DE2710438A1

DE2710438A1 - Verfahren und vorrichtung zum analysieren eines fluids

Info

Publication number: DE2710438A1
Application number: DE19772710438
Authority: DE
Inventors: John Austin Clements; Gordon Coulter Forrest; Ronald Frank Jay
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1976-03-12
Filing date: 1977-03-10
Publication date: 1977-11-03
Also published as: CH619537A5; DD129826A5; IT1116284B; FR2344019A1; CA1079189A; SE7702731L; JPS60122374A; AU2307277A; GB1575805A; JPS618388B2; BR7701509A; AR214993A1; FR2344019B1; JPS6250784B2; BE852327A; PL111132B1; US4141687A; AU508301B2; JPS52141697A; NL7702647A

Description

g. Wilhelm Metal MpMng. Wiping ilsisl

6 Frask u.i a. M. 1 ü 13

8709

TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y. VStA

Verfahren und Vorrichtung zum Analysieren eines Fluids

7098U/063A

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Analyse einer Fluidprobe, und zwar Insbesondere, jedoch nicht ausschließlich auf die Verwendung zur Imnunoanalyse·

Es 1st bekannt, biologische Fluide, wie Blutserum oder Urin, zu analysieren, üb darin die Gegenwart von Antikörpern (und ähnlichen bindenden Proteinen), Antigenen (und ähnlichen Substanzen, wie Bapten) und Antikörper-Antlgen-Immunkomplex» zu bestimmen und zu quantifizieren. Solche Verfahren werden im allgemeinen Immunoanalysen genannt· Bei der Ausführung von Immunoanalysen ist es üblich, von der bindenden Reaktion Gebrauch zu machen, die zwischen einer begrenzten Menge eines Antikörpers und zweier Antigene stattfindet, wobei beide Antigene in der Lage sind, mit dem Antikörper eine Bindung einzugehen, und wobei die beiden Antigene voneinander unterscheidbar sind, beispielsweise dadurch, daß das eine Antigen eine Identifizierungskennung trägt· Der Anteil des gekennzeichneten Antigens oder Kennantlgens, der sich mit dem Antikörper bindet, liefert eine Anzeige über die Menge des vorhandenen nicht gekennzeichneten Antigens. Venn somit beispielsweise eine biologische Fluidprobe, die ein spezifisches Antigen enthält, mit einem Antikörper und einer Menge des Kennantigens gemischt wird, kann man die Menge des nicht gekennzeichneten Antigens in der Probe bestimmen.

Verschiedenartige Kennungen können verwendet werden. Mit großem Erfolg ist eine radioaktive Kennung angewendet worden. Immunoanalysen unter Verwendung radioaktiver Kennungen werden "Radioimmunoanalysen" (RIA) genannt.

7098U/0634

Bei Immunoanalyseverfahren ist es oft notwendig, das Reaktionsprodukt (beispielsweise den Antikörper-Antigen-Komplex) von dem Reaktionsgemisch zu trennen, um die Menge des Kennantigens in dem Produkt zu bestimmen, und zwar entweder durch direkte Analyse des Produkts oder des restlichen Reaktionsgemisches· Bei RIA-Verfahren, bei denen ein Trennungsschritt erforderlich ist, ist es bekannt, den Antikörper auf einem Träger zu immobilisieren, um die anschließende Trennung des Reaktionsprodukts zu erleichtern. Aus einem Aufsatz "Continuous Flow Automated Radioimmunoassay Using Antibodies Attached to Red Blood Cells¹¹, von S.J. Luner, Analytical Biochemistry, Vol. 65 (1975), Seiten 355-364, ist es bekannt, in automatischen RIA-Verfahren bei Anwendung des kontinuierlichen Durchflußprinzips rote Blutzellen zur Immobilisation der Antikörper zu verwenden.

Aus dem Aufsatz "Magnetic Solid-Phase Radioimmunoassay ", von L.S. Hersh und S. Yaverbaum, Clinica Chemica Acta, Vo. 63 (1975)» Seite 69-72, ist es bekannt, den Antikörper auf magnetischen Teilchen zu immobilisieren und das Reaktionsprodukt von dem Reaktionsgemisch durch Anwendung eines magnetischen Feldes zu trennen. Dieses RIA-Verfahren wird in einem Reagenzglasreaktor ausgeführt, und das obenaufschwimmende Reaktionsgemisch wird analysiert.

Nach der Erfindung wird ein kontinuierliches Durchflußverfahren und eine entsprechende Vorrichtung zum Ausführen von Immunoanalysen vorgeschlagen, wobei magnetische Teilchen benutzt werden und eine Reihe von Flüssigkeitsproben aufeinanderfolgend und automatisch analysiert werden können, beispielsweise durch RIA.

7098U/Ö634

Ein Verfahren zum Analysieren eines biologischen Fluids auf eine interessierende Substanz ist nach der Erfindung durch die folgenden Schritte gekennzeichnet:

(a) daß aus einer Probe des Fluids und einer festen Phase mit einem an magnetisch anziehbarem Teilchenmaterial gebundenen Reagenz ein Gemisch gebildet wird,

(b) daß das Gemisch durch eine Leitung gefördert wird,

(c) daß die feste Phase in der Leitung magnetisch eingefangen wird, um das Teilchenmaterial gegenüber der Strömung festzuhalten und auf diese Weise die feste Phase von dem Gemisch zu trennen, und

(d) daß die in der Probe enthaltene interessierende Substanz durch Analyse der getrennten festen Phase und bzw. oder des getrennten Gemisches bestimmt wird.

Eine Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens ist nach der Erfindung gekennzeichnet durch Mittel zum Fördern eines Reaktionsgemisches durch eine Leitung, das eine flüssige Phase einschließlich einer Probe des die interessierende Substanz enthaltenden Fluide und eine feste Phase mit einem Reagenz enthält, das an ein magnetisch anziehbares Teilchenmaterial gebunden ist, wobei in dem Gemisch eine Reaktion stattfindet, um an der festen Phase ein Reaktionsprodukt auszubilden, durch Mittel zum magnetischen Einfangen des Teilchenmaterials in der Leitung, um es gegen den Einfluß der Strömung festzuhalten und auf diese Weise die feste Phase von der fließenden flüssigen Phase zu trennen, und durch stromabwärts der Einfangmittel gelegene Mittel zum Bestimmen der in der Probe enthaltenen interessierenden Substanz durch Analyse der getrennten festen Phase oder flüssigen Phase·

7098U/0634

IV

Nach dem Verfahren der Erfindung und der entsprechenden Vorrichtung wird somit ein Reaktionsgemisch durch eine Leitung gefördert. Das Gemisch enthält die zu analysierende Probe, die somit die interessierende Substanz aufweist. Im Falle biologischer Fluide, beispielsweise Blutseren, kann die interessierende Substanz ein Antigen, beispielsweise ein Peptidhormon, ein Steroidhormon, eine Droge oder ein Virus (der Ausdruck "Antigen" soll Hapten und andere ähnliche Substanzen umfassen), ein Antikörper (dieser Ausdruck soll andere bindende Substanzen umfassen) oder ein Antikörper :Antigen-Komplex oder ein einziges Protein sein. Die Erfindung ist allerdings auf die Analyse biologischer Fluide nicht beschränkt.

Das Reaktionsgemisch enthält auch als feste Phase magnetisch anziehbare Teilchen, an die ein Reagenz gebunden ist. Dieses Teilchenmaterial kann ein zusammengesetztes Material sein, beispielsweise eine Matrix, die magnetisch anziehbare Teilchen enthält, an die das Reagenz gebunden 1st. Ein solches Material ist neu und stellt einen Aspekt der Erfindung dar. Bei dem magnetisch anziehbaren Material kann es sich beispielsweise um Eisen oder Magneteisenoxide, Nickel, Kobalt oder Chromoxid handeln. Ein oder mehrere Teilchen dieses Materials können in der Matrix eingebettet sein. Die Matrix selbst kann aus vielen verschiedenartigen Materialien bestehen, einschließlich zahlreicher synthetischer und natürlicher polymerer Materialien (beispielsweise Cellulose, Cellulosederivate, Agarose, organische Polymere). Das Reagenz kann direkt an die Matrix oder an ein anderes Material innerhalb der Matrix gebunden sein.

Das Reagenz selbst ist eine Substanz, die an einer Reaktion in dem Reaktionsgemisch teilnimmt. Das

Reagenz kann direkt mit dem interessierenden Bestand-

7098U/0634

At

tell In der Probe reagieren· Anstatt direkt mit der Probe zu reagieren, kann es mit einem zweiten Reagenz In dem Gemisch reagieren. Das Reagenz an dem Teilchenmaterial kann beispielsweise ein Antikörper sein, der direkt mit einem Antigen in der Probe reagiert· Die Probe selbst kann einen Antikörper enthalten, und das Reagenz reagiert mit einem Antigen, das als zweites Reagenz zugegeben wird. Im zuletzt genannten Fall kann das das zweite Reagenz darstellende Antigen auch mit dem Antikörper in der Probe reagieren.

Das Reagenz ist an das Teilchenmaterial in einer solchen Weise gebunden, daß das Reagenz verfügbar ist, um mit einer anderen Substanz in dem Reaktionsgemisch zu reagieren. Im allgemeinen ist das Reagenz an die äußere Umfangsfläche des Teilchenmaterials gebunden. Dies 1st aber nicht wesentlich. Allerdings muß sichergestellt sein, daß das Reagenz für die Reaktion zugreifbar ist. Das Reagenz kann vollkommen innerhalb der Matrix angeordnet sein. In diesem Fall ist die Matrix für die Flüssigkeit des Reaktionsgemisches porös.

In Abhängigkeit von der besonderen auszuführenden Analyse kann die Eigenheit des Reagenzes einen sehr großen Bereich überspannen. Es kann sich beispielsweise um ein Immunoglobulin, ein Antigen (beispielsweise ein Virus) oder eine andere biologische Substanz handeln. Nach der Reaktion bleibt das Reagenz (als Reaktionsprodukt) an das Teilchenmaterial gebunden· Es kann somit zusammen mit dem Teilchenmaterial von dem Reaktionsgemisch getrennt werden.

Die Trennung der das Teilchenmaterial darstellenden festen Phase von der Flüssigkeitsphase des Reaktionsgemisches wird in der Leitung unter Anwendung einer ma-

709844/0634

/rt

gnetisehen Falle oder Fangeinrichtung bewirkt. Das Reaktionsgemisch fließt durch die Leitung in den Bereich eines örtlichen Magnetfeldes (Magnetfalle), das die feste Phase festhält. Die flüssige Phase strömt weiter.

Das Magnetfeld 1st in der Leitung vorzugsweise so ausgerichtet, daß es im wesentlichen quer auf der Strömungsrichtung des Reaktionsgemisches steht. Allerdings ist diese Bedingung nicht wesentlich. Die Stärke des Magnetfeldes muß allerdings hinreichend sein, um die feste Phase gegenüber der Flüssigkeitsströmung zurückzuhalten·

Nachdem die Flüssigkeit die Magnetfalle passiert hat, kann die in der Falle zurückbehaltene feste Phase gewaschen werden, und zwar durch Hindurchschicken von Waschflüssigkeit durch den betreffenden Teil der Leitung. Dabei bleibt zwar die feste Phase in der Magnetfalle gefangen, jedoch werden die Teilchen der durchfließenden Waschflüssigkeit ausgesetzt und gereinigt. Ein außergewöhnlich großer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die feste Phase in schritthaltender mitlaufender Weise, also "on line" ausgewaschen wird. Die nach der Erfindung ausgebildete Vorrichtung enthält daher vorzugsweise Mittel zum Durchleiten einer Waschflüssigkeit durch die Leitung.

Bei der Waschflüssigkeit kann es sich um Wasser oder Irgendein inertes Fluid bzw. eine inerte Lösung handeln. Der Zweck der Waschflüssigkeit besteht darin, von der festen Phase Irgendwelche restlichen Spuren der Flüssigkeitsphase des Reaktionsgemisches zu entfernen. Dies ist Insbesondere bei der Immunoanalyse, beispielsweise der RIA, wichtig, bei der die feste Phase in bezug auf das Vorhandensein einer Kennung analysiert wird. In

7 098U/06TT

einem solchen Fall könnten selbst Restspuren der flüssigen Phase des Reaktionsgemisches zu unrichtigen Analysenergebnissen führen·

Das Magnetfeld wird vorzugsweise von mindestens einer Hagneteinrichtung bereitgestellt, die aktivierbar ist, um in einem Abschnitt der Leitung ein Hagnetfeld zu erzeugen· Die (oder jede) Magneteinrichtung kann einen Permanentmagneten enthalten, der bewegbar 1st, um das Magnetfeld von einem Hinimumwert (wenn die Hagnetfalle inaktiviert ist) bis auf einen Haximumwert (wenn die Hagnetfalle aktiviert ist) zu bringen. Allerdings werden einer oder mehrere KLektromagnete bevorzugt. Bei der Inaktivierung des ELektromagnets wird vorzugsweise eine Entmagnetisierung mit einem Wechselstrom vorgenommen, um das magnetische Restfeld aus dem Elektromagneten zu beseitigen. Die feste Phase in der Hagnetfalle wird durch diesen Vorgang ebenfalls entmagnetisiert. Dadurch wird die Gefahr eines Zusammenballens Infolge magnetischer Anziehung vermieden.

Die Hagnetfalle kann aus einer einzigen Magneteinrichtung, aber auch aus zwei oder mehreren Hagneteinrichtungen bestehen. Für viele Anwendungszwecke wird es bevorzugt, zwei oder mehrere Hagnetfallen vorzusehen, die längs der Leitung in einem Abstand voneinander angeordnet sind. Dadurch 1st es möglich, ein verbessertes Waschverfahren durchzuführen. Bei zwei Hagnetfallen können die Magnete jeder Falle unabhängig voneinander aktiviert werden. Die feste Phase wird von der flüssigen Phase des Reaktionsgemisches in der stromaufwärts gelegenen ersten Magnetfalle getrennt. Sie wird gewaschen, während sie in der Magnetfalle festgehalten wird. Dann wird die Magnetfalle inaktiviert, um die Suspension der festen Phase in der strömenden Waschflüssigkeit zuzulassen. Das Teilchenmaterial wird zur zweiten Magnet-

7098U/0G3*

■IC:

falle befördert (die aktiviert ist) und dort entgegen der WaschflUssigkeitsströmung festgehalten. Dieses Doppelwaschverfahren ist besonders wirksam·

Die Flüssigkeitsphase des Reaktionsgemisches passiert die magnetische Falle oder die magnetischen Fallen und strömt dann weiter durch die Leitung. Nach dem Waschen wird die feste Phase von der Hagnetfalle freigegeben tind wird dann durch die gewaschene Leitung gefördert· Vorzugsweise sind in der Leitung Ventileinrichtungen vorgesehen, um die getrennte feste Phase oder flüssige Phase der Analysiereinrichtung zuzuführen, wie es gewünscht wird. Falls die feste Phase analysiert werden soll, kann man die flüssige Phase des Reaktionsgemisches in einem Behälter aufsammeln oder zum Abfluß weiterleiten. Falls die flüssige Phase analysiert werden soll (möglicherweise zusammen mit Waschflüssigkeit), kann man die feste Phase in einem Behälter aufsammeln und möglicherweise (nach Behandlung) erneut benutzen. Es wird bevorzugt, die feste Phase zu analysieren, da sie automatisch ausgewaschen werden kann. Die flüssige Phase ist voluminöser (mit der Waschflüssigkeit) und kann nicht so leicht gehandhabt und analysiert werden.

Die in der Probe befindliche interessierende Substanz wird durch Analyse der getrennten festen Phase oder der getrennten flüssigen Phase des Reaktionsgemisches bestimmt. Diese Bestimmung kann mehrere analytische und bzw. oder Rechenschritte enthalten. Im Falle der RIA gibt die Analyse der festen Phase durch Feststellen der Radioaktivität die Menge der radioaktiven Kennung in der festen Phase an. Mit Hilfe von genormten Kurven ist es dann möglich, die Menge der interessierenden Substanz in der Probe anzugeben.

7098U/0634

vil-

Nach der Erfindung ist es möglich, weitere Reaktionen an der getrennten festen oder flüssigen Phase auszuführen. Weiterhin können für einen nachfolgenden Trennschritt weitere magnetisch anziehbare Teilchen zugegeben werden. Dies kann beispielsweise erwünscht sein, wenn das Reaktionsgemisch ein Enzym oder Koenzym enthält. In diesem Fall können weitere Magnetfallen in der Leitung stromabwärts der die erste Trennung bewirkenden Hagnetfalle oder Hagnetfallen vorgesehen sein.

Bei dem Verfahren nach der Erfindung und bei der Anwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann man das gesamte oder einen Teil des Reaktionsgemisches vor dem Durchleiten durch die Leitung herstellen. Es wird allerdings bevorzugt» der in der Leitung strömenden Probe (oder einem Teilgemisch) ein Reagenz oder mehrere Reagenzien zuzusetzen. Die Vorrichtung enthält daher vorzugsweise MIttel zum Einmischen des Teilchenmaterials und bzw. oder des zweiten Reagenzes in die in der Leitung fließende Probe (oder in das Reaktionsgemische. Die Durchmischung der Probe mit den Reagenzien findet während des Fließens in der Leitung statt.

Obwohl bisher lediglich auf ein an das Teilchenmaterial gebundenes Reagenz und ein zweites Reagenz Bezug genommen wurde, können in dem Reaktionsgemisch weitere Reagenzien vorhanden sein. Diese weiteren Reagenzien können dem Teilchenmaterial oder dem zweiten Reagenz beigemengt werden. Sie können aber auch vorab mit der Probe gemischt werden. Sie können auch einzeln der flieBenden Probe (oder dem Reaktionsgemisch) in der Leitung zugegeben werden. Die Eigenheit dieser Reagenzien hängt (im Falle ihrer Benutzung) von der Natur der auszuführenden Analyse ab. Das Reaktionsgemisch kann auch noch andere Substanzen enthalten, beispielsweise Pufferlösungen. 709844/0634

Bel Immunoanalysen mit einer Bindung zwischen beispielsweise einem Antikörper und einem Antigen trägt das zweite Reagenz Im allgemeinen eine Identifizierungskennung, beispielsweise ein radioaktives Atom, eine Fluoreszenzgruppe, ein Enzym oder Koenzym oder ein Chemolumineszenzmaterial. Wenn die biologische Fluidprobe beispielsweise auf einen Antikörper analysiert werden soll, handelt es sich bei dem an das Teilchenmaterial gebundenen Reagenz um einen Antikörper, der zur Bindung des Antigens dient· Das zweite Reagenz 1st ein Antigen, das ebenfalls von dem Antikörper gebunden wird und eine Kennung trägt· Andererseits kann eine Fluidprobe auf einen Antikörper dadurch analysiert werden, daS das Teilchenmaterial mit einem Antigen versehen wird und daß als zweites Reagenz ein gekennzeichneter Antikörper verwendet wird· Die Analyse der getrennten festen oder flüssigen Phase auf die Menge der vorhandenen Kennung läßt die Bestimmung der Menge der interessierenden Substanz in der Fluidprobe zu.

Die an der getrennten festen oder flüssigen Phase auszuführende besondere Analyse hängt von der zu erstellenden Versuchsreihe ab und (sofern ein gekennzeichnetes Reagenz verwendet wird), von der Natur der Kennung. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann somit beispielsweise Mittel zum Messen der Radioaktivität, der Farbe oder Fluoreszenz der getrennten Phase oder ihrer Enzymaktivität enthalten.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nicht wesentlich, ein zweites oder irgendein weiteres Reagenz zusätzlich zu dem Reagenz zu verwenden, das an das Teilchenmaterial gebunden ist. Das Verfahren (und die Vorrichtung) kann beispielsweise zum Trennen eines besonderen Bestandteils aus einer Fluidprobe (durch

709844/0634

selektives Binden dieses Bestandteils an das Reagenz an dem Teilchenmaterial) und zum anschließenden Analysleren der getrennten festen Phase verwendet werden. Bei den meisten Immunoanalyseverfahren wird allerdings ein zweites Reagenz benutzt (und es werden oft noch weitere Reagenzien verwendet)·

Das Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung kann man zusammen mit dem bekannten kontinuierlichen DurchfluBverfahren verwenden, »el dem durch die Leitung einzelne Schübe des Reaktionsgemisches gefördert werden, die durch einen inerten Fluldschub (beispielsweise Luft) voneinander getrennt sind und die, sofern erwünscht, zusätzlich durch einen Vaschflüssigkeitsschub voneinander getrennt sind· Das kontinuierliche Durchflußverfahren ist beispielsweise aus der US-PS 2 797 149 bekannt. Die Vorrichtung nach der Erfindung enthält vorzugsweise Mittel, die durch die Leitung aufeinanderfolgende Reaktionsgemische fördern, die voneinander durch wenigstens einen inerten Fluidschub getrennt sind, dessen Volumen ausreicht, die Leitung zu verschließen und die aufeinanderfolgenden Gemische in einem voneinander getrennten Zustand zu halten· Die Vorrichtung kann weiterhin Mittel aufweisen, die inerte Fluidschübe in die Leitung einleiten, um die flüssigen Proben oder Reaktionsgemische welter zu unterteilen. Die Vorrichtung weist weiterhin vorzugsweise Mittel auf, die zwischen die in der Leitung fließenden aufeinanderfolgenden Reaktionsgemische einen Waschflüssigkeltsschub einleiten. Das Reaktionsgemisch ist von dem angrenzenden WaschflUssigkeitsschub wenigstens durch einen Inerten Fluldschub getrennt.

7098U/0S3*

Venn das Reaktionsgemisch (oder die Probe) segmentiert oder unterteilt ist und dann das Teilchenmaterial und bzw. oder das zweite Reagenz den in der Leitung fließenden Schüben zugegeben werden soll, geschieht dies vorzugsweise mit Hilfe von Mitteln, die das Teilchenmaterial und bzw· oder das zweite Reagenz intermittierend einleiten, so daß es sich nur mit den in der Leitung fließenden aufeinanderfolgenden Probenschüben vermengt. Diese Mittel zum Intermittierenden Einleiten enthalten vorzugsweise Einrichtungen, um das nicht in die Leitung eingeführte Teilchenmaterial zu einem Reservoir zurückzuführen· Zweckmäßigerweise enthält die Vorrichtung auch noch Kittel, die in der Lage sind, abwechselnd das Teilchenmaterial und eine Pufferlösung in die Leitung einzuführen, um einen im wesentlichen konstanten Durchfluß in der Leitung aufrechtzuerhalten·

Es ist wichtig, daß das gekennzeichnete Reagenz (oder ein anderes für das endgültige Bestimmungsverfahren wichtiges Reagenz) nur der Probe oder dem Reaktionsgemisch zugesetzt wird , aber nicht der Waschflüssigkeit oder anderen in der Leitung vorkommenden Schüben, da sonst die Analyse falsche Ergebnisse liefern kann.

Es ist zweckmäßig, insbesondere wenn ein segmentierter Strom benutzt wird, stromaufwärts der Magnetfalle oder der magnetischen Fallen einen Fühler vorzusehen, der den Durchtritt eines Reaktionsgemisches durch die Leitung feststellt, und Mittel vorzusehen, die angesteuert durch den Fühler die magnetische Falle aktivleren, um die Teilchen im Reaktionsgemisch elnzufangen· In Abhängigkeit davon, wie weit der Fühler stromabwärts der Magnetfalle angeordnet ist, muß man für die Aktivierung oder Betätigung der Magnetfalle eine Verzögerungszeit in Betracht ziehen.

709844/0634

Das Teilchenmaterial hat vorzugsweise eine Wichte, die nahe an diejenige der flüssigen Phase des Reaktionsgemisches herankommt, so daß sich das Teilchenmaterial weder absetzt noch nach oben schwimmt, sondern in einem guten durchmischten Zustand in Suspension bleibt. Das Teilchenmaterial hat im allgemeinen eine Wichte von etwa 1,4 bis 3,2. Allerdings können auch Werte außerhalb dieses Bereiches verwendet werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und der entsprechenden Vorrichtung muß man nach der Herstellung des Reaktionsgemisches eine hinreichende Zeitspanne für den Ablauf der gewünschten Reaktionen bereitstellen, bevor die feste Phase von der flüssigen Phase getrennt werden kann. Um diese im allgemeinen Inkubationszelt genannte Zeitperlode zur Verfügung zu stellen, enthält die Leitung beispielsweise eine Inkubationsschlange·

Bei einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäfien Verfahrens enthält das Reaktionsgemisch als zweites Reagenz eine vorbestimmte Menge einer Substanz, die mit der in der Probe befindlichen interessierenden Substanz reagiert, um mit dieser einen Komplex zu bilden. Das Reagenz des Teilchenmaterials bindet entweder diesen Komplex oder das überschüssige, nicht zur Reaktion benutzte zweite Reagenz· Beim Schritt (d) wird das getrennte Gemisch analysiert, um den in der Probe befindlichen Bestandteil zu bestimmen. Bei diesem Verfahren wird die Analyse entweder für den Komplex oder für den überschüssigen Anteil des zweiten Reagenzes ausgeführt, der zur Reaktion nicht herangezogen wurde.

Weiterhin ist es entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, einen Antikörper in einer Probe zu analysieren, und zwar dadurch, daß das an das Teil-

7098U/0634

chenmaterlal gebundene Reagenz ein Antikörper ist und als zweites Reagenz ein (gekennzeichnetes) Antigen verwendet wird, das mit beiden Antikörpern (es kann sich um denselben Antikörper handeln) eine Bindung eingeht·

Bei dem Verfahren und der Vorrichtung nach der Erfindung kann man die Mengen der benutzten Reagenzien in geeigneter Weise steuern. Bei der RIA mit einem radioaktiv gekennzeichneten zweiten Reagenz kann man beispielsweise die Menge des im Reaktionsgemisch vorkommenden zweiten Reagenzes (oder die Menge der Kennung) genau steuern und einstellen, so daß sie bekannt ist.

Das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung werden vorzugsweise mechanisiert bzw. automatisiert. Man erhält dann eine effiziente kompakte Einheit, die speziell für Immunoanalysen, insbesondere für RIA, geeignet ist.

Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung wird an Hand einer Zeichnung erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 ein Flußdiagramm für eine nach der Erfindung ausgebildete Vorrichtung,

Fig. 2 die Zusammensetzung des durch die Vorrichtung nach der Fig. 1 fließenden Fluidstroms,

Fig. 2A das zweiphasige laminare Strömungsmuster innerhalb der Fluidproben des in der Fig. 2 dargestellten Fluidstroms und

Flg. 3A bis 3C eine Erläuterung der Arbeitsweise der einen schritthaltenden Betrieb ausführenden Magnetfallen zwecks Trennung und Behandlung der festen Phase.

7098U/0634

a*

Die in der Fig. 1 dargestellte Vorrichtung enthält einen Probennehmer 10, von dem aus eine Reihe flüssiger Proben längs eines zusammendrückbaren Pumpenschlauches 12 gefördert werden. Der Probennehmer 10 kann derart ausgebildet sein, wie es aus der US-PS 3 038 340 bekannt ist. Der Pumpenschlauch 12 ist durch eine perlstaltische Pumpe nach Art einer Schlauchquetsch pumpe 14 geführt, die derart ausgebildet sein kann, wie es aus der US-PS 2 935 028 bekannt ist. Die Schlauchquetschpumpe 14 wirkt auf weitere Pumpenschläuche 38, 40, 34, 34«, 30, 30·, 32, 36, 52, 57, 84 und 80 ein. Eine Sonde 15 des Probennehmers wird derart gesteuert, daß sie abwechselnd in aufeinanderfolgende Probenbehälter 16 und einen Waschmittelbehälter 18 eintaucht. Der durch den Pumpenschlauch 12 geförderte Probenstrom enthält somit aufeinanderfolgende Proben, die voneinander durch einen von Luftschüben umschlossenen Waschflüssigkeitsschub getrennt sind. Auf diese Weise wird die Probenintegrität in der gesamten Vorrichtung aufrechterhalten. Außer dem Probennehmer 10 sind eine Quelle 20 für Antikörper, die auf der Oberfläche von in Suspension befindlichen, magnetisch anziehbaren Teilchen immobilisiert sind, und eine zugehörige Quelle 22 für eine Pufferlösung sowie eine Quelle 24 für ein in Suspension befindliches, gekennzeichnetes Antigen und eine zugehörige Quelle 26 für eine Pufferlösung vorgesehen. Die Vorrichtung wird so betrieben, daß die in geeigneter Weise gepufferte feste Phase von der Quelle 20 und das in geeigneter Weise gepufferte, gekennzeichnete Antigen von der Quelle 24 in Form von gesteuerten einzelnen Volumen mit geeigneter Phasenlage eingeleitet werden, um nur mit aufeinanderfolgenden Proben gemischt zu werden, die längs des Pumpenschlauches 12 und einer Leitung 28 gefördert werden. Zu diesem Zweck enthält die Pumpe 14 die bereits erwähnten Pumpenschläuche 30, 32, 34 und 36, deren Einlasse mit der Quelle 20 für die feste Phase_f

7 0 98U/0634

mit der Quelle 24 für das gekennzeichnete Antigen und mit den Quellen 22 und 26 für die zugehörigen Pufferlösungen in Verbindung stehen. Die Pumpenschläuche 38 und 40 dienen zum periodischen Injizieren von Luftblasen, um die in den Pumpenschläuchen 30 und 34 weitergeleiteten Fluidströme zu segment!eren, um einzelne Schübe gleichförmiger Konzentration der festen Phase vorzusehen und einen konstanten Durchfluß in der gesamten Vorrichtung aufrechtzuerhalten, wenn Ventile 40 und 42 betätigt werden. Jedem der Pumpenschläuche 30, 32, 34 und 36 ist eine RUckleitung 30·, 32', 34» und 36« zugeordnet, über diese Rückleitungen können die einzelnen Fluide zurück in die zugehörigen Quellen 20, 24, 22, und 26 geführt werden. Die Auslässe der Pumpenschläuche 30, 32, 34 und 36 sind mit den Einlassen von Dreiweg-Zweistellungs-Ventilen 42, 44, 40 und 46 verbunden. Ein Auslaß jedes dieser Ventile steht mit der zugehörigen Rückleitung in Verbindung. Die anderen Auslässe der der festen Phase zugeordneten Ventile 40 und 42 stehen miteinander in Verbindung und führen gemeinsam durch eine Mischschlange 48, die an eine Verbindungsstelle A der Leitung 28 angeschlossen ist. Die anderen Auslässe der Ventile 40 und 46 sind ebenfalls miteinander vereint und über eine gemeinsame Leitung 50 mit einer Verbindungsstelle B der Leitung 28 verbunden. Der Pumpenschlauch 52 ist mit seinem Einlaß der Umgebungsluft ausgesetzt. Der Auslaß des Pumpenschlauches 52 ist so angeschlossen, daß er den Flüssigkeitsstrom in der Leitung 50 vor dessen Eintritt in die Leitung 28 mit LuftSchüben segmentiert. Die Schlauchquetschpumpe 14 arbeitet fortwährend, so daß über die Pumpenschläuche 38, 40 und 42 fortlaufend Luftschübe eingeleitet werden, um sowohl eine Intraprobenunterteilung als auch eine Intrawaschflüssigkeitsunterteilung zu bewirken, d.h. eine Unterteilung innerhalb der Probe und innerhalb der Waschflüssigkeit_o Auf diese

709844/0634

kann man eine äußerst wirksame Durchmischung der einzelnen Schübe des längs der Leitung 28 fließenden Stromes erreichen.

Die Ventile AO, 42, 44 und 46 werden von einer Programmeinheit 152 gesteuert, die in bezug auf den Probennehmer 10 zeitlich oder taktmäßig so eingestellt ist, daß der gepufferte Kennantigenstrom in der Leitung 50 und der gepufferte Festphasenstrom in der Mischschlange 48 in diskreten Einzelvolumen und mit geeigneter Phase an den Verbindungsstellen B und A eingeleitet werden, um in der Leitung 28 nur mit Jeder der Flüssigkeitsproben vermischt zu werden. Während des Durchtritts des Waschflüssigkeitsschubs zwischen den aufeinanderfolgenden Proben durch die Verbindungsstelle A bzw. durch die Verbindungsstelle B werden die Ventile 42 und 44 in ihre Schaltstellung I gebracht, um die Pumpenschläuche 30 und 32 mit den Rückleitungen 30' und 32' zu verbinden, so daß die betreffenden Flüssigkeiten zu ihren Quellen zurückgeleitet werden. Gleichzeitig werden die Ventile 40 und 46 in ihre Schalt stellung II gebracht, um die Pufferlösungen von den Quellen 22 und 26 den Verbindungsstellen A und B zuzuführen, so daß in der Leitung 28 ein konstanter Durchfluß aufrechterhalten wird. Während dieser Zeit wird laufend Luft durch den Pumpenschlauch 52 gepumpt, so daß in die Leitung 50 Luftblasen periodisch eingeleitet werden, um den Fluidstrom in der Leitung 50 zu unterteilen bzw. zu segmentieren und auf diese Weise eine gute Durchmischung in einer Mischschlange 55 sicherzustellen. Während des Durchtritts einer Probe durch die Verbindungsstellen A und B bringt die Programmeinheit 152 die Ventile 42 und 44 vorübergehend in ihre Schaltstellung II, um gesteuerte diskrete Einzelvolumen der gepufferten festen Phase über die

7098U/0634

Mischschlange 48 und des suspendierten gekennzeichneten Antigens über die Leitung 50 in die Probe einzuleiten. Die zwischen den Verbindungsstellen A und B in der Leitung 28 vorgesehene Mischschlange 55 stellt sicher, daß das gekennzeichnete Antigen vollkommen mit jedem Flüssigkeitsprobenschub gemischt und gleichmäßig darin verteilt wird, bevor bei der Verbindungsstelle A die feste Phase eingeleitet wird.

Die mit der festen Phase und dem gekennzeichneten Antigen vollkommen durchmischten aufeinanderfolgenden Probenschübe bilden ein Reaktionsgemisch, das über die Leitung 28 einer Inkubationsschlange 54 zugeführt wird. Die Zusammensetzung des durch die Inkubationsschlange geleiteten Stroms ist in der Fig. 2 dargestellt. Jeder der Schübe oder jedes Aliquot der Proben S₁, S₂ usw. enthält gesteuerte oder eingestellte Volumen der festen Phase und des Kennantigens. Die zwischen aufeinanderfolgenden Proben auftretenden Waschflüssigkeitsschübe W und die aufeinanderfolgenden Proben selbst sind durch Luftblasen unterteilt, die über den Pumpenschlauch 52 eingeleitet werden. In der Fig. 2A sieht man, wie das Kennantigen und die feste Phase, d.h. die auf magnetisch anziehbaren Teilchen immobilisierten Antikörper innerhalb eines Probenschubs oder Probenaliquots verteilt sind, wobei in der zeichnerischen Darstellung das Kennantigen mit "-ⁿ und die feste Phase mit "+" bezeichnet ist. Das Vorhandensein eines Luftschubs unmittelbar vor und hinter einem Flüssigkeitsschub induziert ein zweiphasiges laminares Strömungsmuster, wobei die Flüssigkeit in einem solchen Schub zur Zirkulation veranlaßt wird, wie es durch Pfeile in der Fig. 2A dargestellt ist. Das sich einstellende Strömungsmuster ist in erster Linie auf den Strömungswiderstand zurückzuführen, dem die sich bewegende Flüssigkeit unmittelbar an der Innenoberfläche der

7098U/0634

Leitung 28 ausgesetzt ist. Dieses Strömungsrauster beschleunigt die Durchmischung der verschiedenartigen Komponenten des Reaktionsgemisches.

Wie bereits erwähnt, enthält die feste Phase magnetisch anziehbare Teilchen von gesteuerter oder eingestellter Wichte. Diese Teilchen enthalten vorzugsweise eine Matrix mit einem oder mehreren darin eingebetteten, kleinen ferromagnetisehen Teilchen. Die ferromagnetisehen Teilchen können beispielsweise mit einem organischen Material überzogen sein, z.B. mit einem Polymer, oder sie können silanisiert sein, um entweder einen Antikörper oder ein Antigen zu binden. Geeignete Überzugsverfahren sind aus dem oben erwähnten Aufsatz von Hersh und Yaverbaum bekannt und auch von P.J. Robinson et al in einer Druckschrift "The Properties of Magnetic Supports in Relation to Immobilized Enzyme Reactions", Biotechnology and Bioengineering, Vol. XV (1937), Seite 603-609, beschrieben. Das Verhältnis zwischen den Volumen der Matrix und der magnetischen Teilchen ist so gewählt, daß sich die ergebende Wichte der Wichte der Flüssigkeitsphase annähert. Folglich werden diese magnetisch anziehbaren Teilchen von dem innerhalb jedes Probenschubs erzeugten laminaren Zweiphasenströmungsmuster mitgeschleppt. Die Teilchen haben somit keine Neigung, sich infolge Gravitation oder Flotation abzusetzen oder sonstwie anzuhäufen. Es sei bemerkt, daß die Wichte der magnetischen Teilchen nicht gleich der Wichte der Flüssigkeitsphase zu sein braucht. Sie soll aber so sein, daß während des Durchtritts durch die Vorrichtung ein Absetzen oder eine Flotation der festen Phase vermieden wird. Die verminderte Dichte der Teilchen sorgt für ausgezeichnete Auswascheigenschaften, so daß es im wesentlichen zu keinen Verseuchungen zwischen aufeinanderfolgenden Proben kommt. Wenn die Teilchen beispielsweise eine Wichte hätten, die wesentlich

709844/0634

größer als die Wichte der flüssigen Phase wäre, bestände die Neigung, daß sich die Teilchen absetzen und in dem Spitzenbereich bei der Grenzfläche zwischen dem Probenschub und dem nachfolgenden Luftschub längs der Innenwandoberfläche der Leitung 28 ansammeln. Ein solches Absetzen würde die Möglichkeit erhöhen, daß die Teilchen von dem nachfolgenden Luftschub sowie den sich daran anschließenden Flüssigkeits- und Luftschüben des fließenden Stroms passiert werden und in die nachfolgende Probe gelangen, die dann verunreinigt werden würde. Wenn die Wichte der Teilchen viel niedriger als diejenige der Probe wäre, käme es zu einer Absonderung der Teilchen durch Flotation, und es bestände die Gefahr, daß die Teilchen von den nachfolgenden Flüssigkeits- und Luftschüben passiert werden und dadurch eine Verunreinigung bewirken. Die Wichte der festen Phase wird folglich so gesteuert oder eingestellt, daß die Teilchen in dem laminaren Zweiphasenströmungsmuster verbleiben und mit diesem weitergetragen werden. Eine Verunreinigung oder Verseuchung aufeinanderfolgender Proben wird vermieden.

Der Reaktionsgemischstrom mit ständig zirkulierender fester Phase innerhalb der einzelnen Probenschübe oder Probenaliquote wird durch die Inkubationsschlange geleitet, um die Reaktion voranschreiten zu lassen. Der aus der Inkubationsschlange 54 austretende Strom wird in einem hohen Maße durch eine Pufferlösung verdünnt, die über den Pumpenschlauch 57 und eine Leitung 53 zugeführt wird, um die Reaktion zu hemmen (d.h. um die Reaktion zu löschen) und das Waschen der festen Phase durch einen Verdünnungsvorgang zu erleichtern. Der Auslaß der Inkubationsschlange 5^ ist über eine Leitung 56 mit einer Waschstation 58 verbunden. Die Waschstation enthält vorzugsweise eine erste Magnetfalle 60 und eine zweite Magnetfalle 62, die in bezug auf die Leitung 56 hinter-

7098U/0634

3M

einander angeordnet sind. Die Magnetfallen 60 und 62 arbeiten auf elektromagnetischer Grundlage und sind so angeordnet, daß die Magnetflußlinien quer zur Strömungsrichtung des Probenstroms gerichtet sind. Die Magnetfallen 60 und 62 werden von einer Programmeinheit 64 in einer besonders getaktetea Sequenz betätigt. Die Programmeinheit 64 wird von einem Probendetektor 65 angesteuert. Der Probendetektor 65 enthält eine Lichtquelle 66 und einen Lichtdetektor 68, der zusammen mit der Lichtquelle 66 am Ausgang der Inkubationsschlange 54 angeordnet ist. Das Licht der Lichtquelle 66 ist quer durch die Leitung 56 zum Lichtdetektor 68 gerichtet. Wenn eine durch die Leitung 56 geleitete Probe zu einem in der Fig. 2 dargestellten Zeitpunkt t den Lichtweg unterbricht, teilt der herabgesetzte Ausgangspegel des Lichtdetektors 68 der Programmeinheit 64 mit, die Magnetfallen 60 und 62 gleichzeitig zu erregen.

Im erregten Zustand spült die erste Magnetfalle 60 die feste Phase aus jedem der Probenschübe oder Probenaliquote heraus, die beispielsweise die in der Fig. 2 gezeigte Probe S₁ bilden. Die Intensität des von der ersten Magnetfalle 60 und auch von der zweiten Magnetfalle 62 erzeugten Magnetfeldes reicht aus, daß die Intraprobenluftblasen innerhalb einer der Proben S keinen Anteil der in der Waschstation 58 zurückgehaltenen festen Phase verdrängen oder wegtragen. Folglich wird die feste Phase jeder Probe, obgleich sich die feste Phase in einzelnen Probenschüben der Probe befindet, in der durch die erste Magnetfalle 60 geführten Leitung 56 angehäuft. Die Erregung der Magnetfalle 62 zum Zeitpunkt t₁ stellt sicher, daß irgendwelche Anteile der festen Phase, die von der Magnetfalle 60 nicht ausgespült werden, zurückgehalten werden. Die Magnetfalle 60 bleibt während des Durchtritts des gesamten Vo-

709844/0634

■'is

lumens jeder Probe S erregt und auch während des Durchtritts von wenigstens einem Teil des folgenden Waschflüssigkeitsschubs. Die Erregung ist somit während des in der Fig. 2 dargestellten Zeitintervalls t^ - t₂ vorhanden. Der Durchtritt des Waschflüssigkeitsschubs durch die Waschstation 58 dient dazu, während die feste Phase zusammengepackt ist, irgendwelches Obenaufschwimmendes von den magnetischen Teilchen zu entfernen. Bevor der gesamte Waschflüssigkeitsschub vorbeigeströmt ist, schaltet die Programmeinheit 64 zum Zeitpunkt t₂ die Erregung von der Magnetfalle 60 ab. Es kommt daher zu einer Wiedersuspension der festen Phase innerhalb des restlichen Waschflüssigkeitsschubs. Die vom Pumpenschlauch 52 in den Waschflüssigkeitsschub eingeleiteten Luftblasen haben die Neigung, die von der Magnetfalle zusammengepackte feste Phase aufzubrechen und die erneute Suspension der festen Phase in der Waschflüssigkeit zu beschleunigen, um eine vollständige Entfernung irgendeiner Flüssigkeitsphase, d.h. nichtgebundener gekennzeichneter oder nichtgekennzeichneter Antigene von ihrer Oberfläche sicherzustellen. Da die zweite Magnetfalle 62 erregt ist, wird die feste Phase nochmals von dem Waschlüssigkeitsschub ausgewaschen.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die durch die Waschstation 58 geführte Leitung 56 mit dem Einlaß eines Dreiweg-Zweistellungs-Ventils 70 verbunden. Die Auslässe dieses Ventils sind an einen Festphasen-Szintillationszähler 72 (Schaltstellung I) und an den Abfluß (Schaltstellung II) angeschlossen. Der Einlaß eines weiteren Dreiweg-Zweistellungs-Ventils 76 ist mit einer Leitung 78 verbunden, die.zum Pumpenschlauch 80 führt. Der Einlaß des Pumpenschlauchs 80 steht mit einer Quelle 82 für eine Pufferlösung in

709844/063A

" 3

Verbindung. Der eine Auslaß des Ventils 76 führt zum Abfluß (Schaltstellung I) und der andere Auslaß zum Festphasen-Szintillationszähler 72 (Schaltstellung II). Die Ventile 70 und 76 werden gleichzeitig von der Programmeinheit 64 gesteuert. Der Pumpenschlauch 84 steht mit seinem Einlaß mit der Umgebungsluft in Verbindung und ist mit seinem Auslaß an die Leitung 78 angeschlossen, so daß in den durch die Leitung 78 fließenden Pufferlösungsstrom Luftblasen periodisch eingeleitet werden. Die durch die Leitung 78 geförderte Pufferlösung oder Pufferflüssigkeit dient zur Reinigung des Festphasen-Szintillationszählers 72. Das Vorhandensein von Luftblasen in dem durch die Leitung 78 fließenden Strom dient zur Beschleunigung der Reinigung des Zählers 72 von irgendwelchen Resten der vorangegangenen Probe. Wenn die Festphase in der Waschstation 58 vollkommen ausgewaschen ist, wird vor dem Auftreten der nächsten Probe an der Lichtquelle 66 die Magnetfalle 62 zu dem in der Fig. 2 dargestellten Zeitpunkt t, abgeschaltet, und die Ventile 70 und 72 werden vorübergehend in die Schaltstellung I gebracht, um die Jetzt in der Waschflüssigkeit suspendierte feste Phase dem Zähler 72 zuzuführen und um den segmentierten Pufferlösungsstrom in der Leitung 78 zum Abfluß zu leiten. Die feste Phase wird durch eine im Zähler 72 enthaltene Speicherschlange 79 geleitet, um die Radioaktivität zu messen. Die Meßergebnisse können beispielsweise von einem Drucker ·'"'' registriert werden. Danach werden die Ventile 70 und V in die Schaltstellung II gebracht, um den Fluidstrom in der Leitung 58 zum Abfluß zu leiten und den segmentierten oder unterteilten Pufferlösungsstrom von der Leitung 78 durch den Zähler 72 zu führen. All dies geschieht zur Vorbereitung der Waschung und Messung der Festphase der nächsten Probe.

7098U/0634

Sofern es erwünscht ist, kann man auch anstelle der festen Phase die flüssige Phase messen. Zu diesem Zweck wird der Festphasen-Szintillationszähler lh durch einen Flüssigkeitsphasen-Szintillationszähler ersetzt. Die Magnetfallen 60 und 62 werden wie beschrieben betätigt, um die Festphase aus den Probenschüben oder Probenaliquoten derselben Probe herauszuwaschen. Gleichzeitig werden die Ventile 70 und 72 so gesteuert (Schaltstellung I), um die getrennte Flüssigkeitsphase direkt zur Speicherschlange des Flüssigkeitsphasen-Szintillationszähler zu leiten, und zwar während der Erregung der Magnetfallen 60 und 62. Vor der Abschaltung der Erregung der Magnetfallen 60 und 62 werden dann die Ventile 70 und 72 so betätigt (Schaltstellung II), daß die Festphase in der Waschflüssigkeit erneut suspendiert wird und dem Abfluß zugeleitet wird, während der segmentierte Pufferflüssigkeitsstrom zum Auswaschen durch den Flüssigkeits-Szintillationszähler geleitet wird. In beiden Fällen arbeiten die gesteuerte oder eingestellte Wichte der magnetischen Teilchen, auf denen die feste Phase immobilisiert ist, und das beschriebene magnetische direkte Fangverfahren zusammen, um eine positive oder zwangsläufige Trennung der festen und flüssigen Phase voneinander zu erreichen, ohne daß dabei die Auswascheigenschaften der Vorrichtung verschlechtert werden.

Nach der Erfindung können die einzelnen Proben, die durch die Leitung 28 geleitet werden, selektiv zur Reaktion gebracht werden. Dies ist im einzelnen nicht dargestellt. Aber es können beispielsweise mehrere Festphasenquellen 20 und Kennquellen 24 vorgesehen werden, denen jeweils ein Pumpenschlauch 30 und eine Rückleitung 30' zugeordnet ist und von denen jede mit einem zugehörigen Dreiweg-Zweistellungs-Umschaltventil ver-

7098U/0634

2710A38

bunden ist. Die Auslässe der Umschaltventile von jedem der Festphasen- und Kennsysteme als auch die Auslässe der Pufferflüssigkeitsventile kann man mit entsprechenden Einlassen eines Ventils mit zahlreichen Einlassen und einem einzigen Auslaß verbinden. Dieser Auslaß steht dann mit den Verbindungsstellen A und B in Verbindung.

Jedes der Einzelauslaßventile wird gesteuert aufgrund von Information, die von jedem einzelnen Behälter 16 gelesen wird, um die geeignete Festphase und Kennphase in geeigneter Phasenbeziehung zueinander den Verbindungsstellen B und A so zuzuführen, daß jede Probe selektiv zur Reaktion gebracht werden kann. Die Ausgabedaten können am Drucker 88 in geeigneter Weise identifiziert werden.

7098U/0634

Leerseite

Claims

Patentanspruch·

Vorrichtung zum Analysieren eines Fluids auf eine interessierende Substanz, gekennzeichnet durch Mittel (14) zuB Fördern eines Reaktionsgemisches durch eine Leitung (28, 56), das eine flüssige Phase einschließlich einer Probe des die interessierende Substanz enthaltenden Fluids und eine feste Phase mit einem Reagenz enthält, das an ein magnetisch anziehbares Teilchenmaterial gebunden ist, wobei in dem Gemisch eine Reaktion stattfindet, um an der festen Phase ein Reaktionsprodukt auszubilden, durch Mittel (58) zum magnetischen Einfangen des Teilchenmaterials in der Leitung (28, 56), um es gegen den Einfluß der Strömung festzuhalten und auf diese Weise die feste Phase von der fließenden flüssigen Phase zu trennen, und durch stromabwärts der Einfangmittel (58) gelegene Mittel (72, 79) zum Bestimmen der in der Probe enthaltenen interessierenden Substanz durch Amalyse der getrennten festen Phase oder flüssigen Phase·

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Mittel (A, 54) zum Einbringen des Teilchenmaterials durch Zumischung in die in der Leitung (28, 56) fließende Probe.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Einfangmittel (58) wenigstens eine Magneteinrichtung (60 oder 62) enthalten, die aktivierbar ist, um in einem Abschnitt der Leitung (28, 56) ein Magnetfeld vorzusehen.

709844/063*

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Einfangmittel (58) zwei voneinander beabstandete Hagneteinrichtungen (60 und 62) enthalten, die aktivierbar sind, um in zwei voneinander beabstandeten Abschnitten der Leitung (28, 56) ein Nagnetfeld vorzusehen·

5· Vorrichtung nach Anspruch 4,

dadurch gekennzeichnet, daß jede der Magneteinrichtungen (60, 62) unabhängig von der anderen aktivierbar ist«

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch Mittel (15, 18) zum Fördern einer Waschflüssigkeit durch die Leitung (28, 56).

7. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, gekennzeichnet durch Mittel (15» 18) zum Fördern einer Waschflüssigkeit durch die Leitung (28, 56) und dadurch daß die Magneteinrichtung bzw. die Magneteinrichtungen (60, 62) aktivierbar sind, um das Teilchenmaterial zum Auswaschen mit der fließenden Waschflüssigkeit festzuhalten, und anschließend inaktivierbar sind, um das Teilchenmaterial als Suspension in die Waschflüssigkeit freizugeben.

8. Vorrichtung nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch Mittel (15, 18) zum Fördern einer Waschflüssigkeit durch die Leitung (28, 56) und dadurch daß beide Magneteinrichtungen (60,.62) zunächst aktivierbar sind, um das Teilchenmaterial zum Auswaschen mit der Waschflüssigkeit festzuhalten, und daß anschließend die stromaufwärts gelegene Magneteinrichtung (60) selektiv inaktivierbar ist,

709844/0634

um es dem von ihr festgehaltenen Material zu gestatten, in der Waschflüssigkeit zu suspendieren und zu der stromabwärts gelegenen Hagneteinrichtung (62) zu gelangen.

9· Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die oder jede der Hagneteinrichtungen (60, 62) so angeordnet ist, daß sie im aktivierten Zustand in der Leitung (28, 56) ein Hagnetfeld erzeugt, das im wesentlichen quer zur Strömungsrichtung des Reaktionsgemisches in der Leitung (28, 56) gerichtet ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die oder jede der Hagneteinrichtungen (60, 62) elektromagnetisch ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch Mittel zum Entmagnetisieren der oder jeder der elektromagnetischen Einrichtungen.

12. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Kittel (14) zum Fördern aufeinanderfolgender Reaktionsgemische durch die Leitung (28, 56), wobei die Reaktionsgemische durch wenigstens einen inerten Fluidschub voneinander getrennt sind, dessen Volumen hinreichend ist, um die Leitung (28, 56) abzuschließen und die aufeinanderfolgenden Gemische in einem voneinander getrennten Zustand zu halten.

709844/0634

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, gekennzeichnet durch Mittel (38, 40, 52) zum Einleiten inerter Fluidschübe in die Leitung (28, 56) zur Weiterunterteilung der FlUssigkeitsproben oder Reaktionsgemische in der Leitung.

14. Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, gekennzeichnet durch Mittel (15» 18) zum Einführen eines Waschflüssigkeitsschubs zwischen in der Leitung (28, 56) fließende aufeinanderfolgende Reaktionsgemische, wobei jedes Reaktionsgemisch von den angrenzenden Waschflüssigkeitsschüben wenigstens durch einen Inerten Fluidschub getrennt ist.

15· Vorrichtung nach Anspruch 12, 13 oder 14, gekennzeichnet durch Mittel (42) zum Einleiten des Teilchenmaterials in die Leitung (28, 56) in einer solchen intermittierenden Weise, daß das Teilchenmaterial mit den aufeinanderfolgenden Proben zusammengebracht wird.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die die intermittierende Einleitung vornehmenden Mittel eine Einrichtung (30*) zum Zurückführen des nicht zur Leitung (28, 56) zugelassenen Teilchenmaterials zu einem dafür vorgesehenen Reservoir (20) enthalten.

17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, gekennzeichnet durch Mittel (22, 34, 34«, 40) zum Einleiten einer Pufferlösung in die Leitung (28, 56), und zwar abwechselnd mit dem Teilchenmaterial, um in der Leitung (28, 56) einen im wesentlichen konstanten Durchfluß aufrechtzuerhalten.

7098U/0834

18. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder einem der Ansprüche 4 bis 17, wenn abhängig von Anspruch 3, gekennzeichnet durch stromaufwärts der Magneteinrichtung (60 oder 62) vorgesehene Mittel (65) zum Erfassen des Durchtritts eines Reaktionsgenlsches durch die Leitung (28, 56) und durch Mittel (64) zum Aktivieren der Magneteinrichtung (60 oder 62) aufgrund der Erfassung des Durchtritts eines Reaktionsgemisches, um die Teilchen in dem Gemisch einzufangen·

19· Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Mittel (24, 32, 32', 44) zum Einführen eines zweiten Reagenzes in das Reaktionsgemisch·

20· Vorrichtung nach Anspruch 19» gekennzeichnet durch Mittel (B₉ 55) zum Einbringen des zweiten Reagenzes durch Zumischung in die in der Leitung (28, 56) fließende Probe oder in das in der Leitung fließende Reaktionsgemisch·

21. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch stromabwärts der Einfangmittel in der Leitung (28, 56) vorgesehene Ventileinrichtungen (70) zum Zuführen von getrenntem Teilchenmaterial oder getrennter flüssiger Phase zu den Mitteln (72) zum Bestimmen der interessierenden Substanz.

7098U/0634

·» 6 —

22. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Mittel zum Messen der Radioaktivität, der Farbe, der Fluoreszenz oder der Lumineszenz In dem getrennten Teil* chenmaterial oder in der getrennten flüssigen Phase stromabwärts der Einfangmittel (58).

23· Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch die Beschreibung der Fig. 1 oder die Beschreibung der Fig. 1 bis 3C.

24. Verfahren zum Analysieren eines Fluids auf eine interessierende Substanz,

gekennzei chnet durch die folgenden Schritte:

(a) daß aus einer Probe des Fluids und einer festen Phase mit einem an magnetisch anziehbarem Teilchenmaterial gebundenen Reagenz ein Gemisch gebildet wird,

(b) daß das Gemisch durch eine Leitung gefördert wird,

(c) daß die feste Phase in der Leitung magnetisch eingefangen wird, um das Teilchenmaterial gegenüber der Strömung festzuhalten und auf diese Welse die feste Phase von dem Gemisch zu trennen, und

(d) daß die In der Probe enthaltene interessierende Substanz durch Analyse der getrennten festen Phase und bzw. oder des getrennten Gemisches bestimmt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24,
dadurch gekennzei chnet, daß beim Schritt (d) die feste Phase durch Zumischen in die in der Leitung fließende Probe eingebracht wird.

7098U/0634

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet» daß nach den Schritt (c), aber vor dem Schritt (d) eine Waschflüssigkeit durch die Leitung geleitet wird, um das eingefangene Teilchenmaterial auszuwaschen.

27· Verfahren nach Anspruch 26,

dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Waschen das eingefangene Teilchenmaterial freigegeben und in dem Fluid suspendiert wird.

28. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Teilchenmaterial in einer ersten magnetischen Fangeinrichtung festgehalten wird, gewaschen wird, aus der ersten magnetischen Fangeinrichtung freigegeben und in fließender Waschflüssigkeit suspendiert wird, zu einer zweiten magnetischen Fangeinrichtung stromabwärts der ersten magnetischen Fangeinrichtung befördert wird, dort zum Waschen festgehalten wird und schließlich freigegeben wird, um im Fluid erneut suspendiert zu werden und von der zweiten magnetischen Fangeinrichtung wegbefördert zu werden.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Teilchenmaterial von der magnetischen Fangeinrichtung freigegeben wird und getrennt vom Reaktionsgemisch aufgesammelt wird.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Teilchenmaterial unter Verwendung von einem oder mehreren Elektromagneten eingefangen wird und daß der oder jeder Elektromagnet bei seiner Inaktivierung entmagnetisiert wird. 7 0 9 8 A kl 0 6 3 k

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß aufeinanderfolgende Reaktionsgemische durch wenigstens einen inerten Fluidschub voneinander getrennt durch die Leitung gefördert werden, wobei der Fluidschub ein hinreichendes Volumen hat, um die Leitung abzuschließen und die aufeinanderfolgenden Proben in einem voneinander getrennten Zustand zu halten.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß Inerte Fluidschübe in die Leitung eingebracht werden, um eine Probe oder ein Reaktionsgemisch in zwei oder mehrere Schübe zu unterteilen.

33· Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen aufeinanderfolgenden Reaktionsgemischen in der Leitung ein Waschflüssigkeitsschub vorgesehen wird, und jedes Gemisch von den angrenzenden Waschflüssigkeitsschüben mindestens durch einen inerten Fluidschub getrennt wird.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß das Teilchenmaterial in die Leitung intermittierend eingeleitet wird, um mit aufeinanderfolgenden Proben oder Probenschüben vermengt zu werden.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß eine Pufferlösung abwechselnd mit dem Teilchenmaterial in die Leitung eingeleitet wird, und zwar in einer solchen Weise, daß der Durchfluß in der Leitung im wesentlichen konstantgehalten wird.

7098U/0634

36· Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß in das Gemisch ein zweites Reagenz eingebracht wird·

37· Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Reagenz durch Zumischen in die in der Leitung fließende Probe eingebracht wird·

38. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß als Probe eine Menschen- oder Tierprobe verwendet wird und daß die Analyse als Immunoanalyse durchgeführt

39· Verfahren nach Anspruch 38»

dadurch gekennzeichnet, daß die interessierende Substanz ein Antigen, Antikörper oder Antigen:Antikörper-Komplex ist.

40. Verfahren nach Anspruch 36 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Interessierende Substanz ein Antigen ist, daß das an das Teilchenmaterial gebundene Reagenz ein Antikörper zu diesem Antigen ist und daß das zweite Reagenz ein Antigen 1st, das von dem Antikörper gebunden werden kann und eine Identifizierungskennung trägt,

41· Verfahren nach Anspruch 36 oder 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Interessierende Substanz ein Antikörper ist, daß das an das Teilchenmaterial gebundene Reagenz ein Antigen ist, welches den Antikörper binden kann, und daß das zweite Reagenz ein Antikörper ist, der das Antigen binden kann und der eine Identifizierungskennung trägt.

709844/0634

42. Verfahren nach Anspruch 40 oder 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Kennung ein radioaktives Atom, eine Fluoreszenzgruppe, ein Enzym oder Koenzym oder ein Chemolumineszenzmaterlal 1st.

43· Verfahren nach Anspruch 36 oder 37 _t dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgemisch als zweites Reagenz eine vorbestimmte Menge einer Substanz enthält, die mit der Interessierenden Substanz reagiert und mit ihr einen Komplex bildet, und daß das Reagenz an dem Teilchenmaterial entweder den Komplex oder den Überschuß des nicht reagierten zweiten Reagenzes bindet und daß beim Schritt (d) das getrennte Gemisch analysiert wird, um die in der Probe befindliche interessierende Substanz zu bestimmen·

44. Verfahren nach Anspruch 36 oder 37, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Reagenz eine radioaktive Kennung trägt.

45· Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz am Teilchenmaterial ein Virus oder ein Immunoglobulin ist·

46. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 45, dadurch gekennzeichnet, daß das Teilchenmaterial von einer zusammengesetzten Struktur 1st.

7098M/0634

47. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß das Teilchenmaterial eine Matrix enthält, die ein magnetisch anziehbares Material aufweist und an die ein

Reagenz gebunden ist.

48· Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix ein organisches Material enthält, das ein Reagenz binden kann.

49· Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 48, dadurch gekennzei c hnet, daß das Teilchenmaterial eine Wichte hat, die sehr dicht an die Wichte des Reaktionsgemisches herankommt.

50. Verfahren nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, daß die Wichte im wesentlichen in einem Bereich von 1,4 bis 3,2 liegt.

51. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 48 zum Analysieren eines biologischen Fluids im wesentlichen wie an Hand der Zeichnung beschrieben·

52. Teilchenreagenz zur Verwendung bei der Analyse einer flüssigen Probe,

dadurch gekennzeichnet, daß jedes Teilchen eine Matrix mit einem magnetisch anziehbaren Material enthält und daß an das Teilchen ein Reagenz gebunden 1st, das in der Lage ist, mit der flüssigen Probe zu reagieren·

709844/0634

53. Reagenz nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix ein organisches Material enthält, an das das Reagenz gebunden ist.

54. Reagenz nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix ein anorganisches Material enthält, an das das Reagenz gebunden 1st.

55· Reagenz nach Anspruch 52, 53 oder 54, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix Cellulose oder ein Cellulosederivat, ein synthetisches polymeres Material oder Agarose ist·

56. Reagenz nach Anspruch 52, 53, 54 oder 55, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen eine Wichte in einem Bereich von 1,4 bis 3,2 haben.

57· Reagenz nach Anspruch 52, im wesentlichen wie in der Beschreibung erläutert.

709844/0634