DE2934190A1

DE2934190A1 - Verfahren und vorrichtung zur molekuelspektroskopie, insbesondere zur bestimmung von stoffwechselprodukten

Info

Publication number: DE2934190A1
Application number: DE19792934190
Authority: DE
Inventors: Holger Dr. 8551 Adelsdorf Brauner; Gerhard Prof. Dr. 7080 Aalen Müller
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1979-08-23
Filing date: 1979-08-23
Publication date: 1981-03-19
Also published as: JPS56501174A; US4427889A; WO1981000622A1; EP0034156A1; EP0034156B1; DE3069635D1

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Molekülspektroskopie, insbesondere zur Bestimmung von Stoffwechselprodukten, bei dem die Absorption von Infrarotstrahlung durch eine Probe, welche eine zu bestimmende Substanz enthält, gemessen wird.

Außerdem betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens mit einer Infrarotstrahlungebündel erz eugungs einri chtung und einer Infrarotstrahlungsdetek toreinrichtung sowie mit einem Probenträger für eine Probe, welche eine zu bestimmende Substanz enthält und mittels des Probenträgers im Infrarotstrahlengang zwischen der Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung und der Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung positionierbar ist.

Das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung sollen insbesondere für die Glucosebestimmung dienen, denn die Glucosebestimmung im Vollblut oder Serum oder auch im Harn ist von außerordentlicher Bedeutung für die Erkennung und die Therapiekontrolle der Diabetes mellitus. Und zwar handelt es sich hierbei vor allem um die Bestimmung der Glucosekonzentration im Blut, weil diese sehr wichtig für die Therapie, die Therapiekontrolle, die Einstellung des Jeweiligen Tagesprofils etc. ist und nicht durch den Gebrauch von Teststreifen ersetzt werden kann, die in den Harn eingetaucht werden und hauptsächlich nur zur Feststellung der Diabetes mellitus dienen, wenn sie auch daneben bei einem gut eingestellten Diabetiker, der regelmäßige Urinuntersuchungen durchführt, dazu führen, daß er mit wenigen Stichproben der Ermittlung des Blutglucosegehalts auskommen kann. Zur Bestimmung der Glucosekonzentratlon im Blut ist es bisher immer noch erforderlich, eine Blutprobe abzunehmen, da implantierbare Glucosesensoren bisher praktisch nicht verfügbar sind.

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Die bekannten Verfahren zur Glucosebestimmung lassen sich in drei Gruppen einteilen, nämlich in biochemische, elektrochemische und spektroskopische Verfahren. Von diesen Verfahren sind die biochemischen Verfahren nur als Laborverfahren geeignet; die elektrochemischen Verfahren bieten zwar derzeit die aussichtsreichsten Ansatzpunkte für die Entwicklung von implantierbaren Glucosesensoren, sind aber in ihrer Genauigkeit und SpezifitMt ebenso wie die biochemischen Verfahren den spektroskopischen Verfahren unterlegen, die in ihren bekannten Ausführungsformen aber bisher noch nicht das Stadium experimenteller Voruntersuchungen überschritten haben.

Daneben gibt es noch einige unspezifische Verfahren, die praktisch nicht mehr in Gebrauch sind. So ist beispielsweise aus der DE-OS 2 724 543 ein Verfahren zur Bestimmung von Glucose auf der Grundlage der seit langem bekannten, aber wegen nicht hinreichender Spezifität nur noch selten angewandten Polarimetrie bekannt, welches allenfalls unter günstigen Umständen zur Zuckerbestimmung im Harn geeignet ist. Die in dieser Druckschrift erwähnten Wellenlängen'zur Glucosebestimmung, die bei 2,8, 4,8 und 6,1 aj liegen, sind identisch mit den Hauptabsorptionsbanden von Wasser und haben mit den der Glucose eigenen Absorptionsbanden nicht das geringste zu tun. Das zeigt u.a. die Schwierigkeiten, die einer Glucosebestimmung in wäßriger Lösung im Infraroten entgegenstehen. Entgegen den Ausführungen in dieser Druckschrift ist es nach dem darin beschriebenen Verfahren tatsachlich nicht möglich, die Glucosekonzentration im Blut transcutan zu messen.

Unter den biochemischen Verfahren werden gegenwärtig die Glucoseoxidase (Hugget, A. St. G., D. A. Nixon: Lancet 2 (1957), 368), das Enzympaar Hexok"inase/G-6-P-DH (Slein, M. W,_f G.T. Cori, CF. Cori: J. Biol. Chem. 186 (1950), 763) und die Glucosedehydrogenase (Banauch, D.: Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. 13 (1975), 101) zur klinischen Glucosebe-

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eingesetzt.. Daneben sr>ie_~ noch das c-1c.,:;c:.' Verfahren (Hyvärineri, S. , E.A. Kikkiia: Clir.. Cnt-ir,.- Ar--: (19fc2), ^AO) eine gewissen Rolle; es ist jedoch kein er.-ymatische? Verfahren und hat infolgedessen eine geringere Soezifitat. Die Verfahren zur Bestimmung von Glucose ir biologischem Material, die auf dem Einsatz der erwähnte:. Enzyme basieren, sind in vielen Varianten beschrieben vorden; die meisten Lehr- und Handbücher geben eine Aufv?.:.! davon wieder.

Die Bestimmung des Glucosegehalts über die Giucoseoxicxr·: (GOD) ist nicht nur ein biochemisches Verfahren, sonder. sie findet auch bei elektrochemischen Verfahren Armine .η·-. Bei der Glucoseoxidase stehen a-D-Glucose und ß-D-GIuc "■£·' über die offene Aldehydfora im Gleichgewicht- GOD clehv riert S-D-Glucose. Das in der GOD enthaltene FAD (Flavin-Adenin-Dinucleotid) wird zunächst zum FADHo reduzier";;, kehrt aber durch die Reduktion von Luftsauerstoff zu Wasserstoffperoxid wieder zur; oxidierten Zustand zurück. L ntden Einfluß von Peroxidase (POD) oxidiert H-O₉ schließ.", ic·. o-Dianisidin oder ähnliche Verbindungen zu Farbstoffen, welche sich im Photometer messen lassen.

In ihren ursprünglichen Konseptionen waren die enζymatischen Verfahren durch Probenvorbereitung und Cherr.ikalitnhandhabung umständlich und mit Durchführungszeiten von .'.0 bis 30 Minuten sehr langsam. Der Trend bei der biochemischen Glucosemessung besteht daher in der Entwicklung von schnellen und einfachen, aber dabei genauen Bestimmungsver fahren. Ein beachtenswertes Verfahren ist in diesem Zusammenhang die Kurzzeitmessung der Reaktionskinetik (Kelltr, H., U. Faust, J. Becker: Chem. Rundschau 26 (1973), 2U), die über die Glucosedehydrogenase arbeitet und mit einer Meßzeit von 15 see sehr schnell ist. Die Tendenz zur Vereinfachung läßt sich am besten durch die ständige Genauigkeitserhöhung der Teststreifenmethoden (Burgi, W., W. Hohenwallner, R. Sommer, D. Banauch: D.M.W. 103 (1978), *c5: charakterisieren.

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Allen diesen bisher bekannten biochemischen Verfahren rcmeinsarr. ist die Notwendigkeit der Probeentnahme, ein Verbrauch en Chemikalien und die Undurchführbarkeit kontinuierlicher Messungen.

Die elektrochemischen Verfahren stellen eine bedeutende Erweiterung der klassischen Methoden dar und scheinen bisher die einzige Möglichkeit zu sein, zu realisierbaren, implantierbaren Glucosesensorsystemen zu gelangen. Neben einer: rein elektrochemischen Meßprinzip der Glucosebrennstofizelle (Gebhardt, U., G. Luft, G. Richter, F.v.Sturm: Bioired. Technik 22 (1977) 399 und Rao, J.R., G.J. Richter, G. Luft, F.v.Sturm: Biomat., Med. Dev. Artif. Org. 6 (2) (1978), 127) benötigen die anderen Verfahren zur elektrochemischen Auswertung eine enzymatische Hilfsreaktion. In die letzte Gruppe gehört der bekannte Beckman Glucose Analysator (Kadish, H.A., J.C. Sternberg: Diabetes 18 (1969) 467). Der bei der Oxidation der Glucose in Gegenwart von Glucoseoxidase verbrauchte Sauerstoff wird mittels eines polarographischen Sauerstoffsensors gemessen. Das differenzierte Meßsignal gibt dann die Sauerstoffabnahmegeschwindigkeit an und ist der Glucosekonzentration der Probe direkt proportional. Die kinetische Sauerstoffmessung bleibt ungestört durch übliche Antigerinnungsmittel, auch der beim normalen GOD-Verfahren verfälschende Katalyseeffekt hat keinen Einfluß. Das Meßergebnis steht nach 10 see zur Verfügung; die Probenvorbereitung beschränkt sich auf das Zentrifugieren der Blutprobe. Kontinuierliche Messungen sind demnach mit diesem Verfahren nicht möglich.

Für kontinuierliche Messungen auf elektrochemischem Wege hat sich der Biostator (Warenzeichen der Miles Laboratores, Ekhart, Indiana) (Clarke, W.L., J.V. Santiago: Artifical Organs 1 (2) (1977), 78) bewährt. Der Biostator benutzt ebenfalls GOD als Hilfsreagenz. Das Enzym befindet sich immobilisiert in Acrylamid zwischen Polycarbonatmembranen. Ausgewertet wird die HpO„-Bildung, die zu einem proportionalen Strom an einer polarisierten Silber-Platin-Elektrode

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führt., ir. Kombination ir.it einer Mehrkanaliriiusior.sr-urr.r· und einerr. online-Rechner stellt dann ein rolcner iv.-r.e: praktisch einen externen künstlichen Pankree.: dar. Venire ■ Blut wird Kit 2 ml/h stetig den Patienten entnommer., n.:^J Antikoagulantien versehen, verdünnt und dem Gluccseser.^ : zugeführt. Der nach 60 see zur Verfügung stehende KeSv-wird irr- Rechner zu dem physiologisch richtigen Infusicr.rsiemal für die Insulinpumpe verarbeitet. Die Membran bleibt bis zu 140 h stabil und laß" sich bei Bedarf lei:;,· auswechseln. Das bedeutet, daß auch dieses System somit r:: Zeit für die Implantation noch nicht geeignet ist.

Die allgemein anerkannte Schwierigkeit bei glucosegesteiK τι en Systemen besteht darin, daß die FunktionsfähipJceit der Glucosesensors über längere Zeiträume hxnweg bisher nie.·". gewährleistet werden kann. Erfolgversprechende Ansätze f^J-- ■ len die Glucosebrennstoffzelle (Chang, K.W. , S. Aisenberr. J. S. Soeldner, J.Vi. Hiebert: Trans. Am er. Soc Artif. Int. Organs 19 (1973), 352) und die Enzymelektrode (Updike, S.J. G.P. Hicks: Nature 214 (1967), 686) dar:

In der Glucosebrennstoffzelle wird die anodische Oxida-jcr.· von Glucose zu Gluconsäure an einer platinierten Platin-Elektrode zur Messung benutzt, wobei der Diffusionsrrenr:- strom ein Maß für die vorhandene Glucosekonzentration ist. Als Kathodenreaktion läuft die Reduktion des Sauerstoffi. ab Mit einer Hilfsanode wird die elektrokatalytische Aktivität von Anode und Kathode durch Potentialsprungtechnik regeneriert. Die Kachteile dieses Verfahrens liegen in der mangelnden Spezifität des Anodenmaterials, so daß andere oxidierbare Substanzen, z.B. Proteine, Aminosäuren, Harnstoff, Kreatinin etc. zu einer nicht interpretierbaren anodischen Teilstromdichte führen.

Demgegenüber weist die Enzymelektrode eine hohe Spezifität auf. Ähnlich wie beim oben erwähnten Glucose Analysator (Radish, H.A., J.C. Sternberg: Diabetes 18 (1969), ^67) wird hier die Abnahme der Sauerstoffkonzentration ausgewertet. Die GOD befindet sich in der Membranschicht einer

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CLARK-Elektrode (Clark, L.C. Jr.: Trans. Amer. Soc. Artif. Int. Organs 2 (1956), 41), die über den Diffusionsgrenzstrom die Sauerstoffkonzentration bestimmt. Eine weitere CLARK-Elektrode ir> unmittelbarer Nähe mißt den ursprünglichen Sauerstoffgehalt. Die Differenz der beiden Op-Konzentrationen entspricht dem gesuchten Glucosegehalt. Die Probleme bei der Enzymelektrode liegen in der Stabilerhaltung und der Fixierung des Enzyms im biologischen Milieu.

Mit beiden zuletzt beschriebenen Meßanordnungen, nämlich mit der Glucosebrennstoffzelle und der Enzymelektrode, sind in vitro Messungen möglich; die Enzymelektrode wurde auch in Zitrablut untersucht (Bessman, S.P., R.D. Schultz: Trans. Amer. Soc. Artif. Int. Organs 19 (1973) 361), für die GIucosebrennstoffzelle liegen Erfahrungen über eine Implantationsdauer von 117 Tagen im Gewebe vor (Chang, K.W., S. Aisenberg, J.3. Soeldner, J.M. Hiebert: Trans. Amer. Soc. Artif. Int. Organs 19 (1973), 352). Keines der Systeme ist bisher für die Implantation im Blutstrom geeignet; dies ist einerseits bedingt durch die immer noch zu großen Abmessungen, andererseits wurden die Probleme, die der Kontakt Blut/ Implantat mit sich bringt, noch nicht ausreichend gelöst. So bedingen beide Systeme Membranen, um unerwünschte Reaktionspartner fernzuhalten. Im Blutkontakt können Eiweißablagerungen die ungestörte Diffusion der Reaktanten behindern; stellt sich bei der Ablagerung kein stabiles Gleichgewicht ein, ist eine Auswertung der aktuellen Glucosekon- ~entration nicht mehr möglich. Daher ist derzeit die Anwendung dieser Verfahren noch auf extracorporale nur am Krankenbett verwendbare Systeme beschränkt (Clarke, W.L., J.V. Santiago: Artifical Organs 1 (2) (1977), 78).

Weitere Möglichkeiten zur Glucosebestimmungen im Labor oder im Krankenbett stellen die verschiedenen spektroskopischen '/erfahren dar. Im Gegensatz zu den bisher angeführten biochemischen und elektrochemischen Verfahren, bei denen der ilucosenachweis nur indirekt über die Reaktionsprodukte er- :":L^t, wird beim spektroskotsischen Wachweis das Glucosemo-Le.<ül nicht verändert.

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Eine erste Möglichkeit stellt die Laser-Raman-Spektroskopie dar (Albrecht, H.: "Untersuchungen zur Anwendung der Raman Spektroskopie in der Medizin" Dissertation, D29 Erlangen (1976). Bei der Raman-Spektroskopie (Brandmüller, J., M. Moser: Einführung in die Raman-Spektroskopie, Darmstadt; Steinkopf Verlag (1962) wird die Tatsache ausgenutzt, da3

bei Durchstrahlung einer Probe mit monochromatischem Licht der Frequenz V neben der normalen Absorption auch eine Streuung des eingestrahlten Lichtes auftritt. Die Frequenz der Erregerstrahlung liegt dabei im sichtbaren Spektralbereich, Im Spektrum des Streuli-htes beobachtet man dann neben einer sehr intensiven Linie mit der Erregerfrequen;: •Λ'' (Rayleigh-Linie) auch noch frequenzverschobene, sehr intensitätsschwache Linien mit den Frequenzen Y - -κ; (Rar-"η-Linien); aus Intensitätsgründen wird normalerweise nur c^r "rot"-verschobene Teil {T~-y) oder die Stokes-Linien '/er-.-Hessen. Die -y sind dabei die Schwingungs- und/oder Rotations-Frequenzen der betreffenden Molekülsorte,an der die Streuung stattfindet, Das heißt, bei dieser unelastischer, Lichtstreuung (Raman-Effekt) nimmt das ,jeweilige Molekül Energie aus dem Strahlungsfeld auf oder gibt sie an dieses ab. Sine gewisse Sonderstellung nimmt der Fall ein, bei dem de Frequenz der Erregerstrahlung mit einer Absorotionsstelle des Moleküls zusammenfällt; dann tritt Resonanzverstärkung der Raman-Streuung auf; aber gleichseitig steigt: natürlich auch die spontane Fluoreszenz stark an.

Bei der spektroskopischen Untersuchung von wäßriger D-GIucoselösung und des Mucopolysaccharids Heparin, das in Leukozyten enthalten ist, treten signifikante Absorotionsbanden

_ ι im tfellenzahlenbereich von 500 bis IGOO cm 'auf, die zur Glucosebestimmung herangezogen werden können. Bei Messungen ira Tollblut tritt jedoch die Schwierigkeit auf, daß im ^-- samten sichtbaren Spektralbereich Blut, bedingt durch Hä.no- ■rLobLn und die anderen chromophoren Substanzen, eine star^e Arrsorption zeigt, was zwar für diese Moleküle zu einer ?.-..-- ~ rnanzverstärkung der -ainan-StreuunÄ führt, jedoch ηίΐ ei.-

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nem hohen Fluoreszenzuntsrgrund verbunden ist und somit die Detektion nicht resonanzverstärkter Banden erschwert, wenn nicht ganz unmöglich macht.

Dieses Problem läßt sich zwar mit den heute zur Verfügung stehenden Möglichkeiten zur Anregung der Raman-Streuung mit kurzen Laserimpulsen im Subnanosekunden-Bereich lösen; jedoch ist der technische Aufwand so erheblich, daß sich damit in absehbarer Zeit für Vollblutproben kein praktisch einsetzbares Verfahren realisieren läßt.

Eine andere Möglichkeit, die Störung durch Fluoreszenz der Chromophore zu vermeiden, besteht darin, direkt im infraroten Spektralbereich zu arbeiten. Da aber die Probenaufbereitung, Registrierung und Auswertung des Spektrums zeitaufwendi2 und kompliziert ist, stellt die bisher übliche Infrarot-Spektroskopie in der durchgeführten Art keine Konkurrenz zu den bestehenden anderen Verfahren dar. Grundsätzlich ist jedoch eine spezifische Auswertung in dem Bereich von 940 bis 1150 cm" möglich. Als Störfaktor steht der traditionellen IR-Spektroskopie, abgesehen von der ob ·. erwähnten Probenaufbereitung, wesentlich noch die hohe Eigenabsorption des Wassers (der Absorptionskoeffizient beträgt bei 9,28 Ai ca. 700 cm" ) gegenüber, auch wenn sich durch den Einsatz von Lasern anstelle der konventionellen Lichtquellen diese Schwierigkeiten mildern lassen (Kaiser, N.: in "Modern Techniques in Physiological Sciences" J.F. Gross et •al. ed.; New York: Academic Press (1973). 237 und Kaiser, M.: Biomed. Technik 20 (1975), 291).

Ein weiteres spektroskopisches Verfahren, das zunehmende Beachtung in der Fachwelt gefunden hat, ist die sogenannte ATR-Spektroskopie, d.h. die Totalreflexionsspektroskopie -nit quergedämpfter tfelle (Kaiser, N.: Appl. Phys. 17 (1978) 1208; Kaiser, M.: in "Laser 77 Opto-Electronics Conference Proceedings" V. Waidelich ed., Guildford: IPC Science and TeohnoLoey Press Ltd. (1977), 5^3; Kaiser, N.: Ξ ..ectronics, :ίον. 23. (1978), 74; Kaiser, W.: Electro, Mo. 11. (1977),

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24; und Kaiser, N.: Spektrum der Wissenschaft, Nov. ('978), 77). So ist es beispielsweise aus der DE-OS 2 606 991 bekannt, einen (X^-Laser in Verbindung mit der seit langem bekannten ATR-Spektroskopie zur Bestimmung von Glucose bzw. auch von anderen Stoffwechseiprodukten zu verwenden. Dies läßt sich ,jedoch ^nur *ⁿ reinen Lösungen durchführen; in Mehrkomponentensystemen oder gar im Vollblut muß dieses Verfahren aufgrund prinzipieller Schwierigkeiten scheitern:

Die ATR-Spektroskopie macht von der Tatsache Gebrauch, daß sich bei einer Totalreflexion, die oberhalb eines bestimmten kritischen Winkels an der Grenzschicht von einem optisch dichteren zu einem optisch dünneren Material auftritt, die Lichtwelle auch längs dieser Grenzschicht im optisch dünneren Material ausbreitet. Dabei tritt dann auch noch eine Strahlversetzung auf, die als Goos-Hähnchen-Effekt bezeichnet wird. Die Amplitude des elektromagnetischen Feldes der Lichtwelle an der Grenzfläche klingt normal zur Grenzschicht exponentiell ab, und man definiert als Eindrinrtiefe diejenige Länge, auf der die Amplitude auf den e-ten Tel] abgefallen ist. Von spektroskopischer Bedeutung ist jedoch nicht so sehr diese Größe sondern vielmehr die sogenannte "effektive Eindringtiefe", in die wesentlich noch die Feldverteilung in Abhängigkeit vom Einfallswinkel eingeht. Die so beschriebene Lichtwelle an der Grenzschicht bezeichnet man als quergedämpfte oder auch evanescente Welle. Diese quergedämpfte Welle, die ein Stehwellenfeld bildet, hat in Abhängigkeit vom Polarisationszustand auch longitudinale Feldkomponenten (Harrick, N.J.: "Internal Reflection Spectroscopy" Berlin: Springer (1969); Hirschfeld, T., P.A. Wilks Jr.: Applied Spectroscopy Reviews 1 (1967), 99; Kortüm, G.: "Reflectance Spectroscopy" Berlin: Springer (1969))· Dies, verbunden mit dispersiven Effekten, wie der Änderung des Brechungsindex innerhalb einer Absorptionsbande, und deren Auswirkung auf die effektive Eindringtiefe führt dazu, daß für quantitative Konzentrationsmessungen mit der ATR-Technik ganz bestimmte Voraussetzungen erfüllt sein

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müssen. So gilt zum Beispiel das Lambert-Beer'sche Gesetz für die ATR-Spektroskopie nur für einen Absorptionskoeffizienten im Bereich von 0,1 und kleiner sowie für einen Einfallswinkel von ungefähr 60° oder größer, bezogen auf die im IR üblichen Materialien, wie KRS-5, IRTRAN, Si o.dgl., und außerdem nur bei hinreichend großen Wellenlängen, und auch hier nur annäherungsweise für isotrope Proben. Selbst bei in vitro Messungen im Vollblut würden hier also bereits Schwierigkeiten auftreten, bedingt zum Beispiel auch durch die Proteinadsorption an den Reflexionsflächen, die das System in eine Anisotropie überführen. Bei Relativmessungen und nur kleinen Konzentrationsänderungen liegen die Verhältnisse etwas günstiger, sind aber auch nicht befriedigend (Müller, G.: "Spectroscopy with the evanescent wave in the visible Region of the Spectrum" in "Multichannel Image Detectors", Yair Talmi, ed., Washington D.C. (1979): American Chemical Soc; Albrecht, H., G. Müller, M. Schaldach: Biomed. Techn. 23 E. (1978), 98).

Aus dem erwähnten sinnvollen Einfallswinkel bei der ATR-Spektroskopie und bei der für Glucosemessungen sinnvollen './ellenlange von ca. 10ja folgt eine Eindringtiefe der in das optisch dünnere Medium überkoppelnden, quergedämpften Lichtwelle von etwa 1/U. Nahe dem sogenannten kritischen Winkel lassen sich Eindringtiefen von ca. 20 bis 50ja erreichen, jedoch gilt dann, wie erwähnt, das Lambert-Beer' sehe Gesetz nicht taehr. Das heißt aber, daß der in der erwähnten DE-OS 2 506 991 gemachte Vorschlag, die absolute Konzentration der Glucose mit Hilfe der ATR-Spektroskopie in vitro im Vollblut oder auch in vivo in den peripheren Blutgefäßen transcutan zu messen, nicht praktikabel ist.

Bei Messungen im Infrarotspektralbereich wird üblicherweise der Absorptionsbeitrag des Lösungs- bzw. Einbettungsrait-♦els für die zu bestimmende Substanz durch die Anwendung eines Referenzstrahlengangs zusätzlich zum eigentlichen Meßstrahlengang kompensiert, wobei in beiden Strahlengängen

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Infrarotstrahlung der gleichen Wellenlänge verwendet wird. Die notwendige Reproduzierbarkeit der Messung im Referenzstrahlengang erfordert jedoch eine Probenvorbehandlung und ist auf zu untersuchende Substanzen, die im natürlichen biologischen Milieu vorliegen, nicht; direkt anwendbar.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, insbesondere aufgrund der in letzter Zelt verstärkt diskutierten Möglichkeiten zur Entwicklung eines extracorporalen oder auch implantierbaren künstlichen Pankreas, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu dessen Durchführung zu schaffen, die es bei hoher Empfindlichkeit, Genauigkeit und Spezifität sowie in einfacher und technisch leicht zu realisierender Weise gestatten, eine Molekülspektroskopie zu betreiben, mit der es insbesondere möglich ist, ohne Probenvorbehandlung auszukommen und ohne weiteres Proben zu messen, bei denen sich die zu bestimmenden Substanzen, insbesondere StoffWechselprodukte, im natürlichen biologischen Milieu, insbesondere im Vollblut, d.h. in einem Mehrkomponentensystem, befinden, wie es vorzugsweise die Bestimmung von Glucose im menschlichen Vollblut ist. Mit diesem Verfahren und der Vorrichtung zu dessen Durchführung sollen darüberhinaus vorzugsweise weitere Nachteile der Verfahren und Vorrichtungen nach dem Stande der Technik, wie er hier eingehend erläutert ist, ausgeschaltet v/erden.

Das Verfahren nach der Erfindung, mit dem das ermöglicht v.-ird, zeichnet sich dadurch aus, da3 die Absorption von Infrartostrahlung durch die Probe bei zwei unterschieldichen '..'ellenlangen der Infrarotstrahlung gleichzeitig bestimmt wird, wobei die erste Wellenlänge so ausgewählt ist, daß bei Konzentrationsänderun^en der zu bestimmenden Substanz

in der Probe keine oder nur eine vernachlässigbar kleine Änderung der Infrarotstrahlungsabsorotion auftritt, während die zweite '/ellenlänse so ausgewählt ist, daß sie im Bereich einer substanzspezifischen Abscrt>tionsbande der zu 'a~ n Substanz liegt; und daß man den Quotienten au,:

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den bei diesen beiden Wellenlängen gemessenen Absorptionswerten bildet.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher als Zweiwellenlängenverfahren charakterisiert werden, bei dem die eine Wellenlänge in einem "quasi-isosbestischen" Bereich liegt, während die andere Wellenlänge im Bereich einer substanzspezifischen Absorptionsbande liegt, und zwar so, daß bei dieser letzteren Wellenlänge eine Absorptionsänderung nur durch eine Konzentrationsänderung der untersuchten Substanz verursacht wird. Im allgemeinen lassen sich Wellenlängen dieser Eigenschaften aufgrund von vorliegenden Infrarotabsorptionsspektren der infragestehenden Proben ohne weiteres auswählen, da es neben den substanzspezifischen Absorptionsbanden entsprechende auasi-isosbestische Bereiche gibt.

Das Verfahren nach der Erfindung kann in der Weise durchgeführt werden, daß man die Absorption bei den beiden unterschiedlichen Wellenlängen mittels Transmissions-Spektroskopie oder mittels Reflexions-Spektroskopie, insbesondere ATR-Spektroskopie, bestimmt. Transmissionsmessungen haben, beisDielsweise im Falle der Glucosebestimmung im Vollblut, ■~eaenüber Messungen mittels ATR-Spektroskopie den Vorteil, dafl das Lambert-Beer'sche Gesetz hier gültig ist und daß sie für die Erzielung quantitativer Meßwerte durch biochemische Absolutbestimmung kalibriert werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht nur auf Glucose als StoffWechselprodukt anwendbar, sondern es können damit auch beispielsweise Harnstoff, Harnsäure, Kreatinin und/ oder Lioide als S^.of fwechselprodukte bestimmt werden.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens , die den eingangs genannten grundsätzlichen Aufbau hat, zeichnet sich dadurch aus, daß die Infrarotstrahlungsb'Indelerzeugungseinrichtung ein Infrarotstrahlungsbündel er- -z-iu-,ζζ, das aus Infrarotstrahlung von wenigstens einer ersten .:nd zweiten '.iellanl.'inge besteht, wobei die erste Wellenlänge

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so ausgewählt ist, daß bei Konzentrationsänderungen der zu bestimmenden Substanz in der Probe keine oder nur eine vernachlässigbar kleine Änderung der Infrarotstrahlungsabsorption auftritt, während die andere Wellenlänge so ausgewählt ist, daß sie im Bereich einer substanzspezifischen Absorptionsbande der zu bestimmenden Substanz liegt; daß die Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung eine die Absorptionswerte der Infrarotstrahlung der unterschiedlichen Wellenlängen gesondert messende Detektoreinrichtung ist; und daß der Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung eine den Quotienten aus den ermittelten Absorptionswerten bildende Divisionsschaltung nachgeschaltet ist.

Durch die zuletzt genannte Quotientenbildung der Absorptionswerte, die man für die beiden Wellenlängen mißt, erhält man ein normiertes Meßsignal.

Weitere Merkmale der Erfindung sind in den Unteransprüchen wi edergegeben.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Figuren 1 bis 12 der Zeichnung anhand einiger besonders bevorzugter Ausführungsbeispiele näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 ein Infrarotabsorptionsspektrum von Wasser; Fig. 2 ein Infrarotabsorptionsspektrum von Heparin; Fig. 3 ein Infrarotabsorptionsspektrum von D-Glucose;

Fig. k ein Infrarotabsorptionsspektrum von getrocknetem menschlichem Vollblut ohne Glucose;

Fig. 5 ein Infrarotabsorptionsspektrum von getrocknetem menschlichem Vollblut, das mit 100 mg% D-Glucose versetzt ist;

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Fig. 6 eine erste Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, mit der die Absorption einer Probe bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen mittels Spektroskopie bestimmt werden kann;

Fig. 7 ein zweites Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung nach der Erfindung;

Fig. 8 eine dritte Ausführungsform der Erfindung mit einer abgewandelten Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung und einer Detektoreinrichtung nach der Ausführungsform der Erfindung nach Fig. 7;

Fig. 9 eine vierte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;

Fig. 10 eine fünfte Ausführungsform der Erfindung mit einer abgewandelten Ausführungsform einer Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung und mit einer Detektoreinrichtung nach den Ausführungsbeispielen der Fig. 6 oder 7;

Fig. 11 Durchlaßkurven zweier Einband-Interferenzfilter, wie sie in den Ausführungsbeispielen nach den Fig. 6, 7 und 9 Verwendung finden; und eine Durchlaßkurve eines Doppelband-Interferenzfilters, wie es im Ausführungsbeispiel nach der Fig. 8 vorgesehen ist; und

Fig. 12 die Durchlaßkurven eines wellenlängenselektiven Strahlenteilers, wie er in den AusfUhrungsformen nach den Fig. 7 und 9 vorgesehen ist.

Eine wesentliche Schwierigkeit der Glucosebestimmung im Vollblut oder Harn besteht darin, daß die Körperflüssigkeiten zu einem hohen Prozentsatz aus Wasser bestehen. Wasser hat aber im Bereich der Glucoseabsorption im Infraroten einen Absorptionskoeffizienten von 700 cm . Glucose hat da-

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gegen in diesem Bereich lediglich einen Absorptionskoeffizienten von ca. 0,1 cm . Das heißt, ein Detektionssysten; müßte eine Dynamik von besser als 10 haben» um Glucose in Gegenwart von Wasser direkt messen zu können. Im IR ist _vie~ doch bis heute kein solches Svstem bekannt.

Die Fig. 1 bis 5, die Infrarotabsorptionsspektren von Wasser, Heparin, Glucose sowie von getrocknetem Vollblut mit und ohne Glucose in KBr-Technik im Bereich von 3000 bi£ 600 cm" zeigen, veranschaulichen die AbsorptionsVerhältnisse im IR-Bereich und zeigen durch einen Vergleich die Nachweisempfindlichkeit für Glucose. Da die Probenaufbereitung, Registrierung und Auswertung des Spektrums zeitaufwendig und kompliziert ist, stellt die bisher übliche IR-Spektroskopie in der durchgeführten Art keine Konkurrenz zu den bestehenden Verfahren dar. Grundsätzlich ist aber den dargestellten Spektren zu entnehmen, daß eine spezifiscne

— 1 Auswertung in dem Bereich von 9^0 bis 1150 cm möglich ist.

Als Störfaktor steht der traditionellen IR-Spektroskopie neben der oben erwähnten Probenaufbereitung wesentlich die hohe Eigenabsorption des Wassers gegenüber. Üblicherweise wird diese Schwierigkeit, die generell bei IR-Messungen in wäßrigen Lösungen besteht, durch ein sogenanntes Zweistrahlverfahren vermieden; dabei wird die Lösungs- bzw. Einbettungsini ttelabsorption durch einen Referenzstrahlengang, in dem sich eine Probe befindet, die nur aus Wasser besteht, kompensiert, Durch den Einsatz von Lasern anstelle der konventionellen Lichtquellen läßt sich dieses Problem weiter reduzieren.

Um eine lokale thermische Schädigung des durchstrahlten Blutes und eventuell Gewebes zu vermeiden, ist es notwendig, den Strahl des Lasers aufzuweiten; geeignete Systeme sind Stand der Technik und von verschiedenen Herstellern lieferbar. Dadurch läßt sich die Leistungsdichte unter die Gefahrenschwelle absenken. Daß sich, wie in der DE-OS 2 606 991 erwähnt, bei Verwendung eines nicht aufgeweiteten 2-Watt-(cw)-Laserstrahles die Gesamttemperatur des

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nicht erhöht, ist sicher richtig, jedoch führt die Absorption von nahezu der gesamten eingestrahlten Leistung bei einer Schichtdicke von ca. 0,1 mm und bei einem Strahlquer-

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schnitt von ca. 2 mm zu lokalen Denaturierungen. Mit einer erfindungsgemäßen Aufweitung des Strahles entsprechend der Laserleistung ist dieses Problem jedoch zu lösen. Für in vitro Messungen ist eine Aufweitung des Strahles ebenfalls angezeigt, wenn neben Glucose weitere Stoffwechselbestandteile nachgewiesen werden sollen.

Bei Messungen im Infrarot, wofür hier auch die übliche Abkürzung "IR" verwendet wird, wird die Lösungs- bzw. Einbettungsmittelabsorption durch einen Referenzstrahlengang kompensiert, man spricht auch von einem Zweistrahlverfahren. Erfindungsgemäß wird jedoch eine komplizierte Probenvorbehandlung, die erst eine sinnvolle Verwendung des Referenzstrahlenganges ermöglicht, eliminiert, und es wird, um wie im vorliegenden Fall eine Probe im natürlichen biologischen Milieu zu untersuchen, statt des Zweistrahlverfahrens ein Zweiwellenlängenverfahren angewendet. Dabei wird die Absorption der Probe bei zwei verschiedenen Wellenlängen simultan bestimmt. Die beiden Wellenlängen liegen dabei so dicht beieinander, daß dispersive Effekte klein zu halten, sind.

Die eine Wellenlänge 9^ wählt man so, daß bei Konzentrationsänderungen der zu untersuchenden Substanz in der Probe keine oder nur eine vernachlässigbar kleine Änderung der Absorption auftritt, d.h. ^ sollte im "isosbestischen Punkt" oder in einem "quasi-isosbestischen" Bereich liegen. Die andere Wellenlänge ^p legt ^{man au}f eine subs tanz spezifische Absorptionsbande. Durch Quotientenbildung der Absorptionswerte bei 9* * und <λρ erhält man dann ein normiertes Meßsignal. Voraussetzung für ein solches Zweiwellenlängenverfahren ist allerdings, daß eine alleinige Absorptionsänderung bei ^₂ ^nur durch die Konzentrationsänderung der untersuchten Substanz bedingt ist. Schwankungen der Licht-

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quellenintensität, die bei den beiden Wellenlängen unterschiedlich sind, können daneben unabhängig und in üblicher Weise kompensiert werden,

Wie man den Figuren 1 bis 5 entnehmen kann, lassen sich für die Glucosebestimmung im Vollblut zwei solche Wellenlängen, die, genauer gesagt, Wellenlängenbereiche sind, finden. Die Messung der Glucoseabsorption erfolgt bei einer Wellenlängt

_ -1

bzw. in einem Wellenlängenbereich Ά ₂ ^von 1090 bis 1095 cn: , zum Beispiel entsprechend den CO„-Laserlinien R(40) bis R(52). Die in der DE-OS 2 606 991 angegebenen Messungen bei 1030 cm~ , im Maximum der Glucoseabsorption, sind bei einen:¹ realen Einsatz Störungen durch die Heparinabsorption in diesem Bereich unterworfen, wie die Fig. 1 bis 5 erkennen lassen. Das Muccopolysaccharid Heparin ist im Vollblut zu einem relativ hohen Prozentsatz in den basophilen Leukozyten vorhanden. Im Normalfall ist der Einfluß nicht allzu hoch, etwa 0,5 %, jedoch kann in pathologischen Grenzsituationen mit einem erhöhten Leukozytenanteil oder auch nach Verabreichung von Heparin als Antikoagulanz eine empfindliche Störung der Glucosemessung entstehen.

Die Grundabsorption des Blutes und eventuell Gewebes wird bei einer Wellenlänge bzw. in einem Wellenlängenbereich Ά von 940 bis 950 cm bestimmt, zum Beispiel entsprechend den CO₂-Laserlinien P(14) bis P(26). Technisch läßt sich ein solches Verfahren realisieren, indem erfindungsgemäß eine Mehrlinien- oder Mehrbanden-Lichtquelle, zum Beispiel ein COp-Laser, in den o.a. Bereichen verwendet wird und die Wellenlängenselektion durch geeignete Interferenzfilter vorgenommen wird, die in diesen Bereichen nach dem Stand der Technik mit einer Halbwertsbreite von etwa 5 cm~ hergestellt werden können. Statt eines COp-Lasers kann zum Beispiel auch ein Halbleiterlaser, beispielsweise ein Pb* Sn-Te- oder Raman-Laser, oder ein Kontinuumstränier mit Frequenzselektion verwendet werden. Die Detektion des Meßsignals erfolgt mit den nach dem Stand der Technik üblichen

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Verfahren und Vorrichtungen, wie zum Beispiel TGS-Detektor und ^tILock-in"-Technik.

Die Blutprobe selbst befindet sich vorzugsweise auf einem als Einwegartikel ausgebildeten, dünnen Kunststoffträger, zum Beispiel aus einem Copolymer aus Polyäthylen und Polypropylen, der in dem für die Glucosemessung in Frage kommenden Bereich transparent ist.

In den Fig. 6 bis 10 sind Prinzipdarstellungen einiger Ausführungsformen einer Vorrichtung zur Molekülspektroskopie, insbesondere zur Bestimmung von Stoffwechselprodukten, gezeigt, und zwar können diese Vorrichtungen sowohl zur Transmissionsspektroskopie als auch zur ATR-Totalreflexions-Spektroskopie mit quergedämpften Infrarotlichtquellen verwendet werden. Dabei ist der nur schematisch angedeutete Probenträger 1, in oder auf dem die Probe 2 vorgesehen ist, vorzugsweise entweder als Objektträgerplättchen oder als Küvette aus zum Beispiel einem Copolymer aus Polyäthylen und Polypropylen gefertigt, Je nachdem ob die Probe 1 senkrecht oder horizontal durchstrahlt wird.

Jede der Ausführungsformen nach den Fig. 6 bis 10 weist eine Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung 3 und eine Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung 4 auf. In dem Infrarotstrahlungsbündel 5, das den Infrarotstrahlengang zwischen der Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung 3 und der Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung 4 bildet, befindet sich der Probenträger 1 mit der Probe 2, welche eine zu bestimmende Substanz enthält.

Die Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung 3 ist so ausgebildet, daß sie ein Infrarotstrahlungsbündel 5 erzeugt, welches aus Infrarotstrahlung von wenigstens einer ersten und zweiten Wellenlänge ^ ^ bzw. λ ~ besteht. Die erste Wellenlänge /I₁ ist so ausgewählt, daß bei Konzentrationsänderungen der zu bestimmenden Substanz in der Probe 2 keine

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oder nur eine vemachlMssigbar kleine Änderung der Infrarot Strahlungsabsorption auftritt, während die andere Wellenlänge ^X 2 so gewählt ist, daß sie im Bereich einer substanzspezifischen Absorptionsbande der zu bestimmenden Substanz liegt. Und die Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung A ist so ausgebildet, daß sie die Absorptions- bzw. Intensitätswerte der Infrarotstrahlung der unterschiedlichen Wellenlängen /\ ^ und λ ρ gesondert mißt. Weiterhin ist der Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung k eine Divisionsschaltunf 6 nachgeschaltet, der die beiden von der Infrarotstrahlun.rsdetektoreinrichtung k ermittelten Absorptions- bzw. Ιητβη-sitätswerte bzw. diesen Werten proportionale Signale zugeführt werden und die den Quotienten Q » Ip/I-i bildet, worin Ip . der der Wellenlänge 7\ ρ entsprechende Absorptions- bzw. Intensitätswert ist, während I₁ der der Wellenlänge 7\ -j entsprechende Absorptions- bzw. Intensitätswert ist. Dieser Divisionsschaltung 6 ist eine Anzeige- und/oder Aufzeichungseinrichtung 7 nachgeschaltet, die beispielsweise ein Schreiber, ein Drucker, ein Digital- oder Analofanzeigegerät o.dgl. sein kann.

Die verschiedenen Ausführungsfcrmen der Fig. 6 bis 10 unterscheiden sich nun im einzelnen durch die unterschiedliche Ausbildung ihrer jeweiligen Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung 3 und/ocer ihrer jeweiligen Infraroistrahlungsdetektoreinrichtung 4; nachfolgend sei daher auf diese unterschiedlichen Ausbildungen näher eingegangen:

Bei der Ausführungsform nach der Fig, 6 weist die strahlungsbündelerzeugungseinrichtung 3 als Infrarotstrahlungsquelle 8 einen starken Kontinuumsstrahler auf, wie beispielsweise eine Globar- oder Nernst-Stift-Infrarotstrahlungsquelle. Mittels einer Strahlungsbündelausblendvorrichtung 9 wird ein erstes und zweites Infrarotstrahlungsbündel 10 bzw. 11 ausgeblendet, und zur Selektierung der beiden Wellenlängen λ ^ und λ ρ aus dem Kontinuumsspektrum der Infrarotstrahlungsquelle 8 ist im Strahlengang des ersten Infra-

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rotstrahlungsbündels 10 ein erstes Interferenzfilter 12 angeordnet, das im wesentlichen nur Strahlung der Wellenlänge

'X ₁ durchläßt, während im Strahlengang des zweiten Infrarotstrahlungsbündels 11 ein zweites Interferenzfilter 13 angeordnet ist, das im wesentlichen nur Strahlung der Wellenlänge \ ₂ durchläßt.

Der prinzipielle Verlauf der Durchlaßfunktion der Interferenzfilter 12,13 ist im oberen und mittleren Teil der Fig. 11 darrestellt, worin die Transparenz in Prozent über der Wellenlänge in /um aufgetragen ist. Die Halbwertsbreite Δ λ sollte kleiner oder gleich 1 % der jeweiligen durchzulassenden Wellenlänge ^ ^ bzw. Λ ρ ^sein·

Die beiden Infrarotstrahlungsbündel 10,11 werden durch eine Strahlumlenk- und -zusammenführungsvorrichtung, die aus mehreren Spiegeln 14 und einem wellenlängenselektiven Strahlteiler 15 besteht, zu einem einzigen Infrarotstrahlungsbündel, nämlich dem Infrarotstrahlungsbündel 5, vereinigt, nachdem sie vorher durch einen Chopper 16 mit unterschiedlichen Frequenzen f.. (Modulationsfrequenz des Infrarotstrahlungsbündels 10) bzw. fp (Modulationsfrequenz des Infrarotstrahlungsbündels 11) moduliert worden sind. Daß sich unterschiedliche Frequenzen ergeben, ist dadurch angedeutet, daß die Unterbrecherscheibe 17 des Choppers 16 das Infrarotstrahlungsbündel 11 an einer der Rotationsachse 18 des Choppers näher gelegenen Stelle schneidet als das Infrarotstrahlungsbündel 10 und daß das Chopperblatt bzw. die Unterbrecherscheibe für die beiden Bündel 10,11 eine unterschiedliche Zahl von Segmenten hat.

Die Durchlaßfunktion des wellenlängenselektiven Strahlenteilers 15 ist in Fig. 12 dargestellt, worin die Transparenz T bzw. die Reflexionsfähigkeit R, jeweils in Prozent, über der Wellenlänge in /um aufgetragen und die Wellenlängen ¹^₁ und Λ 2 eingezeichnet sind.

Nach Durchstrahlung der Probe 2, die zum Beispiel ein Ausstrich eine Bluttropfens auf einem als Objektträger ausgebildeten Probenträger 1 sein kann, der seinerseits bei-

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spielsweise aus einem Copolymer aus Polyäthylen und Polypropylen bestehen kann, gelangt dann das Infrarotstrahlungbündel 5 in die Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung A, und zwar trifft es hier auf einen einzigen Detektor 19 auf, der in dem jeweiligen Spektralbereich, in dem sich die Wellenlängen /\ ,j und ¹X ρ befinden, nahezu gleiche Empfindlichkeit besitzt. Beispielsweise kann der Detektor 19 ein pyroelektrischer Empfänger, wie etwa ein Triglycinsulfat-Kristall sein, der abgekürzt auch als TGS-Kristall bezeichnet wird. Diese nahezu gleiche Empfindlichkeit ist notwendir, damit die nachgeschaltete Elektronik mit gleichen Zeitkonstanten betrieben werden kann. Das Ausgangssignal des Detektors 19 wird auf zwei parallele Lock-in-Verstärker 20,21 (phasenempfindliche Gleichrichter mit gegebenenfalls nachgeschaltetem Verstärker), von denen ersterer auf die Moduxationsfrequenz 1* des Infrarotstrahlungsanteils der Wellenlänge ?\ ^ und letzterer auf die Modulationsfrequenz fp des Infrarotstrahlungsanteils der Wellenlänge λ ₂ abgestimmt ist gegeben.Am Ausgang des Lock-in-Verstärkers 20 erhält man den oben erwähnten Intensitätswert I₁ bzw. ein ihm proportionales Signal, und am Ausgang des Lock-in-Verstärkers 21 steht der oben genannte Intensitätswert I₀ bzw. ein ihm proportionales Signal zur Verfügung. Diese beiden Signale werden in die nachgeschaltete Divisionsschaltung 6 eingegeben, die hieraus das normierte konzentrationsproportionale Signal 1 = Io/I-j durch Quotientenbildung erzeugt.

Es sei nun auf die Ausführungsform nach Fig. 7 eingegangen, die im wesentlichen so wie die Ausführungsform nach Fig. 6 aufgebaut ist, jedoch dieser gegenüber folgende Änderungen aufweist:

In der Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung 3 ist der Chopper 16 so angeordnet und ausgebildet, daß er beide Infrarotstrahlungsbündel 10 und 11 mit der gleichen Chopfrequenz f moduliert. Infolgedessen ist in der zugehörigen Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung A ein zweiter wellen-

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längenselektiver Strahlenteiler 22 vorgesehen, der das darauf auftreffende einzige Infrarotstrahlungsbündel 5 in ein erstes Infrarotstrahlungsbündel 23 der Wellenlänge /\ - und ein zweites Infrarotstrahlungsbündel 24 der Wellenlänge Ά £ aufteilt. Das erste Infrarotstrahlungsbündel 23 gelangt auf einen ersten Infrarotstrahlungsdetektor 25, und das zweite Infrarotstrahlungsbündel 24 trifft auf einen zweiten Infrarotstrahlungsdetektor 26 auf. Diese Infrarotstrahlungsdetektoren 25,26 können von der gleichen Art wie der Infrarotstrahlungsdetektor 19 sein.

Die den beiden Infrarotstrahlungsdetektoren 25,26 nachgeschalteten Lock-in-Verstärker 27 bzw. 28, die beide auf die Modulationsfrequenz f abgestimmt sind, erzeugen wiederum an ihren Ausgängen Intensitätswerte I^ bzw. Ip, aus denen der oben erwähnte Quotient Q in der Divisionsschaltung 6 gebildet wird.

Die Fig. 8 zeigt eine Ausführungsform, bei der aus der Strahlung der ebenfalls als Kontinuumsstrahler ausgebildeten Infrarotstrahlungsquelle 8 mittels der Strahlungsbündelausblendvorrichtung 9 nur ein einziges Strahlungsbündel, nämlich das Infrarotstrahlungsbündel 5 ausgeblendet wird, das, bevor es die Probe 2 durchsetzt, durch ein Doppelband-Interferenzfilter 29 und die Unterbrecherscheibe 17 eines Choppers 16 hindurchgeht. Die Durchlaßkurve dieses Doppelband-Interferenzfilters 29 ist im unteren Teil der Fig. 11 gezeigt und stellt, wie ein Vergleich mit dem mittleren und oberen Teil der Fig. 11 ergibt, eine Kombination der Durchlaßkurven der beiden Interferenzfilter 12 und 13 dar, die in den Ausführungsformen nach den Fig. 6 und 7 verwendet werden.

Die Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung 4 der Ausführungsform nach Fig. 8 kann so ausgebildet sein, wie in Fig. 7 dargestellt.

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Die Fig. 9 zeigt eine Ausführungsform, in der die Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung 3 als Infrarotstrahlungsquelle 8 einen Laser, zum Beispiel einen CO^-Laser oder einen Raman-Laser, mit Mehrlinienemission aufweist, welcher mit einer Strahlaufweitungsvorrichtung 30 versehen ist. Mittels der Strahlungsbündelausblendvorrichtung 9 wird ein einziges Strahlungsbündel, nämlich das Infrarotstrahlungsbündel 5» ausgeblendet, das, bevor es durch die Probe I verläuft, nicht weiter gefiltert sondern nur mittels eines Choppers 16 mit einer Chop-Frequenz f moduliert wird.

Die Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung 4 der Ausführungsform nach der Fig. 9 ist im wesentlichen so aufgebaut, wie in Fig. 7 dargestellt; jedoch ist zum Zwecke der Wellenlärgenselektion ein erstes Interferenzfilter 12 in dem Strahlengang des ersten Infrarotstrahlungsbündels 23 zwischen ceir. wellenlMngenselektiven Strahlenteiler 22 und dem ersten Detektor 25 angeordnet, so daß letzterer nur Infrarotstrahlung der Wellenlänge "X * erhält, während in dem Strahlengang des zweiten Infrarotstrahlungsbündels 24 zwischen dem wellenlängenselektiven Strahlenteiler 23 und dem zweiten Infrarotstrahlungsdetektor 26 ein zweites Interferenzfilter 13 vorgesehen ist, das nur Strahlung der Wellenlänge ¹X ~ durchläßt.

Das Ausführungsbeispiel nach Fig. 9 kann auch so abgewandelt sein, daß durch Aufteilung und Wiedervereinigung des aus äer Strahlaufweitungsvorrichtung 30 austretenden Strahlungsbündels unter Selektion der Wellenlängen ^. ^ und /{ ρ und einer Zweifrequenzmodulation mittels eines Choppers 16 entsprechend der Ausführungsform nach Fig. 6 eine Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung 4 der in Fig. 6 gezeigten Art verwendet werden kann, die nur einen einzigen Detektor 19 erfordert.

Schließlich ist in Fig. 10 eine Ausführungsform gezeigt, in der zwei monochromatische Laser 8 vorgesehen sind, von denen der eine die Emissionswellenlänge Ά ₁ und der andere die Emissionswellenlänge Λ ? ^na"t· Diese Laser 8 können beispie! s-

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weise Pb₁ Sn Te-Laser sein, so daß nach Durchgang der Laserstrahlungen durch die Strahlaufweitungsvorrichtung 30 mittels der Strahlungsbündelausblendvorrichtung 9 ein erstes Strahlungsbündel 10 erzeugt wird, das nur Infrarotstrahlung der Wellenlänge \ * enthält, sowie ein zweites Infrarotstrahlungsbündel 11, das nur Infrarotstrahlung der Wellenlänge ^. ~ aufweist. Diese beiden Strahlungsbündel werden in ähnlicher Weise wie in der Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung 3 der Fig. 6 mit zwei unterschiedlichen Chop-Frequenzen f* bzw. fp moduliert und durch einen Spiegel 14 und einen wellenlängenselektiven Strahlenteiler 15 zu dem gemeinsamen Infrarotstrahlungsbündel 5 vereinigt. Die Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung 4 kann bei diesem Ausführungsbeispiel von der in Fig. 6 gezeigten Art sein, sie kann jedoch auch so ausgebildet sein, wie in Fig. 7 gezeigt ist, sofern man die beiden Infrarotstrahlungsbündel 10,11 in Fig. 10 mit der gleichen Chop-Frequenz f moduliert.

In weiterer Ausbildung der Erfindung kann der Probenraum auch als Durchflußküvette geringer Schichtdicke ausgeführt sein. Dies ist insbesondere von Interesse, wenn das Verfahren zum kontinuierlichen Messen, zum Beispiel bei der Dialyse mit einer künstlichen Niere, eingesetzt werden soll. Bei diesem Anwendungsfall ist weniger die Glucosebestimmung als vielmehr die Bestimmung von Peptidspaltprodukten, Defekthormonen, Harnstoff, Harnsäure und Kreatinin im Dialysat von Interesse. Der isosbestische bzw. quasi-isosbestische Bereich für % ^ ist dabei im wesentlichen der gleiche wie bei der Glucosemsessung, jedoch muß die zweite Wellenlänge /\ P jeweils den Substanzen entsprechend ausgewählt werden. Der weitere optische und elektrische Aufbau erfolgt dann entsprechend den oben angegebenen Ausführungsformen.

Schließlich sei darauf hingewiesen, daß in weiterer Ausbildung der Erfindung auch mehrere Substanzen simultan bestimmt werden können. Jedoch müssen dann mehr als zwei Wellenlängen simultan durch die Probe gestrahlt werden, wobei eine dieser

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Wellenlängen in einem mindestens quasl-isosbestischen gereich liegt und die anderen jeweils den zu untersuchenden Substanzen angepaßt ausgesucht werden. So ist es zum Peispiel ohne weiteres möglich, daß unter Verwendung von fünf verschiedenen Wellenlängen Glucose, Äthylalkohol, Harnsaure und Kreatinin simultan zu bestimmen; die Normierung erfolrt dabei durch die fünfte Wellenlänge in einem quasi-isosbest-sehen Bereich, zum Beispiel in dem oben diesbezüglich erwähnten Bereich.

Ende der Beschreibung.

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Claims

KRAUS & WEISERT 293,190

PATENTANWÄLTE ί, 9 Q H J <? U

DR WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-1NG. ANNEKATE WEISERT DiPLMNG. FACHRICHTUNG CHEMiL IRMGARDSTRASSE 15 ■ D-80O0 MÜNCHEN 71 · TELEFON 069/707077-707078 ■ TELEX Ο5-212156 kpatd

TELEGRAMM KRAUSPATENT ,

PROF, DR,. GERHARD HÜLLER Aalen

Verfahren und Vorrichtung zur Molekülspektroskopie, insbesondere zur Bestimmung von Stoffwechselproäukten

PAT EI₁T₁Jl₁₁K₁S P R U₁C₁ H₁E

1,1 Verfahren zur Molekülspektroskopie, insbesondere zur 'Bestimmung von Stoffwechselprodukten, bei dem die Absorption von Infrarotstrahlung durch eine Probe, welche eine zu bestimmende Substanz enthält, gemessen wird, dadurch g e kennzeichne t , daß die Absorption von Infrarotstrahlung durch die Probe (2) bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen ('Χ^,'λ?) der Infrarotstrahlung gleichzeitig bestimmt wird, wobei die erste Wellenlänge (λ..) so ausgewählt ist, daß bei KonzentratiOnsänderungen der zu bestimmenden Substanz in der Probe (2) keine oder nur eine vernachlässigbar kleine Änderung der Infrarotstrahlungsabsorption auftritt, während die zweite Wellenlänge (¹Ap) ^so ausgewählt ist, daß sie im Bereich einer substanzspezifischen Absorptionsbande der zu bestimmenden Substanz liegt; und daß man den Quotienten aus den bei diesen beiden Wellenlängen (T^. *X ρ) gemessenen Absorptionswerten bildet.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man für die Messung bei der ersten Wellenlänge (<λ ^) zur Bestimmung der Grundabsorption der Probe (2), insbesondere von Blut und/oder Körpergewebe, den Infrarotspektralbereich von 9^0 bis 950 cm" verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e kennzeichnet, daß man für die Messung bei der zweiten Wellenlänge ( >p) ^zur Bestimmung der spezifischen Absorption von Glucose, insbesondere in Körperflüssigkeiten oder im Dialysat, den Infrarotspektralbereich von 1090 bis 1095 cm verwendet.
A. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß damit Äthylalkohol, Harnstoff, Harnsäure, Kreatinin, Peptidspaltprodukte, Cholesterin und/oder Lipide, insbesondere in Körperflüssigkeiten oder im Dialysat, bestimmt werden, und zwar eine dieser Substanzen für sich oder mehrere dieser Substanzen gleichzeitig.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis h_t dadurch gekennzeichnet , daß man die Absorption bei den beiden unterschiedlichen Wellenlängen (λ_1#/\₂) mittels Transmissions-Spektroskopie bestimmt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man die Absorption bei den beiden unterschiedlichen Wellenlängen (λ.., Λ ο) mittels Reflexions-Spektroskopie bestimmt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß man als Reflexions-Spektroskopie eine Totalreflexions-Spektroskopie mit quergedämpften Infrarotlichtwellen durchführt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß die Probe (2) als Ausstrich bzw. Film vorgesehen wird.

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9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß ein Probenträger (1), vorzugsweise ein Wegwerf- bzw. Einwegprobenträger, aus einem Kunststoff verwendet wird, der im Bereich der ersten und zweiten Wellenlänge (ν\-|,λ_ο) nur eine geringe Eigenabsorption besitzt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß ein Probenträger (1) aus Polyäthylen, insbesondere Lupolen 2430 H oder Hostalen GS, verwendet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß ein Probenträger (1) aus einem Copolymer oder einer Mischung aus Polyäthylen und Polypropylen verwendet wird, insbesondere aus einer Mischung; bzw. einem Blend von 97 % Polyäthylen und 3 % Polypropylen.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß ein Probenträger (1) aus einem Terpolymer aus Äthylen, Butadien und/oder Propylen verwendet wird, insbesondere aus EPT-Kautschuk.
13· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß ein Probenträger (1) aus Chalcogenidglas verwendet wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13» dadurch gekennzeichnet , daß als Probenträger (1) ein ebener Objektträger verwendet wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13» dadurch gekennzeichnet , daß als Probenträger (1) eine Küvette verwendet wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß als Probenträger (1) eine Durch- flußküvette verwendet wird.

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17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß als Probenträger (1) eine Trogküvette verwendet wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17. dadurch gekennzeichnet , daß zur Trennung der Infrarotstrahlung unterschiedlicher Wellenlängen Interferenzfilter (12,13;29) und/oder wellenlängenselektive Strahlenteiler (15,22) verwendet werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet , daß zum Messen der Absorption ein Zweifrequenz-Lock-in-Verfahren angewandt wird.
20. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur Molekülspektroskopie, insbesondere zur Bestimmung von Stoffwechselprodukten, nach einem der Ansprüche 1 bis 19, mit einer Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung und einer Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung, sowie mit einem Probenträger für eine Probe, welche eine zu bestimmende Substanz enthält und mittels des Probenträgers im Infrarotstrahlengang zwischen der Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung und der Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung positionierbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung (3) ein Infrarotstrahlungsbündel (5) erzeugt, das aus Infrarotstrahlung von wenigstens einer ersten und zweiten Wellenlänge (Ά^,Τίρ) besteht, wobei die erste Wellenlänge (/V₁) so ausgewählt ist, daß bei Konzentrationsänderungen der zu bestimmenden Substanz in der Probe (2) keine oder nur eine vernachlässigbar kleine Änderung der Infrarotstrahlungsabsorption auftritt, während die andere Wellenlänge CA₂) so ausgewählt ist, daß sie im Bereich einer substanzspezifischen Absorptionsbande der zu bestimmenden Substanz liegt; daß die Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung (4) eine die Absorptionswerte der Infrarotstrahlung der unterschiedlichen Wellenlängen (¹A₁,/^) gesondert messende Detektoreinrichtung ist; und daß der Infrarotstrahlungsdetek-

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toreinrichtung (4) eine den Quotienten aus den ermittelten Absorptionswerten bildende Divisionsschaltung (6) nachgeschaltet ist.
21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung (3) als Infrarotstrahlungsquelle (8) einen starken Kontinuumstrahler aufweist.
22. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Infrarotstrahlungsbiindelerzeugungseinrichtung (3) als Infrarotstrahlungsquelle (8) einen oder mehrere Laser aufweist,
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der bzw. die Laser mit einer Strahlaufweitungsvorrichtung (30) versehen ist bzw. sind.
24. Vorrichtung nach Anspruch 22 oder 23» dadurch gekennzeichnet , daß der bzw. die Laser COo- oder Raman-Laser ist bzw. sind.
25· Vorrichtung nach Anspruch 22 oder 23» dadurch gekennzeichnet, daß der bzw. die Laser Festkörperlaser, insbesondere Pb₁ Sn Te-Laser, ist bzw. sind.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 25» dadurch gekennzeichnet , daß die Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung (3) mit einer Strahlungsbündelausblendvorrichtung (9) zum Ausblenden eines ersten und zweiten Infrarotstrahlungsbündels (10,11) versehen ist, wobei im Strahlengang des ersten Infrarotstrahlungsbündels (10) ein erstes Interferenzfilter (12), das nur Infrarotstrahlung der ersten Wellenlänge (^₁) durchläßt, und im Strahlengang des zweiten Infrarotstrahlungsbündels (11) ein zweites Interferenzfilter (13), das nur Infrarotstrahlung der zweiten Wellenlänge (9\p^ durchläßt, vorgesehen ist; und daß eine Strahlumlenk- und -zusammen-

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führungsvorrichtung (14,15) zum Vereinigen der beiden Infrarotstrahlungsbündel (10,11) zu einem einzigen, die Probe (2) durchsetzenden Infrarotstrahlungsbündel (5) vorgesehen ist (Fig. 6 und 7).
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 25» dadurch gekennzeichnet , daß die Infrarotstrahlungsbündelerz eugungseinrichtung (3) mit einer Strahlungsbündelausblendvorrichtung (9) zum Ausblenden eines einzigen Infrarotstrahlungsbündels (5) versehen ist, in dessen Strahlengang ein Doppelband-Interferenzfilter (29) vorgesehen ist, das nur Infrarotstrahlung der ersten und zweiten Wellenlänge ('λ _r^₂) durchläßt (Fig. 8).
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 25> dadurch gekennzeichnet , daß die Infrarotstrahlungsbündelerzeugungseinrichtung (3) niit einer Strahlungsbündelausblendvorrichtung (9) zum Ausblenden eines einzigen Infrarotstrahlungsbündels (5) versehen ist, das ohne Wellenlängenselektion durch die Probe (2) verläuft (Fig. 9).
29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 25» dadurch gekennzeichnet , daß die Infrarotstrahlungsbündel er ζ eugungseinrichtung (3) zwei monochromatische Infrarotstrahlungsquellen (8) aufweist, und mit einer Strahlungsbündelausblendvorrichtung (9) zum Ausblenden eines ersten Infrarotstrahlungsbündels (10) von der einen Infrarotstrahlungsquelle (8) sowie eines zweiten Infrarotstrahlungsbündels (11) von der anderen Infrarotstrahlungsquelle (8) versehen ist; und daß eine Strahlumlenk- und -zusammenführungsvorrichtung (14,15) zum Vereinigen der beiden Infrarotstrahlungsbündel (10,11) zu einem einzigen, die Probe (2) durchsetzenden Infrarotstrahlungsbündel (15) vorgesehen ist (Fig. 10).
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet , daß im Strahlengang des ersten und zweiten Infrarotstrahlungsbündels (10,11)

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oder des einzigen Infrarotstrahlungsbündels (5) ein Chopper (16) zum Modulieren der Infrarotstrahlung mit einer einzigen Chop-Frequenz (f) vorgesehen ist (Fig. 7 und 9).
31. Vorrichtung nach Anspruch 26 oder 29, dadurch gekennzeichnet , daß im Strahlengang des ersten und zweiten Infrarotstrahlungsbündels (10,11) ein Chopper (16) zum Modulieren des ersten Infrarotstrahlungsbündels (10) mit einer ersten Chop-Frequenz (f*) und zum Modulieren des zweiten Infrarotstrahlungs"bündels (11) mit einer zweiten Chop-Frequenz (fp) vorgesehen ist (Fig. 6 und 10).
32. Vorrichtung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet , daß in der Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung (4) ein wellenlängenselektiver Strahlenteiler (22) zum Aufteilen des einzigen Infrarotstrahlungsbündels (5) in ein erstes und zweites Infrarotstrahlungsbündel (23, 24) vorgesehen ist, wobei das erste Infrarotstrahlungsbündel (23) auf einen ersten Infrarotstrahlungsdetektor (25) und das zweite Infrarotstrahlungsbündel (24) auf einen zweiten Infrarotstrahlungsdetektor (26) gerichtet ist, denen je ein Lock-in-Verstärker (27,28) nachgeschaltet ist, deren Ausgänge an die Divisionsschaltung (6) angeschaltet sind (Fig. 7 und 9).
33· Vorrichtung nach Anspruch 28 und 32, dadurch gekennzeichnet , daß im Strahlengang des ersten Infrarotstrahlungsbündels (23) zwischen dem Strahlenteiler (22) und dem ersten -Infrarotstrahlungsdetektor (25) ein erstes Interferenzfilter (12) angeordnet ist, das nur Infrarotstrahlung der ersten Wellenlänge (# ^) durchläßt, während im Strahlengang des zweiten Infrarotstrahlungsbündels (24) zwischen dem Strahlenteiler (22) und dem zweiten Infrarots trahlungsdetekt or (26) ein zweites Interferenzfilter (13) angeordnet ist, das nur Infrarotstrahlung der zweiten Wellenlänge (^₂) durchläßt (Fig. 9).

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GOPY

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34. Vorrichtung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet , daß in der Infrarotstrahlungsdetektoreinrichtung (4) ein einziger Infrarotstrahlungsdetektor (19) für das von der Probe (2) herkommende einzige Infrarotstrah«- lungsbündel (5) vorgesehen ist, dem zwei parallele Lock-in-Verstärker (20,21) nachgeschaltet sind, von denen der eine auf die erste Chop-Frequenz (f₁) und der andere auf die zweite Chop-Frequenz (fp) abgestimmt ist; und daß die Ausgänge der Lock-in-Verstärker (20,21) an die Divisionsschaltung (6) angeschaltet sind (Fig. 6).

35· Vorrichtung nach Anspruch 26 oder 27 oder nach einem der Ansprüche 30 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Interferenzfilter (12,13;29) in dem infragestehenden Infrarotwellenlängenbereich (^₁₁A₉) eine Halb*

—1
wertsbreite von 10 cm oder weniger, vorzugsweise von 5

_<j
cm oder weniger, haben.

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