DE2916736A1 - Verfahren zur gewinnung eines mikroorganismenstammes - Google Patents

Description

J. REITSTÖTTER

HROF. DR. DR. DIPL. ING.

PATENTANWÄLTE

W-. KINZEBAC

DR. PHIU DIPL. CHBM.

^916736

W. BUNTE (1958-1976) DR. ING.

K. P. HÖLLER

DR. RBR. NAT. DIPL. CHBM.

TELEFON: (ΟΒΘ) 37 OB 83 TELBXl G216208 ISAR D

BAUERSTRASSB 22, 8000 MÜNCHEN

München, 25. April 1979 M/20 112

GLAXO GROUP LIMITED Clarges House, 6-12 Clarges Street

London W1Y8DH / England

Verfahren zur Gewinnung.eines flikroorganismenStammes

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ORIGINAL INSPECTED

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinen. Sie betrifft insbesondere die Erzeugung der Fungus-Species Acremonium chrysogenum (früher als Cephalosporium acremonium bezeichnet), die für die Herstellung von Cephalosporinen verwendet werden kann.

Cephalosporin C wird kommerziell durch Kultivieren von A. chrysogenum und Extrahieren des Cephalosporins C aus dem Kulturmedium gewonnen. Obgleich andere Fungus-Spezies ebenfalls Cephalosporin C erzeugen können, sind sie für den vorliegenden Zweck nicht von kommerzieller Bedeutung. Weiterhin ist bekannt, daß auch andere Cephalosporine, wie Desacetyl- und Desacetoxy-Cephalosporin C durch Kultivieren von A.chrysogenum gewonnen werden können.

Es sind bereits erhebliche Anstrengungen unternommen worden, > um Stämme von A. chrysogenum, die hinsichtlich der Cephalospo- ι rinherstellung optimale Eigenschaften zeigen, zu selektieren. Die wichtigste Eigenschaft ist natürlich die Herstellung des : gewünschten Cephalosporins in hohen Ausbeuten. Jedoch sind auch, andere Eigenschaften eines Stammes, der für ein kommerzielles ι Verfahren verwendet wird, wünschenswert, wie z.B. gute Sporenbildung und eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit in Agaroberflächenkultur oder Submerskultür.

Die Selektion von wünschenswerten Stämmen aus natürlichen oder induzierten Mutanten ist ein langsames Verfahren. Ein Hauptgrund für die langsame Entwicklung solcher Arbeiten beruht auf der Wahrscheinl ichkeit,daß durch die Selektion bezüglich einer gewünschten Eigenschaft (wiez;B.die Herstellung von Cephalosporin in hohen Ausbeuten) eine andere gewünschte Eigenschaft (wie z.B hohe Wachstumsgeschwindigkeit) nachteilig beeinflußt wird. Somit wäre es äußerst wünschenswert, wenn man in der Lage wäre,

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verschiedene Stämme von A. chrysogenum zu kreuzen, um einen verbesserten Stamm zu erhalten, der die besten Eigenschaften der beiden Mutterstämme auf sich vereinigt.

Die Kreuzung verschiedener Stämme von A. chrysogenum ist äußerst schwierig. Diese Spezies hat hautpsächlich einkernige Hyphenkompartments und weist keinen Geschlechtszyklus auf. Es wurde behauptet (Nuesch et al, Gen. Ind. Microorg. (1973) U 309 bis 334), daß gelegentlich Heterokaryone in A. chrysogenum synthetisiert werden können durch gemischte Kulturen von ; keimenden Konidien und daß Abkömmlinge einer Kernverschmelzung entweder direkt oder vorzugsweise nach vorhergehender Selektion von Heterozygoten erhalten werden können. Dieses Verfahren ist erfahrungsgemäß jedoch sehr mühsam, unergiebig und unverläßlich, insbesondere dann, wenn man versucht, divergieren¹ de Stämme zu kreuzen. Obwohl dieses Verfahren von theoretischem: Interesse ist, stellt es keinen gangbaren Weg dar für die Er- > zeugung verbesserter Stämme von A.chrysogenum im Hinblick auf ; die kommerzielle Herstellung von Cephalosporinen.

Es wurde nun gefunden, daß verschiedene Stämme von A. chrysoge-_: num und selbst Stämme stark divergierender Natur erfolgreich j durch Protoplastverschmelzung gekreuzt werden können, um re- j kombinierte Segreganten (recombinant segregants) oder andere Kernverschmelzungsprodukte zu erzeugen.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Erzeugung eines verbesserten Stammes von A. chrysogenum, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Mutterstämme von A. chrysogenum der Protoplast- und Kernverschmelzung unterwirft und den verbesserten Stamm aus der Nachkommenschaft oder einem Mutanten davon selektiert.

Der Ausdruck "verbesserter Stamm" steht für einen Stamm, der verglichen mit den Mutterstämmen Verfahrensvorteile bei der

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Herstellung von Cephalosporinen aufweist. Beispiele solcher Verfahrensvorteile schließen eine verbesserte Sporenbildung, Wachstunisgeschwindigkeit oder Cephalosporingehalt, verbesserte Stabilität, verbesserte Wachstumsmerkmale auf verschiedenen Medien, erleichterte Extraktion etc. ein.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen verbessertem Stamm von A. chrysogenum, der durch Protoplast- und Kernverschmelzung von Mutterstämmen von A. chrysogenum und Selektion des verbesserten Stamms aus der Nachkommenschaft oder einem Mutanten davon, hergestellt worden ist, kultiviert und das gewünschte Cephalosporin oder ein Derivat desselben aus dem Kulturmedium isoliert.

Die Mutterstämme von A. chrysogenum, die zur Erzeugung des verbesserten Stammes dienen sollen, können so ausgewählt werden, 'daß sie gemeinsam in dem Kreuzungsprodukt gewünschte Eigenschaften erzeugen (d.h.- in den Kernverschmelzungsprodukten), wie z.B. hohe Ausbeute an Cephalosporin, gute Wachstumsgeschwindigkeit und gute Sporenbildung. Dies ist jedoch nicht so wesentlich und manchmal weist die Nachkommenschaft eine vor-J teilhafte Eigenschaft auf, die bei den Mutterstämmen nicht ge- j funden werden kann.

Es ist nicht notwendig, jedoch wünschenswert, die Mutterstämme in irgendeiner Weise zu behandeln, um die Selektion der Nachkommenschaft zu erleichtern. Beispielsweise können die Mutter- i stamme genetisch markiert werden wie z.B. mit auxotrophen Markie-r rungsmitteln. Die Verwendung von auxotrophen Markierungsmitteln j erleichtert die Selektion der Nachkommenschaft, da zur Verhütun<i des Wachstums der Mutterstämme Minimalmedien verwendet werden können. Andere verwendbare Markierungsmittel sind Farbe und Arzneimittel res istenz.

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Es ist wünschenswert, solche markierten Stämme zu verwenden, die keine Hfr-RUckmutation ("high frequency reverse mutation") der Markierungsmittel zeigen, so daß die aus den Kreuzungen erhaltenen Selektanten mit hoher Wahrscheinlichkeit als "nonrevertants" klassifiziert werden können. Weiterhin wird das Selektionsverfahren vereinfacht, wenn in jedem Mutterstamm mindestens zwei auxotrophe Markierungsmittel vorhanden sind. Dadurch fällt die Wachstumsgeschwindigkeit der Mutterstämme auf Minimalmedien auf praktisch Null und verringert darüber hinaus die Wahrscheinlichkeit eines signifikanten Wachstums der "revertants" auf Minimalmedien.

Die Markierungsmittel können auf herkömmliche Weise durch mutagene Chemikalien oder Bestrahlungen in die Mutterstämme eingeführt werden oder es können durch herkömmliche Verfahren markierte Stämme durch natürliche Mutationen erhalten werden.

Bei einem alternativen Verfahren werden die Mutterstämme vor der Protoplast- und Kernverschmelzung jeweils mit einem verschiedenen irreversiblen Stoffwechsel inhibitor behandelt. Dadurch zeigt jeder Mutterstamm verschiedene und komplementäre Aspekte seines inhibierten Stoffwechsels. Die so behandelten Mutterstämme können dann nach Entfernung des nicht umgesetzten Inhibitors der Protoplast- und Kernverschmelzung unterworfen werden. Durch die induzierten Stoffwechselinhibitionseffekte

sind nur solche Zellen wachstumsfähig, die aus der Verschmelzung der Mutterstämme stammen, wobei sich die nicht inhibierten Stoffwechsel aspekte der Elternstämme gegenseitig in dem Ausmaß ergänzen, daß ein überleben der Zelle gewährleistet ist. Diese Methode wird von W.E.Wright in Experimental Cell Research 112 (1978),395 bis 407 beschrieben.

Vor der Bildung der Protoplaste werden die Mutterstämme bis zu einer geeigneten Populationsgröße auf herkömmliche Weise,

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z.B. in Schüttelkolben kultiviert. Die Natur des Kulturmediums kann die Ausbeute an Protoplast beeinflussen, im allgemeinen wird jedoch für das Wachstum von A. chrysogenum ein herkömmliches verwendet. Ebenso wird die maximale Ausbeute an Protoplasten von dem Mycel der kultivierten Mutterstämme gegen Ende der exponentiellen Wachstumsphase erhalten. Das Mycel wird dann durch Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen und zur Entfernung des Kulturmediums gewaschen.

Es wurde festgestellt, daß die Ausbeute an Protoplasten wesentlich erhöht werden kann, wenn man das erhaltene Mycel mit einem Thiolsensitiser, einer Thiolverbindung, die die Protoplasterzeugung fördert, behandelt. Der bevorzugte Thiolsensitiser ist Dithi'othreit, vorzugsweise in Konzentrationen von 0,005 bis 0,1 Mol," beispielsweise etwa 0,01 Mol, und in einem pH-Bereich von 6 bis 8,5, beispielsweise etwa 7,3. Unter Verwendung von Dithiothreit (0,01 Mol), kann das Mycel beispielsweise 15 Minuten bis 3 Stunden bei 20 bis 40⁰C, vorzugsweise 1/2 bis 1 1/2 Stunden bei etwa 30⁰C und einem pH-Wert von 7,3 inkubiert werden. Andere Thiolsensitiser sind z.B. 2-Mercaptoäthanol, Cysteamin und Thioglykolat.

Das behandelte Mycel wird dann gewaschen und mit einer protoplastogenen Kombination von Enzymen behandelt. Eine Reihe geeigneter Enzymkombinationen sind im Handel erhältlich, wie z.b. Cytophaga-Enzym L^ (BDH, Poole) und Oxoporus-Cellulase (E.Merck, Darmstadt). Diese Präparate sind Undefinierte Mischungen, die verschiedene Enzyme wie z.B. ß-Glucanase, Chitinase, Protease und Lipase enthalten. Das Mycel wird mit dem Enzympräparat solange inkubiert, bis eine ausreichende Ausbeute an Protoplasten erhalten worden ist. Der pH-Wert, die Temperatur des Inkubationsmediums und die Inkubationszeit sollten entsprechend den Eigenschaften des verwendeten Systems ausgewählt werden, beispielsweise etwa pH 6,8, etwa 30⁰C und etwa 3 Stunden im Falle des Cytophaga-Enzyms L₁ . Typische Enzymkonzentrationeη liegen

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in dem Bereich 0,05 bis 20 mg/ml , beispielsweise ca.2 mg/ml für das Cytophaga-Enzym L, und 2 bis 40 mg/ml für Oxoporus-CeTlulase. Es ist ebenfalls wichtig zu beachten, daß der osmotische Druck des Mediums in einem solchen Bereich liegt, der die Stabilität der Protoplasten gewährleistet und der beispiel sweise einer 0,5 bis 1,0-molaren, vorzugsweise etwa 0,9-molaren Natriumchloridlösung äquivalent ist. Der osmotische Druck des Inkubationsmediums kann mit anorganischen Salzen eingestellt werden, beispielsweise mit Natriumchlorid oder mit Zucker oder Zuckeralkohol. Es ist vorteilhaft Magnesium zuzusetzen, beispiels- i

weise als Magnesiumsulfat in Konzentrationen von 0,005 bis i 0,1 Mol, vorzugsweise etwa 0,02 Hol. ·

Die folgenden Kriterien scheinen geeignet zu sein, um Protoplaste zu charakterisieren: osmotische Fragilitat; Verlust an Festigkeit, was zu einer sphärischen Form führt; und die Beobachtung, daß die Protoplaste durch eine Pore treten und die : leeren Zeil wände zurücklassen. :

Nach der Inkubation wird die Mischung der Protoplaste und das teilweise verdaute Mycel abgetrennt, beispielsweise durch Filtrieren durch ein Medium geeigneter Porengröße, wie z.B. durch eine Schicht Baumwolle oder durch mildes Zentrifugieren beispielsweise 5 Minuten bei 200 bis 300 g. Falls es sich als notwendig erweisen sollte, kann die Trennstufe wiederholt werden. Das Filtrat oder der Oberstand ist eine Suspension, die im wesentlichen aus Protoplasten und wenig Mycelfragmenten besteht. Die Protoplaste können gewaschen werden, indem man sie ein oder zweimal zentrifugiert, beispielsweise 5 Minuten bei 700 g und jeweils anschließend in einer osmotischen stabilisieren den Lösung suspendiert (beispielsweise 0,9-molare Natriumchloridlösung) und schließlich in der osmotisch stabilisierender Lösung wieder suspendiert.

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Anstelle der Verwendung des Mycels ist es auch möglich, die Protoplaste aus Konidisn oder Arthrosporen von A. chrysogenum unter Verwendung ähnlicher Methoden zu erzeugen.

Die Lebensfähigkeit der Protoplaste kann mit Hilfe des "plating out"-Verfahrens auf osmotisch stabilisiertem (beispielsweise mit 2 % Rohrzucker und 0,8 Mol Natriumchlorid) und nicht stabilisiertem Wachstumsmedium untersucht werden. Die Protoplaste sind osmotisch fragil und überleben nicht nach dem "plating out" von mit Wasser gewaschenen Suspensionen auf nicht stabilisierten Medien. Somit rührt jedes Wachstum auf diesen Medien von den Mycelfragmenten her, die j als Verunreinigung in den Protoplastpräparaten vorhanden sind. Auf stabilisiertem Medium ist ein hoher Anteil der Protoplaste , gewöhnlich lebensfähig und bildet schließlich Kolonien. Die Lebensfähigkeit der Protoplaste variiert zwischen etwa 5 und 80 %. Etwa 5 bis 20 % des Wachstums auf stabilisiertem Agar ist auf j die Mycelfragmente zurückzuführen. Da die Protoplaste osmotisch fragil sind, sollte in jeder Verfahrensstufe darauf geachtet werden, daß eine angemessene osmotische Pufferung des Mediums gewährleistet ist.

Die Protoplaste aus den Mutterstämmen werden dann gemischt. Um die Wahrscheinlichkeit für die gewünschte Verschmelzung zwischen den Protoplasten von zwei oder mehr Mutterstämmen zu maximieren, wird vorzugsweise eine angenähert gleiche Anzahl von lebensfähigen Protoplasten von jedem Stamm eingesetzt. Falls es gewünscht wird, kann die Mischung der Protoplaste aus einer Mischung der Mycelien aus den Mutterstämmen hergestellt werden, jedoch bringt dies im allgemeinen keinen Vorteil für dieses Verfahren.

Die Protoplaste werden in Gegenwart eines "Fusogens" (ein die Verschmelzung förderndes Mittel) verschmolzen. Obwohl die Verschmelzung teilweise spontan stattfindet, ist die Wahrschein-

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lichkeit für eine spontane Verschmelzung zu gering. Es gibt eine Reihe Reagentien mit fusogener Wirkung, jedoch werden Polyalkylenglykole, insbesondere Polyäthylenglykol, vorgezogen. Das Polyäthylenglykol hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von 1000 bis 8000, beispielsweise 6000. Das Glykol wird als Lösung in einem wäßrigen Puffer vorzugsweise in einer Konzentration von 20 bis 60 %, beispielsweise etwa 30 %, eingesetzt. ; Der pH-Wert liegt vorzugsweise in einem Bereich von 5 bis 10, z.B. ca. 7,5. Das Verfahren wird durch die Anwesenheit von Calcium-i ionen,- beispielsweise in Konzentrationen von 0,002 bis 1,0MoI₅ z.B. etwa 0,01 Mol , gefördert. Die Aggregation der Protoplaste erfolgt rasch und man läßt das Reagens etwa 1 Minute bis 2 Stunden, beispielsweise 5 bis 20 Minuten bei einer Inkubationstemperatur von 0 bis 30⁰C, beispielsweise 25°C, einwirken.

Das fusogene Reagens wird dann mit einer osmotisch stabilisierenden Lösung durch verdünnen entfernt und die Protoplaste (von denen einige verschmolzen sind) werden zentrifugiert und gewaschen. Die Waschflüssigkeit sollte im Hinblick auf die Protoplaste isotonisch sein, z.B. eine 0,9-molare Natriumchloridlösung.

Die Selektion des gewünschten Kernverschmelzungsprodukts kann mit einer im wesentlichen herkömmlichen Methode durchgeführt werden. Falls auxotrophe Mutterstämme eingesetzt worden sind, wird die Verschmelzungsmischung nach dem "plating out"-Verfahren auf osmotisch stabilisierte Minimalregenerationsmedien gebracht, die manchmal ergänzt sind, jedoch immer so ausgewählt sein müssen, daß nicht die Mutterstämme sondern nur bestimmte Kernverschmelzungsprodukte und irgendwelche gebildeten Heterokaryone wachsen können. Die Stämme der zuletzt genannten beiden Typen sind prototroph.Es wurde festgestellt, daß zwei allgemeine Typen von Prototrophen gewonnen wurden, nämlich stabile und instabile. Die stabilen

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Prototrophen sind bei äquivalenter "plating"-Dichte gekennzeichnet durch eine annähernd gleiche Zahl von Kolonien auf einem vollständigen Medium und auf einem Minimalmedium mit vorausgehender Subkultur auf einem vollständigen Medium. Diese Stämme sind rekombinierte Segreganten und können unter Verwendung herkömmlicher Methoden unbegrenzt vermehrt werden. Man darf erwarten, daß sie die von beiden Mutterstämmen abgeleiteten Eigenschaften aufweisen. Diese stabilen prototrophen rekombinierten Segreganten unterliegen nicht der Segregation bei Behandlung mit rekombinogenen Mitteln (Mittel, die die j Rekombination fördern) wie beispielsweise p-Fluorphenylalanin ! oder Gammastrahlen, d.h. sie zeigen im Hinblick auf die bei der Rekombinationsstufe verwendeten Markierungsmittel keine Änderung in der genetischen Konstitution.

Die instabilen Prototrophen zeigen nach der Reinigung durch Kultivierung auf Minimalmedien schließlich ein instabiles Ver- ' halten auf vollständigen Medien, was zur Bildung von Auxotrophen führt.

Neben der oben abgehandelten prototrophen Nachkommenschaft

kann das "plating" der Verschmelzungsmischung auf eine

Reihe von selektiven Regenerationsmedien manchmal dazu führen, ,

daß sämtliche in dem Rekombinationsverfahren eingesetzten Erbfaktoren, wie in Beispiel 1 beschrieben, wieder erhalten ! werden. Die Selektion eines verbesserten Stammes aus den ' durch die Kernverschmelzung erhaltenen Produkten kann in der ^! gleichen Weise wie ein herkömmliches Brutprogramm durchge- ! führt werden und wird in erster Linie von der besonderen Kombination von Eigenschaften, die die Nachkommenschaft haben soll, abhängen. Entsprechend der her-

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kömmlichen Praxis sollte eine große Anzahl von Kernverschmelzungsprodukten untersucht werden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, einen Stamm zu finden, der den Mutterstämmen in signifikanter Weise überlegen ist. Falls es wünschenswert erscheint, kann ein solcher Stamm einem Mutationsprogramm unterworfen werden mit dem Ziel, diesen Stamm weiter zu verbessern.

.Kernverschmelzungsprodukte, z.B. rekombinierte Segreganten, die Cephalosporin erzeugen und von der Species A. chrysogenum durch Protoplastverschmelzung erhalten werden, sind bislang nicht hergestellt worden und somit stellen derartige Organismen einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.

Der verbesserte Stamm kann für die Herstellung des gewünschten Cephalosporins auf bekannte und herkömmliche Weise kultiviert werden.

Somit kann der Stamm unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise in einer Submerskultur, unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff, kultiviert werden. Das verwendete Fermentations medium sollte eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine verdaubare Stickstoffquelle und, falls es wünschenswert erscheint, das Wachstum fördernde Substanzen und anorganische Salze enthalten.

Geeignete Kohlenstoffquellen sind z.B. Traubenzucker, Rohrzucker,Stärke, lösliche Stärke,.n-Paraffine, pflanzliche oder tierische öle, | Essigsäure, Methanol, Glycerin, Sorbit und Äthanol. j

Geeignete Stickstoffquellen sind z.B. natürliche Stickstoff-enthaitende Substanzen oder aus ihnen hergestellte Materialien, wie z.B. Fleischextrakte, Peptone, Kasein, MaismaischfTdssigkeit, Hefeextrakte, Sojabohnenmehl, Trypton, Baumwol1samenmehl und Weizenkleie. Stickstoff-enthaltende organische oder anorganische Verbindungen können ebenfalls verwendet werden, beispiels-

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weise Harnstoff, Nitrate und Ammoniumsalze, wie Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat.

Anorganische Salze, die in dem Fermentationsmedium verwendet werden können, sind z.B. Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate und Phosphate von Kalium, Magnesium und Calcium.

Das Wachstum fördernde Substanzen, die verwendet werden können, sind z.B. Cystein, Cystin, Thiosulfat, Methyloleat und insbesondere Methionin und ebenso Spurenelemente wie Eisen, Zink, j Kupfer und Mangan. ;

Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und Fermentationszeit, werden so ausgewählt, daß der eingesetzte Stamm maximale Mengen des gewünschten Cephalosporins erzeugen kann. Beispielsweise wird die Fermentation bei einer Temperatur zwischen 15 und 45°C, vorzugsweise etwa 25°C und bei einem pH-Wert von 4 bis 9, vorzugsweise etwa 6, und in einem Zeitraum von 1 bis 20 Tagen, vorzugsweise 4 bis 10 Tagen durchgeführt.

Die Abtrennung des gewünschten Cephalosporins von der Kultur- ! brühe kann bequem mit herkömmlichen Mitteln durchgeführt werden, z.B. durch Filtrieren der Kulturbrühe, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Filterhilfsstoffes, wie Diatomeenerde, durch Waschen der Zellen mit Wasser und durch Gewinnung des gewünsch-j ten Cephalosporins aus der Mischung des Filtrats und der Waschflüssigkeiten.

Die Kulturbrühe oder das Filtrat kann gegebenenfalls zu Beginn mit einer Säure, wie z.B. einer Mineralsäure, behandelt werden, um mäßig lösliche Salze und proteinhaltige Materialien aus der Nährlösung auszufällen oder jegliches anwesendes Penicillin N zu zerstören. Penicillin N kann auch durch Behandlung

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mit Penicillinase zerstört werden. Die Kulturbrühe oder das Filtrat können gegebenenfalls weiter gereinigt werden durch Lösungsmittelextraktion oder durch Ionenaustauschadsorption, um lipophile Verunreinigungen zu entfernen.

Zur Gewinnung des gewünschten Cephalosporins können herkömmliche Methoden verwendet werden, beispielsweise Absorptions-oder Adsorptionschromatographie oder Ausfallungsmethoden.

Absorbtions- oder Adsorbtionsmittel, die verwendet werden können, sind beispielsweise Aktivkohle, Ionenaustauschharze und nicht-ionische Adsorptionsharze. Die Eluierung des Cephalo- ' sporins kann insbesondere durch Verwendung von wäßrigen Lösungen erfolgen. Insbesonders bevorzugte Ionenaustauschharze sind schwach basische Anionenaustauscher, aus denen das , Cephalosporin mit beispielsweise gepufferten Ammonium-, Natriumoder Kaliumacetat eluiert werden kann. Stark basische Anionen- ' austauschharze, aus denen das Cephalosporin mit beispielsweise j 1-molarer Essigsäure eluiert werden kann, können ebenfalls j verwendet werden. Nicht-ionische Adsorptionsharze sind z.B. j mit Divinylbenzol vernetzte Styrol polymere mit großer Oberfläche^ wie z.B. Amberlite XAD-4. Das Cephalosporin kann mit einer wäßrigen alkoholischen oder ketonischen Lösung, wie z.B. einer wäßrigen Isopropanol-oder wäßrigen Acetonlösung euliert werden.

Das Cephalosporin kann aus den wäßrigen Lösungen beispielsweise unter Verwendung von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Ketonen, z.B. Aceton oder niedrigen Alkanolen, ausgefällt werden.

Das Cephalosporin kann ebenso aus konzentrierten wäßrigen Lösungen in Form eines Metallsalzes ausgefällt werden, wie z.B. als iAl kai imetall salz, iiTst>esondere als Natrium- oder Kaliumsalz.

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Es kann wünschenswert sein, das fermentierte Cephalosporin vor der Isolierung in ein Derivat zu überführen, beispielsweise durch Reaktion entweder der in Stellung 7 oder in Stellung 3 befindlichen Seitenketten. So kann die Amingruppe der in Stellung 7 befindlichen Seitenkette durch eine beispielsweise in den britischen Patentschriften 1 041 985, 1 302 015 oder 1 313 207 beschriebenen Gruppe substituiert werden, wie durch eine Arylgruppe (z.B. 2,4-Dinitrophenylgruppe), eine Acylgruppe, insbesondere ein niedere Alkanoylgruppe (z.B. Acetylgruppe), eine Haiogenniederalkanoylgruppe (z.B. Chloracetyl- oder Dichloracetylgruppe), eine Aroylgruppe (z.B. Benzoyl-, Chlorbenzoyl-,Nitrobenzoyl- oder Tosylgruppe), eine Niederalkoxycarbonylgruppe (z.B. tert.-Butoxycarbonylgruppe), eine Arylniederalkoxycarbonylgruppe (z.B. Benzyloxycarbonylgruppe) oder eine Diacylgruppe, wie z.B. die Phthaloylgruppe. Die in Stellung 7 befindliche Seitenkette kann ebenso beispielsweise nach dem Verfahren der britischen Patentschrift 1 272 769 in eine 4-Carboxybutanamidogruppe oder nach dem Verfahren der britischen Patentschrift 1 355 347 durch eine 5-Carboxy-5-(2,6-dimethyl-3 ,5-dicarbäthoxy -1,4-dihydropyrid-1-yl)-pentanamidogruppe in ein Dihydropyridinderivat überführt werden. Das Cephalosporin C kann durch Behandlung mit einer Esterase in das Desacetylcephalosporin C überführt werden, beispielsweise nach den Verfahren der britischen Patentschriften 1 080 904 oder 1 474 519.

Das Verfahren zur Abtrennung des Derivats des fermentierten Cephalosporins wird von der Natur des Produktes und der verwendeten Reaktion abhängig, aber es können im allgemeinen herkömmliche ^Methoden angewandt werden.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Die Beschreibung der Stämme von A. chrysogenum, die in den folgenden Beispielen verwendet wird, steht

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in Einklang mit der in "Cephalosporium-artige Schimmelpilze (Hyphomycetes)" von Walter Gams (BR.Deutschland) 1971, Seiten 109 bis 111 dargestellten Beschreibung.

Beispiel 1

Zwei von dem A. chrysogenum-Stamm M8650 (ATCC 14553) abgeleitete auxotrophe Mutanten wurden gekreuzt. Die Kreuzung war Rot Arg Leu (IMI 227144) χ Weiß Arg Met (IMI 227145). Die Abkürzungen Arg, Met und Leu zeigen einen Bedarf für Arginin, [ Methionin bzw. Leucin an. "Rot" bedeutet eine rote Mycel-

pigmentierung und "Weiß" bedeutet eine weiße Mycelpigmentierung, Die Arg-Mutanten waren nicht alle!isch.

Die beiden Mutterstämme wurden getrennt in Schüttelkoiben in einem wäßrigen Medium der folgenden Zusammensetzung kultiviert:

Rohrzucker	36 .g/l
L-Asparagin	7,5 g/l
KH2PO4	15 g/l
K2HPO4	21 g/l
Na2SO4	0,75g/1
Mg SO4-JH2O	0,18g/l
"Salzlösung"	1 ml /1
CaCl2	0,06g/l
natürlicher pH-Wert

Die "Salzlösung" enthielt:

Fe (NH₄)₂ (S0₄)₂-6H₂0 15 g/100 ml

Mn S0₄-4H₂0 3 g/100 ml

Zn SO₄-7H₂O 3 g/100 ml

Cu S0₄-5H₂0 0,8 g/100 ml

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Dieses Medium wurde in konischen 250 ml-Kolben in 40 ml aliquoten Teilen dispensiert. Nach 20-minütiger Aufbewahrung im Autoklaven bei 121°C wurde jedem Kolben 1 ml sterile Traubenzuckerlösung (10,8% Gew./Vol.) hinzugefügt.Die Kolben wurden dann mit einer den auxotrophen Bedarf der Mutterstämme deckenden Menge an Aminosäure bis zu einer Endkonzentration von 0,01 % aufgefüllt. Zusätzlich wurde jedem Kolben 2 ml einer sterilen wäßrigen Lösung der folgenden Zusammensetzung hinzugegeben:

Rohrzucker 25 g/l Kornmaischflüssigkeit 0,1 % (als Stickstoff) Ammoniumacetat 5,5 g/l

CaCO₃ 5 g/l

Vor der 20-minütigen Aufbewahrung im Autoklaven bei 121⁰C wurde der pH-Wert mit KOH auf 6,5 eingestellt. ^:

Jede Schüttelflasche wurde dann mit dem geeigneten Stamm geimpft, 48 Stunden für den weißen Stamm und 72 Stunden für den I roten Stamm inkubiert (25°C, 250 Upm) und zur Impfung eines zweiten Kolbens mit demselben Medium (40 ml) verwendet. Die ; Aberntung erfolgte nach 48 bzw. 72 Stunden und das Mycel wurde I durch Vakuumfiltration durch ein Papierfilter gewonnen. Das \ Mycel wurde zwei- oder dreimal mit destilliertem Wasser ge- i waschen, dann (Gesamtnaßgewicht 1 bis 2 g) in einer 0,01-molaren Dithiothreitlösung in einem auf pH 7,3 eingestellten Citrat/Phos«- phatpuffer (10 ml) wieder suspendiert und unter leichtem Schütteln 1 Stunde lang bei 30⁰C inkubiert.

Das mit Dithiothreit behandelte Mycel wurde anschließend mit j destilliertem Wasser gewaschen und in einer auf pH 6,8 eingestellten Pufferlösung (10 ml), die Cytophaga-Enzym Lj (20 mg, erhältlich von BDH), 0,8 Mol NaCl und 0,02 Mol MgSO₄ enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde unter leichtem Schütteln 3 Stunden lang bei 30⁰C inkubiert.

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inspected

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Die erhaltene Mischung von Protoplasten und teilweise verdautem Mycel wurde durch Baumwolle filtriert, · um das Mycel zu entfernen und das Filtrat wurde 5 Minuten lang bei 700 g zentrifugiert. Das tablettenförmige Produkt wurde zweimal mit isotonischer Salzlösung (0,9-molare Natriumchloridlösung) gewaschen und schließlich in isotonischer Salzlösung suspendiert.

Die Herstellung von Protoplasten wurde sichergestellt durch das Auftreten von kleinen sphärischen Zellen, die sich von den unverdauten Mycelfragmenten erheblich unterschieden. Die Lebensfähigkeit der Protoplasten konnte durch "plating out" auf osmotisch stabilisiertem (2 % Rohrzucker und 0,8 Mol pro Liter NaCl) und auf nicht stabilisiertem Herzinfusionsagar (Bacto Herzinfusionslösung (Difco) geliert mit Oxoidagar) bestimmt werden. Die Protoplaste waren osmotisch fragil und überlebten auf n'cht stabilisiertem Agar nicht. Die Lebensfähigkeit der Protoplaste betrug etwa 70 % und etwa 15 % des Wachstums, auf dem stabilisierten Agar war auf die Mycelfragmente zurückzuführen.

Protoplaste von jedem Mutterstamm (1 bis 2 χ 10 von jedem Auxotroph pro ml) wurden in isotonischer Salzlösung (5 ml) suspendiert, vermischt und 5 Minuten bei 700 g zentrifugiert. Das tablettenförmige Produkt wurde in einer 30 %-igen Lösung von Polyäthylenglykol (Molekulargewicht 6000) in einem auf pH 7,5 eingestellten Glycinpuffer (2 ml), der 0,01 Mol

Calciumchlorid enthielt und auf 30⁰C vorgewärmt worden war, suspendiert und 10 Minuten lang bei 30⁰C inkubiert. Nach der Verdünnung mit isotonischer Salzlösung (6 ml) wurde das Präparat 5 Minuten bei 700 g zentrifugiert, zweimal mit isotonischer Salzlösung gewaschen und schließlich in isotonischer Salzlösung suspendiert.

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Die Verschmelzungsmischung wurde zunächst nach dem "plating out"-Verfahren auf eine Reihe von osmotisch stabilisierten selektiven Regenerationsmedien, die in der Kopfzeile der folgenden Tabelle aufgeführt sind, aufgebracht. Sporen und Hyphenfragmente -wurden aus den Wachstumszentren der Regenerationsmedien entfernt und auf Minimalmedien und vollständige Medien "cjeplated". Wiederholtes aufeinanderfolgendes "plating" der erhaltenen Kolonien auf Minimalmedien und vollständigen Medien führte zu einer Reinigung der Nachkommenschaft und stellte einen Stabilitätstest dar. I

Das Mini ma!medi um (Czapek Dox Minimalagar) hatte folgende Zusammensetzung :

Czapek Pox

Rohrzucker 3 Gew.-%

NaNO₃ 0,2 Gew.-«

KH₂PO₄ 0,1 Gew.-«

MgS0₄'7H₂0 0,05 Gew.-«

KCl 0,05 Gew.-«

FeSO₄ 0,001 Gew.-« Agar (Oxoid Nr. 3) 2 Gew.-%

Vor der 20-minütigen Aufbewahrung im Autoklaven bei 121 °C wurde.der pH-Wert mit KOH auf 6,8 eingestellt.

Das vollständige Medium (Sabourauds-Agar) hatte folgende Zusammensetzung:

Maltose .4 Gew.-%

Pepton (Oxoid bact. neutralisiert) 1 Gew.-%

Malzextrakt (Oxoid) 2,4 Gew.-%

Agar (Oxoid Nr. 3) 2 Gew.-%

Vor der 20-minütigen Aufbewahrung im Autoklaven bei 121?C wurde

der pH-Wert mit NaOH auf 7,5 eingestellt.

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,INSPECTED^

Die aus dem vollständigen Medium erhaltenen und gereinigten Kolonien wurden dann wie die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Stämme hinsichtlich der Farbe und der Wachstumserfordernisse charakterisiert» Die Zahl solcher aus jedem einzelnen selektiven Medium erhaltenen Stämme ist in der Tabelle aufgeführt. Die Stämme schließen Prototrophe ein, die bei Behandlung mit p-Fluorphenylalanin oder durch Einwirkung von Gammastrahlen nicht der Segregation unterliegen. "MM" bedeutet Minimalmedium und "MM⁺" bedeutet osmotisch stabilisiertes Minimalmedium.

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TABELLE I

5'

«Ö j

*-1

cn

^* O

co

	selektives Regenerationsmedium	MM+	MM+ + Arginin	MM+ + Methionin	MM+ + Leucin	MM+ + Leucin + Methionin	Gesamt .
Stämme	1	1	1	8	7	18
Rot Arg Leu (Mutterstamm)		11	8		13	32
Weiß Arg Met (Mutterstamm)					2	2
Rot Leu Met					3	3
Weiß Leu Met					2	2
Rot Arg Met				1	4	5
Weiß Arg Leu	3	4	2	1		10
Rot Arg	1	7	13	2	3	26
Weiß Arg				5	3	8
Rot Leu				3	11	14
Weiß Leu		1			1	2
Rot Met		1	1	1	4	7
Weiß Met	3	1	1	1	2	8
Rot	18	6	12	8	15	59
Weiß
Rot Arg Leu Met				1	1	2
Weiß Arg Leu Met

ro ro

rv CiD

CO

GJ CD

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Die Wachstumsgeschwindigkeiten und die Sporenbildungseigenschaften der isolierten Nachkommenschaft wurden bestimmt.

Tabelle II zeigt einen Vergleich der Wachstumsgeschwindigkeiten der Mutterstämme und einer prototrophen Machkommenschaft, dem Stamm P.

Tabelle III zeigt einen Vergleich der Sporenbildungswerte der Mutterstämme und einer Weiß Arg Met-Nachkommenschaft, dem Stamm Q.

Der Stamm P zeigte sowohl auf einem festen Medium als auch in einer Submerskultür eine signifikant höhere Wachstumsgeschwindigkeit als beide Mutterstämme, während der Stamm Q einen signifikant höheren Sporenbildungsgrad als die beiden Mutterstämme ' zeigte.

ι TABELLE II ;

Eigenschaften	Mutterstamm Rot Arg Leu	Mutterstamm Weiß Arg Met	Prototrophe Nachkommen schaft Stamm P
Wach s turns geschwin digkeit auf festem Medium (mm/Std. auf Sabourauds- Agar)	0,031	0,063	0,083
Wachstum in Sub- merskultur (g Trockengewicht pro Liter nach 5 Tagen)	2,5	7,2	17,3

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TABELLE III

Eigenschaften

Mutte rs tamm Rot Arg Leu

Mutterstamm
Weiß Arg Met

Nachkommenschaft Stamm Q Weiß Arg Met

Sporenbildung (durchschnitt-Iiehe Zahl an Sporen pro Kolonie auf Sabourauds-Agar nach 3 Wochen bei 25°C)

OO¹

10'

Beispiel 2

I Zwei sehr divergierende Stämme von A. chrysogenum, Stämme A und ^j j B, · beide von A. chrysogenum ATCC 14553 abgeleitet, hatten die
j in Tabelle IV dargestellten Eigenschaften.

ι Mit Hilfe herkömmlicher Mutationsmethoden wurden in beide Stämme . ι auxotrophe Markierungsmittel eingeführt. Dann wurden Sporen ; 'von beiden Stämmen ferner UV-Strahlung ausgesetzt, so daß etwa * j 99 % der Sporen abgetötet wurden. Die überlebenden Sporen wurden j

dann hinsichtlich ihrer Wachstumserfordernisse untersucht und
i von jedem Stamm wurde ein Mutant selektiert, der geeignete ■ I Wachstumsbedarfmutationen zeigte, um so als auxotrophes Markie-' rungsmittel dienen zu können. Auf diese Weise wurde ein Mutant i : des Stammes A selektiert, der zusätzlich zu dem Nikotinamid-

bedarf einen Bedarf an Aneurin aufwies, dargestellt in Tabelle j ¹ IV, und ein Mutant des Stammes B selektiert, der einen Bedarf '

für sowohl Arginin als auch Aneurin zeigte.

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Analog dem Verfahren von Beispiel 1 wurden diese beiden markierten Stämme dann getrennt 48 Stunden lang kultiviert und aus dem Mycel von jedem Stamm wurden Protoplaste hergestellt. Anschließend wurden die Protoplaste der beiden Stämme gemischt und verschmolzen.

Die Verschmelzungsmischung wurde nach dem "plating out"-Verfahren auf osmotisch stabilisierte Minimalmedien gebracht. Die Sporen-und Hyphenfragmente wurden den Wachstumszentren entnommen und dann auf vollständige Medien "geplated"« Die· Minimal- und vollständigen Medien hatten die in Beispiel 1 ; angegebenen Zusammensetzungen. Die somit erhaltenen Kolonien wurden beispielsweise hinsichtlich ihrer Farbe, ihrem Wachstum und hinsichtlich ihrer Eigenschaft,Cephalosporin G zu erzeugen, charakterisiert.

Es wurde festgestellt, daß von etwa 600 Prototrophen oder Nikotinamid-bedürftigen Nachkömmlingen 35 einen größeren Cephalosporin C-Gehalt zeigten als die Mutterstämme, d.h. ; einen Überschuß von 100 Einheiten, wenn sie unter den gleichen \ Bedingungen kultiviert wurden. :

Ein Nachkömmling, Stamm R, hatte die in Tabelle IV angegebenen Eigenschaften. Der Stamm R zeigte einen signifikant höheren Cephalosporin C-Gehalt als beide Mutterstämme und wies eine Wachstumsgeschwindigkeit und einen Sporenbildungsgrad auf, der zwischen der Wachstumsgeschwindigkeit und dem Sporenbildungsgrad der beiden Mutterstämme lag.

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TABELLE IV

Eigenschaften	Mutterstämme	Stamm B	Nachkommenschafi
Wachstumserfordernisse	Stamm A	Keine	Stamm R
Mycelfarbe	Nikotinamid	Weiß	Nikotinamid
Möglichkeit zur Verwendung von Sulfat bei der Cepha- losporinsynthese	Rot	Nein	Weiß
Cephalosporin C-Erzeugung	Ja	30 Einheiten	Ja
Wachstumsgeschwindigkeit (mm/Std. auf Sabourauds- Agar)	mo Einheiten	0,083	210 Einheiten
Sporenbildung (durch schnittliche Anzahl von Sporen pro Kolonie auf Sabourauds-Agar nach 3 Wochen bei 25°C)	0,012	106	0,042
<103	105

Beispiel 3

Ein auxotropher Mutant, abgeleitet von dem A. chrysogenum-Stamm M8650 (ATCC 14553) wurde mit einem auxotrophen Mutanten, abgeleitet von dem Stamm C0728(IMI 237183),der seinerseits durch mehrere herkömmliche Mutationsschritte von dem Stamm M8650 abgeleitet war, gekreuzt. Die Kreuzung war Arg Met (M8650) χ Leu (C0728). Die Abkürzungen Arg, Met und Leu zeigen einen Bedarf für Arginin, Methionin bzw. Leucin an. Die beiden auxotrophen Mutterstämme sind unter den Aufnahmenummern IMI 227145 und

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IMI 237183 II hinterlegt worden.

j Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1 wurden diese beiden { markierten Stämme getrennt 48 Stunden lang kultiviert und

Protoplaste aus dem Mycel von jedem Stamm hergestellt. Die Protoplaste der beiden Stämme wurden dann gemischt und verschmolzen.

Die Verschmelzungsmischung wurde nach dem "plating out"-Verfahren auf osmotisch stabilisierte Minimalmedien aufgebracht. Sporen und Hyphenfragmente wurden den Wachstumszentren entnommen und dann auf Minimalmedien und vollständige Medien "geplated" ·, um die Stabilität der isolierten Produkte zu bestätigen. Die Minimal- bzw. vollständigen Medien hatten die in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzungen.

Die stabilen prototrophen rekombinierten Stämme, die aus dieser Kreuzung erhalten wurden und die Mutterstämme wurde getrennt wie folgt fermentiert Die Stämme wurden auf Sabourauds Agar (Zusammensetzung wie in Beispiel 1) 10 Tage lang bei 25°C kultiviert. Von diesen Kulturen abgeschabte Sporen und Hyphenfragmente wurden zur Impfung von SchUttelkolben, die ein Medium (16 ml) der folgenden Zusammensetzung enthielten, verwendet:

Maismaischflüssigkeit Ammoniumacetat Rohrzucker
Calciumcarbonat

0,1 % (als Stickstoff)

5,5 g/l

25 g/l

10 g/l

Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 6,5 eingestellt. Nach 20-minütiger Aufbewahrung im Autoklaven bei 121°C wurden die Schüttelkolben 48 Stunden inkubiert (25°C, 250 Upm). Ein Impfstoff von j

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0,5 ml wurde dann aus jedem Schütte!kolben entnommen und zur Impfung eines zweiten Schüttelkolbens, der ein Medium (9,5 ml) der folgenden Zusammensetzung enthielt, verwendet:

Kornmaischflüssigkeit 0,5 % (als Stickstoff)

Lactose 46 g/l Traubenzucker 2 g/l

Methionin 2,3 g/l Phenylacetyläthanolamin 1,5 g/l

Calciumcarbonat 16 g/l Harnstoff 0,8 g/l

Ammoniumsulfat 3,4 g/l Maisöl 6 Tropfen pro Kolben

Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 6,6 eingestellt. Nach 20-minütiger Aufbewahrung im Autoklaven bei 121⁰C wurden die Schüttelkolben 120 Stunden inkubiert (25⁰C, 250 Upm).

Die insbesonders verbesserte Eigenschaft der isolierten rekombinierten Stämme war ein erhöhter Gehalt an Desacetylcephalosporin C, der chemisch ermittelt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle V dargestellt. · '

TABELLE V

Chemische Untersuchung (ug/mi)

Stamm Desacty!cephalosporin

M8650 C0728 rekombinierter Stamm 1 rekombinierter Stamm 2 rekombinierter Stamm 3

71 O/V.

Claims (1)

1. Verfahren zur Erzeugung eines Stammes von Acremonium
   chrysogenum, dadurch gekennzeichnet, da3 man Mutterstämme
   von Acremonium chrysogenum der Protoplast- und Kernverschmelzung unterwirft und den gewünschten Stamm aus der
   Nachkommenschaft oder einem Mutanten davon selektiert.

   Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
   Mutterstämme behandelt worden sind, um die Selektion der
   Nachkommenschaft zu erleichtern.

   Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Mutterstämme vor der Protoplast- und Kernverschmelzung
   mit auxotrophen Markierungsmitteln genetisch markiert wird.

   Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Mutterstamm mit mindestens zwei auxotrophen Markierungsmitteln genetisch markiert wird.

   Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Mutterstamm vor der Protoplast- und Kernverschmelzung durch
   Farbe oder Arzneimittelresistenz genetisch markiert wird.

   Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die \

   Mutterstämme vor der Protoplast- und Kernverschmelzung je- ^! weils mit einem verschiedenen irreversiblen Stoffwechsel-

   inhibitor behandelt werden, um verschiedene und komplemen- .

   täre Stoffwechselinhibitionswirkungen zu erzielen. \

   S098A5/083 7 :

   M/20 112 /&

   7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Mycelien, Arthrosporen oder Konidien der Mutterstämme zur Förderung der Protoplasterzeugung mit einem Thiolsensitiser behandelt werden.

   8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Thiolsensitiser Dithiothreit verwendet wird.

   9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Protoplastverschmelzung in Gegenwart eines | Polyäthylenglykols mit einem Molekulargewicht von etwa

   1000 bis 8000 durchgeführt wird.

   10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Protoplastverschmelzung in Gegenwart von Calciumionen in einer Konzentration von 0,002 bis 1,0 Mol durchgeführt wird.

   11. Stamm von Acremonium chrysogenum, dadurch gekennzeichnet, j

   daß er durch Protoplast- und Kernverschmelzung von Mutter- ; stammen von Acremonium chrysogenum und Selektion dieses Stammes aus der Nachkommenschaft oder einem Mutanten davon j erzeugt worden ist.

   12. Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Acremonium chrysogenum nach Anspruch 11 kultiviert und das gewünschte Cephalosporin oder ein Derivat davon aus dem Kulturmedium isoliert.

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