des Ansatzes erfolgten wie in Beispiel 44 beschrieben.
Man erhielt als Endprodukt 920 mg Lyophilisat mit einem Proteingehalt von 89 %.
1,3 g BPTI wurden wie in Beispiel 44 citraconyliert. 0,6 mMol 3,5-Dichloranilin wurden in Analogie zu Beispiel
44 diazotiert.
Der Diazotierungsansatz wurde wie in Beispiel 44 mit dem citraconylierten BPTI in einer Kupplungsreaktion
umgesetzt. Danach wurden die Citraconylgruppen wie in Beispiel 44 abgespalten.
Der Ansatz wurde wie in Beispiel 44 daraufhin stark essigsauer gestellt. Trotzdem verblieben erhebliche Mengen
ungelöst, die daraufhin abfiltriert und verworfen wurden. Das Filtrat wurde wie in Beispiel 44 durch zwei-
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malige Gelfiltration an Sephadex G 15 gereinigt. Man erhielt
zum Schluß 250 mg Lyophilisat mit einem Proteingehalt von 89 %.
1,3 g BPTI wurden wie in Beispiel 44 citraconyliert.
0,6 mMol Aminobenzol-3,5-disulfonsäure wurden in 1,5 ml 1 M NaOH gelöst; dazu wurden 50 mg NaNO2 gegeben und
ebenfalls gelöst. Die Diazotierung wurde wie in Beispiel 46 durch Zugabe von Phosphorsäure durchgeführt.
Die Kupplungsreaktion mit dem citraconylierten BPTI, die
Abspaltung der Citracony!gruppen sowie die Aufarbeitung
wurden, wie in Beispiel 44 beschrieben, durchgeführt. Man erhielt als Endprodukt 1100 mg Lyophilisat mit einem
Proteingehalt von 95 %.
1,3 g BPTI wurden wie in Beispiel 44 citraconyliert. 0,6 mMol i-(p-Aminophenyl)-3,5-dichlor-1,2,4-Triazol
wurden analog zu Beispiel 44 diazotiert.
Der Diazotierungsansatz wurde wie bei Beispiel 44 mit dem citraconylierten BPTI in einer Kupplungsreaktion
umgesetzt. Nach Abspaltung der Citraconylgruppen wie
in Beispiel 44 wurde der gesamte Ansatz durch zweimalige
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- η-
Gelfiltration an Sephadex G 15, wie unter 44 beschrieben,
aufgearbeitet. Man erhielt zum Schluß ein Lyophilisat
von 1170 mg mit 74 % Protein.
Es wurde wie in Beispiel 49 vorgegangen mit dem einzigen
Unterschied, daß der Lösung des citraconylierten BPTI vor der Kupplungsreaktion 15g fester Harnstoff
zugegeben wurden.
Als Endprodukt fielen 1030 mg Lyophilisat mit einem Proteingehalt
von 100 % an.
1,3 g BPTI wurden wie in Beispiel 44 citraconyliert.
0,6 mMol Sulfanilsäure wurden in Analogie zu Beispiel 46 diazotiert.
Die Kupplungsreaktion, die Abspaltung der Citraconylgruppen
und die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches: erfolgten
wie in Beispiel 44. Man erhielt zuletzt 1130 mg Lyophilisat mit einem Proteingehalt von 100 %.
1,3 g BPTI wurden wie im Beispiel 44 beschrieben citraconyliert. Diesem Ansatz wurden 15 g Harnstoff zugesetzt.
0,6 mMol p-Aminobenzoesäure wurden in Analogie zu Beispiel
46 diazotiert.
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Die Kupplungsreaktion, die Abspaltung der Citraconylgruppen und die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches erfolgen
wie in Beispiel 44. Man erhielt zuletzt 700 mg Lyophilisat mit einem Proteingehalt von 88 %.
650 mg (100,u Mol) eines Gemisches von nitriertem BPTI
/B.Meloun, I. Fric und F. Sorm, Europ. J. Biochem. A_,
112 (1968)/ wurden in 25 ml m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer,
pH 7,5 gelöst. Unter gutem Rühren fügte man in zwei Anteilen je 300 mg Natriumdithionit im Abstand
von 10 Minuten zu der Lösung und versetzte das Gemisch 10 Minuten nach der letzten Zugabe mit Essigsäure,
bis ein pH-Wert von 5,0 erreicht wurde. Zur Entsalzung wurde das Reaktionsgemisch über Sephadex G 10
mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel filtriert. Die Protein enthaltenden Eluate wurden gefriergetrocknet. Man
löste das Lyophilisat in 5 ml η Salzsäure und versetzte die Lösung nach dem Abkühlen auf 4°C mit einer Lösung von
14 mg Natriumnitrit (203 ,u Mol) in 100 ,ul Wasser unter
gutem Rühren. Nach 10 Minuten fügte man 10 mg feste Amidosulfonsäure
zu der Lösung und nach weiteren 5 Minuten eine vorgekühlte Lösung von 94 mg Phenol (1 mMol) in 5 ml η
Natronlauge (pH 8,2). Man rührte die gelbe Suspension unter Zugabe von Natronlauge, bis ein pH-Wert von 9,0 erreicht
wurde. Im Verlaufe von 30 Minuten wurde eine rote Lösung erhalten. Nach Zugabe von Essigsäure bis pH 4,0 wurde
die Reaktionslösung durch Chromatographie an Sephadex G
entsalzt. Anschließend wurden die höhermolekularen Anteile
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durch Chromatographie der Protein enthaltenden Eluate
an Sephadex G 50 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel abgetrennt. Man erhielt schließlich 425 mg gelborangefarbene Substanz.
750 mg eines Gemisches von Mono- und Di-nitro-BPTI wurden,
wie in Beispiel 53 beschrieben, mit Dithionit behandelt. Die Reaktionslösung wurde durch Ultrafiltrieren
über eine Diaflow UM 05-Membran konzentriert und entsalzt und schließlich über Sephadex G 10 filtriert. Beim
Lyophilisieren der Protein enthaltenden Eluate wurden 630 mg farblose Substanz erhalten, die man in 10 ml 6m
Harnstofflösung löste.
Man vereinigte die eiskalte Lösung des so gewonnenen
Gemisches von Mono- und Di-3-Amino-tyrosyl-BPTI mit einer nach Beispiel 12 hergestellten Diazoniumsalzlösung
aus 50 mg 3,5-Dichloranilin und stellte den pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe von 8 m Natronlauge
zunächst auf 4,0 und nach 15 Minuten auf 5,0. Nach
60 Minuten wurde die braune Lösung durch Filtration über Sephadex G 10 mit 50 proz. Essigsäure entsalzt. Die polymeren
Anteile wurden anschließend durch Chromatographie der Protein enthaltenden Eluate über Sephadex G 50 mit
50 proz. Essigsäure als Elutionsmittel abgetrennt (60 mg, 9 %). Man erhielt durch Lyophilisation der Hauptfraktion
480 mg orangefarbene Substanz (76 %).
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51 mg 5-Aminobenztriazol (380/U Mol) wurden unter Erwärmen
in 2,5 ml 60 proz. Phosphorsäure gelöst. Zu dieser Lösung fügte man bei 4°C unter Rühren eine Lösung
von 29 mg Natriumnitrit (410,u Mol) in 250,ul Wasser.
Nach 10 Minuten setzte man 60 mg Harnstoff (1 mMol)
zu der Lösung des Diazoniumsalzes und vereinigte sie
nach weiteren 15 Minuten mit einer vorgekühlten Lösung von 1 g BPTI (154,u Mol) in 10 ml Wasser. Mit
eiskalter 8 η Natronlauge stellte man den pH-Wert der Kupplungslösung auf 9,0 und rührte das Reaktionsgemisch 3 Stunden bei 4°C.Dann versetzte man mit Eisessig bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 4,0 und trennte ungelöste Anteile durch Zentrifugieren - 10 Minuten,
2000 g - ab. Die überstehende Lösung wurde durch Filtrieren über Sephadex G 10 mit 1 m Essigsäure entsalzt. Durch Chromatographie der Protein enthaltenden Eluate an Sephadex G 50 wurden 93 mg (9 %) höhermolekulare
Anteile abgetrennt. Man erhielt 723 mg (72 %) orangefarbene Substanz.
zu der Lösung des Diazoniumsalzes und vereinigte sie
nach weiteren 15 Minuten mit einer vorgekühlten Lösung von 1 g BPTI (154,u Mol) in 10 ml Wasser. Mit
eiskalter 8 η Natronlauge stellte man den pH-Wert der Kupplungslösung auf 9,0 und rührte das Reaktionsgemisch 3 Stunden bei 4°C.Dann versetzte man mit Eisessig bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 4,0 und trennte ungelöste Anteile durch Zentrifugieren - 10 Minuten,
2000 g - ab. Die überstehende Lösung wurde durch Filtrieren über Sephadex G 10 mit 1 m Essigsäure entsalzt. Durch Chromatographie der Protein enthaltenden Eluate an Sephadex G 50 wurden 93 mg (9 %) höhermolekulare
Anteile abgetrennt. Man erhielt 723 mg (72 %) orangefarbene Substanz.
1 g NaNO2 wurden in 14 ml ausgekochtem Wasser gelöst.
Nach dem Abkühlen dieser Lösung auf 4 C trug man nach und nach 0,5 g Azo-BPTI-Derivat, erhalten nach Beispiel
48, ein. Nachdem es sich gelöst hatte, wurde so viel Zitronensäure zugelöst, daß der pH-Wert 5,0 betrug.
Anschließend stellte man mit ca. 10 %iger SaIz-
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säure den pH-Wert auf 4,0 ein. Das Reaktionsgefäß wurde
evakuiert und bei 4°C 24 Stunden stehen gelassen.
Man verdünnte dann den Ansatz mit 10 ml H^O, stellte
den pH-Wert mit 10 %iger Imidazollösung auf 8,5, filtrierte geringe unlösliche Anteile ab und gelfiltrierte das Filtrat über eine Sephadex-G-15-Säule (250 ml
Gelbett, mit 0,1 m NH4HCO3-Lösung äquilibriert) mit
0,1 M NH4HCO3-Lösung als Elutionsmittel. Die Proteinhaltigen:
Fraktionen wurden lyophilisiert. Man erhielt 400 mg Lyophilisat mit 78 % Proteingehalt.
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7o mg 3,6-Dimethoxy-anilin (46o uMol) wurden in 2,5 ml 2 η
Schwefelsäure gelöst. Zu dieser lösung fügte man bei O0C unter
Rühren eine Lösung von 35 mg Natriumnitrit in loo ill Wasser.
Man rührte 2o Min. bei 0-4^, gab dann 6o mg Harnstoff
zu dem Reaktionsgemisch und vereinigte es mit einer auf 40C
vorgekühlten Lösung von 1 g BPTI in Io ml einer 6 m Harnstofflösung.
Man versetzte die Lösung dann mit 8 η NaOH bis zum Erreichen von pH 8,5 und rührte die Suspension 3 Std. bei
40C Dann wurden Io al Eisessig zu der Mischung gegeben und
die Lösung durch Filtration über Sephadex G Io mit 5o proz. Essigsäure als Lösungsmittel entsalzt. Die proteinenthaltenden
Eluate wurden nach dem Gefriertrocknen zum Abtrennen höhermolekularer Anteile (8o mg) mit 5o proz. Essigsäure als
Laufmittel über Sephadex G 5o chromatographiert. Man erhielt
783 mg (78 $>) rotbraune Substanz als Haupt fraktion.
loo mg 2,3-Dimethylanilin (8oo iiMol) wurden in 1 ml 8o proz.
Phosphorsäure gelöst. In die auf 20C gekühlte Lösung tropfte
man unter Rühren eine Lösung von 63 mg Natriumnitrit in 2oo ul'Wasser und fügte nach Io Min. 2o mg Amidosulfonsäure
zu der Mischung. Nach weiteren Io Min. Rühren vereinigte man mit einer Lösung von 1,3 g BPTI (2oo uMol) in Io ml o,l m
Boratpuffer pH 9,o. Man stellte den pH-Wert der Mischung durch Zugabe von 8 η NaOH auf 8,5 ein und versetzte die orangefarbene
Suspension nach 1 Std. mit Io ml Eisessig. Die Lösung
wurde durch Filtration über Sephadex G-Io mit 5o proz.
Essigsäure entsalzt. Man erhielt 93o mg orangefarbene Substanz. (72 %).
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123 mg 2,4-Mmethoxyanilin (8oo uMol) wurden analog Beispiel
58 unter N2-Atmosphäre diazotiert. Nach dem Zerstören der
überschüssigen salpetrigen Säure mit 5o mg Harnstoff vereinigte man die Lösung des Diazoniumsalzes mit einer Lösung von
1?3 g BPTI in Io ml o,l m Boratpuffer pH 9,ο und stellte den
pH-Wert der Mischung mit 8 m NaOH auf 8,5. Dabei färbte sich das Gemisch dunkelbraun. Nach 1 Std. wurden 2o mg Phenol und
schliesslich nach weiteren Io Min. Io ml Eisessig zugefügt
und die Kupplungslösung durch Filtrieren über Sephadex G-Io mit 5o proz. Essigsäure als Lösungsmittel entsalzt. Man erhielt
95o mg braunorangefarbene Substanz (73 %) .
Methylierung: In Analogie zu G.E. Means und R.E.Feeney /Biochemistry
7, 2192 (1968)/ wurde Ig BPTI (154yuMol) in loo ml o,o5 m Boratpuffer pH 9fo gelöst. Unter gutem Rühren gab man
bei O0C 5o mg Natriumborhydrid sowie 5o ril 35 proz. Formaldehydlösung
zu dem Reaktionsgemisch und im Abstand von 5 Min. noch dreimal jeweils 5o iil Formaldehydlösung. Nach 3o Min.
und ebenso nach weiteren 15 Min. wurden nochmals je 5o mg Natriumborhydrid und 5o ul Formaldehydlösung zugesetzt. Dann
versetzte man die Reaktionslösung bis zum Erreichen von pH 6,0 mit Essigsäure und engte das Volumen der Lösung durch Ultrafiltration
über ein UM o5-Filter auf Io ml ein. Nach dem Entsalzen an Sephadex G-Io mit o,l m Essigsäure wurden die proteinenthaltenden
Fraktionen gefriergetrocknet. Man erhielt 7o5 mg (7o #) farblose Substanz; nach dem Verfahren von A.F.
S.A.Habeeb, Analytical Biochem. 14_, 328 (1966) lag der mit
2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure ermittelte Endgruppengehalt
bei 2o fo des Ausgangswertes.
Kupplung mit diazotiertem 3,5-Dichloranilin: 5oo mg des obigen
methylierten BPTI-Derivats wurden in 5 ml Wasser gelöst
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und diese Lösung vereinigt mit der Lösung der Diazoniumverbindung,
die aus 5o mg 3,5-Dichloranilin durch Diazotieren nach Beispiel 11 hergestellt worden war. Man stellte den pH-Wert
des Gemisches mit 8 η NaOH auf 8,5. Dabei entstand eine intensiv braunrote Suspension. Nach 3o Min. wurden 2o mg Phenol
zugefügt und schliesslich Io ml Eisessig. Die klare Lösung wurde zum Abtrennen der Salze und niedrigmolekularen
Beimengungen mit 5o proz. Essigsäure über Sephadex G-Io filtriert.
Man erhielt nach dem Abtrennen höherpolymerer Anteile durch Chromatographie an Sephadex G-5o mit 5o proz. Essigsäure
375 mg einer orangeroten Substanz (75 ?<>).
5oo mg guanidiertes BPTI (B.Kassell und R.B.Chow, Biochemistry
5,, 3449-3453 /196o/; J.Chauvet und R.A'eher, Biochem.Biophys.
Res.Comm. 2J, 23o-235 /1967/) wurden gelöst in 7,5 ml o,l m
Boratpuffer pH 9,5, der 6 m an Harnstoff war. Diese Lösung vereinigte man bei O0C mit der Lösung des Diazoniumsalzes,
das aus 5o mg 3,5-Dichloranilin nach Beispiel 11 hergestellt
worden war^und fügte 8 η NaOH zu der Mischung, bis ein pH-Wert
von 8,5 erreicht war. Nach 3o Min. Rühren unter Eiskühlung fügte man 5o mg Phenol zu dem Gemisch und versetzte mit Io ml
Eisessig. Zur Entsalzung wurde über Sephadex G-Io mit 5o proz. Essigsäure als Lösungsmittel chromatographiert. Nach dem Lyophilisieren
der Hauptfraktion erhielt man 416 mg (83 %) rotorange Substanz.
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-3A-
800 mg nur partiell guanyliertes BPTI wurden in 2o ml o,l'm
Eoratpuffer pH 9,o gelöst. In diese Lösung trug man bei 4- G
und unter gutem Rühren 5oo mg Bernsteinsäureanhydrid in 5 gleichen Portionen ein, wobei man den pH-Wert der Mischung
durch Zugabe von S η NaOH bei pH 8,5-9,ο hielt. 1 Std. nach
der letzten Zugabe des Bernsteinsäureanhydrids versetzte man mit einer Diazoniumsalzlö'sung, die durch Diazo tieren von loo mg
3,5-Dichloranilin analog Beispiel 11 dargestellt worden war.
Man hielt während der Kupplung einen pH-Wert von~8,o durch Zugabe von 8 η NaOH aufrecht. Der braunen Suspension wurden
nach. 1 Std. 5o mg Phenol zugesetzt. Mit Eisessig stellte man
die Suspension schwach sauer und trennte den Niederschlag durch Abzentrifugieren - 2ooo g/lo Min. - ab. Die überstehende
Lösung wurde durch Ultrafiltration auf 5 ml eingeengt und das Retentat zusammen mit dem Sediment der Zentrifugation
durch Eisessigzugabe gelöst. Man entsalzte die Lösung durch Filtration über Sephadex G-Io mit5o proz. Essigsäure als
Lösungsmittel und erhielt durch Gefriertrocknen 7oo mg (88 i>)
einer braunroten Substanz.
1,3 g des nach Beispiel 36 erhaltenen Azoderivates von BPTI
(2oo iiMol), das gleichzeitig partiell desaminiert war, wurden
in 2o ml o,l m Boratpuffer pH 9»ο suspendiert und unter gutem
Rühren bei 4-0C 5oo mg Bernsteinsäureanhydrid in Io Anteilen
und im Verlaufe von 1 Std. in die Mischung eingetragen. Alsbald war eine klare olivgrüne Lösung entstanden. Während der
Umsetzung hielt man den pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 8 η NaOH auf 9,o. Nach insgesamt 2-stündiger Umsetzung
filtrierte man das Gemisch mit o,l m Ammoniumhydroxidlösung
als Elutionsmittel über Sephadex G-Io und erhielt nach dem Gefriertrocknen der ersten gefärbten Eluate l,lo g (85 #)"
einer dunkelbraunen Substanz.
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8-Q9822/0-391
Claims (16)
- Patentansprüche/1I Derivate des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderorganen (BPTI), deren Tyrosinreste 10 und/oder 21 in ortho-Stellung zur phenolischen Hydroxylgruppe über eine Azogruppe mit einem gegebenenfalls substituierten aromatischen oder heterocyclischen Rest verknüpft sind.
- 2. Derivate des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderorganen (BPTI), bei denen einer der Tyrosinreste 10 oder 21 in o-Stellung zur phenolischen Hydroxylgruppe über eine Azo-Gruppe mit einem gegebenenfalls substituierten aromatischen oder heterocyclischen Rest verknüpft ist und bei denen zusätzlich der andere der beiden Tyrosinreste 10 oder 21 eine Nitrogruppe in o-Stellung zur phenolischen Hydroxylgruppe trägt.
- 3. Derivate gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich partiell oder vollständig desaminiert sind.
- 4. Derivate gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich partiell' oder vollständig desamidiert sind.
- 5. Derivate gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die aliphatischen Aminogruppen zusätzlich partiell oder vollkommen mit Hilfe in der Proteinchemie üblicher Modifizierungsreagentien substituiert sind.Le A 17 449 - 88 -§09822/0391
- 6. Derivate gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil ihrer freien Aminogruppen zusätzlich desaminiert sind und gleichzeitig andere Aminogruppen mit Hilfe in der Proteinchemie üblicher Modifizierungsreagentien substituiert sind.
- 7. Derivate gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich partiell oder vollständig desaminiert sind und darüber hinaus gleichzeitig auch partiell oder vollständig desamidiert sind.
- 8. Derivate gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die aliphatischen Aminogruppen zusätzlich partiell oder vollständig mit Hilfe in der Proteinchemie üblicher Modifizierungsreagentien substituiert sind, und die darüber hinaus gleichzeitig partiell oder vollständig desamidiert sind.
- 9. Derivate gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil ihrer freien Aminogruppen zusätzlich desaminieri; sind und gleichzeitig andere Aminogruppen mit Hilfe in der Proteinchemie üblicher Modifizierungsreagentien substituiert sind, und die darüber hinaus gleichzeitig partiell oder vollständig desamidiert sind.
- 10. Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors (BPTI) gemäß Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man BPTI oder Derivate des BPTI nach an sich bekannten Methoden mit aromatischen oder heterocyclischen Diazoniumverbindungen, die gegebenenfalls substituiert sein können, kuppelt und die entstandenen Äzo-BPTI-Derivate isoliert.Le A 17 449 - 89 -809822/0
- 11. Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors (BPTI) gemäß Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man BPTI oder Derivate des BPTI nach reversibler Blockierung der Aminogruppen nach an sich bekannten Methoden mit aromatischen oder heterocyclischen Diazoniumverbindungen, die gegebenenfalls . substituiert sein können, kuppelt, die Aminogruppen anschließend vollständig oder teilweise deblockiert und die entstandenen Azo-BPTI-Derivate isoliert.
- 12. Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Kalllkrein-Trypsin-Inhibitors (BPTI) gemäß Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man BPTI oder Derivate des BPTI mit konzentrierter Salpetersäure umsetzt und das Reaktionsgemisch nach an sich bekannten Verfahren aufarbeitet.
- 13. Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors (BPTI) gemäß Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man Derivate des BPTI, deren Tyrosinreste 10 und/oder 21 Nitrogruppen oder über Azogruppen verknüpfte aromatische oder heterocyclische Reste tragen, in an sich bekannter Art so reduziert, daß die entsprechenden Aminogruppen an den Tyrosinresten ίθ und/oder 21 entstehen, anschließend diese Derivate diazotiert, darauf einer Kupplungsreaktion mit aromatischen Hydroxyl- oder Aminoverbindungen unterwirft und die entstehenden Reaktionsgemische nach an sich bekannten Verfahren aufarbeitet.Le A 17 449 - 90 -809822/0391jur Herstel]NACHGEREICHT
- 14. V-erfahren zur Herstellung von Derivaten des BPTI, dadurch gekennzeichnet, daß man BPTI oder BPTI mit reversiblen Aminogruppen zunächst in an sich bekannter Weise mit aromatischen oder heterocyclischen Diazoniumverbindungen, die gegebenenfalls substituiert .sein können, kuppelt, anschließend die Aminogruppe gegebenenfalls ganz oder teilweise deblockiert und anschließend die Reaktionsprodukte in an sich bekannter Weise desamidiert und/oder desaniniert und/oder mit Hilfe in der Proteinchemie üblicher Modifizierungsreagentien an den Aminogruppen substituiert und/oder in an sich bekannter Weise oder gemäß Anspruch 12 nitriert und die entstandenen Azo-BPTI-Derivate isoliert.
- 15. Arzneimittel gekennzeichnet durch einen Gehalt an Azo-BPTI-Derivaten gemäß Anspruch 1 bis 9.
- 16. Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man Azo-BPTI-Derivate gemäß Anspruch 1 bis 9 mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen vermischt.Le A 17 449 - 91 -09822/0391
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0001773A1 (de) * | 1977-10-27 | 1979-05-16 | Bayer Ag | Neue Derivate des BPTI(basic pancreatic trypsin-inhibitor), Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Arzneimittel |
| EP0001774A1 (de) * | 1977-10-27 | 1979-05-16 | Bayer Ag | Neue Derivate des BPTI(basic pancreatic trypsin-inhibitor), Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2054180C1 (ru) * | 1991-08-21 | 1996-02-10 | Жирнов Олег Петрович (н/п) | Способ лечения вирусных респираторных инфекций |
| US6057287A (en) | 1994-01-11 | 2000-05-02 | Dyax Corp. | Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof |
| DK1489097T3 (da) * | 1994-01-11 | 2012-01-09 | Dyax Corp | Hæmmere af humant plasmin, der er afledt af kunitz-domæner, og nukleinsyrer, der koder for samme |
| DK0739355T3 (da) * | 1994-01-11 | 2005-01-24 | Dyax Corp | Kallikrein-inhiberende "Kunitz-domæne"-proteiner og analoger deraf |
| US20040054082A1 (en) * | 2001-12-03 | 2004-03-18 | Bank David H | Toughened polymer blends with improved surface properties |
| US7153829B2 (en) * | 2002-06-07 | 2006-12-26 | Dyax Corp. | Kallikrein-inhibitor therapies |
| JP2005534647A (ja) | 2002-06-07 | 2005-11-17 | ダイアックス、コープ | 失血の予防及び軽減 |
| EP2386310B1 (de) * | 2002-08-28 | 2018-11-07 | Dyax Corp. | Verfahren zur Erhaltung von Organen und Geweben |
| US7235530B2 (en) * | 2004-09-27 | 2007-06-26 | Dyax Corporation | Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof |
| US7276480B1 (en) | 2005-12-30 | 2007-10-02 | Dyax Corp. | Prevention and reduction of blood loss |
| CA2643693A1 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Dyax Corp. | Formulations for ecallantide |
| WO2010080833A1 (en) * | 2009-01-06 | 2010-07-15 | Dyax Corp. | Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors |
| CA3168591A1 (en) | 2010-01-06 | 2011-07-14 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Plasma kallikrein binding proteins |
| KR102169651B1 (ko) | 2011-01-06 | 2020-10-23 | 다이액스 코포레이션 | 혈장 칼리크레인 결합 단백질 |
| WO2012170945A2 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for modulating kallikrein (klkb1) expression |
| CA2840614A1 (en) | 2011-06-29 | 2013-01-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for modulating kallikrein (klkb1) expression |
| CA2921839A1 (en) | 2013-08-28 | 2015-03-05 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of prekallikrein (pkk) expression |
| EP3122782A4 (de) | 2014-03-27 | 2017-09-13 | Dyax Corp. | Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von diabetischem makulaödem |
| HUE052709T2 (hu) | 2014-05-01 | 2021-05-28 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Módosított antiszensz oligonukleotidok konjugátumai és azok alkalmazása PKK expressziójának módosítására |
| WO2017100679A1 (en) | 2015-12-11 | 2017-06-15 | Dyax Corp. | Plasma kallikrein inhibitors and uses thereof for treating hereditary angioedema attack |
-
1976
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-
1977
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Cited By (2)
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