DE2903216C2

DE2903216C2 - Enzymelektrode und immobilisiertes Enzym enthaltende Membran

Info

Publication number: DE2903216C2
Application number: DE2903216A
Authority: DE
Inventors: Toshio Otsu Shiga Tsuchida; Rintaro Shiga Urakabe; Kentaro Otsu Shiga Yoda
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1978-01-28
Filing date: 1979-01-27
Publication date: 1983-12-22
Also published as: JPS5921500B2; US4240889A; DE2903216A1; JPS54102193A

Description

a) der der Anode zugewandte Oberflächenbereich der Membran glatt und eben, für Wasserstoffperoxid selektiv durchlässig ist und sich nicht mehr als 5 μιη in die Tiefe der Membran erstreckt.

b) die !pt» der Testlösung in Berührung stehende Oberfläche der Membran rauh und porös ist und an ihr das Enzym immobilisiert ist und

c) die Dicke der Membran 5 bis 50 μπι beträgt

Z Enzymelektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Oxidoreduktase ist, die mit dem Substrat unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid reaktionsfähig ist oder Wasserstoffperoxid zu verbrauchen vermag.

Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid, die mit einer immobilisiertes Enzym enthaltenden Membran versehen ist, mit einer Anode, einer Kathode, einer immobilisiertes Enzym enthaltenden Membran mit ganz spezieller Struktur und einem Elektrolyten, wobei die Membran so angeordnet ist, daß die das immobilisierte Enzym enthaltende Seite von der Anode abgewandt ist.

Es gibt allgemein angewendete Methoden zur selektiven Bestimmung einer sehr geringen Menge verschiedener Komponenten wie Glucose, Harnstoff. Harnsäure, Triglyceride, Phospholipide, Kreatinin, Aminosäuren, Milchsäure, Xanthin. Chondroitin, Transaminase usw, die in Körperflüssigkeiten, Körpergewebe, Nahrungsmitteln o. dgl. enthalten sind.

Enzyme weisen im allgemeinen Spezifität gegenüber ihrem Substrat auf und wirken unter milden Bedingungen selektiv darauf ein, so daß sie vorteilhaft für die Bestimmung der vorstehend genannten Komponenten in geringer Konzentration ohne Verwendung eines spezifischen Reagens sowie ohne jedes Problem hinsichtlich Umweltverunreinigung verwendet werden. Andererseits weisen die Enzyme einige Nachteile auf: Sie sind chemisch und physikalisch instabil, und die Bestimmungsmethode ist sehr kompliziert. Zur Ausschaltung der Nachteile wurde vorgeschlagen, das Enzym zu immobilisieren. Ferner wurde vorgeschlagen, die immobilisierten Enzyme in der Polarographie zu verwenden, die für die elektrochemische Bestimmung von Komponenten, die in geringer Menge in Untersuchungsproben enthalten sind, vorteilhaft ist (japanische Patentveröffentlichung 28 672/1972). Hierzu wird eine Enzymelektrode, die mit einer immobilisiertes Enzym enthaltenden Membran versehen ist, mit einer zu analysierenden Losung in Berührung gebracht, wodurch das Enzym mit dem Substrat umgesetzt und eine mit einer Elektrode nachweisbare Substanz, z. B. Wasserstoffperoxyd, gebildet wird. Diese gebildete nachweisbare Substanz wird mit einer Elektrodenzelle bestimmt In dieser Weise wird die in der Untersuchungslösung enthaltene Komponente polarographiscb analysiert Wenn es sich bei der mit der Elektrode nachweisbaren Substanz um Wasserstoffperoxyd handelt wird das

ίο Wasserstoffperoxyd durch die Anode zersetzt, wodurch ein elektrischer Strom, der der Wasserstoffperoxydmenge proportional ist durch die polarographische Zelle fließt Da der Wert des elektrischen Stroms der Menge der zu bestimmenden Komponente proportional ist, kann die- Menge der Komponente berechnet werden. Bei der praktischen Durchführung dieser Methode ist es jedoch erforderlich, daß die in der Tastlösung enthaltenen störenden Stoffe, die gegenüber der Polarographie aktiv sind, vorher entfernt werden. Wenn beispielsweise Glucose, die im Blut enthalten ist, bestimmt wird, müssen andere für die Polarographie aktive Komponenten, z. B. Harnsäure, Ascorbinsäure, Glutathion und Mercaptoessigsäure. vorher entfernt werden. Um diesen Fehler, der auf diese störenden Stoffe zurückzuführen ist, zu korrigieren, wurde vorgeschlagen, ein _;vlehrfachelelarodensvstem zu verwenden, wodurch das auf die störenden Stoffe zurückzuführende Signal korrigiert wird (japanische Patentveröffentlichung 35 360/1970). Dieses System weist jedoch einen komplizierten Elektrodenaufbau und eine komplizierte elektrische Schaltung auf und ist daher kostspielig und störungsanfällig im Betrieb. Es wurde ferner vorgeschlagen, eine Laminatmembran aus einer Membran, die für die zu bestimmende Substanz selektiv durchlässig ist, einer immobilisiertes Enzym enthaltenden Membran und einer Membran zur Entfernung von hochmolekularen Materialien, um niedrigmolekulare störende .Materialien zu eliminieren, zu verwenden (japanische Offenlegungsschrift (unge-

«o prüft) 55 691/1977). Es ist jedoch schwierig und umständlich, mehrere Membranen gleichmäßig und genau zu laminieren und zu verkleben. Hierzu sind komplizierte und anspruchsvolle Arbeitsverfahren erforderlich. Die Laminatmembran hat ferner geringe

*5 Festigkeit und bricht leicht und schrumpft, so daß es schwierig ist. sie an der Elektrode zu befestigen oder von der Elektrode abzunehmen. Es wurde ferner vorgeschlagen, eine poröse Membran zu verwenden (japanische Offenlegungsschrift (ungeprüft) 17 889/ 1977). Wenn der Porendurchmesser der porösen Membran gering ist, weist sie gute selektive Permeabilität für die bestimmbare Substanz auf, jedoch wird der Kontakt zwischen Substrat und Enzym ungenügend, so daß ungenaue Ergebnisse der Bestimmung die Folge sind. Wenn dagegen die poröse Membran einen großen Porendurchmesser hat, wird die selektive Permeabilität ungenügend, und die störenden Stoffe können ebenfalls hindurchtreten, so daß ebenfalls ungenaue Ergebnisse der Bestimmung erhalten werden.

In der DE-OS 26 34 562 wird eine Enzymmembran beschrieben, die für eine Enzymelektrode verwendet wird. Sie ist Bestandteil einer Doppelmembran, die aus einem porösen organischen hochmolekularen, polymeren Membranteil, an dem ein Enzym immobilisiert ist, und einem für Sauerstoff permeablen, aus Teflon bestehenden Membranteil zusammengesetzt ist. Nachteil einer solchen Verbund- oder Doppelmembran ist, daß jede der Ausgangsmembranen schlechte mechani-

sehe Festigkeiten aufweist und schrumpft oder sogar bricht was bedeutet daß es sehr schwierig ist, geeignete Membranen für eine Enzymelektrode zu erhalten.

Die DE-OS 26 38 193 beschreibt eine polarographische Zelle, in der eine laminierte Membran angeordnet ist. wobei diese laminierte Membran aus drei verschiedenen Schichten besteht und zwar aus einer ersten Schicht, die im wesentlichen aus Silikonkautschuk, Methylmethacrylat oder Celluloseacetat besteht einer zweiten Schicht aus einem Stützmaterial, das den i" Durchgang niedermolekularer Substanzen gestattet jedoch den Durchgang hochmolekularer Substanzen ausschließt und einer dritten Schicht und zwar einer Klebeschicht die zwischen der ersten und der zweiten Schicht angeordnet ist und diese miteinander verbindet ι > und wenigstens ein Enzym eingeschlossen enthält Bei der laminierten Membran der genannten DE-OS ist die erste Schicht eine Schicht aus dichter Haut die der Anode zugewandt ist während die äußere Schicht der Testlösung zugewandt ist und eine poröse Schicht ist, *-' während die das Enzym enthaltende dritte Schicht zwischen den beiden anderen Schichten liegt und eine Klebeschicht ist Daher findet die Reaktion zwischen dem Substrat und dem Enzym durch die äußere poröse Schicht hindurch statt, woraus folgt daß die Reaktion -5 sehr langsam abläuft und die Empfindlichkeit schlecht ist.

Es wurde nun gefunden, daß die vorstehend genannten Nachteile der bekannten Methoden und Apparate ausgeschaltet werden können, wenn eine w einzige besondere Membran verwendet wird, die eine ganz spezielle Struktur aufweist, bei der eine Membranflache, die der Elektrode zugewandt ist, glatt und eben und für Wasserstoffperoxid selektiv durchlässig, aber für das Substrat und die störenden Stoffe undurchlässig ist und-sich nicht mehr als 5μπι in die Tiefe der Membran erstreckt, und die andere Membranfläche, die der Testlösung zugewandt und mit ihr in Berührung ist, rauh und porös is „ und bei der das Enzym an der rauhen, porösen, der Testlösung zugewandten Oberfläche der *o Membran immobilisiert ist.

Gegenstand der Erfindung ist eine Enzymelektrode, die mit einer immobilisiertes Enzym enthaltenden Membran mit ganz spezieller Struktur versehen ist. Die Erfindung ist ferner auf eine verbessertt, immobilisier- «5 tes Enzym enthaltende Membran gerichtet, die für die polarographische Analyse einer geringen Menge von Komponenten geeignet ist. Die Erfindung umfaßt außerdem eine Methode zjr Bestimmung geringer Mengen von Komponenten durch Nachweis von Wasserstoffperoxid, das durch die Reaktion eines Enzyms und des Substrats gebildet oder verbraucht wird, mit Hilfe einer polarographischen Zeile mit einer Anode, einer Kathode, einer immobilisiertes Enzym enthaltenden Membran mit ganz spezieller Struktur und einem Elektrolyten, wobei die das immobilisierte Enzym enthaltende Membranfläche so angeordnet ist. daß sie von der Anode abgewandt ist.

Die das immobilisierte Enzym enthaltende Membran gemäß der Erfindung hat eine ganz spezielle Struktur, ^b0 bei der eine Membranfläche, die der Elektrode zugewandt ist, dicht ist und eine glatte, ebene Haut bildet, die selektive Permeabilität aufweist, nur für Wasserstoffperoxid durchlässig ist und sich nicht mehr als 5 μπι in die Tiefe der Membran erstreckt, und bei der die andere Membranfläche p:<rös ist, wobei das Enzym an den Poren der porösen Membranfläche immobilisiert ist. Die das immobilisierte Enzym enthaltende Membranfläche steht mit der Testlösung in Berührung. Das Substrat dringt in die Poren ein und reagiert darin mit dem Enzym unter Bildung von Wasserstoffperoxid.

Die das immobilisierte Enzym enthaltende Membran gemäß der Erfindung weist ausgezeichnete selektive Permeabilität auf und vermag das unerwünschte Hindurchtreten von niedrigmolekularen störenden Stoffen vollständig zu verhindern. Sie zeigt ferner ausgezeichneten Kontakt des Enzyms mit dem Substrat, so daß die Enzymelektrode, die mit der immobilisiertes Enzym enthaltenden Membran versehen ist, für die genaue Bestimmung geringer Konzentrationen von Komponenten in Körperflüssigkeiten, Körpergewebe, Nahrungsmitteln o. dgl. geeignet ist Die das immobilisierte Enzym enthaltende Membran hat zahlreiche weitere Vorteile:

1. Sie weist hohe Festigkeit auf und läßt sich leicht handhaben.

2. Da sie aus einer Einzelschicht besteht (d.h. kein Laminat ist), ist sie gleichmäßig und eben und ermöglicht die Ermittlung genauer Bestimmungsdaten n:it guter Reproduzierbarkeit

3. Sie kann mit geringen Kosten hergestellt werden.

4. Auf Grund des. guten Eindringens des Substrats kann die Messung in kurzer Zeit erfolgen.

5. Es findet kein Durchschlag statt.

Die das immobilisierte Enzym enthaltende Membran und die Enzymelektrode gemäß der Erfindung werden nachstehend ausführlich unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben.

Fig. 1 zeigt schematisch im Schnitt die das immobilisierte Enzym enthaltende Membran gemäß der Erfindung. Wie die Figur zeigt, weist diese Membran 1 «ine der Elektrode zugewandte Oberfläche 2, die eine dichte Haut bildet, und eineiOberfläche 3 auf, die der Testlösung zugewandt und rauh und porös ist. Das Enzym 4 ist auf der porösen Oberfläche insbesondere in den Por-v-a der porösen Oberfläche 3 immobilisiert.

Fig. 2 zeigt schematisch als Querschnitt eine Enzymelektrode für die Polarographie. Diese Elektrode ist mit einer erfindungsgemäßen, immobilisiertes Enzym enthaltenden Membran versehen. Hierbei ist 5 eine Anode 6, eine Kathode 7, ein isolierter Halter für die Elektrode und 8 ein Elektrolyt, d. h. eine Testlösung. Wie F i g. 2 zeigt, ist die das immobilisierte Enzym enthaltende Membran 1 gemäß der Erfindung im Polarography so angeordnet, daß die Oberfläche 2 der Elektrode zugewandt und die poröse Oberfläche 3 mit der zu analysierenden Testlösung in Berührung ist An der porösen .Oberfläche 3 reagiert das auf der porösen Oberfläche immobilisierte Enzym 4 mit dem in der Testlösung enthaltenen Substrat unter Bildung einer durch die Elektrode nachweisbaren Substanz, nämlich Wasserstoffperoxid. Das hierbei gebildete Wasserstoffperoxid durchdringt die das immobilisierte Enzym enthaltende Membran 1 und wird an der Anode 5 zersetzt, wodurch die Menge des Wasserstoffperoxids polarographisch bestimmt wird. Die Anode besteht gewöhnlich aus Platin, kann jedoch auch tus Gold bestehen. Die Kathode besteht gewöhnlich aus Silber, kann jedoch auch aus Silber-Silberchlorid bestehen.

Die Membran wird aus hochmolekularen Verbindungen, d. h. Homopolymeren oder Copolymeren beispielsweise Polyamiden. Polyurethanen. Celluloseacetat, Cellulose, Polycthylcnimin, Polyvinylalkohol, Polycarbonaten, Polymethyimethacrylat oder Polyacrylnitril, herge-

stellt. Bevorzugt als hochmolekulare Verbindungen werden hydrophile hochmolekulare Verbindungen. /.. B. Polyamide, Celluloseacetat und Polyvinylalkohol.

Die Membran mit der speziellen Struktur kann nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Beispiels- '■ weise wird die als Ausgangsmaterial verwendete hochmolekulare Verbindung in einem Lösungsmittel (z. B. Aceton) gelöst, und die hierbei erhaltene Lösung wird auf einer Grundplatte mit glatter Oberfläche, beispielsweise einer Glasplatte, Kunststoffplatte oder m Metallplatte, zu einer dünnen Folie gegossen. Das Lösungsmittel wird in kurzer Zeit verdampft, wobei auf der Grundplatte eine Hautschicht mit selektiver Permeabilität gebildet wird. Die erhaltene Membran wird in ein Lösungsmittel getaucht, in dem die ü hochmolekulare Verbindung schwerlöslich oder wenig löslich ist. Hierdurch wird die in der Membran enthaltene, im Lösungsmittel lösliche hochmolekulare Verbindung entfernt und eine an die Hautschicht angrenzende poröse Schicht gebildet (japanische -" Offenlegungsschrift (ungeprüit) 94 482/1976 und US-PS 31 33 IJ2 und 31 33 133). Die Membran kann auch hergestellt werden, indem eine poröse Membran mit durchgehenden Poren aus der als Ausgangsmaterial dienenden hochmolekularen Verbindung nach üblichen -5 Verfahren, beispielsweise durch Elution. Gießen oder Recken, gebildet, eine Oberfläche der hierbei erhaltenen porösen Membran mit einem Lösungsmittel, das die als Ausgangsmaterial dienende hochmolekulare Verbindung za lösen vermag, behände!, und hierdurch die w Hautschicht auf der Oberfläche gebildet wird (japanische Offenlegungsschrift 69 476/1977). Nach einem anderen Verfahren kann die Membran durch Bildung einer dünnen Schicht auf einer Oberfläche einer porösen Membran hergestellt werden, indem die poröse ->5 Membran einer Plasmapolymerisation in einem inertgas unterworfen wird (J. R. Hollaman und T. Wydcven in |. Appl. Polymer Sei. 21 (1977) 923 und japanische Patentveröffentlichung 32 755/1977).

Die Membran hat vorzugsweise eine Dicke von 5 bis 50 μπι, insbesondere von 10 bis 20 μιη. Die Hautschicht der Membran mit ausgezeichneter selektiver Permeabilität (undurchlässig für das Substrat und durchlässig nur für das Wasserstoffperoxid) hat vorzugsweise eine Dicke von nicht mehr als etwa 5 μπι, insbesondere nicht *5 mehr als 1 μιη. Besonders bevorzugt wird für die Hautschtcht eine Dicke im Bereich von 03 bis 1 μηι.

Als Enzyme, die auf der porösen Oberfläche der Membran zu immobilisieren sind, kommen verschiedene Oxidoreduktasen in Frage, die mit dem Substrat unter so Freisetzung von Wasserstoffperoxid reaktionsfähig sind oder Wasserstoffperoxid durch eine enzymatische Reaktion zu verbrauchen vermögen, z. B. Glucoseoxidase, Galactoseoxidase, Uricase. Cholesterinoxidase, Cholinoxidase. 1-Aminosäureoxidase, d-Aminosäureoxidase. Xanthinoxidase, Alkoholoxidase, Aldehydoxidase. Milchsäureoxidase, Brenztraubensäureoxidase und Peroxidase. Geeignet sind auch Enzyme oder Coenzyme, die Wasserstoffperoxid durch eine enzymatische Reaktion nicht direkt freisetzen oder verbrauchen, sondern ein Substrat für eine enzymatische Reaktion unter Bildung oder Verbrauch von Wasserstoffperoxid bilden, ζ. B. Lipase, Lipoproteinlipase, Phospholipase, Cholesterinesterase, /i-Galactosidase und Mutarotase. An Stelle der Enzyme selbst können Mikroorganismen oder Organellen, die Enzyme enthalten, immobilisiert werden.

Die Immobilisierung des Enzyms auf der Membran kann nach üblichen Verfahren erfolgen. Beispielsweise wird bei chemischen Bindiingsverfahren, /.. B. beim Verfahren der kovalenten Bindung, nach dem lonenbindungsvcrfahren oder Vcrnet/.ungsverfahren, das Enzym an die in der die Membran bildenden Verbindung enthaltene Aminogrtippc. Hydroxylgruppe o. dgl. mit Hilfe eines Vernetzungsmittels, beispielsweise Glutaraldehyd oder Hexamethylendiisocyanat gebunden. Die Immobilisierung des Enzyms kann auch durch direkte Reaktion der im Enzym enthaltenen Carboxylgruppe und einer Aminogruppe oder anderen in der die Membran bildenden Substanz enthaltenen rekationsfähigen Gruppe erfolgen. Das Enzym kann auch immobilisiert werden, indem zuerst die in der die Membran bildenden Substanz enthaltene Hydroxylgruppe durch Modifizierung mit einem Säureazid oder durch Imidocarbonisation oder Carbonisation aktiviert und dann das ^: Enzym damit umgescUi wird. Die Immobilisierung des Enzyms kann auch nach einem physikalischen Adsorptionsverfahren erfolgen, bei dem man beispielsweise einen Träger (z. B. Kaolinit. Calciumphosphatgel, Stärke oder Gluten) in die poröse Oberfläche der Membran eindringen und dann das Enzym darin eindringen IaQt oder indem man das Enzym direkt in die poröse Oberfläche eindringen läßt. Ferner kann das Enzym immobilisiert werden, indem man d>* poröse Oberfläche der Membran von einem Gemisch eines Enzyms mit einer hochmolekularen Verbindung, die eine aktive Gruppe (z. B. Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe) enthält, z. B. Polyamide, Cellulose oder Polyacrylsäure, durchdringen läßt und dann das Enzym mit einem Vernetzungsmittel (z. B. Glutaraldehyd oder Hexamethylendiisocyanat) vernetzt, oder indem man eine Enzymlösung in die poröse Oberfläche der Membran eindringen läßt und dann das Enzym mit dem vorstehend genannten Vernetzungsmittel direkt mit der Membran vernetzt oder indem man ein Gemisch eines Enzyms und einer hochmolekularen Verbindung, z. B. Protein oder Chitosan, in die poröse Oberfläche der Membran eindringen läßt und das Gemisch dann durch Behandlung mit Alkali geliert.

Die Immobilisierung des Enzyms kann gleichzeitig mit der Bildung der Membran oder nach der Bildung der Membran erfolgen. Wenn gleichzeitig ein anderes Enzym oder Coenzym verwendet wird, kann es in der zu analysierenden Testlösung gelöst oder zusammen mit dem Hauptenzym an der Membran immobilisiert werden.

Die das immobilisierte Enzym enthaltende Membran gemäß der Erfindung wird in die übliche polarographische Zelle eingesetzt, die mit einer Platinanode, einer Kathode aus Silber-Silberchlorid und Kaliumchlorid als Elektrolyt versehen ist oder eine Platinanode, eine Silberkathode und Natriumacetat als Elektrolyt aufweist. Andere polarographische Zellen können ebenfalls verwendet werden.

Die das immobilisierte Enzym enthaltende Membran gemäß der Erfindung weist ausgezeichnete selektive Permeabilität. Stabilität und enzymatische Aktivität auf. Die mit der das immobilisierte Enzym enthaltenden Membran versehene Enzymelektrode eignet sich somit zur Bestimmung geringer Konzentrationen von Komponenten, die fin Blut, Urin, in Körpergeweben, Nahrungsmitteln o. dgL enthalten sind. Die mit der das immobilisierte Enzym enthaltenden Membran versehene Enzymelektrode gemäß der Erfindung eignet sich ferner zur kontinuierlichen Überwachung von Blut-

zuckerwerten. Die Enzymelekirode ermöglicht die Bestimmungen mit großer Genauigkeit und niedrigen Kosten innerhalb sehr kurzer Zeit unter Verwendung einer geringen Menge der zu untersuchenden Probe.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel I

2 g Celluloseacetat wurden in 50 ml eines Lösungsmittelgemisches aus 30 ml Aceton und 20 ml Cyclohexa- "> non gelöst. Das Gemisch wurde mit einer Rakel in Form eines Films einer Dicke von 300 um auf eine Glasplatte aufgebracht. Das Produkt wurde 10 Minuten an der Luft stehen gelassen und dnnn in η-Hexan getiucht, um das Lösungsmittel zu extrahieren. Nach dem Trocknen an der Luft wurde die in dieser Weise gebildete Folie von der Glasplatte abgestreift, wobei eine weiße Membran einer Dicke von ϊ3 μιπ ernaiien wurde. Diese Membran wies eine dichte Hautschicht (1 um) und eine poröse Schicht auf. Die Haut war für Wasserstoffperoxid leicht durchdringbar, jedoch völlig undurchlässig für Harnsäure, Ascorbinsäure und Glucose. Dies wurde durch einen Membranpermeabilitätstest bestätigt.

Getrennt hiervon wurden 25 mg Glucoseoxidase (50 I E/mg). 50 mg eines porenbildenden Mittels und 75 mg Albumin in 8 ml 0,05-molarem Natriumacetatpuffer (pH 5,1) gelöst. Der Lösung wurden OJ ml 25%ige wäßrige Glutaraldehydlösung unter Bildung einer Enzymlösung zugesetzt.

Die i.i dieser Weise erhaltene Enzymlösung ließ man *> in die poröse Oberfläche der in der beschriebenen Weise hergestellten Membran eindringen. Durch Stehenlassen der in dieser Weise behandelten Membran für 8 Stunden bei 5° C wurde das Enzym an der porösen Oberfläche der Membran vollständig immobilisiert. Die das immobüisierte Enzym enthaltende Membran wurde mit Natriumacetatpuffer gewaschen und an der Luft getrocknet.

Die in der beschriebenen Weise hergestellte, immobilisiertes Enzym enthaltende Membran wurde an einer Clarke-Wasserstoffperoxidclektrode so befestigt, daß die Hautschicht der Elektrode am Kopfteil der Elektrode zugewandt war und die poröse Schicht, die das immobüisierte Enzym enthielt, sich an der der Elektrode abgewandten Seite befand (d.h. mit der «⁵ Testlösung in Berührung war), wie in F i g. 2 dargestellt

Die so gebildete Enzymelektrode wurde in eine Zelle getaucht, die 0,5 ml 0,05-molaren Phosphatpuffer (pH 7,0) enthielt. Dem Puffer wurden unter Rühren 10 μΙ einer Glucosestandardlösung (100 bis 700 mg/dl) mit einer Mikropipette zugesetzt.-Mit Hilfe eines Polarographen (YSI, Typ 25, Oxidasemesser). der mit der Elektrode verbunden war, wurden der Strom, der auf das durch die enzymatische Reaktion gebildete Wasserstoffperoxid zurückzuführen war. und die Veränderung mit der Zeit gemessen. Der elektrische Strom erreichte nach 20 Sekunden einen konstanten Wert In F i g. 3 ist die Beziehung zwischen der Stromstärke beim Maximum, bevor ihr Wert konstant wurde (Ordinate), und der Konzentration der Glucosestandardlösung (Abszis- ^M se) dargestellt Wie diese Abbildung zeigt besteht eine gute geradlinige Beziehung zwischen der Glucosekonzentration und der Stromstärke, so daß es möglich ist, unbekannte Konzentrationen der Glucose zu bestimmen. ^a

Wenn 10 μΐ einer Lösung, die 100 mg Harnsäure/dl und 100 mg Ascorbinsäure/dl enthielt an Stelle der Glucosestandardlösung in die Zelle gegeben wurde.

wurde keine Reaktion an der Elektrode beobachtet. Dieser Test bestätigte, daß die gemäß diesem Beispiel hergestellte Enzymelektrode durch polarographisch aktive störende Stoffe nicht gehemmt wurde.

Beispiel 2

Unter Verwendung der in Beispiel I beschriebenen Enzymelektrode wurden 10 μΐ einer Probe von menschlichem Blut an Stelle der Glucosestandardlösung in die Zelle gegeben. Die Glucosekonzentration im menschlichen Blut wurde auf die in Beispiel I beschriebene Weise gemessen. Auf der Grundlage der für die Glucosestandardlösun» aufgenommenen Eichkurve wurde ein Blutzuckerwart der Testprobe von 175 mg/dl berechnet.

Die gleiche Blutprobe (IC μΐ) wurde einem Phosphatpuffer (0,5 ml) zugeseui. der Harnsäure (10 mg/dl) enthielt. Das Gemisch v.nrde in der gleicher. Weise behandelt. Hierbei wurde ein Blutzuckerwert von 172 mg/dl ermittelt. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Harnsäure als störendes Material keinen Einfluß auf die Messung hatte.

Beispiel 3

5 Gew.-Teile Polyhydroxyäthylinethacrylat. das durch Polymerisation von Hydroxyäthylmethacrylat in Benzol unter Verwendung von Denzoylperoxid als Initiator hergestellt worden war, 90 Gew.-Teile Methylethylketon und 5 Gew.-Teile Isopropylalkohol wurden gemischt, wobei eine Polymerlösung gebildet wurde. Diese Polymerlösung wurde auf eine glatte Glasplatte in einer Dicke von 150 μπη geräkelt Nach dem Trocknen an der Luft bei Raumtemperatur für 10 Minuten wurde das erhaltene Produkt in kaltes Wasser getaucht und die Folie von der Glasplatte abgestreift, wobei eine milchigweiße, klare Membran mit unterschiedlichen Oberflächen und einer Dicke von 73 μπι erhalten wurde.

Eine wäßrige Cholinoxidaselösung ließ man in die Poren der porösen Oberfläche der in der beschriebenen Weise hergesiellten asymmetrischen Membran eindringen. Die behandelte Membran wurde an der Luft getrocknet und mit Kaliumphosphatpuffer (pH 73) gewaschen. Die wäßrige Cholinoxidaselösung wurde durch Auflösen von 10 mg Cholinoxidase (6,2 1 E/mg), 20 mg Rinderserumalbumin und 0,05 ml einer 25%igen wäßrigen Glutaraldehydlösung in 2 ml eines 0.05-molaren KaliumphosphatpuFfers (ph 73) hergestellt

Die die immobilisierte Cholinoxidase enthaltende Membran wurde an einer Clarke-Wasserstoffperoxidelektrode mit einer Platinanode und einer Silberkathode auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise angebracht

10 μΐ menschliches Blutserum wurde zu 1 ml Kaliumphosphatpuffer (ph 73) gegeben, der 03 mg'PhospholiphaseD (631 E/mg) enthielt Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 37° C erhitzt wodurch die im Blutserum enthaltenen Phospholipide unter Bildung von freiem Cholin hydrolysiert wurden. Das Gemisch wurde in die polarographische Zelle überführt in der das durch die Oxidation des Cholins als Folge der enzymatischen Reaktion (37° C) mit der Enzymelektrode gebildete Wasserstoffperoxid polarographisch gemessen wurde. Auf der Grundlage einer vorher mit Cholinchlorid-Standardlösung (1 bis 1000 mg/dl) aufgenommenen Eichkurve wurde die im zu untersuchenden Blutserum enthaltende Menge der Phospholipide mit 281 mg/dl berechnet Wenn das gleiche Blutserum nach der üblichen Hoeflmayer-Fried-Methode untersucht wurde.

wurde ein Phospholipidgehalt von 285 mg/dl berechnet. Die beiden Werte stimmten gut übercin.

Beispiel 4

10 Gew.-Teile Polymctaphenylcnisophthalamid (relative Viskosität (?₍vw) einer l°/oigen Lösung in Dimethylformamid 1,47 bei 30⁰C), 85 Gew.-Tcile Dimethylacetamid und 5 Gew.-Teile Lithiumehlorid wurden gemischt. Das Gemisch wurde in einer Dicke von 100 μηι auf eine glätte Glasplatte geräkelt. Die beschichtete Glasplatte wurde 2 Minuten im Wärmeschrank bei 100"C in waagerechter Lage gehalten und dann in kaltes Wasser getaucht. Die hierbei gebildete Folie wurde von der Glasplatte abgestreift, wobei eine milchigweiße, klare Membran mit unterschiedlichen Oberflächen und einer Dicke von 1 \2 μηι erhalten wurde.

in die Poren der porösen Obeniäcne tief criiiiiicricn asymmetrischen Membran ließ man eine Enzymlösung eindringen. Die behandelte Membran wurde an der Luft getrocknet. Die Enzymlösung wurde durch Auflösen von 20 mg Uricase (3,5 ΙΕ/mg) und 100 mg Chitosan in 5 g einer 2%igen wäßrigen Essigsäurelösung hergestellt.

Die die Uricase enthaltende Membran wurde in einen Boratpuffer (pH 10) und dann in einen Boratpuffer (pH 9) getaucht, wodurch das Enzym immobilisiert wurde.

Die die immobilisierte Uricase enthaltende Membran wurde an einer Clarke-Wasserstoffperoxidelektrodc. die eine Platinanode und eine Silberkathode an ihrem Kopfteil aufwies, auf die in Beispiel I beschriebene Weise angebracht. Die erhaltene Enzymelektrode wurde in eine Zelle getaucht, die 20 ml Boratpuffer (pH 8.4) bei 35°C enthielt.

Menschliches Blutserum (1 ml) wurde mit einer Mikropipette unter Rühren in die Zelle gegeben, in der das durch die enzymatische Reaktion gebildete Wasserstoffperoxid potarographisch gemessen wurde. Auf der Grundlage einer Eichkurve, die vorher für eine Harnsäurestandardlösung (I bis 100 mg/dl) aufgenommen war. wurde die im zu untersuchenden Blutserum enthaltene Harnsäuremenge mit 9.0 mg/dl berechnet. Wenn das gleiche Blutserum durch direkte UV-Spcktrophotometrie mit üblicher Uricase gemessen wurde, betrug der Gehalt an Harnsäure 8.8 mg/dl. Die beiden Ergebnisse stimmten gut überein.

Beispiel 5

5 Gew.-Teile sutfoniertes Polyphenylenoxid (Sulfonierungsgrad I,l2mg-Äquivalent/1 g Polymerisat). 90 Gew.-Teile Chloroform und 5 Gew.-Teile Isopropylalkohol wurden gemischt. Die hierbei erhaltene Polymerlösung wurde in einer Dicke von 150 μιη auf eine glatte Glasplatte geräkelt Nach dem Trocknen für 3 Minuten an der Luft bei Raumtemperatur wurde die beschichtete Platte in Methanol getaucht. Die hierbei gebildete Folie wurde von der Glasplatte abgestreift, wobei eine milchigweiße, klare Membran mit unterschiedlichen Oberflächen und einer Dicke von 7,7 μπι erhalten wurde.

Glucoseoxtdase wurde in der in Beispiel \ beschriebenen Weise an der in der beschriebenen Weise hergestellten asymmetrischen Membran immobilisiert. Diese Membran wurde in der beschriebenen Weise an der Elektrode angebracht. Die bei dem in Beispiel 2 beschriebenen Versuch verwendete Probe wurde analysiert. Hierbei wurde ein Blutzuckerwert von 173 mg/dl, der nut dem gemäß Beispiel 2 erhaltenen Ergebnis gut übereinstimmte, ermittelt.

Beispiel 6

^r> Polypropylen und Nylon 66 (Gewichtsverhältnis 50 :50) wurden geknetet. Aus dem Polymergeniisch wurde eine 30 μιη dicke Folie durch Schmelzbeschichten hergestellt. Die Folie wurde durch uniaxiales Recken auf die zweifache Länge bei 130⁰C orientiert, wobei

¹⁽¹ gleichzeitig Risse in der Folie gebildet wurden. Eine Oberfläche der orientierten Folie wurde 10 Minuten der Einwirkung \on dampfförmigem η-Hexan bei 100 C ausgesetzt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei eine Membran mit verschiedenen

¹^ Oberflächen und einer Dicke von 20 μπι erhalten wurde.

Uricnse wurde an der erhaltenen asymmetrischen

Membran in der in Beispiel 4 beschriebenen Weise immobilisiert. Die das irniiiüuiilsiCf'it: Enzym criinaiiende Membran wurde in der beschriebenen Weise an einer

-'" Elektrode angebracht. Die gleiche Probe wie in Beispiel 4 wurde analysiert. Hierbei wurde festgestellt, daß das Blutserum 8.5 mg/dl Harnsäure enthielt. Dieses Ergebnis stimmte mit dem gemäß Beispiel 4 erhaltenen Ergebnis gut übercin.

Beispiel 7

5 Gew.-Teile Nylon 6 (relative Viskosität einer l%igen Lösung in 96%iger Schwefelsäure: 3.41 bei 30⁰C). 90 Gew.-Teile Ameisensäure und 5 Gew.-Teile Lithiumehlorid wurden gemischt. Die erhaltene Polymerlösung wurde in einer Dicke von 150 μιη auf eine saubere glatte Glasplatte gegossen. Nach Stehenlassen im Wärmeschrank für 5 Minuten bei 100⁰C in waagerechter Lage wurde die beschichtete Platte in kalte·* Wasser getaucht. Die hierbei gebildete Folie wurde von der Glasplatte abgestreift, wobei eine milchigweiße, klare Membran mit verschiedenen Oberflächen und einer Dicke von 8,7 μιτι erhalten wurde.
Die poröse Oberfläche der erhaltenen Membran wurde durch Behandlung mit Dimethylsulfat Sei 100⁰C für 3 Minuten aktiviert, dann mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Die aktivierte Oberfläche der Membran wurde 2 Stunden in eine 0.1-molare wäßrige Lysinlösung (pH 9,5) getaucht

⁴> und dann mit 0.5-molarer wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Anschließend wurde die Membran mit 2.5%iger Glutaraldehydlösung in 0,1-molarem Natriumborat (pH 8.5) behandelt, mit Methanol gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet.

Auf die Membran, in die Aldehydgruppen eingeführt worden waren, wurde eine Lösung von 6,25 mg Cholesterinoxidase (10IE/mg) in ImI 0.05-mo!arem Phosphatpuffer (pH 7.0) gegossen. Nach 12-stündiger Reaktion bei 4° C wurde die Membran 5 Stunden bei Raumtemperatur gehalten und mit Phosphatpuffer gewaschen, wobei eine immobilisiertes Enzym enthaltende Membran erhalten wurde.

Die das immobilisierte Enzym enthaltende Membran wurde an einer Wasserstoffperoxidelektrode so angebracht, daß die Hautschicht der Membran der Elektrode zugewandt war. Die Enzymelektrode wurde in 350 ml eines 0,05-molaren Natriumacetatpuffers (pH 5,1) bei 37° C getaucht. Dem Puffer wurde menschliches Blut, das eine bekannte Menge freien Cholesterins (201 mg/dl) enthielt, zugesetzt, worauf der Gehalt an freiem Cholesterin polarographisch gemessen wurde. Die Messung ergab einen Gehalt an freiem Cholesterin von 197 mg/dl.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Ρ3λ die polarographische Bestimmung einer geringen Konzentration einer Komponente m einer Testlösung geeignete Enzymelektrode mit einer Anode, einer Kathode, einem Elektrolyten und einer mit der Testlösung in Berührung stehenden, ein immobilisiertes Enzym enthaltenden Membran, die aus einer dichten Hautschicht und einer porösen Schicht besteht, dadurch gekennzeichnet, daß