DE2905671A1

DE2905671A1 - Immobilisiertes proteinpraeparat, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung

Info

Publication number: DE2905671A1
Application number: DE19792905671
Authority: DE
Inventors: Rokuro Izumi; Kunio Matsumoto; Hiroyuki Mizuguchi; Hideji Seijo
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1978-02-17
Filing date: 1979-02-14
Publication date: 1979-08-30
Also published as: DE2905671C2; FR2417513B1; JPS5548392A; US4371612A; GB2090601A; GB2090601B; GB2015001B; JPS6247516B2; GB2015001A; FR2417513A1; US4486549A

Description

17. Februar 1978, Japan, Nr. 18001/78

Die Erfindung betrifft ein neues immobilisiertes Proteinpräparat, ein biologisch aktives Protein enthaltend, das an ein wasserunlösliches Acrylni tri !-Polymerisat mit freien Aminogruppen als Träger gebunden ist.

Gemäß den japanischen Patentanmeldungen 121592/1976 und 7485/1977 können Acrylnitril-PolymeriKeU-e mit freien Nitrilgruppen ein Enzym, das ja eine biologisch aktive Substanz ist, adsorbieren. Die Meng« des an dieses Polyacrylnitril adsorbierten Enzyms ist jedoch nur gerinn, außerdem wird das adsorbierte Enzym vom Träger leicht, '..'leder freigesetzt.

Im eriindungsgir.iu.inc-r. ProteinprapnrPt w-"d nun ein Polyacrylnitril verwindet, dfjfiCf-H Λπίίηοΐ'.νιιρυ^η cvxcli Tei Irodukt 5 on d-;-r

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Nitrilgruppen eines porösen Polyacrylnitrils in fester Phase erhalten worden sind. Auf diese Weise erhält man eine überraschend hohe Adsorptionsfähigkeit für Enzyme, die etwa zwei- bis dreißig-

ist

mal höher/als vor der Reduktion. Außerdem wird das an diesem behandelten Polyacrylnitril adsorbierte En^ym nur schwer wieder vom Träger freigesetzt.

Ein weiterei· Vorteil des erfindungsgemäßen Proteinpräparats ist die Tatsache, daß das biologisch aktive Protein, z.B. ein Enzym, an den Träger nicht nur durch physikalische Adsorption, sondern gegebenenfalls auch durch kovalente Bindungen unter Verwendung eines Kondensationsmittels, eines Vernetzungsmittels oder eines Brückenbildners gebunden ist. Auf diese Weise wird das biologisch aktive Protein mit erstaunlicher Festigkeit an den Träger gebunden, ohne desaktiviert oder zerstört zu werden. Ein auf diese Weise immobilisiertes Enzympräparat behält über lange Zeit seine Aktivität gegenüber einem entsprechenden Substrat.

Als Träger für das erfindungsgemäße Präparat geeignet ist ein Polymerisat von Acrylnitril-, Methacrylnitril-, c<-Chloracrylnitril und/oder Cinnamylnitril-Einhoiten oder ein Copolyr.erisat

als Bausteine geeigneten monomeren dieser Monomeren mit anderen/Einheiten, die eine äthylenisch ungesättigte Doppelbindung enthalten. Spezielle Beispiele für diese Comonomere sind Styrol, Methylstyrol, Äthylstyrol, Nitrostyrol, Chlorstyrol, Bromstyrol und Chlormethylstyrol, Acryl- oder Methacrylsäureester, wie K^lhyl (ineth)acrylat, Äthyl(meth)acrylat, Butyl (meth)^rylat ₅ 2-Kydroxyäthyl (mei.h)-acrylat und Polyäthylenglycol (ineth)acryj at, konjungierte

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.J. 2 9 U b 6 7 1

Diene, wie Butadien oder Isopren, halogenierte Olefine, wie Vinylchlorid oder Vinylidenchlorid, Vinyläther-Monomere, wie Äthylvinyläther oder Butylvinyläther, Vinylketone, wie Methylvinylketon oder Äthylisopropenylketon, Vinylester, wie Vinylacetat oder Vinylbenzoat, Vinylamid-Monomere, wie (Meth)acrylamid, N ,N-Dimethy 1 (meth)acrylamid, N-Vinylpyrrolidon , M-Viriylsuccinimid und N-Vinylphthalimid, basische Monomere, wie Vinylpyridin, Methy!vinylpyridin, Vinylimidazol und N,N-!)iäthylaminoäthyl(meth)acrylat, und polyfunktionelIe Monomere, wie Divinylbenzol oder Divinyltoluol. Diese Comonomere können mit den Acrylnitril-Konomeren copolymorisiert werden, gegebenenfalls in Gegenwart eines Vernetzungsmittel«, wie Divinylbenzol oder Divinyltoluol.

Um dem Träger :m erfindungsgemäßen Proteinpröparat gute Eigenschaften zu verleihen, sollte das Acrylnitril-Polymerisat porös sein. Zu diesen Zweck wird zum Beispiel Acrylnitril gegebenenfalls mit den anderen Monomeren.einer Suspensions- oder Emulsions-Polymerisation in einem wäßrigen System unterworfen. Man kann das Polymerisat aber auch in einem Lösungsmittel lösen, wie Dimethylformamid, Dirnethylsulfoxid, konzentrierter Salpetersäure, einer wäßrigen Thiocyanat.lösung oder einer wäßrigen Zinkchlorid·- lösung, und dic\ entstandene Lösung in ein Koagulation.-U>ad, das z.B. Wasser·, wäßriges Aceton, wäßriges Äthanol oder wäßriges Dimethylformamid enthält, :-.u.r Bildung von Teilchen, Fasern oder Membranen eintropfen oder einspritzen. Man kann das Polymerisat aber auch in Form von Hohl fasern ausbilden. Die auf djese Weise hergestellte porös·.· .'vruVitiirb.-itoht vermutlich au.3 größeren Kanälen, in die das b.iolo-

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gisch aktive Protein eindringt, und aus kleineren Poren, die das Protein an der Oberfläche oder im Inneren festhalten. Das biologisch aktive Protein wird vermutlich durch diese Mikroporen, die eine Größe von etwa ^IO bis 9OOO A , vorzugsweise etwa 50 bis 4000 Λ, insbesondere etwa 100 bis 2000 A, haben, an den Träger gebunden.

In der nächsten Arbcitsstufe werden die freien Aminogruppen in

das Acrylnitril-Polymerisat eingeführt, um es dadurch für die

machen. Zwecke der Erfindung geeignet zu / Das kann in herkömmlicher Weise erfolgen, z.B. kann man die Nitrilgruppen des Polymerisats zu Aminogruppen reduzieren. Hat das Polymerisat bereits eine poröse Struktur, so erfolgt dies-:: Reduktion vorzugsweise in einem inerten Medium, in dem das Polymerisat nicht löslich ist, um ein Zerstören der porösen Struktur zu vermeiden. Als Reduktionsmittel bevorzugt ist z.B. Lithiumaluminiumhydrid. Als inertes Medium sind organische Lösungsmittel geeignet, wie Diäthyläther, Diox'an oder Tetrahydrofuran. Die Reduktion kann bei Raumtemperatur oder bei einer Temperatur um den Siedepunkt dos Lösungsmittels durchgeführt werden. Die Reaktionszeit, die von der Art, der Form, der Struktur und dem Polymerisationsgrad des Polymerisats abhängt, liegt zwischen 10 Minuten

zweckmäßig
und 48 Stunden und wird/so lange fortgesetzt, bis der Träger mindestens 20 ,iiMol freie Aminogruppen je Gramm Träger enthält, jedoch nicht so lange, daß der Träger in Wasser löslich wird. Im allgemeinen enthält das Polymerisat 20 bis 1000 .uMol freie Aminogruppen je Gramm Träger. Es scheint, daß die Aminogruppen an der Oberfläche des Polymerisats dichter sind als i;n Inneren. Der auf diese V'c;iru> erhaltene Trägerrtoff kann gegebenenfalls

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mit Wasser, einer wäßrigen sauren oder alkalischen Lösung gewaschen werden.

Ein anderes Verfahren, um die Nitrilgruppen zu Aminogruppen zu reduzieren, ist die katalytische Reduktion in einem Autoklaven in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels, das das Polymerisat auflösen kann .Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß die Reduktion in einem solchen Ausmaß ablaufen kann, daß das Produkt in V/asser löslich wird und daß außerdem eine weitere Stufe notwendig ist, um die poröse Struktur des Polymerisats herzustellen.

Man kann aber auch ein Polyacrylnitril, das Halogenatoine, insbesondere Chloratome, enthält, mit Ammoniak umsetzen, um die Chloratome durch freie Aminogruppen zu ersetzen, oder ein Acrylnitrilpolymerisat, das Epoxydgruppcn enthält, mit Lysin oder einem Alkylendiamin, wie Hexamethylendiamin oder Dodecamethylendiamin, umsetzen. Den Träger für das erfindungsgcnäße Präparat erhält man aber auch, wenn man ein Copolymerisat eines Acrylnitrils mit einem Vinylamid einem Hoffman-Abbau unterwirft. Die Nitrogruppen eines Polyacrylnitrile, das man durch Nitrieren in konzentrierter Salpetersäure/Schwefelsäure eines Copolymerisats von aromatischen Vinylmonomeren, wie Styrol, Divinylbenzol oder Vinyläthylbsnzol, mit Acrylnitril erhalten hat, kann man mit einer Lösung von Natriumhydrogensulfit und Kaliumhydroxid reduzieren. Ein Copolymerisat von Acrylnitril mit Methylvinylketon kann man mit Ammoniak behandeln.

Das auf diese Weise hergestellte Acrylnitril-Polymerisat mit

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freien Aminogruppen kann man, bevor man das biologisch aktive Protein daran bindet, gegebenenfalls mit einem Vernetzungsmittel, wie GlutarrJ.dehyd, in einem inerten Medium, wie einem

behandeln
wäßrigen MediunyJ vorzugsweise unter Kühlung zur Vermeidung der Polymerisation von Glularaldehyd, anschließend mit einer als Brückenbildner wirkenden Verbindung, wie Hexamethylendiamin, Dodecamethylendiamin oder einem anderen Alkylendiamin oder Lysin in einem wäßrigen Medium bei Ü°C bis Raumtemperatur behandeln. Anschließend wird das Polymerisat noch einmal mit einem Vernetzungsmittel behandelt.

^s Der vorzugsweise poröse Träger wird mit dem biologisch aktiven Protein in Berührung gebracht. Beispiele für biologisch aktive Proteine sind Enzyme, wie Oxidoreduktasen, Hydrolasen, Transferasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen. Beispiele für Oxidoreduktasen sind Alkoholdehdrogenase, Glycerindehydrogenase, Glycerinphosphat-dehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Galactosedehydrogenase, Glucose-6-phospat-dehydrogenase, 3-Hydroxybutyrat-dehydrogenase, Glucoseoxidase, Cholesterinoxidase,

Galactoseoxidase, Cholinoxidase, Pyruvatoxidase, Glutamatdehydrogenase , Aminosäureoxidase, Aminoxidase, Sarcosinoxidase, Diaphorase, Uricase, Peroxidase, Catalase oder Lipoxygenase. Beispiele für 'Hydrolasen sind Lipase, Phospholipase, Acetylcholinesterase, Cholesterinesterase, Phosphatase, Amylase, Glucosidase, Galactosidase, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Bromelein, Urease, Aminor'cylase, Penicillinacylase, Cephalosporinaeylase, Penicillinase, Cephalosporinase, Creatinase oder Creatininase. Beispiele für Transferasen

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sind Creatinphosphokinase, Pyruvatkinase, Hexokinase oder Glycerinkinase. Beispiele für Isomerasen sind Alaninisomerase, Glucoseisomerase oder Glucosephosphat-isomerase. Eine typische Ligase ist Glutathion-synthetase. Auch Hormone, Antigene und Antikörper können an den Träger gebunden worden, wobei diese biologisch aktiven Proteine einzeln oder in Kombination von zwei oder mehreren verwendet v/erden können.

Das biologisch aktive Protein kann an den Träger entweder durch physikalische Adsorption oder !covalent gebunden sein. Dieses Binden kann in bekannter Weise erfolgen, z.B. wie bei Ichiro Chibata, "Immobilized Enzymes", Kodansha Co., Ltd., Japan, beschrieben.

Das Binden des biologisch aktiven Proteins an den Träger durch Adsorption kann entweder kontinuierlich in einer mit dem Träger gefüllten Säule oder diskontinuierlich in einem Gefäß, in dem der Träger dispergiert ist, erfolgen. Als inertes Medium ist jedes Medium geeignet, in dein das biologisch aktive Protein nicht inaktiviert wird, vorzugsweise ein wäßriges Medium, wie Wasser, Pufferlösungen bei verschieden pH-Werten, z.B. Acetatpuffer mit einem pH-Wert von ¹J bis 6, Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6 bis 8 oder Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8 bis 9· Die Adsorption wird bei einer Temperatur durchgeführt, bei der das biologisch aktive Protein nicht inaktiviert wird, im al.lgerie.inen bei 0 bis 3O°C. Die Menge des an den Träger gebundenen Proteins hängt von der Aufnahmefähigkeit des Trägers ab und wird durch Bestimmung dvz Proteins im inerten

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Medium oder durch biologische Aktivitatsbestimmung des erfindungsgemäßen immobilisierten Präparats gemessen. Auf diese Weise kann man die Menge des an den Träger gebundenen biologisch aktiven Proteins je nach Aktivität des Proteins kontrollieren.

Wird das biologisch aktive Protein kovalent an den Träger gebunden, so geschieht dies unter Verwendung eines Bindemittels im gleichen oder in verschiedenen Systemen. Die Bindung erfolgt über die freien Aminogruppen des Trägers und freie Gruppen im Protein, wie Amino-, Carbonsäure- oder Hydroxylgruppen. Als Vernetzungsmittel geeignet sind z.B. Hexamethylendiisocyanat, Hexamethylendiisothiocyanat, Toluoldiisocyanat, Xyloldiisocyanat, Glutaraldehyd, Uialdehyd-Stärke, Adipinsäureimiddimethylester, Korksa'ureimid-dimethylester, 3> 3' -Dithio-bisprop__ionsäureimid-dimethylester, Bernsteinsäure-anhydrid, Crotonaldehyd oder Acrolein, v/obei der Träger direkt oder über einen Bi'Uckenbildner, wie Lysin oder Hexamethylendiamin, an das Protein gebunden ist. Bei einer direkten kovalenten Bindung des Trägers und des biologisch aktiven Proteins kann man ein wasserlösliches Kondensationsinittel, wie l-Äthyl-3- (3~ dimethylaminopropyl)-carbodiimid verwenden.

Die Bindungsreakt. ion erfolgt in einem inerten Medium, z.B. in einem wäßrigen Medium, dac Tetrahydrofuran, Aceton oder Äthanol enthält, vorzugsweise bei Rauntempcratur und einem pH-Wert, bei dem das Protein stabil ist, im allgemeinen von ¹J bis 12. Das Binderei XA. e 1 wird in einer Mc η ge verwendet·., die der ein-

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— 0 ·-

bis zweifachen molaren Menge der zu bindenden freien Gruppen entspricht.

Das im erfindungsgemäßen Präparat immobilisierte biologisch aktive Protein hat eine gute Aktivität und ist für verschiedene Zwecke zu verwenden, je nach den spezifischen Charakteristiken des eingesetzten Proteins. So kann man in einem System, das das erfindungsgemäße immobilisierte Proteinpräparat und eine Substanz, die gegenüber diesem Protein empfindlich ist. enthält, z.B. ein Substrat, wenn das Protein ein Enzym ist, das Produkt der enzymstischen Reaktion sammeln und eine quantitative Bestimmung des Substrats unter Verwendung der enzyinatischen Reaktion durchführen. Im Falle eines Enzyms wird gegebenenfalls eine Pufferlösung verwendet, um das pH-Optimum des Enzyms aufrechtzuerhalten.

Die für diese Reaktion geeigneten Substrate können in verschiedenen Formen vorliegen, z.B. als wäßriges Medium, als wäßrige Lösung, z.B. Pufferlösungen, als Körperflüssigkeiten, wie Blut

Körper
oder Urin, oder als behandelte /flüssigkeiten. Bei Verwendung einer Acylase als Enzym kann das Substrat z.B. eine Lösung eines T-Acyl-cephalosporansäure-Derivats, eine Lösung eines 6~Acylpenici] lansäur*.:·-Derivats oder eine Lösung von 7-Amino-3~c^phem- ^-carbonsäure oder deren Derivat, ö-Aminopenam-J-carbonsäure oder deren Derivat oder Thienylessigsäure-methylester oder (X-Aminophenylessigsäure-methylester sein. Bei Verwendung einer· Cholinoxidase, verschiedener Phosphorlipasen, Uricase oder G3ucoseoxidase sind Phospholipide, Harnsäure, Glucose, Körper-

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flüssigkeiten, wie Blut oder Urin, als Substrat geeignet. Wird im erfindungsgemäßen Proteinpräparat eine Penicillinacylase verwendet, wie sie von Bacillus megaterium B-iJOO (FERM-P 718), Escherichiacoli ATCC 9637 oder Escherichia coli ATCC IIO5 produziert wird, so erhält man eine immobilisierte Penicillinacylase mit extrem hoher spezifischer Aktivität. Wird eine natürlichoPenicillinlösung mit einer Konzentration von 3 bis 12 Gramm je 100 ml Lösung als Substrat verwendet, so erhält man 6-Aminopenicillansäure in einer Ausbeute von 95 % oder darüber, die mit hoher Reinheit und sehr guter Ausbeute durch einfaches Einstellen des pH-Wertes des Reaktionsgemisches auf den isoelektrischen Punkt der 6-Aminopenicillansäure und ohne Einengen des Reaktionsgemisches isoliert werden kann. Dieses erfindungsgemäße Penicillinacylase-Präparat kann viele Male über lange Zeit verwendet werden; die Kosten für die Herstellung des erfindungsgemäßen immobilisierten Enzympräparates sind bei der Herstellung von 6-Aminopenicillansäure vernachlässigbar. Außerdem kann man das erfindungsgemäße immobilisierte Enzympräparat nicht nur bei der Reinigung und Isolierung von Penicillin in Form des Salzes aus der Kulturbrühe verwenden, sondern auch bei den Extrakten, die bei dem Phasentransfer des Penicillins in eine wäßrige Lösung entstehen. Auf diese Weise kann man die Herstellungskosten für 6-Aminopenicillansäure weiter senken.

In einer speziellen Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Enzympräparat in einer Anordnung verv/endet, die das immobili-

geeigmetes
sierte Enzympräparat, ein / Substrat und eine Vorrichtung ent-

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hält, die die Änderungen der enzymatischen Reaktion anzeigt.Die Figuren la bis Ic und 10 erläutern diese Anordnung, wobei die

Anordnung von Fig. 10 speziell zur Gewinnung von Produkten aus

der Reaktion dient. _. , ,

Thermobad ein Reaktionsgefaß

Gemäß Fig. la befinden sich in einem/ in Form einer Säule 1, die das immobilisierte Enzympräparat enthält, eine Meßvorrichtung 2, die über ein Glasrohr mit dem Reaktionsgefäß verbunden ist, und eine Elektrode 3, z.B. eine Glas- oder Sauerstoffelektrode. Das Volumen des Reaktionsgefäßes und der Meßvorrichtung 2 wird so k]ein wie möglich gehalten, um die Fehler, die durch Diffusion des Reaktionsgemisches entstehen, zu verringern. Die Elektrode 3 ist gegebenenfalls mit einem Elektrometer

Sauerstoff 5, oder einem Meßgerät für gelösten / die mit einem Differentialumwandler ausgerüstet und an den Schreiber 6 angeschlossen sind.verbunden. Bei quantitativen Bestimmungen wird eine Probe oder eine Referenzflüssigkeit, die vorher auf einen konstanten pH-Wert eingestellt worden ist, durch den Probeneinlaß in das Reaktionsgefaß eingeführt; die elektrische Änderung (Potentialänderung oder Änderung im Gehalt an gelöstem Sauerstoff), die durch die enzymatische Reaktion hervorgerufen wird

und der

/ßubstratkonzentration entspricht, wird bestimmt. Die Konzentration der Probe wird quantitativ anhand des Potentialwertes und der Eichkurve bestimmt. Wird bei einer quantitativen Bestimmung eine Glaselektrode verwendet, so wird in das Reaktionsgefaß Stickstoff eingeführt, da sich der pH-Wert durch das in der Luft vorhandene Kohlendioxid (wie in der Elektrode 3) ändert. Das pH-Meter 8 dient zur Korrektur des Unterschieds des pH-Wertes der Probenlösung und der Referenzlösung .

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Der Probeneinlaß kann auch für die Referenzlösung verwendet werden und zwar abwechselnd. Sind getrennte Einlasse vorhanden, so können diese an verschiedenen Stellen angeordnet sein.

Das mit einem Thermostat ausgerüstete Bad 7 wird auf eine für die enzymatische Reaktion günstige Temperatur eingestellt, vorzugsweise auf 30 bis 37°C. Die Reaktionszeit wird durch die enzymatische Reaktion bestimmt.

Diese quantitative Bestimmung kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden.

wird bestimmt

Die Menge der eingeführten Probe / durch die Aktivität des verwendeten Enzyms. Im allgemeinen werden in einem kontinuierlichen Verfahren jedoch 1 bis 2 ml/Minute einer Probe verwendet. Die Probenkonzentration, die von der Aktivität des verwendeten Enzyms abhängt, kann auch, wenn sie zu hoch ist, auf jede Konzentration verdünnt werden.

Das Reaktionsprodukt dieser enzymatischen Reaktion kann in herkömmlicher Weise isoliert und gewonnen werden. Außerdem kann man bei gleichzeitiger quantitativer Bestimmung die Konzentration und die Menge der Probe bestimmten.

Ist die Elektrode 3 eine Sauerstoffelektrode, so ist das pH-Meter8

erforderlich, und man kann einen

nicht unbedingt / die Aufzeichnung über/Differential umwandler durchführen. Eine solche Kombination kann gegebenenfalls auch geändert, werden, man kann auch die Vorrichtungen gemäß

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der Pig. Ib, lc und 10 verwenden.

Bei Bestimmung von Flüssigkeiten, die Phosphoriipide, Cholin oder Betainaldehyd enthalten, sowie Körperflüssigkeiten, wird das oben angegebene System vorzugsweise mit einem System kombiniert, das immobilisierte Cholirioxidase auf einem Träger allein oder zusammen mit Phospholipase D, die unbehandelt oder an einen Träger gebunden ist, sowie gegebenenfalls Indikatoren und Pufferlösungen sowie andere Hilfsstoffe enthält. Bei dieser Systemkombination werden die immobilisierten Enzympräparate

und die Flüssigkeiten eine gewisse Zeit inkubiert, wobei Wassergehalt Stoffperoxid und Betain entstehen, die den Sauerstoff/ reduzieren. Folglich werden während dieser Reaktion gebildetes Wasserstoffperoxid, Betain und Sauerstoff bestimmt. Für die Bestimmung des Sauerstoffs v/ird zweckmäßigerv;eise eine Sauerstoffelektrode verwendet. Für die Bestimmung des Betains wird vorzugsweise die Reineckes-Salz-Methode verwendet oder das Betain wird verestert und anschließend gaschromatografisch bestimmt. Das Wasserstoffperoxid wird vorzugsweise mit einer Wasserstoffperoxid-Elektrode (z.B. einem Oxidasemesser) in der oben angegebenen Vorrichtung gemessen. Man kann es aber auch colorimetrisch bestimmen in einem System, das mindestens einen Indikator enthält, der durch die Reaktion mit dem Wasserstoffperoxid seine Farbe' verändert. Spezielle Beispiele dafür sind die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit vierwertigen Titanverbindungen und Xylenol-Orange, wobei eine stabile rote Farbe entsteht, oder die Reaktion mit Phenol, ^-Aminoantipyrin und Peroxidase. Bei dieser Bestimmungsmethode wird ^-Aminoantipyrin

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zweckmäßigerweise in einer Menge von mindestens 0,5 Mol, vorzugsweise 2 Mol oder darüber, je Mol gebildetes Wasserstoffperoxid verwendet. Die Menge an Peroxidase beträgt mindestens 0,1 U, vorzugsweise etwa 0,2 bis 0,5 U. Zur Bestimmung des Wasserstoffperoxids kann man aber auch Ί-Aminophenazon verwenden.

Alle diese Reagenzien können als vorher hergestellte Lösungen verwendet werden. Die entstandene Farbe wird bei geeigneter Wellenlänge gemessen. Das im System vorhandene Wasserstoffperoxid wird der Eichkurve entsprechend quantitativ bestimmt, wobei man auch vorhandenes Cholin, Betainaldehyd oder Derivate von Cholin oder Betainaldehyd sowie die Aktivität des Enzyms, das die Cholin-Derivate hydrolysiert, bestimmen kann.

Das Wasserstoffperoxid kann man auch mit einer Kombination von

phenol

2,6-Dichlorphenol-indo]/und Peroxidase, mit Guayacfett und Peroxidase sowie mit einer Kombination von Homovanillinsäure und Peroxidase quantitativ bestimmen.

In all diesen Vorrichtungen und Verfahren kann man das erfindungsgemäße immobilisierte Proteinpräparat in verschiedenen Formen verwenden, z.B. als Teilchen, Fasern oder Membranen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die Aktivitätsbestimmungen bei Verv/endung eines Enzyms als biologisch aktives Protein werden nach folgenden Verfahren durchgeführt:

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I. Penicillinacylase

1) Enzymlösung

0,5 ml einer Enzymlösung, 4,0 ml eines 0,1 m Phosphatpuffers (pH 7,5) und 0,5 ml einer 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) Lösung, die 4 g Kaliumsalz von Penicillin G enthält, werden bei 37⁰C 30 Minuten lang umgesetzt. 0,5 ml dieses Gemisches werden zu 3 ml eines Puffers gegeben, der 1 ml 0,05 η Natriumhydroxid, 2 ml 2 5?ige Essigsäure und 0,5 ml einer Methanol-Lösung enthält, die 0,5 g p-Dimethylaminofcenzaldehyd

ml Lösung enthält.
je 100 / Dieses Gemisch wird bei Raumtemperatur 10 Minuten lang umgesetzt. Die Menge an gebildeter 6-Aminopenicillansäure wird durch Absorption bei ')15 nm gemessen.

Die Enzymaktivität, die 1/uMol 6-Aminopenicillansäure je Minute bildet, wird als eine Einheit (1 U) definiert.

2) Immobilisiertes Enzympräparat

Eine vorher bestimmte Menge an immobilisiertem Enzym wird zu einer Lösung von Ί,5 ml 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,5) und 0,5 ml einer 0,1 m Phosphatpuffer (pK 7,5) Lösung, die 4 g

enthält, Penicillin G-Kaliumsalz je 100 ml Lösung/gegeben. Die Reaktion wird bei 37⁰C 30 Minuten lang durchgeführt. Die Menge an gebildeter 6-Aminopenicillansäure wird wie für die Enzymlösung bestimmt.

3) Acylasebestimmung

a) 0,25 nil einer Acylaselösung und 0,25 ml einer Lösung, die

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1 % 7~(^-CarboxybutanamidoJ-desacetoxycephalosporansäure als Substrat in 0,1 m Phospatpuffer (pH 7,0) enthält, oder ein System, das aus einem erfindungsgemäßen immobilisierten Acylasepräparat, 2,0 ml dos oben angegebenen Substrats und

(pH 7,0)
2,0 ml 0,1 m Phosphatpuffex"/besteht, werden 30 'Minuten bei 37°C umgesetzt.

0,5 ml dieses Reaktionsgemisches, das die während der Reaktion entstandene 7~Amino-desacetoxycephalosporansäure (7~ADCA) enthält, werden zu 3 ml eines Puffers gegeben, der 1 ml 0,05 η Natronlauge, 2 ml 2#ige Essigsäure und 0,5 ml einer 0,5%igen p-Diinethylaminobenzaldehyd-Methanollösung enthält. Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Absorption des Produkts wird bei ^15 nm gemessen. Die Menge an 7-Amino-desacetoxycephalosporansäure wird aus der Eichkurve für diese Säure bestimmt. Die Aktivität, die 100 !('/nil 7~Amino-desacetoxycephalosporansäure bildet, wird als 100 U definiert.

Diese Bestimmurigsmethode wird bei Verwendung von Acylase aus Comamonas sp. SY-77-1 (FERM-P 2^10) durchgeführt.

b) Anstelle des bei der Acylasebestimmung a) verwendeten Substrats wird unter gleichen Bedingungen 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7>5) verwendet, der 1 % 7-Phenylacetamido-desacetoxycephalosporansäure enthält.

Diese Bestimniungsmethode wird bei Verwendung von Acylase aus Bacillus megaterium B-400 (FERK-P 7'l8) durchgeführt.

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II. Cholinoxidase

Ein System, das 5/Ul einer Cholinoxidaselösung oder 1 bis 5 mg eines erfindungsgemäßen immobilisierten Cholinoxidasepräparats, 0,05 ml eines 0,2 m Tris-(hydroxymethyl Jominomethanhydrochlorid-Puffers (pH 8,0), 0,05 ml einer Lösung von 3 mg/ml 4-Aminoantipyrinj 0,10 ml 0,1 5? Phenol, 0,1 ml einer Lösung von 2 U/ml Peroxidase, 0,1 ml 0,1 m Cholinchlorid und 0,1 ml destilliertes V/asser enthält, wird bei 37⁰C 5 Minuten umgesetzt. Durch Zugabe von 2,5 ml Äthanol wird die Reaktion unterbrochen. Die Absorption wird bei *J80 mn gemessen. Die Aktivität, bei der 1/uMol Wasserstoffperoxid je Minute entsteht, wird als 1 U definiert. Die Aktivität des immobilisierten Enzympräparats wird entsprechend folgender Formel berechnet:

Aktivität (U/g) = A

Reaktionszeit mg immobilisiertes in Minuten Präparat

Bei dieser Bestimmung wird Cholinoxidase aus Arthrobacter globiformis B-0577 verwendet.

III. Phospholipase D

Ein System aus 0,05 ml einer Phospholipase D-Lösung, 0,1 ml 0,2 m Tris-hjMrochlorid-Puffer (pH 8,0), 0,1 ml einer 0,01 m Lecithinemulsion, 0,05 ml 0,1 m Calciumchlorid, 0,1 ml 15?iges Alkyl-polyäthoxyäthanol und 0,1 ml Wasser werden bei 37°C 10 Minuten lang umgesetzt. Man kann aber auch ein System aus 1 bis 5 mg immobilisiertem Phospholipase D-Präparat, 0,15 ml 0,2 m Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 8,0), 0,1 ml einer 0,01 m

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Lecithinemulsion, 0,05 ml 0,1 m Calciumchlorid, 0,1 ml 1 £igen Alkyl-polyäthoxyä'thanol und 0,1 ml Wasser bei 37°C 5 Minuten lang umsetzen. Durch Erhitzung bis zum Sieden wird die Reaktion beendet, dann wird das Gemisch auf 37°C abgekühlt und mit 0,1 ml einer Lösung von 3 mg/ml 4-Aminoantipyridin, 0,1 ml 2 U/ml Peroxidase, 0,10 ml 0,1 % Phenol, 0,1 ml 12 U/ml Cholinoxidase und 0,1 ml Wasser versetzt. Dieses Gemisch wird bei 37°C 20 Minuten umgesetzt, dann wird nach Zugabe von 2 ml l^igem Alkyl-polyäthoxyäthanol die Absorption bei 500 nm gemessen. Die Aktivität, die l.uMol Cholin je Minute bildet, wird als 1 U definiert. Die Aktivität des immobilisierten Enzympräparats wird gemäß folgender Formel berechnet:

Δ A 500 nm χ 0,25 χ 1000 Aktivität (U/g) =

Reaktionszeit mg immobilisiertes in Minuten Präparat

Bei der Bestimmung der Enzymaktivität kann man auch andere herkömmliche Verfahren verwenden. Bei Verwendung des erfindungsgemäßen immobilisierten Enzympräparats kann man dieses in den oben beschriebenen Vorrichtungen auch als Enzymelektrode verwenden.

Beispiel 1

a) Herstellung von Polyacrylnitril mit poröser Struktur

Ein 500 ml fassender Dreihalskolben in einem Wasserbad, das mittels Thermostat auf etwa 35°G gehalten wird, wird mit Stickstoff etwa 15 Minuten gespült. Dann werden 120 ml destilliertes Wasser, anschließend 2 g Natriumalkylsulfonat, 80 g Acrylnitril,

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0,1 g Natriumpersulfat und 0,033 g Natriumhydrogensulfit eingespeist. Das Gemisch wird etwa 3 Stunden gerührt. Die dabei erhaltene Emulsion wird in etwa 500 ml Wasser gegossen und zum Ausfällen durch Coagulation mit Natriumchlorid versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft ge-

s zahl trocknet. Das Polyacrylnitril hat eine Viskosität/ von etwa 10,5, bestimmt in 0,5 #iger Dimethylformamidlösung bei 30 C.

10 g dieses Polyacrylnitril werden in 150 ml Dimethylformamid gelöst und zur Bildung von Eilamentenin eine 20 #ige wäßrige Dimethylformamidlösung eingespritzt. Man erhält Polyacry.lnitriIfPamente mit einer Dicke von 20 bis 35/u, die 90 % odor mehr Acrylnitril enthalten und eine poröse Struktur haben.

Die gleiche Polyacrylnitrillösung kann man mittels einer Tropfvorrichtung
. / in eine 20 jSige wäßrige Dimethylformamidlösung eintropfen,

wodurch man Polyacrylnitril-Teilchen mit poröser Struktur und einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,15 mm erhält (entspricht der Sieböffnung eines 100-Maschensiebs). b) Herstellung von Polyacrylnitril mit freien Aminogruppen

1»5 g des gemäß Beispiel la) hergestellten Polyacrylnitril werden zu einer Lösung vcn 1,5 g Lithiumaluminiumhydrid in 120 ml trockenem Diäthyläther gegeben. Das Gemisch wird in einem ölbad bei 50⁰C 10 Minuten bis 30 Stunden am Rückfluß erhitzt. Die EUamente werden dem Gemisch entnommen, nacheinander mit trockenem Diäthyläther, eingehend mit 1 η Salzsäure, Wasser, 1 η Natronlauge und Wasser gewaschen. Man erhält Filamente von Polyacrylnitril mit freien Aminogruppen in einer Dicke von 20 bis 35/u. Nicht umge-

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setztes Lithiumaluminiumhydrid wird durch tropfenweise Zugabe von geringen Mengen Wasser zersetzt.

Die auf diese Weise hergestellten Amino-Polyacrylnitril-Filamente haben folgende physikalische Eigenschaften:

Farbe: gelb, etwas intensiver als Polyacrylnitril, wobei die Farbe mit verlängerter Reduktionszeit intensiver wird.

Viskosität:

nicht meßbar, da die Filamente in den unten angegebenen Lösungsmitteln nicht löslich sind.

Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln:

Amino-P olyacrylnitril-Filamente

DimethyIsulfoxid
Dimethylformamid

konzentrierte Salpetersäure

60 %ige KSCN-Lösung

Chloroform

Acetonitril

Pyridin

Nitromethan

Cyclohexan

Diäthyläther

Dioxan

teilweise löslich

unlöslich

Polyacrylnitril-Filamente

löslich

unlöslich

(Fortsetzung)

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Tetrahydrofuran unlöslich unlöslich

30 i&ige Natronlauge " "

nicht vollständig löslich, die Dicke derFilarnente bleibt ohne wesentliche Veränderung erhalten. Diese Teillöslichkeit wird anhand der Trübung des Lösungsmittels bei Zugabe von Wasser wie auch durch Gewichtsverlust (siehe folgenden Versuch) nachgewiesen.

Verschiedene Amino-Polyacrylnitril-Filamente bzw. -Fasern, die nach

in Mengen von jeweils J5O mg verschiedenen Reduktionszeiten erhalten worden sind, wtrden/in 5 ml Dimethylformamid 3 Minuten auf 60 C erhitzt. Die Fasern werden dann abfiltriert, mit V/asser gewaschen und getrocknet. Der Gewichtsverlust der Fasern nach dem Trocknen wird bestimmt:

Reduktionszeit Gewichtsverlust,%

5 Minuten
1 Stunde
5 Stunden

Polyacrylnitril-Fasern zeigen mit Natrium-2,¹^, 6-trinitrobenzolsulfonat keine Farbe, wogegen die Amino-Polyacrylnitril-Fasern gelb erscheinen, wodurch die Anwesenheit freier Aminogruppen bestätigt ist.

Gehalt an Aminogruppen:

Immobilisierte Proteinpräparate werden gemessen, und der Gehalt an freien Aminogruppen bei verschiedenen Trägern wird bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen I bis III angegeben.

31	,3
29	,0
27	,0.

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c) Immobilisiertes Enzympräparat

Je l8 mg verschiedener Träger, die nach verschiedenen Reaktionszeiten erhalten worden sind, werden in 10 ml 12,5 /Sigem Glutaraldehyd/Boratpuffer (pH 8,5) bei O⁰C 20 Minuten gerührt. Die Pasern werden abfiltriert, und eingehend mit Boratpuffer (pH 8,5) und 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschenj unmittelbar danach werden die Pasern in 2 ml 0,3 tigern Rinderserum-Albumin oder mo /u/ml Penicillinacylase aus Bacillus megaterium Β-ΊΟΟ in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,5) 1 Stunde bei 30⁰C geschüttelt. Nach dem Abfiltrieren werden die in der Mutterlauge zurückbleibenden Mengen an Rinderserum-Albumin und Penicillin-

<y it

acylase quantitativ nach O.H. Lowry in J. Biol. Chem., Bd. 193> S. 265 (1951) bestimmt. Aus diesem Wert kann der Gehalt des Trägers an gebundenem Rinderserum-Albumin oder an gebundener Penicillinacylase bestimmt werden.

Die gleichen Träger werden,jedoch ohne Behandlung mit Glutaraldehydjdirekt zu der Rinderserum-Albumin- oder Penicillinacylaselösung gegeben und 1 Stunde bei 3O⁰C geschüttelt. Die Menge des an den Träger gebundenen Proteins wird wie oben bestimmt.

d) Bestimmung des Aminogruppengehalts anhand der Bindefähigkeit für Aminosäuren

Je 18 mg Trägerstoff, die nach verschiedenen Reaktionszeiten erhalten worden sind, werden gemäß der Arbeitsweise des Beispiels Ic) mit 12,5 iSiger Glutaraldehydlösung behandelt, dann zu 2 ml eines 0,1 m Phosphatpuffers (pH 7,5) gegeben, der je 0,3 % Glutaminsäure (GIu), Threonin (Thr) oder 7-Amino-desacetoxycephalosporansäure (7-ADC¹A) enthält, und 1 Stunde bei 30⁰C ge-

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29Q5671

schüttelt. Das Gemisch wird abfiltriert, der Aminosäuregehalt im Überstand wird im automatischen Aminosäure-Analys3tor quantitativ bestimmt. Aus diesem Wert wird der Aminosäuregehalt des Trägers als Bindefähigkeit für Aminosäuren bestimmt. Die Unfähigkeit des Trägers, Aminosäuren zu absorbieren, wird unter Verwendung von Aminosäure-hydrazid anstelle von Aminosäuren bestätigt. Bei Verwendung von T-Amino-desacetoxyeephalosporansäure als Aminosäure wird deren Gehalt im Überstand mittels Hochdruckflüssigchromatographie und Absorption bei 25') nni bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.

e) Bestimmung des

Aminogruppengehalte durch Titration

Je 80 mg der verschiedenen Träger werden mit 15 ml 0,002 m Salzsäure und 30 ml destilliertem Wasser 1 Stunde gerührt. Die überschüssige Salzsäure wird mit 0,002 in Natronlauge titriert, um die als Hydrochlorid gebundene, den Aminogruppen entsprechende Menge an Salzsäure zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

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	29Ü5671	10	Rückfluß zeit, Min.	10 13	1 Adsorption ohne Glutar aldehyd
		80	0	24 , 145	6
		83	30	27 160	66
	Rinderserum-Albumin, y/mg Penicillinacylase, )f/mg	89	360	42 . 155	84
	• _t Glutaraldehyd Adsorption Glutaraldehyc w. ' Behandlung ohne Glutar- Behandlung aldehyd	74	1800	51 149	85
	0			Tcibell-j II	97
	10			Bindefähigkeit für Aminosäuren
.30-	30	Rückfluß zeit, Min.	GIu Thr 7-ADCA ,uMol/mg
Tabelle I	360	5	0 0 0
Menge des an den Träger gebun denen Proteins	1800	60	86 51 46
	300	73 120 44
	480	92 84 ' 45
	Tabelle III
	Aminogruppen, bestimmt durch Salzsäurot it rat ion
	Ami nogruppen, ,
	175	uMol/g
	263
	300
	275

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29ÜS671

f) Menge an adsorbierter Penicillinacylase

Die Menge der an den Träger gebundenen Penicillinacylase aus Bacillus megaterium B-^OO (FEKM-P 1^8) wird unter Verwendung oder in Abwesenheit von Glutaraldehyd (Arbeitsweise des Beispiels Ic) bzw. Bestimmungsmethode Ib), S. 16) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Spezifische Aktivität von Penicillinacylase	Adsorption ohne Glutar aldehyd, U/mg
Behandlung mit Glutaral'iehyd, U/mg	0,10
0,12	3,05
2,88	3,00
2,90	3,05
2,85	3,05
2,83

Rückflußzeit, Min.

Beispiel 2

a) In einem Dreihalskolben werden 2,5 g Lithiumaluminiumhydrid und 100 ml trockener Diäthyläther gerührt und mit 2 g gemäß Beispiel la) hergestellten porösen Polyacrylnitril-Teilchen (mittlere Teilchengrößen: 0,15 mm) versetzt. Das Gemisch wird 16 Stunden bei 50⁰C unter Rückfluß erhitzt, dann tropfenweise unter Eiskühlung mit Wasser versetzt, um das nicht umgesetzte Lithiumaluminiumhydrid zu zersetzen. Durch tropfenweise Zugabe von 1 η Salzsäure wird das zersetzte Produkt aufgelöst. Das Amino-Polyacry.lnitril wird abfiltriert, nacheinander mit 1 η Salzsäure,

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. Wasser, 1 η Natronlauge, Wasser und 0,1 η Phosphatpuffer (pH 7>5) gewaschen. Man erhält . schwachgelbe Polyacrylnitril-Teilchen mit freien Aminogruppen von poröser Struktur (mittlerer Teilchendurchmesser: 0,15 mm).

b) Ein Gemisch von 2 g Lithiumaluminiumhydrid und 50 ml trockenem Diäthyläther werden gerührt und unter Kühlen portionsweise mit 3 g Acrylnitril-Copolymerisat-rTeilchen poröser Struktur (mittlerer Durchmesser: 0,15 mm) versetzt. Dieses Copolymer!sat enthält 55 Teile Acrylnitril, 25 Teile Divinylbenzol und 20 Teile Vinyläthylbenzol und wurde gemäß Beispiel la) hergestellt. Das Gemisch wird unter Rückfluß bei 45⁰C 10 Minuten bis 8 Stunden erhitzt, dann unter Rühren und unter Kühlen in einem Eisbad mit 2 ml Wasser versetzt, um das nicht umgesetzte Lithiumaluminiumhydrid zu zersetzen. Nach der Zugabe von 1 η Salzsäure wird das unlösliche, freie Aminogruppen enthaltende Polymerisat abfiltriert und gewaschen. Man erhält 9 g (im nassen Zustand) eines Acrylnitril-Copolymerisats mit freien Aminogruppen von poröser Struktur und einer Teilchengröße von 0,15 nun.

Dieses Copolymerisat hat folgende physikalische und chemische Eigenschaften:

Farbe: schwachgelb, die gelbe Farbe wird mit zunehmender Reduktionszeit intensiver.

Viskosität:

nicht meßbar wegen der Unlöslichkeit des Polymerisats in den angegebenen Lösungsmitteln.

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Löslichkeit: unlöslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, konzentrierter Salpetersäure, 65 JSiger Kaliumthiocyanatlösung (bei 6O⁰C), Chloroform, Acetonitril, Pyridin, Nitrornethan, Cyclohexan, Diäthyläther und 30 SÜiger Natronlauge.

Aminogruppen-Gehalt: Bestimmt durch Salzsäuretitration gemäß Beispiel Ie). Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.

Tabelle V

Aminogruppen, bestimmt durch Salzsäuretitration

Reduktions- Aminogruppen,

zeit, Min. /uMol/g Träger

10 5Ί5

60 738

480 780

Die Bindefähigkeit für verschiedene Enzyme dieser Copolymerisat-Teilchen mit poröser Struktur und freien Aminogruppen und die Bindefähigkeit des als Ausgangsmaterial verwendeten Polyacrylnitrils (Kontrolle) werden verglichen. Dazu werden 50 bis 100 mg des Polymerisats mit freien Aminogruppen oder des Kontroll-Polymerisats in ein Probenröhrchen mit L-Form eingefüllt und mit einem Puffer, der das Enzym enthält, versetzt. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 30⁰C gerührt, dann abgetrennt und mit 0,5 m Natriumchlorid/ 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7j5)» anschließend mit 0,1 m Phosphat-

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puffer (pH 7,5) gewaschen. Die Aktivität des Produkts wird bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt.

Tabelle VI

Bindefähigkeit für Enzyme von Polyacrylnitril mit und ohne (Kontrolle) Aminogruppen

Aktivität, U/mg ^Enzyme erfindungsgemäß Kontrolle

Acylase aus Bacillus

megaterium B-400 I50 40

Acylase aus

Comamonas sp. SY-77-I 67O 350

Cholinoxidase aus

Arthrobacter globiformis

B-0577 7,0 0,45

Vergleichsbeispiel 1 Acylase aus Bacillus megaterium B-400

In einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben werden 100 ml eines Mediums (pH 7,0), das 1 % Polypepton, 1 % Fleischextrakt und 0,5 %■ Natriumchlorid enthält, 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Das Medium wird mit Bacillus megaterium B-400 (FERM-P 74 8) beimpft und unter Schütteln 48 Stunden bei 30⁰C bebrütet. Die Zellen werden abfiltriert, das Filtrat wird auf pH 7,5 eingestellt und mit 1 g DiaVomeenerde versetzt. Das Gemisch wird etwa 30 Minuten gerührt, die Diatomeenerde wird abfiltriert. Die erhaltene Diatomeenerde hat eine Aktivität von 20,4 U/g. 800 g dieses Präparats werden in Wasser suspendiert, in eine Säule (9,5 χ 80 cm) eingefüllt und mit 24 % Ammoniumsulfat/0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanlösung (pH 8,5) mit einer Raumgeschwindigkeit von

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0,5 eluiert. Es werden 210 ml mit einer Aktivität von 30 U/ml in Fraktionen erhalten, deren Absorption bei 280 nm gemessen wird.120 ml dieses Eluats werden zur Gelfiltration auf eine Säule (3,2 χ 41 cm), die mit Polyacrylamidgel (Teilchengröße: 0,075 bis 0,15 mm) in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,5) gefüllt ist, aufgegeben, wobei 120 ml als natriumchloridfreie Fraktionen mit einer Absorption von 280 nm erhalten werden (21,6 U/ml). Diese Lösung wird in einem Dialyserohr in 1 Liter 30$igem Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht: etwa 20.000)/0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,5) auf 24 ml eingeengt, dann gegen 0,1 η Phosphatpuffer (pH 7 j 5) über Nacht dialysiert. Man erhält 23 ml konzentrierte Acylaselösung aus Bacillus megaterium B-JiOO mit einer Aktivität von 120 U/ml.

Vergleichsbeispiel 2■ Acylase aus Comamonas sp. SY-77-1

In einem 5 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben werden 500 ml eines Mediums (pH 7,0), das 1 % Pepton, 0,5 % Fleischextrakt und 0,3 % Natriumchlorid enthält, 15 Minuten bei 120°C sterilisiert. Das Medium wird mit Comamonas sp. SY-77-1 (FERM-P 2410) beimpft und unter Schütteln 24 Stunden bei 30⁰C bebrütet. Diese Impfkultur wird zu 10 Litern eines Mediums (pH 9*0) in einem 20 Liter fassenden Fermenter gegeben, das 2 % Casein, 0,05 % Hefeextrakt, 0,4 % Maisquellwasser, 0,5 % Natriumglutamat und 0,1 % Glutarsäure enthält und 30 Minuten bei 130⁰C sterilisiert worden ist. Nach dem dreitägigen Bebrüten bei 30⁰C unter 100 SSiger Belüftung pro Minute und Rühren bei 300 UpM werden die Zellen unter Kühlen abzentrifugiert. Man erhält etwa 100 g nasse Zellen, die in

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500 ml 0,1 in Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert und mit 25 ml eines kationischen Netzmittels versetzt werden. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, dann werden die Zellen abzentrifugiert. Man erhält etwa 500 ml überstand. Vier entsprechend hergestellte Überstand-Proben werden zu etwa 2000 ml Überstand mit einer Aktivität von 50 000 U/ml vereinigt. 1170 ml dieser Lösung werden mit 90 g Ionenaustauscherharz (Amberlite XAD-7) versetzt, das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, dann filtriert. Das Filtrat (1150 ml mit einer Aktivität von Ί6 600 U/ml) wird auf eine Säule (3,4 x 26 cm), die mit 30 g Polyacrylnitrilfasern mit poröser Struktur ohne Luftblasen gefüllt ist, aufgegeben. Nach dem Ablaufen der Flüssigkeit wird die Säule gewaschen und mit 150 ml/Stunde 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert. Man erhält 12*1 ml aktive Fraktionen mit einer Aktivität von 1*40 800 U/ml.

Vergleichsbeispiel 3 Cholinoxidase aus Arthrobacter globiformis B-0577

In einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben werden 100 ml eines Mediums (pH 7,2), das 1,0 % Cholin, 0,5 % Kaliumchlorid, 0,1 % K₂HPO₁₄, 0,05 % MgSO₁₄^H₂O, 0,25 % Hefeextrakt, 1,0 % löslichen Fischextrakt und 0,1 % Antischaummittel enthält, bei 120⁰C 20 Minuten sterilisiert. Dieses Medium wird mit Arthrobacter globiformis B-0577 (FERM-P 3518) beimpft und 2¹I Stunden bei 30°C bebrütet. Diese Impfkultur wird in einem 30 Liter fassenden Fermenter übergeführt, der 10 Liter· des oben angegebenen sterilisierten Kulturmediums enthält, und 2 Tage unter Rühren bei 200 UpM

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und Belüftung mit sterilisierter Luft mit einer Geschwindigkeit von 20 Litern/Minute bebrütet. Die Kulturbrühe wird zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Nach dem Waschen der Zellen mit 1 Liter einer Lösung von 0,01 m Tris-hydrochloridpuffer (pH 8,0), 0,002 m Äthylendiamin-tetraessigsäure und 1 % Kaliumchlorid v/erden die Zellen in einem Liter einer Lösung von 0,01 m Phosphatpuffer, 0,002 m Äthylendiamirr-tetraessigsäure und 1 % Kaliumchlorid suspendiert und mit 200 mg Lysozym (als Lysozymchlorid) versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 37°C gerührt, dann 15 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert. Der überstand (Gesamtaktivität: 998 U, Gesamtprotein: 7680 mg, spezifische Aktivität: 0,13 U/mg) wird mit einem Liter Aceton vermischt. Nach dem Entfernen der ausgefallenen Verunreinigungen wird das Gemisch weiter mit Aceton bis auf eine Acetonkonzentration von 65 % verdünnt und 15 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert. Die Niederschläge werden gesammelt (Gesamtaktivität: 900 U, Gesamtprotein: 580 mg, spezifische Aktivität: 1,55 U/mg) und in ¹JO ml einer Lösung aus 0,01 m Tris-hydrochloridpuffer (pH 8,0), 0,002 m Äthylendiamintetraessigsäure und 1 % Kaliumchlorid gelöst. Die unlöslichen Feststoffe werden abzentrifugiert und mit 60 ml einer^wäßrigen gesättigten Ammoniumsulfatlösung versetzt. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und bei 12 000 UpM 15 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag (Gesamtaktivität: 825 U, Gesamtprotein: 300 mg, spezifische Aktivität: 2,75 U/mg) wird in 15 ml einer Lösung von 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7,0) und 0,002 m Äthylendiamin-tetraessigsäure gelöst. Diese Lösung wird zum Entsalzen mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/Stunde auf eine Kolonne mit vernetzten Dextran aufgegeben. Die ablaufende gereinigte

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Lösung wird an einer Säule (2,0 χ 7j0 cm), die mit einer auf pH 7,0 gepufferten Diäthylaminoäthylcellulose gefüllt ist, adsorbiert. Die Säule wird mit einem Kaliumchloridgradienten von 0,2 auf 5,0 m eluiert; die bei einer Kaliumchloridkonzentration von 0,H m eluierten Fx*aktionen werden gesammelt. Man erhält 172 ml aktive Fraktionen (Fließgeschwindigkeit: 1,4 ml/ Minute, 6 ml-Praktionen). Diese aktiven Fraktionen werden durch eine Celluloseacetat-Membran gegen eine Lösung von 0,005 m Phosphatpuffer und 0,002 m Äthylendiamin-tetraessigsäure 7 Stunden dialysiert. Das Dialysat wird lyophllisiert, das Produkt wird in 10 ml einer Lösung, die 0,01 m Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 8,0), 0,002m Äthylendiamin-tetraessigsäure und 1,0 % Kaliumchlorid enthält, gelöst. Diese Lösung wird an einer Dextransäule (2,8 χ 9,5 cm) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,18 ml/Minute chromatografiert. Es werden 6 ml-Fraktionen gesammelt, die Fraktionen Nr. 42 bis 48 werden isoliert und lyophilisiert, dann noch einmal an der oben angegebenen Säule chromatografiert. Man erhält Cholinoxidase mit einer Gesamtaktivität von 380 ü, einem Gesamtproteingehalt von 55,9 mg und einer spezifischen Aktivität von 6,80 U/ml.

Vergleichsbeispiel 4 Phospholipase D aus Streptomyces chromofuscus A-0848

100 ml eines Mediums, das 2 % Pepton, 2 % Lactose, 0,1 % Natriumchlorid, 0,05 % K₂HPO₄, 0,05 % MgSO₄'7H₂O und 0,5 % Antischaummittel enthält, werden in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert, dann mit Streptomyces

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chromofuscus Λ-Ο848 (FERM-P 3519) beimpft. Nach dem Bebrüten bei 26°C während 3 Tagen wird diese Impfkultur in einen 30 Liter fassenden Fermenter übergeführt, der 20 Liter des oben angegebenen Mediums enthält, und 2 Tage bei 26°C unter Rühren bei 3OO UpM und Belüftung mit 20 Litern Luft/Minute bebrütet. Die Kulturbrühe (0,5 U/ml) wird zentrifugiert, man erhält etwa 18 Liter Filtrat, das auf etwa 3 Liter konzentriert und mit 2,4 Litern Aceton vermischt wird. Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert, der überstand wird mit v/eiteren 2 Litern Aceton vermischt. Der Niederschlag wird isoliert, die unlöslichen Feststoffe werden durch Zugabe von 500 ml Wasser zu dem Niederschlag entfernt. Der Niederschlag wird mit weiteren 330 ml Aceton vermischt, dann isoliert und in 200 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wird mit 200 ml einer gesättigten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung vermischt. Der Niederschlag wird isoliert, in 50 ml Wasser gelöst, mit vernetztem Dextran entsalzt und lyophilisiert. Man erhält 700 mg Phospholipase D als Pulver mit einer Aktivität von 5 U/mg.

Beispiel 3

9 g der nach Beispiel 2b) hergestellten Teilchen des Acrylnitril-Copolymerisats ir*xt poröser Struktur werden mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen, zu 200 ml einer vorher gekühlten Lösung von 12,5 % Glutaraldehyd in Phosphatpuffer (pH 8,5) gegeben und 20 Minuten bei O⁰C gerührt. Der Träger wird abfiltriert, gut mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen und in 60 ml einer Acylaselösung (60 U/mg) aus Bacillus megateriurn B-400 ein-

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. ij). 29ÜS671

getragen. Das Gemisch wird über Nacht bei 4°C gerührt, dann wird

mit
der Träger abfiltriert und/0,5m Natriumchlorid/O,1m Phosphat-.puffer (pH 7,5) und 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gev/aschen. Man erhält 8,7 g immobilisiertes Acylasepräparat in Teilchenform mit einer Aktivität von 324 U/g.

Beispiel 4

Das gemäß Beispiel 3 hergestellte immobilisierte Enzympräparat wird in eine Säule mit Mantel (1,2 χ 8 cm) eingefüllt und bei 37°C während 20 Tagen kontinuierlich mit einer 1 %igen Lösung von 7-Phenylacetamido-desacetoxycephalosporansäure in 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) mit einer Raumgeschwindigkeit von 0,5 beladen. Der Gehalt an 7-Amino-desacetoxycephalosporansäure wird dadurch gemessen, daß man das Gemisch 10 Minuten in einem Puffer, der 1 ml 0,05m Natronlauge und 20 ml 2 %ige Essigsäure sowie 0,5 ml 0,5 % p-Dimethylaminobenzaldehyd in Methanol enthält, umsetzt und die Absorption bei 415 nm mißt. Aus

diesem Wert wird der Gehalt mit Hilfe der Eichkurve für 7-Amino-

bestimmt desacetoxycephalosporansäure gemäß Fig. 2/, in der das Volumen des Reaktionsteilnehmers/Volumen der Säule und die Tage für die Beladung auf der Abszisse gegen die Ausbeute an 7-Amino-desacetoxycephalosporansäure aufgetragen sind. Wie aus Fig. 2 ersichtlich, kann das erfindungsgemäße immobilisierte Enzympräparat sehr lange Zeit verwendet werden.

Beisp.iel 5

2,5 g Polyacrylnitril-Fasern (Acrylnitrilgehalt: 95 %, Dicke:

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20 bis 3 5 /a) werden mit einem Gemisch von 3,8 g Lithiumaluminiumhydrid in 120 ml trockenem Diäthylather versetzt und unter Rühren 24 Stunden bei 45°C reduziert. Das Gemisch wird dann in einem Eisbad abgekühlt und unter Rühren tropfenv/eise mit 3 ml Wasser, anschließend portionsweise init 1n Salzsäure versetzt, bis die Freisetzung von Chlorwasserstoff beendet ist. Das Produkt wird abfiltriert, man erhält 12,5 g (Naßgewicht) Polyacrylnitril-Fasern mit freien Aminogruppen und poröser Struktur.

600 mg (Naßgewicht) dieser Fasern v/erden mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen und zu 50 ml einer gekühlten Lösung von 12,5 % Glutaraldehyd in Phosphatpuffer (pH 8,5) gegeben und 20 Minuten bei O⁰C gerührt. Die so behandelten Fasern werden abfiltriert und mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Dieser Träger wird mit 8 ml einer Acylaselösung (108 000 U/ml) aus Comamonas sp. SY-77-1 versetzt und bei Raumtemperatur 5 Minuten gerührt. Nach der· Zugabe von 10 /ul 25 %igem Glutaraldehyd wird das Gemisch weitere 60 Minuten bei 30°C gerührt. Das Produkt wird abfiltriert, die Feststoffe werden mit 0,5m Natriumchlorid/O,1m Phosphatpuffer (pH 7,5), dann mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Man erhält 300 mg (Naßgewicht) immobilisiertes Acylasepräparat mit einer Aktivität von 1600 U/mg.

4,5 g (Naßgewicht) dieses Präparats werden in eine Säule mit Mantel (1x5 cm, Volumen: 4ml) eingefüllt und mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Die Säule wird mit einer Raumgeschwindigkeit von 1,5 mit einer Lösung von 9,92 mg/ml 7-(4-Carboxybutanamido)-cephalosporansäure in 0,1m Phosphatpuffer beladen. Die in der abfließenden Lösung enthaltene 7-Amino-

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cephalosporansäure wird mittels p-Dimethylaminobenzaldehyd gemäß Beispiel 4 bestimmt, ihr Gehalt wird anhand der Eichkurve für 7-Amino-cephalosporansäure der Fig. 3 berechnet, in der die Menge der durchgelaufenen Lösung auf der Abszisse gegen die Spaltung in %, d.h. die Ausbeute an 7-Amino-cephalosporansäure, aufgetragen ist. Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße immobilisierte Enzympräparat lange Zeit ohne Abnahme der Enzymaktivität verwendet werden kann.

600 ml der abfließenden, die 7-Amino-cephalosporansäure enthaltende Lösung (Spaltung: 84,5 %) werden auf pH 3,2 eingestellt, auf etwa 45 ml eingeengt und über Nacht bei 4°C stehengelassen. Dabei fallen 3,22 g 7-Amino-cephalosporansäure mit einer Reinheit von 86,3 % aus.

Beispiel 6

0,6 g (Naßgewicht) gemäß Beispiel 5 hergestellte Amino-PoIyacrylnitril-Fasern werden mit 50 ml einer eisgekühlten Lösung von 12,5 % Glutaraldehyd in Boratpuffer (pH 8,5) versetzt und bei 0⁰C 20 Minuten gerührt. Die Fasern werden abfiltriert, mit Boratpuffer (pH 8,5), dann mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen und mit 12 ml eines 0,1m Phosphatpuffers (pH 7,5),der 20 U/ml Phospholipase D und 5 U/ml Cholinoxidase enthält, vermischt. Das Gemisch wird über Nacht bei O⁰C gerührt. Das Produkt wird abfiltriert und mit O,5m Natriumchlorid/0, 1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Man erhält ein erfindungsgemäßes Enzympräparat mit einer Phospho-

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lipase D-Aktivität von 119 U/g und einer Cholinoxidase-Aktivität von 17 U/g.

Dieses immobilisierte Enzympräparat wird in der Vorrichtung der Fig. 1b verwendet. Das immobilisierte Enzympräparat wird in die Kolonne 1 (5 χ 3,5 cm) eingefüllt. Über den Probeneinlaß B wird eine Substratlösung, die O,O1m Tr.i s-hydroxymethyl) -ami.nomethan-hydrochlorid-Puffer, 0,3 % Alkyl-polyäthoxyäthanol und 0,01m Calciumchlorid enthält, mit einer FIi eßgeschwi ndi.g-

sieh

keit von 20 ml/Stunde eingespeist, bis/das System in einem stationären Zustand befindet. Über den Probeneinlaß B werden je 5 ill Phospholipidlösungen verschiedener Konzentrationen eingespritzt. Das Phospholipid wird in der Säule 1 durch die Phospholipase D und die Cholinoxidase des immobilisierten Präparats zersetzt, wodurch der gelöste Sauerstoff bei der Cholinoxidation durch die Cholinoxidase verbraucht wird. Dieser Verbrauch wird in

gemessen

der Meßvorrichtung 2 (Durchflußküvette)/, die mit einer Sauerstoff elektrode 3 und einem Meßgerät für gelösten Sauerstoff 5, das mit einem Schreiber 6 verbunden ist, ausgerüstet ist.

Fig. 4 zeigt die Eichkurve aus diesen Phospholipidkonzentrationen

Kurven-
und den Flächen unterhalb der\Gipfel, die mit diesem Verfahren

erhalten wurde. Anhand dieser Eichkurve kann man die Menge eines Phospholivids im Blut quantitativ bestimmen, indem man eine Serumprobe durch den Einlaß B in das System einspritzt. Ein typisches Beispiel für diese Reaktion ist Lecithin, das nach folgendem Schema reagiert, wobei der Sauerstoffverbrauch gemessen wird:

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BAD ORIGINAL

• bfc.

Lecithin

Phospholipase D Cbolin

I Cholinoxidase

+ 2O₂ +

Betain + 2H₃O₂

Bei Verwendung von Lecithin als Substrat in Konzentrationen

von von 1, 2 und 3 mMol und Einspritzen/je 10 ul dieser Lösungen kann man die Änderungen der Flächenwerte in Abhängigkeit von der Anzahl der wiederholten Verwendungen bestimmen, wobei die Fließgeschwindigkeit 38 ml/Stunde und die Aufzeichnungsgeschwin-

digke.it

/JOO mm/Stunde betragen. Man erhält die Ergebnisse der

Fig. 5. Somit erhält man mit dem erfindungsgemäßen immobilisierten Enzympräparat nicht nur erstaunlich genaue Werte (siehe Fig. ¹O, sondern auch bei den verschiedenen Substrab-Konzentrationen eine gleichmäßige Leistung.

Beispiel 7

Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Polyacrylnitril wird in Dimethylformamid gelöst. Aus dieser Lösung wird in einem Wasserbad, das 15 % Dimethylformamid enthält, eine Membran gebildet, die mit Wasser 'gewaschen und an der Luft getrocknet wird. Diese Membran (k50 mg) wird in Gegenwart von 700 mg Lithiumaluminiumhydrid und 30 ml Diäthyläther 18 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Man erhält 520 mg (Naßgewicht) einer Polyacrylnitrj1-Membran mit freien Aminogruppen und poröser Struktur. 150 mg dieser Membran werden mit h0 ml einer Lösung von 12,5 % Glutar-

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- ΊΑ -

aldehyd in Boratpuffer (pH 8,5) vermischt und 20 Minuten bei 0⁰C gerührt. Die Membran v/ird dann ab filtriert und unter Rühren bei 3O⁰C 60 Minuten lang mit 5 ml eines 0,Im Phosphatpuffers (pH 7,5), der 15 mg Cholinoxidase (3,6 U/mg) enthält, vermischt. Das Produkt v/ird abfiltriert und mit 0,5n Natriurnchlorid/O, Im Phosphatpuffer (pH 7,5), dann mit 0,1m Phosphatpuffer· (pH 7,5) gewaschen. Man erhält ein Cholinoxidasepräparat, das an diese Membran gebunden ist, mit einer Cholinoxidaseaktivität von 3 U/g.

Das immobilisierte Enzympräparat wird dann in Streifen von 5 x 5 mm geschnitten und in der Vorrichtung der Fig. l(c) verwendet. Der Streifen wird an der Sauerstoffelektrode 3 befestigt, mit einem Nylonnetz bedeckt und in die Heftvorrichtung 2 eingebracht. Diese Anordnung wird in das mit einem Thermostaten versehene Bad 7 eingesetzt. In die Meßvorrichtung 2 wird durch den Einlaß B 1 ml 0,01m Trispuffer (pH 8,0) eingespeist, um den Wert des gelösten Sauerstoffs zu stabilisieren. Dann v/erden je 20/ul Cholinchloridlösungen verschiedener Konzentrationen eingespritzt. Die Ergebnisse werden auf dem Schreiber 6 festgehalten, der mit dem Meßgerät 5 (für gelösten Sauerstoff) und einem Differentialumwandler verbunden ist. Aus der Cholinchlorid-Konzentration und den entsprechenden maximalen Geschwindigkeitdifferentialen (dtOp) erhält man die Eichkurve der Fig. 6. Fig. 7 zeigt die V/erte bei Verwendung von 20 ul einer 0,016m Cholinchloridlösung in Abhängigkeit von der Anzahl der wiederholten Verwendungen. Diese Ergebnisse zeigen, daß man mit dem erfindungsgemäßen Enzympräparat genaue und auch sehr stabile V/erte erhält.

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-So -

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Beispiel 8

10 mg (Naßgewicht) der in Beispiel 7 hergestellten Polyacrylnitril-Membran werden bei 0⁰C v.'ährend 20 Minuten unter Rühren mit 40 ml einer Lösung von 12,5 % Glutaraldehyd in Boratpuffer (pH 8,5) vermischt. Nach dem Abfiltrieren und Waschen mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) wird die behandelte Membran unter Rühren bei 30°C 60 Minuten lang mit 5 ml eines 0,1m Phosphatpuffers (pH 7,5) vermischt, der 10 mg Glucoseoxidase (210 U/mg) enthält. Das Produkt wird abfiltriert und mit 0,5m Natriumchlorid/O,Im Phosphatpuffer (pH 7,5), dann mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Man erhält ein immobilisiertes Präparat, bei dem die

Glucoseoxidase

/ an die Membran gebunden ist, mit einer Aktivität

von 150 U/g.

Dieses Präparat wird in Streifen von 5 x 5 mm geschnitten und in der in Beispiel 7 beschriebenen Vorrichtung eingesetzt, wobei jedoch Glucose anstelle von Cholinchlorid verwendet wird.

Die Eichkurve der Fig. 8 sowie die Werte nach wiederholten Anwendungen der Fig. 9 zeigen, daß man mit dem erfindungsgemäßen Enzympräparat ausgezeichnete und stabile Meßwerte erhält.

Beispiel 9

Eine Lösung von 16O ml (3,6 U/mg) Cholinoxidase in 5 ml 0,1m Phosphatpuffer (pil 7,5) wird unter Rühren in einem Eisbad mit 100 mg (Naßgewicht) Amino-Polyacrylnitril-Fasern des Beispiels vermischt. Das Gemisch wird mit 20/ul l-Sthyl-3-(3-dimethyl-

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2 9 ϋ 5 6 71

aminopropyl)-carbodiimid versetzt, mit In Salzsäure auf pH 7,5 eingestellt und 3 Stunden in einem Eisbad.dann über Nacht bei 4°C gerührt. Das Produkt wird abfiltriert und mit 0,5m Natriumchlorid/O,Im FhoGphatpuffer (pH 7,5) j dann mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7j5) gewaschen. Man erhält ein erfindungsgemäßes Cholinoxidasepräparat mit einer Aktivität von 5,6 U/mg.

Beispiel 10

Die Arbeitsweise des Beispiels 9 wird wiederholt mit dem Unterschied, daß anstelle der Cholinoxidase 5 nil einer Acylaselösung (96 U/ml) aus Bacillus megaterium B-400 und 40,ul l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid verwendet werden. Man erhält ein erfindungsgemäßes Acylasepräparat mit einer Aktivität von 264 U/g.

Beispiel 11

5OO mg (Naßgewicht) der gemäß Beispiel 2b) hergestellten Amino-Polyacrylnitiil-Teilchen werden bei O⁰C 20 Minuten lang mit 30 ml einer Lösung von 12,5 % Glutaraldehyd in Boratpuffer (pH: 8,5) vermischt. Die so behandelten Teilchen werden abfiltriert, eingehend mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen und unter Rühren bei 4°C 24 Stunden lang mit 30 ml 0,5m wäßriger Hexamethylendiamin-Lösung (pH 9,5) vermischt, dann abfiltriert und eingehend mit Wasser gewaschen. Dieses Produkt wird mit einer Lösung von 12,5 % Glutaraldehyd in Boratpuffer (pH 8,5) behandelt, anschließend mit Wasser gewaschen, unter Rühren bei 4°C 12 Stunden lang mit 5 ml einer Acylaselösung (72 U/ml) aus

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Bacillus raegaterium B-400 (FERM-P 748) vermischt. Nach dem Filtrieren und Waschen mit 0,5m Natriumchlorid/O,Im Phosphatpuffer (pH 7,5) und 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) erhält man 440 mg (Naßgewicht) eines erfindungsgemäßen Acylasepräparats in Teilchenform mit einer Aktivität von 250 U/g.

Beispiel 12

In einem 30 Liter fassenden Fermenter werden 20 Liter eines Mediums (pH 6,0), das 2 % Glucose, 0,4 % Kaliumhydrogenphosphat, 0,1 % Magnesiumsulfat, 0,05 % Kaliumchlorid, 0,0025 % Eisen(II)-sulfat, 0,1 % Hefeextrakt und 0,3 % DL-Methionin enthält, bei 120°C 20 Minuten sterilisiert. Das Medium wird mit Trigonopsis variabilis CBS 4095 beimpft und 48 Stunden bei 30°C bebrütet. Man erhält etwa 20 Liter Kulturbrühe, die abfiltriert wird. Die erhaltenen etwa 400 g Zellen werden in 800 ml 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) dispergiert und durch Zugabe von 1000 g Glasperlen (Durchmesser 0,25 bis 0,30 mm) zerstoßen. Das Gemisch wird unter Kühlung bei 15 000 UpM 20 Minuten zentrifugiert. Der überstand (1000 rnl, D-Aminosäure-oxidase mit einer Aktivität von 15 000 U/ml) wird mit Polyäthylenglykolen (Carbowax) mittleres Molekulargewicht etwa 20 000) behandelt. Man erhält 100 ml einer konzentrierten D-Aminosäure-oxidaselösung mit einer Aktivität von 145 000 U/ml.

10 ml dieser konzentrierten Lösung werden in ein L-förmiges Probenröhrchen eingefüllt und mit 1 Gramm Polyacrylnitril-Fasern (Acrylnitrilgehalt: 95 %) mit poröser Struktur als Kontrolle oder mit den Amino-Polyacrylnitril-Fasern des Beispiels 5 _;

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(Acrylnitrilgehalt: 95 %) versetzt. Jedes Gemisch wird 60 Minuten bei 3O°C gerührt, dann wird das Produkt abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Die Enzymaktivität der Präparate wird bestimmt: Das Kontrollpräparat hat eine D-Aminosäure-oxidase-Aktivität von 7,5 U/mg (Bindung an den Träger: 0,5 %), das erfindungsgemäße Präparat eine Aktivität von 276 U/mg (Bindefähigkeit: 19,0 %). Somit ist das erfindungsgemäße immobilisierte Enzympräparat dem Kontrollpräparat überlegen.

Zur Bestimmung der Aktivität der D-Aminosäure-oxidase wird ein System aus 0,5 ml Enzymlösung und 1,0 ml 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) oder aus erfindungsgemäßem immobilisierten. Enzympräparat und 1,5 ml 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5), 0,5 ml eines Indikators (hergestellt durch Lösen von 5 mg o-Dianisidin in 1 ml Methanol, Versetzen von 10 ml 0,1m Phosphatpuffer mit 0,3 ml dieser Lösung und mit 2 mg Peroxidase mit einer Akti-

wäßrigen

vität von 8 U/mg) und 0,5 ml einer 2 5&igen/Alaninlösung 15 Minuten bei 37 C umgesetzt. Die Reaktion wird durch Zusetzen von 0,5 ml 50 J&iger Trichloressigsäure unterbrochen. Das Gemisch wird mit 2,0 ml Äthanol versetzt und 5 Minuten bei 10 000 UpM zentrifugiert. Die Absorption des Überstands wird bei 400 nm gemessen. Die Enzymaktivität, die die Absorption nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten um 0,100 ändert, wird als 100 U definiert.

Beispiel 13

1,5 g Polyacrylnitril-Fasern mit poröser Struktur (Acrylnitrilgehalt: 90 % oder -}a -über) werden mit 120 ml trockenem Diäthyl-

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äther und 1,5 S Lithiumaluminiumhydrid in einem ölbad bei 50 C 21 Stunden am Rückfluß erhitzt. Das reduzierte Produkt wird abfiltriert und nacheinander mit Äther, einer geringen Menge Wasser, In Salzsäure, Wasser, In Natronlauge, Wasser und 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Man erhält 7 g (Naßgewicht) PoIyacrylnitril-Fasern mit freien Aminogruppen und poröser Struktur.

Die Fasern werden in 2^0 ml einer gekühlten Lösung von 12,5 % Glutaraldehyd in Boratpuffer (pH 8,5) 20 Minuten bei 0⁰C gerührt. Die behandelten Fasern werden abfiltriert, mit Boratpuffer (pH 8,5) und mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen, dann mit 113 ml einer Acylaselösung (60 U/ml) aus Bacillus megaterium B-MOO (FERM-P 7^8) bei Raumtemperatur 4 Stunden vermischt und über Nacht bei 5°C stehengelassen. Das Produkt wird abfiltriert (im Filtrat kann keine Acylaseaktivität mehr festgestellt werden)und mit 0,5m Natriumchlorid/O,Im Phosphatpuffer (pH 7>5) und 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Man erhält 6,8 g (Naßgewicht) erfindungsgemäßes immobilisiertesAcylasepräparat mit einer Aktivität von 584 U/g.

Dieses immobilisierte Enzympräparat wird in der Vorrichtung gemäß Fig. 10 verwendet. Das Enzympräparat wird in die mit einem Mantel versehene Säule 9 (1,6 χ 6 cm) eingefüllt, die Säule wird auf 37°C gehalten. Der 500 ml fassende Kühltank 12 wird mit einem Magnetrührer 10 versehen, um den 50 ml fassenden Vorratsbehälter 11 in einem Eisbad zu kühlen. In diesen gekühlten Vorratsbehälter 11 werden 50 ml einer Lösung von ¹J,^55 g Benzylpcnicillarisäure-kaliumsalz in 0,02m Phosphatpuffer (pH 7,5), die mit In Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt wor-

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den ist, eingefüllt. Die Lösung gelangt mit einer Fließgeschwindigkeit von 21 ml/Minute über den auf 37⁰C gehaltenen Wärmeaustauscher 13 in die Säule 9· Die aus der Säule 9 austretende Lösung wird durch die Pumpe l'J in den Vorratsbehälter 11 zurückgepumpt. Der Vorratsbehälter 11 ist mit einem pH-Messer 15 ausgerüstet, um die. pH-Änderungen, die von der durch die Säule 9 gelaufenen Lösung verursacht werden, mit ^n Natronlauge, pH 7,8 bis 8,2, auszugleichen. Die Lösung wird während 3 Stunden zirkuliert. Anschließend werden die Lösung im Vorratsbehälter 11 und etwa 10 ml Waschflüssigkeit, nach einer Wäsche der Säule 9j gesammelt und vereinigt. Diese Lösung wird

mit

mit 30 ml Aceton versetzt und/6n Salzsäure auf pH Ί,2 eingestellt. Das Gemisch wird über Nacht bei 5°C stehengelassen, dann wird der Niederschlag gesammelt, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Man erhält 2,16 g 6-Amino-penicillansäure mit einer Reinheit von 96 %.

Nach zehnmaligem Wiederholen dieses Versuchs kann keine Abnahme in der Ausbeute der 6-Amino-penicillansäure festgestellt v/erden.

Beispiel lh

2 g Copolymerisat-Teilchen (Durchmesser etwa 100/u) , die 55 Teile Acrylnitril, 25 Teile Divinylbenzol und 20 Teile Vinyläthylbenzol enthalten und poröse Struktur haben, werden mit ^7 5?iger Salpetersäure/Schwefelsäure bei O⁰C 60 Minuten nitriert. Nach dem Waschen mit Wasser wird das Produkt mit einer Lösung von 6 % Natriumhydrogensulfit in 2n Natronlauge 2 Stunden bei 60⁰C reduziert. Das Produkt wird eingehend mit Wasser gewaschen. Man erhält

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- Ire -

5>5 g (Naßgewicht) Polyacrylnitril-Teilchen mit freien Aminogruppen und poröser Struktur.

90 mg (Naßgewicht) dieser Teilchen werden in einer Lösung von 12,5 % Glutaraldehyd/Boratpuffer (pH 8,5) 20 Minuten bei O⁰C gerührt, dann mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen und mit 3 ml einer Acylaselösung (84 U/ml) aus Bacillus megaterium B-400 (FERM-P 7^8) unter Rühren bei JO⁰C 60 Minuten lang vermischt. Das Produkt wird abfiltriert und mit 0,05m Natriumchlorid/O, Im Phosphatpuffer (pH 7,5), dann mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Man erhält ein erfindungsgemäßes im~ /mobilisiertes Acylasepräparat mit einer Aktivität von II8 U/g in Teilchenform, das in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Vorrichtungen eingesetzt werden kann.

Beispiel 15

a) Ein 500 ml fassender Dreihalskolben, der mit einem Rohr zur Einführung von Stickstoff, einem Rührer und einem Rückflußkühler versehen ist, taucht in ein thermostatisiertes Wasserbad von etwa ^0⁰C ein und wird 15 Minuten mit Stickstoff gespült. Eine Lösung von 1 Gramm Natriumalkylsulfonat in 120 ml destilliertem Wasser wird unter Rühren mit 70 g Acrylnitril und 10 g inhibitorfreiem Styrol versetzt. Die Emulsion wird dann mit 0,1 g Kaliumpersulfat versetzt und die Polymerisation 20 bis 22 Stunden durchgeführt. Die Emulsion, die Teilchen mit einem Durchmesser von 0,1 bis 1,0.u enthält, wird in 500 ml Wasser eingegossen und unter Rühren mit Natriumchlorid koaguliert.

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- Jr? -

Das Copolymerisat wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, dann werden nicht umgesetzte Monomere unter vermindertem Druck entfernt. Das Copolymerisat hat eine Viskositätszahl von 1,3 in Dimethylformamid.

10 g dieses Copolymerisats werden in 200 ml Dimethylformamid ge-

2Obigen löst und über eine Tropfvorrichtung in 50 Liter einer/wäßrigen Acetonlösung eingetropft. Man erhält wasserhaltige Teilchen mit poröser Struktur und einer Größe von 0,5 bis 1 mm.

b) In der unter a) beschriebenen Vorrichtung werden 300 ml destilliertes Wasser, das 2 g eines Alkylaryl-polyäthylenglykolesters als Netzmittel und 2 g Polyalkenylglykoläther als Netzmittel enthält, mit 0,2 g Kaliumpersulfat gerührt und mit 80 g Acrylnitril, aus dem die Inhibitoren entfernt worden sind, und 20 g destilliertem Methylacrylat versetzt. Die Polymerisation wird durch Erhitzen auf 40 bis 50°C durchgeführt. Nach 30 Minuten wird bei 90⁰C am Rückfluß erhitzt. Die entstandene Suspension wird 15 bis 20 Minuten lang mit Wasserdampf destilliert, um nicht umgesetzte Monomere zu entfernen. Das Pro-

wie unter a) angegeben
dukt wird / ausgesalzen und an der Luft getrocknet. Man erhält ein Acrylnitril-methylacrylat-Copolymerisat mit einer Viskositätszahl von 1,2 in Dimethylformamid.

10 g dieses Copolymerisats werden in 100 ml Dimethylsulfoxid gelöst und mit einer Tropfvorrichtung in 20 SSiges wäßriges Dimethylsulfoxid eingetropft. Man erhält Copolymerisatteilchen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1 mm in Form eines wasserhaltigen Gels mit poröser Struktur.

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c) Die Arbeitsweise gemäß a) wird wiederholt, mit dem Unterschied, daß anstelle von Styrol 10 g Divenylbenzol verwendet werden. Man erhält Acrylnitril-divinylbenzol-Copolymerisatteilchen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1 mm in Form eines wasserhaltigen Gels mit poröser Struktur.

Je 2 g der nach a) bis c) hergestellten Copolymerisatteilchen werden in einen Dreihalskolben zu einem gerührten Gemisch von 2,5 g Lithiumaluminiumhydrid in 100 ml trockenem Diäthyläther gegeben. Das Gemisch wird bei konstanter Temperatur von 50°C 16 Stunden am Rückfluß erhitzt. Dann wird das Produkt in einem Eisbad mit Wasser und In Salzsäure behandelt, schließlich nacheinander mit In Salzsäure, Wasser, In Natronlauge, Wasser und 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Man erhält Teilchen mit poröser Struktur, die freie Amino- und Nitrilgruppen enthalten.

300 mg (Naßgewicht) dieser Teilchen werden mit 50 ml einer eisgekühlten Lösung von 12,5 % Glutaraldehyd in Boratpuffer (pH 8,5) unter Rühren bei 0°C 20 Minuten lang behandelt. Die Teilchen werden abfiltriert und mit 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen, dann zu 3 ml einer Acylaselösung (72 U/ml) aus Bacillus megaterium B-400 (FERM-P 7^8) in einem Proberöhrchen in L-Form gegeben. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 30⁰C gerührt. Das Produkt wird abfiltriert, mit 0,5m Natriumchlorid/0,Im Phosphatpuffer (pH 7,5) und 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Man erhält erfindungsgemäße immobilisierte Acylasepräparate.

Entsprechend wird mit den nach Beispiel 2a) hergestellten Amino-

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Polyacrylnitril-Teilchen ein immobilisiertes Enzympräparat hergestellt .

Die Acylaseaktivität der verschiedenen Präparate, in denen das Enzym an die verschiedenen Copolymerisate gebunden ist, beträgt für das Copolymerisat gemäß Beispiel 15a) 162 U/g, für das Polymerisat gemäß Beispiel 15b) 216 U/g, für das Copolymerisat gemäß Beispiel 15c) 192 U/g und für das Polymerisat gemäß Beispiel 2a) 252 U/g.

Beispiel 16

1,5 g des gemäß Beispiel 2a) hergestellten Amino-Polyacrylnitrils mit poröser Struktur werden in 25 ml Aceton eingetaucht und mit 1 ml Triäthylamin, dann tropfenweise mit 12 ml einer Lösung von 1 g Bernsteinsäureanhydrid in Aceton im Verlauf von 5 Minuten versetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden weitergerührt, dann wird das Produkt abfiltriert, mit Wasser, In Salzsäure und wieder Wasser gewaschen und getrocknet. 1 g dieses Produkts wird in einem 50 ml-Erlenmeyer-Kolben mit 3 rnl Dioxan und 1 g N-Hydroxysuccinimid versetzt. Das Gemisch wird unter Eiskühlung gerührt und mit 2 ml Dioxan, das 1 g gelöstes N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid enthält, tropfenweise im Verlauf von 10 Minuten versetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei 10°C stehengelassen. Das Produkt wird abfiltriert und durch Dekantieren mit dem Zwanzigfachen seines Volumens an Dioxan gewaschen. Nach dem Entfernen der unlöslichen Feststoffe wird das Produkt mit Dioxan gev/aschen und unter vermindertem Druck getrocknet. 30 mg dieses aktive

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- gb -

Ester enthaltenden Produkts werden in 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) aufgequollen, dann abfiltriert und zu 5 ml einer Acylaselösung (7,2 U/ml) aus Bacillus megaterium B-^OO (FERM-P 748) gegeben. Das Gemisch wird bei pH 7,5 ^ Stunden in einem Eisbad gerührt. Das Produkt wird abfiltriert, mit Im Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen und 60 Minuten mit Im Glycin/0,lm Phosphatpuffer (pH 7,5) gerührt, um nicht umgesetzte aktive Estergruppen zu entfernen. Nach dem Abfiltrieren wird der Feststoff mit 0,5m Natriumchlorid/0,Im Phosphatpuffer (pH 7,5) und 0,1m Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Man erhält 8^0 mg (Naßgewicht) erfindungsgemäßes immobilisiertes Acylase-Präparat in Teilchenform mit einer Aktivität von 177,6 U/g.

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Claims

Patentansprüche

1. Immobilisiertes Proteinpräparat, ein biologisch aktives Protein enthaltend, das an ein wasserunlösliches Acrylnitrilpolymerisat mit freien Aminogruppen als Träger gebunden ist.

2. Proteinpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Acrylnitril-Polymerisat eine poröse Struktur hat.

3. Proteinpräparat nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Acrylnitril-Polymerisat Mikroporen mit einer

Durchschnittsgröße von 40 bis 9000 A enthält.

^. Proteinpräparat nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Acrylnitril-Polymerisat in Form von Fasern, Teilchen, Membranen oder Hohlfasern vorliegt.

5· Proteinpräparat nach Anspruch 1 bis ¹J, dadurch gekennzeichnet, daß das Acrylnitril-Polymerisat Aminogruppen in einer solchen Menge enthält, daß es in Wasser praktisch nicht löslich ist.

6. Proteinpräparat nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Acrylnitril-Polymerisat 20 bis 1000.uMol Aminogruppen je Gramm Polymerisat enthält.

7. Proteinpräpar ,it nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

- Γ- ο p 3 ~ / ^Λ- R 2 B ORIGIFiAL INSPECTED

aus
daß das Acrylnitril-Polymerisat nur/Acrylnitril-Monomeren oder

aus
auch/äthylenisch ungesättigten Comonomeren aufgebaut ist.

8. Proteinpräparat nach Anspruch 1 bis 7> dadurch gekenn-

Baustoine

zeichnet, daß der Träger als monomere/Acrylnitril, Methacrylnitril, o<-Ch]oracrylnitril und/oder Cinnamylnitril enthält.

9. Proteinpräparat nach Anspruch 1 bis 7 > dadurch gekennzeichnet, daß der Träger als comonomere Bausteine ein Styrol, einen Acrylsäureester, ein konjugiertes Dien, ein halogeniertes Olefin, einen Vinyläther, ein Vinylketon, einen Vinylester, ein Vinyl-

amid, ein basisches und/oder ein polyfunktionelles Monomeres enthält.

10. Proteinpräparat nach Anspruch 1 bis 7j dadurch gekennzeichnet, daß der Träger 90 % oder mehr Acrylnitril enthält.

11. Proteinpräparat nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Copolymerisat von Acrylnitril, Dinvinylbenzol und Vinyläthylbenzol ist.

12. Proteinpräparat nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch aktive Protein ein Enzym ist.

13· Proteinpräparat nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch aktive Protein an den Träger durch physikalische Adsorption und/oder kovalent gebunden ist.

14. Verfahren zur Herstellung des Proteinpräparats nach An-

^. 23QS671

spruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man ein biologisch aktives Protein in einem inerten Medium an ein wasserunlösliches Acrylnitril-Polymerisat mit freien Aminogruppen als Träger bindet

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Acrylnitril-Polymerisat mit freien Aminogruppen von poröser Struktur verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Acrylnitril-Polymerisat verwendet, das Mikroporen mit einer Durchschnittsgröße von 40 bis 9OOO A enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Acrylnitril-Polymerisat in Form von Fasern, Teilchen, Membranen oder Hohlfasern verwendet,

18. Verfahren nach Anspruch 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Acrylnitril-Polymerisat verwendet, das Aminogruppen in einer solchen Menge enthält, daß es in Wasser praktisch nicht löslich ist.

19. Verfahren nach Anspruch 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Acrylnitril-Polymerisat verwendet, das 20 bis 1000.uMol Aminogruppen je Gramm Polymerisat enthält.

20. Verfahren nach Anspruch 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Acrylnitril-Polymerisat verwendet, das entweder nur aus Acrylnitril-Monoinoren oder auch aus äthylenisch ungesättigten

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Comonomeren aufgebaut ist.

21. Verfahren nach Anspruch Ik bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Acrylnitril-Polymerisat verwendet, das Acrylnitril, Methacrylnitril, c*C -Chloracrylnitril und/oder Cinnamylnitril als monomere Bausteine enthält.

22. Verfahren nach Anspruch l'l bis 20, dadurch gekennzeichnet,

daß man ein Acrylnitril-Polymerisat verwendet, das als comonomere Bausteine
/ein Styrol, einen Acrylsäureester, ein konjugiertes Dien, ein halogeniertes Olefin, einen Vinyläther, ein Vinylketon, einen Vinylester, ein Vinylamid, ein basisches und/oder polyfunktionelles Monomeres enthält.

23. Verfahren nach Anspruch I^ bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Acrylnitril-Polymerisat verwendet, das 90 % oder mehr Acrylnitril enthält.

2¹I. Verfahren nach Anspruch 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Acrylnitril-Polymerisat verwendet, das Acrylnitril, Divinylbenzol und Vinyläthylbenzol als Bausteine enthält.

25· Verfahren nach Anspruch Ik bis 2k, dadurch gekennzeichnet, daß man als biologisch aktives Protein ein Enzym verwendet.

26. Verfahren nach Anspruch Ik bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein durch physikalische Adsorption oder kovalent an den Träger bindet.

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27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein unter Verwendung eines Vernetzungsmittels, eines Kondensationsmittels oder einer brückenbildenden Verbindung an den Träger bindet.

28. Verfahren nach Anspruch 26 und 27, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Glutaraldehyd, Crotonaldehyd, Acrolein, Hexamethylendiamin- diisocyanat, Hexamethylen-isothiocyanat, Toluoldiisocyanat, Xyloldiisocyanat, Adipinsäureimid-dimethylester, Korksäureimid-dimethylester, 3>3'~Dithiobis-propionsäureimid-dimethylester oder Bernsteinsäure-anhydrid verwendet.

29. Verfahren nach Anspruch 26 und 27> dadurch gekennzeichnet, daß man als Kondensationsmittel l-Sthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid verwendet.

30. Verfahren nach Anspruch 26 und 27 > dadurch gekennzeichnet, daß man als brückenbildende Verbindung ein Alkylendiamin verwendet.

31. Verfahren nach Anspruch 14 bis j50, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger vervicndet, der durch Hydrieren eines Ausgangs-Acrylnitrilpolymerisats in einem inerten Nichtlösungsmittel erhalten worden ist.

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32. Verfahren nach Anspruch jjl, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger verwendet, der mittels Lithiumaluminiumhydrid, vorzugsweise in Diäthyläther, Dioxan oder Tetrahydrofuran, erhalten worden ist.

33· Verfahren nach Anspruch JH ^un<3 32, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger verwendet, der während 10 Minuten bis 30 Stunden hydriert worden ist.

3^. Verwendung des immobilisierten Proteinpräparats nach Anspruch 1 bis 13 bei enzymatir.chen Reaktionen.

35· Ausführungsform nach Anspruch 3^ zur Isolierung von Reaktionsprodukten .

36. Ausführungsform nach Anspruch 3^ zur quantitativen Bestimmung des Substrats, insbesondere mittels elektrischer Änderungen, die durch die enzymatische Reaktion bedingt sind.

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