DE2912239C2 - Verfahren zur Herstellung eines Festphasenträgers für die Radioimmunoanalyse sowie dessen Verwendung in chromatographischen Säulen - Google Patents

Description

(a) Vermischen in der flüssigen Phase von

(i) mindestens einem Antiserum und

(ii) einem chromatographischen Gel, wobei ein proteingebundenes Gel erhalten wird, das selektiv eine oder mehrere der Komponenten, die in der Antigen-Antikörper-haltigen Lösung enthalten sind, binden kann und

(b) Gefriertrocknung des proteingebundenen Gels,

dadurch gekennzeichnet, daß das proteingebundene getrockneie Gel zu einem Pulver zerkleinert und zu einer Tablette umgeformt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tablette außer dem getrockneten proteingebundenen Gel Dicalciumphosphat und Magnesiumstearat enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tablette genügend proteingebundenes Gel enthält, um mindestens 0,400 Mikroliter einer Antigen-Antikörper-enthaltenden Lösung zu absorbieren.

4. Verwendung der gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 hergestellten Tabletten als Festphasenträger in chromatographischen Säulen bei einem Verfahren zur Radioimmunoanalyse, bei dem Proben und Reagenzien gemischt und vermittels Zentrifugalkraft auf chromatographische Säulen gegeben werden.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Festphasenträgers für die Radioimmunoanalyse gemä ß Oberbegriff des Anspruchs 1.

Die Einführung der Radioimmunoanalyse (RIA) im Jahre 1959 durch Yalow und Berson (Nature, 184, 1648, 1959) als eine diagnostische Indikatormethode (Tracer Technik s. Römpps Chemielexikon, 7. Auflage, S. 3637) zum Ersatz der damals verwendeten langsamen bioanalytischen Methoden hat infolge ihrer Spezifität und extremen Empfindlichkeit viele Gebiete der klinischen Prüfung und Forschung revolutioniert.

Die RIA-Technik basiert auf der Fähigkeit eines Antikörpers und eines spezifischen Antigens, einen reversiblen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden. Die Analyse wird durchgeführt, indem eine bestimmte Menge eines radiomarkierten Antigens zu Proben hinzugegeben wird, die Antiseium und bekannte Mengen eines »Standardw-Antigens enthalten. Während der Inkubation konkurrieren radiomarkiertes Antigen und nicht markiertes Antigen um eine begrenzte Zahl von Bindungsstellen an dem Antikörper. Nach der Inkubation wird das an den Antikörper gebundene Antigen vom freien Antigen abgetrennt und das Verhältnis des freien zum gebundenen kann in eine Dosis-Empfindlichkeitskurve eingetragen werden. Eine unbekannte Serumprobe kann dann nach dem gleichen Verfahren gemessen werden und die Konzentration des Antigens durch Vergleich mit der Standard-Dosis-Empfindlichkeits-Kurve bestimmt werden.

Häufig sind die klassischen RIA-Methoden mühsam, zeitraubend und enthalten Fehler verursachende Schritte, da sie vielfache Pipetüerungen und Teströhren, doppelte Analysen, verlängerte Inkubationszeiten und schwierige, ineffiziente Trennungsverfahren erfordern.

Verbesserungen der RIA sind in letzterer Zeit gerichtet worden auf die Festphasen-Radioimmunoanalyse (solid-phase radioimmunoassay, SPRIA) und die Automation. Zur Klarstellung innerhalb dieser Offenbarung bezieht sich SPRlA auf Verfahren, in denen Antiserum für ein spezifisches Antigen auf oder in einem wasserunlöslichen Träger, einem Immunosorbent oder einer Matrix immobilisiert wird, wobei es der Zweck der Immobilisierung ist, die Abtrennung des freien Antigens vom immobilisierten Antiserum-gebundenen Antigen zu erleichtern.

Wie schon angedeutet, ist eines der Gebiete, auf denen die Radioimmunoanalyse verbessert wird, die Verwendung von automatisierten analytischen Vorrichtungen. Solche Vorrichtungen sind derzeit nicht nur für die Radioimmunoanalyse gesucht, sondern auch für andere mikroanalytische Studien, beispielsweise bei solchen, die in der biochemischen Forschung, klinischen Routinetests, enzymatischen Studien und dergl. verwendet werden.

Mehrteilige analytische Vorrichtungen, die ein Zentrifugalfeld verwenden, sind kürzlich in der schnellen Mikroanalyse einer breiten Vielfalt von Flüssigkeiten, wie z. B. Körperflüssigkciten, z. B. Blutserum, Nahrungsmittelprodukten und dergl. verfügbar geworden. Ein Beispiel für ein solches Instrument, das für die automatische Radioimmunoanalyse entwickelt worden ist, wird in der US-PS 39 53 172 beschrieben. Das System der US-PS 39 53 172 bietet einige interessante Merkmale zur Durchführung von Immunoanalysen in gelöster Phase. Das System besteht aus

(a) einer automatisierten Pipettiervorrichtung, die die Proben und Reagenzien verteilt,

(b) dem Schlüsselbaustein, einem Inkubator/Separator, in dem Zentrifugalkräfte verwendet werden, um gleichzeitig mehrfache radioanalytische Inkubationen und Trennungen zu initiieren und zu beenden, und

(c) einem Gammazähler/Computer, der drei Röhrchen gleichzeitig zählt und die Zählungen in Konzentrationseinheiten umwandelt.

Auch die Anwendung des Systems ist in der US-PS 39 53 172 beschrieben. Wie in dieser Patentschrift gezeigt wird, verwendet das System Adsorptionssäulen, um die zu analysierenden Verbindungen zu trennen. Bisher war es eine übliche Praxis, Säulen in den Handel zu bringen, die bereits das geeignete Adsorbensmaterial enthielten und die ohne weitere Vorbereitung gebrauchsfertig waren. Während für die meisten Zwecke solche Säulen zufriedenstellend waren, so erfüllten sie doch nicht die optimalen Bedingungen für klinische diagnostische Verfahren. Wenn Absorptionssäulen in Vorrichtungen verwendet werden, die ein Zentrifugalfeld verwenden, müssen sie bestimmte Charakteristiken aufweisen, die bei den klassischen chromatographischen Verfahren, die lediglich auf Fließen durch Schwerkraft beruhen, gewöhnlich nicht erforderlich sind. Beispielsweise kann bei den in einem Zentrifugalfeld verwendeten Säulen ein Säulenbruch oder eine Verdichtung

infolge des Verlustes von Wasser in den Zwischenräumen auftreten. Weiterhin kann bei Säulen, die Tage oder Monate vor der Verwendung hergestellt wurden, ebenso Säulenbruch, Verdichtung und Wasserverlust während der Lagerung und der Beförderung auftreten.

Verfahren zur Herstellung eines Festphasenträgers für die Radioimmunoanalyse, der beim Kontakt mit einer Antigen-Antikörper-haltigen Lösung quillt und sich der Gestalt einer Säule anpassen kann, durch Vermischen in der flüssigen Phase von mindestens einem Antiserum und einem chromatographischen Gel, wobei ein proteingebundenes Gel erhalten wird, das selektiv eine oder mehrere der Komponenten, die in der Antigen-Antikörper-haltigen Lösung enthalten sind, binden kann und Gefriertrocknung des proteingebundenen Gels, sind aus der DE-AS 15 98 945 bekannt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Festphasenträgers für die Radioimmunoanalyse zu schaffen, der beim Kontakt mit einer Antigen-Antikörper-haltigen Lösung quillt und sich der Gestalt einer Säule anpassen kann, durch dessen Verwendung die Nachteile der bekannten Säulen vermieden werden können.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die im kennzeichnenden Teil des Hauptanspruchs enthaltenen Merkma-Ie.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Tabletten können leichter gehandhabt, gelagert, transportiert und verwendet werden als die bekannten feuchten, chromatographischen Säulen, die gegenwärtig in Verwendung sind. M Der Techniker bringt lediglich eine Tablette in jede Säule, und nach Kontakt mit der Antigen-Antikörperhaltigen Lösung quillt die Tablette und paßt sich der Säulenkonfiguration an.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Träger für Radioimmunoanalysen-Systeme können in Säulen verwendet werden, die in analytischen Systemen angewendet werden, die Zentrifugalkräfte für das Vermischen und Übertragen der Reaktanten verwenden. Die Träger in Form von 1 abletten können sicher gelagert werden bis sie gebrauchsfertig sind. Sie quellen in den Säulen und bilden gleichförmige Gelsubstrate.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann z. B. ein proteingebundenes Gel von modifizierter Agarose, deren Polysaccharidketten zu einem dreidimensionalen Netzwerk verknüpft sind, mit Kaninchen-Antikörper-Antiserum in Tablettenform hergestellt werden.

Es wurde gefunden, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Tabletten ideal für die Verwendung in den chromatographischen Säulen des Systems der US-PS 39 53 172 geeignet sind. Wie in den Beispielen gezeigt ist, können die Tabletten in vorbestimmten Größen und Fließkapazitäten hergestellt werden, die für die speziellen durchzuführenden Analysen geeignet sind, Tabletten von 80 mg Gewicht, die etwa 35 mg des getrockneten proteingebundenen Gels enthalten, sind beispielsweise für die Radioimmunoanalysenproben des thyroid-stimulierenden Hormons (TSH) geeignet. Im TSH-Test wird eine immunologische Reaktion verwendet, in der markierte und nicht markierte TSH-Moleküle um die Bindungsstellen auf einem spezifischen Antikörpermolekül konkurrieren. Das System der US-PS 39 53 172 verwendet Zentrifugalkräfte, um die verschiedenen Reagenzien gleichzeitig auf einer Spezialscheibe zu vermischen und nach der Inkubation das gebundene und freie Antigen durch die Säulen zu trennen, die einen zweiten Antikörper auf dem erfindungsgemäßen Fest phasenträger enthalten. Das bindende Mittel am Boden der Kolonne hat eine solche Porosität und Zusammensetzung, daß die gesamte in die Säule gebrachte Flüssigkeit durch Absorption an der Tablette in der Säule verbleibt Nur wenn die Zentrifugalkraft auf einen Wert gesteigert wird, der oberhalb des Wertes liegt, bei dem die Flüssigkeiten von der Scheibe übertragen werden, kommt Flüssigkeit aus der Säule heraus.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist insbesondere geeignet für die Herstellung von chromatographischen Trägern, die in der Doppel-Antikörper-Festphasen-Technologie verwendet werden. Es wurde festgestellt daß viele der bisher verwendeten Gele, wie sie z. B. als dreidimensional vernetzte Polysaccharide, die durch Quervernetzung der linearen Mikromoleküle von Dextran erhalten werden (Dextran-Gele), in den Handel gebracht werden, wachsende Schwierigkeiten mit sich bringen, wenn Moleküle mit großem Molekulargewicht angetroffen werden. Im Gegensatz hierzu ist es ein Vorteil der Doppel-Antikörper-Festphasentechnologie unter Verwendung der erfindungsgemäßen Träger, daß es bei der Anwendung dieser Technologie keine Grenze hinsichtlich der Größe des Antigens gibt. Dies gilt insbesondere für Träger, die aus Sepharose, das auf der Basis modifizierter Agarose erhalten wird, deren Polysaccharidketten zu einem dreidimensionalen Netzwerk verknüpft sind, hergestellt sind.

Obwohl die erfindungsgemäß hergestellten Tabletten besonders zur Verwendung in Systemen geeignet sind, die ein Zentrifugalfeld verwenden, sind sie selbstverständlich auch zur Verwendung in anderen Systemen geeignet, z. B. solchen, die durch Schwerkraft bedingtes Fließen anwenden.

Der in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendete Ausdruck »chromatographisches Gel« bedeutet die Matrix oder den Träger, der durch Adsorption von Flüssigkeit sich mehrfach ausdehnen kann und selektiv eine oder mehrere der Komponenten binden kann, die in einer Antigen-Antikörper-enthaltenden Lösung enthalten sind, während die anderen Komponenten aus dem Träger ausgewaschen werden können.

Wie bereits ausgeführt wurde, sind chromatographische Gele, die vernetztes Dextranprodukt umfassen, für das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet. In Abhängigkeit von den gewünschten Quell- und Retentionscharakteristiken können jedoch auch eine Vielzahl von anderen Materialien, wie z. B. dreidimensional vernetzte Polysaccharide, die durch Quervernetzung der linearen Mikromoleküle von Dextran erhalten werden (Dextran-Gele), mit einem Fraktionierbereich vom Molekulargewicht 1000—5000 oder als Anionenaustauscher mit einer totalen Kapazität von etwa 2,6—4,0 m val/g, oder Agarose, und dergl. angewandt werden.

Die folgenden Beispiele sind lediglich erläuternd:

Beispiel 1
Herstellung des Festphasenträgers

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines Festphasenträgers für die Doppel-Antikörper-Technik. Es wurde eine Standard-Laboratoriumsausrüstung und Glasapparatur, gespült mit 5 η NaOH, verwendet. In allen Fällen wurden Reagenzien von pharmazeutischer Reinheit verwendet.

(a)Pufferlösungen

Für ein Liter des Gels wurden bei der Trägerherstellung die folgenden Puffer verwendet. Ihre Zusammensetzungen waren wie folgt:

Puffer Zusammensetzung

hergestellte Menge

/3,5 Liter

/5 Liter

A MaHCO₃ 0,1 M, pH 8 4 Liter

33,6 g NaHCO₃Ai Liter

B NaHCO₃ 0,1 M, 5 Liter

NaCl 0,5 M, pH 8

42 g NaHCOj/5 Liter

146,25 g NaCl/5 Liter
C NaHCO₃ 0,1 M, C₂H₇NO 3,5 Liter

1 M, pH 9

29,4 g NaHCO₃ )

217 ml C₂H₇NO

16,2 M
-231 ml HC 32%

D CH₃COONa 0,1 M,
NaCl 1 M, pH 4
41 g CH₃COONa
292,3 g NaCl
-72CCmCHjCOON

E Natriumborat 0,1 M,
NaCl 1 M, pH 8
37,2 g H₃BO₃ )

350,7 g NaCl
-21 ecm NaOH 10 N
(12 g/30 ecm)

F Natriumphosphat 0,03 M, 4 Liter

NaN₃

0,02% pH 7,5 )

3,1SgNaH₂PO₄ ....

13,7OgNa₂HPO₄ ^{/4 Llter}

0,8 g NaN₃ J

G Gleicher Puffer + 0,2% BSA, 400 ml

5% Lactose, 1% Dextran TlO 400 ml Puffer F ]
+ 0,8 g BSA
+ 2Og Lactose
+ 4 g Dextran TlO

5 Liter

6 Liter

/6 Liter

400 ml

Die Carbonatpuffer wurden am Morgen des gleichen Tages hergestellt, während die anderen Puffer am vorhergehenden Tage hergestellt wurden.

(b) Gelherstellung

IO g Bromcyan (BrCN) wurden in 1 Liter destilliertem Wasser in einem 5 Liter-Becherglas gelöst und danach 1 Liter einer Suspension eines Gels auf Basis modifizierter Agarose, deren Polysaccharidketten zu einem dreidimensionalen Netzwerke verknüpft sind, Fraktionierbereich Molekulargewicht 6 · ΙΟ⁴ bis 20 · 10⁶ für Proteine, hinzugeben. Das Gelgefäß wird mit 1 Liter destilliertem Wasser gespült, das danach zur Mischung hinzugegeben wird. Danach wird der pH-Wert sofort auf 10,5 bis 11,5 eingestellt und etwa 5 Minuten in diesem Bereich gehalten, indem tropfenweise 5 η NaOH (etwa 10 ml) zugegeben werden. Die das Gel enthaltende Mischung wird sofort in einen 3-Liter-Büchner-Trichter (Porosität 3) gegossen und die Lösung unter Vakuum abgezogen. Das Gel wird dann mit 5 Liter destilliertem Wasser und danach 2,5 Liter Puffer A bei +4° C gewaschen.

(c) Bindung des Proteins an das Gel

Der »Kuchen« des Geis wird mit einem Spatel gewonnen und auf den Boden eines 5-Liter-Becherglases gebracht Der Büchner-Trichter wird mit Puffer B gespült und das Antikaninchen-Antikörpcr-Antiserum hinzugegeben (das Volumen hängt von der Qualität des Antiserums ab, beispielsweise Wellcome-Serum, 50 ml). Das Gesamtvolumen von Antiserum und Puffer B beträgt 500 ml. Dies ergibt 1 Volumen Gel + V₃ Volumen Protein zum Binden. Die Bindung wird durch 4stündiges Rühren mit einem Wischer bei Laboratoriumstemperatur bewirkt

Wenn die Bindung beendet ist, wird die Mischung in einem Büchner-Trichter filtriert. Eine Fraktion des Filtrats wird zur Kontrolle bei +4⁰C gehalten. Das Gel wird dann mit jeweils 1500 ml der Puffer A, B und C gewaschen. Für jeden Waschvorgang wird die Mischung 15 Minuten gerührt und die Flüssigkeit abgezogen, bevor der nächste Waschvorgang durchgeführt wird. Nach dem letzten Waschen wird der »Kuchen« des Gels auf den Boden eines 5-Liter-Becherglases überführt und der Büchner-Trichter mit 2 Liter Puffer C gewaschen, die in das Becherglas übergeführt werden und 1 Volumen Gel und V₂ Volumen Puffer C ergeben. Nachdem die Mischung noch 1 Stunde gerührt wird, wird die Mischung über Nacht stehengelassen. Nach dem Stehen über Nacht wird die Mischung 15 Minuten gerührt und die Suspension in den Büchner-Trichter gegossen und die Flüssigkeit abgezogen. Das Gel wird dann entsprechend der folgenden Reihenfolge gespült und gewaschen:

Das Gel wird 15 Minuten mit 1500 ml Puffer A gewaschen und die Flüssigkeit abgezogen. Waschen mit 1500 cm³ Puffer B.

15 Minuten Rühren

Abziehen der Flüssigkeit
1500 cm³ Puffer D

15 Minuten Rühren

Abziehen der Flüssigkeit
1500 cm³ Puffer E

15 Minuten Rühren

Abziehen der Flüssigkeit

Dieser Waschzyklus mit den Puffern D und E wird dreimal durchgeführt.
1500 cm³ Puffer E

15 Minuten Rühren

Abziehen der Flüssigkeit
1500 cm³ Puffer F

15 Minuten Rühren

Abziehen der Flüssigkeit.

Das Gel wird dann in einem
cm³ F'uffer G rekonstituiert.

1-Liter-Becherglas mit

(d) Lyophilisation

Das Gel wird in zwei Gefäße aus rostfreiem Stahl überführt und dann gefriergetrocknet. Danach wird das Ge! analysiert, um das Gewicht zu bestimmen, das erforderlich ist, um 400 μΐ der Inkubationslösung wiederzugewinnen. Dieses Gewicht wird dann kontrolliert, um sicherzustellen, daß es der maximalen Bindungskapazität entspricht.

(e) Tablettenherstellung

Nachdem die Lyophilisation des Gels vollendet ist, wird der Feststoff, falls erforderlich, pulverisiert, um ein homogenes Produkt zu erhalten. Das Produkt wird dann durch ein Sieb mit der Maschenweite 0,25 mm gesiebt. Dann werden beispielsweise 80 mg Tabletten formuliert, indem etwa 35 mg des gesiebten Produkts, etwa 44 mg Dicalciumphosphat und 1 mg Magnesiumstearat gemischt und auf einer Tablettiermaschine bei ι ο 4000 kg/cm² verpreßt werden.

Beispiel 2

Klinische menschliche Blutserumproben wurden analysiert, um den Gehalt an thyroid-stimulierendem Hormon (TSH) zu bestimmen, wobei das System der US-PS 39 53 172 verwendet wurde. Proben mit unbekanntem TSH-Gehalt und Standardlösungen mit bekanntem Gehalt wurden gleichzeitig hergestellt. Dazu wurden 20 Gefäßpositionen mit jeweils 250 Mikrolitern einer gesonderten klinischen Serumprobe und 16 Gefäßpositionen mit 250 Mikrolitern Standardlösungen gefüllt. Die verwendeten Standard-TSH-Lösungen enthielten jeweils 0,0 μ U/ml, 2,0 μ U/ml, 4,0 μ U/ml, 10 μ U/ml, 20 μ U/ml, 40 μ U/ml und 100 μ U/ml. Das 125 I TSH wurde mit ii ml destilliertem Wasser eingestellt und ergab etwa 20 000cpm pro 50 μΙ. Das TSH-Antiserum wurde mit 17 ml destilliertem Wasser eingestellt und der NSB-Puffer mit 3 ml destilliertem Wasser eingestellt.

Die Reagenzien und Proben (50 μ|) wurden automatisch in die entsprechenden Ausnehmungen der Transferscheibe pipettiert. Die Transferscheibe wird danach in das Inkubations-Separator-Bauteil gesetzt. Nach dem Vermischen der Reagenzien und Proben wurde die Mischung 24 oder 48 Stunden lang inkubiert Nach dieser Inkubation wurde der Säulenring mit Teströhrchen gefüllt und die Säulen in dem Inkubator-Separator-Bauteil mit hydrophoben Pfropfen versehen. In jede Säule wurde eine erfindungsgemäße Tablette gegeben. Die Mischung wurde unter Verwendung der Zentrifugalkraft auf die Säulen übertragen. Die Tabletten quellen und die feste Phase bindet die gesamten für TSH spezifischen Antikörper. Die feste Phase wird nach 10 Minuten einer zweiten Inkubation mit etwa 2,5 ml einer Pufferlösung (Phosphatpuffei-0,015 m, pH 7,5) gewaschen. Die Säulen werden danach im dritten Abschnitt des Systems der US-PS 39 53 172 gemessen und die Messung durch den Computer aufgezeichnet.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Festphasen trägers für die Radioimmunoanalyse, der beim Kontakt mit einer Antigen-A.uikörper-haitigen Lösung quillt und sich der Gestalt einer Säule anpassen kann, durch