DE2953524A1

DE2953524A1 - Biologisches messverfahren

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Publication number: DE2953524A1
Application number: DE19792953524
Authority: DE
Inventors: Howard Maurice West Newton Mass. Shapiro
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1978-04-20
Filing date: 1979-04-12
Publication date: 1981-08-06
Also published as: FR2467402B1; GB2097530B; CH639776A5; IE47975B1; FR2467402A1; CA1132890A; EP0005032A2; US4343782A; DE2953524C2; JPH0152699B2; NL7915051A; SE455343B; IE790802L; IT8086278A0; JPS54151895A; SE8008648L; BE84T1; EP0005032A3; IT1148234B; GB2097530A

Description

PATENTANWALT

D R.HERMANN O.TH.DIEHL • MÖNCHEN \9 -FlOGGENSTt.

Anmelder:

Howard Maurice Shapiro West Newton Massachusetts

USA

Biologisches Meßverfahren

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Anmelder:

Howard Maurice Shapiro

West Newton Massachusetts

USA

Biologisches Meßverfahren

Die Erfindung betrifft ein biologisches Meßverfahren bzw. Bestimmungsverfahren, insbesondere ein Verfahren für die Registrierung und Messung der Zellreaktion auf bestimmte extrazelluläre Substanzen. 5

Es ist bekannt, daß der Zellinhalt von tierischen und pflanzlichen Zellen in bezug auf die Umgebung elektrisch negativ geladen ist. Die Größe dieser Potentialdifferenz liegt im allgemeinen zwischen 5 und 90 mV, wobei der größte Teil des Potentials über die Zellmenbran entwickelt wird.

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.-■ -ΛΟ - ν -..-

Die Zellmembranpotentiale ändern sich in unterschiedlicher Weise mit dem physiologischen Zustand der Zelle. Da der Verbrauch der metabolischen Energie erforderlich ist, um die Potentiale aufrechtzuerhalten, verringert sich die Höhe des Potentials über die Membran bei einer verletzten oder einer toten Zelle. Zu Änderungen größerer Spezifität im Membranpotential kommt es innerhalb von Minuten bei der Wechselwirkung der Zellen mit sehr vielen unterschiedlichen Substanzen oder Liganden, die mit relativ hoher Affinität eine Bindung mit spezifischen Transmembranrezeptoren eingehen.

In der Zellbiologie hat sich vor kurzem gezeigt, daß hinsichtlich der Liganden und Rezeptoren eine Basisform des Austausches zwischen den Zellen von lebenden Vielzellersystemen ausgelöst wird durch extrazelluläre Liganden oder chemische Überträger bzw. Wirkstoffe. Diese chemischen Überträger können sowohl aus speziellen Geweben innerhalb des Organismus oder auch von externen Quellen stammen. Ihre chemischen Strukturen und die Orte der Wirkung variieren stark. Sie können eine Beeinflussungszone über einen schmalen Bereich von wenigen 100 Angström (z.B. die neuromuskuläre Vereinigung) oder über den gesamten Organismus (z.B. Blutwirkstoffe, wie Hormone) aufweisen.

Bei neuen biochemischen Untersuchungen ist nun gefunden worden, daß viele dieser chemischen Überträger eine Zwischenfläche zwischen der Zelle, die den Reiz bzw. den Impuls über die selektive Kupplung erhält und den Rezeptoren, die sich an der Außenfläche der Zelle befinden, bilden. Es wird angenommen, daß der Rezeptor den chemischen Überträger aufgrund

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dessen stereochemischen Aufbaus und/oder der spatialen Verteilung seiner geladenen oder chemisch aktiven Gruppen erkennt. Auf diese Weise wird der Ligand und der Rezeptor über eine Schloß-Schlüssel-Beziehung nicht kovalent gebunden. Als Ergebnis des Bindungsvorganges kommt es zu einer intrazellulären biochemischen oder biophysikalischen Änderung, so daß in der Zelle ein methabolischer oder physiologischer Prozess ausgelöst oder beendet wird. Als Liganden sind z.B. Substanzen geeignet, wie Acetylcholin, Epinephrin und Norepinephrin (Neurotransmitter), Insulin, Wachstumshormon und Thyrotropin (Hormone), Histamin, Antigene, Proteine des Immunsystems oder Proteine davon, Viren, Bakterien, einige Zellgifte und Sperma. Für viele dieser Substanzen gibt es natürliche oder synthetische Antagonisten, d.h. eine Substanz, die die physiologische Wirkung der korrespondierenden Substanz aufhebt oder an die Rezeptoren gebunden wird, wodurch die Bindung der natürlichen Substanz ausgeschlossen wird. Natürliche oder synthetische Agonisten sind bekannt. Ein Agonist ist eine Substanz, die gebunden an den Rezeptor eine physiologische Zellreaktion ähnlich der des natürlichen Liganden auslöst. Viele Drogen, die üblicherweise in der medizinischen Praxis verwendet werden, sind Agonisten oder Antagonisten der natürlichen Liganden.

In vielen Fällen kann die Reaktion, die in Zellen nach dem Bindungsvorgang des Liganden an die spezifischen Rezeptoren ausgelöst wird, durch eine Reaktion der Zellen mit anderen Substanzen, die mit den Rezeptoren verbindbar sind, z.B. mit einigen Pflanzenlectinen oder mit Antikörpern, hergestellt gegen isolierte Rezeptoren, verdoppelt werden. Es ist auch möglich, eine derartige Zellreaktion durch Addition von Mitteln auszulösen, die das Membranpotential in der gleichen Richtung

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ändern, wie bei der folgenden Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehung.

Es wird daher ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Ermittlung und Messung des intrazellulären Effekts einer Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehung gewünscht, da dieses Verfahren außerordentlich nützlich für die biochemische Forschung und für diagnostische Untersuchungen ist. Aufgrund der Unterschiedlichkeit der Rezeptorspezifität bei an sonsten homogenen Zellkulturen und wegen der sehr großen Zahl unterschiedlicher chemotaktischer Mittel wäre ein solches Meßverfahren ideal geeignet für die Prüfung individueller Zellen.
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Es sind verschiedene direkte und indirakte Verfahren für die Bestimmung der Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehungen bekannt. Bei einer Klasse von bekannten Verfahren werden radioaktivmarkierte oder fluoreszierende Liganden verwendet. Diese Liganden werden in eine Zellsuspension inkubiert und nach dem Herauswaschen der nicht gebundenen Liganden wird die Radioaktivität oder die Fluoreszenz der Zellmasse geprüft. Da bei diesen Verfahren markierte Liganden eingesetzt werden, ist dieses Verfahren in seiner Einsatzmöglichkeit erheblich begrenzt. Bei einer anderen Klasse von Meßverfahren wird der Umstand zur Beobachtung genutzt, daß die Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehungen oft von einem Ansteigen der intrazellulären Bildung von Desoxyribonucleinsäure (DNA) begleitet ist. Bei einigen Systemen kann nach der Bindung der Liganden an den Rezeptor z.B. wenn man Lymphocyten mit einem Antigen oder Mitogenen z.B. Phythohemagglutinin stimuliert, das DNA-Niveau messen und dann mit dem DNA-Niveau einer Vergleichszellmasse, in der keine Ligand-Rezeptor-

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Wechselbeziehung stattgefunden hat, vergleichen. Das relative Niveau der Desoxyribonucleinsäure ist ein Maß für die Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehung. Dieses bekannte Verfahren ist in seiner Anwendung ebenfalls begrenzt, da die Bildung der DNA im allgemeinen nicht für einige Stunden oder noch nach Tagen nach der Ligandenbindung bzw. -Kupplung meßbar ist.

Eine andere bekannte Klasse von Verfahren für die Bestimmung einiger Arten von Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehungen basiert auf Änderungen in der Struktur der Cytoplasmamatrix, die bestimmt wird durch die Messung der Polarisation der Fluoreszenz des intrazellulären Fluorescins. Um eine Analyse nach diesen Methoden durchzuführen, müssen die Zellen in der Lage sein, intrazelluläres Fluorescin durch enzymatische Hydrolyse von Fluorescindiacetat oder einer ähnlichen Verbindung zu bilden. Diese Verfahren sind technisch schwierig durchzuführen und die Ergebnisse sind sehr schwierig zu interpretieren. Außerdem erfordert dieses Verfahren eine metabolische Modifikation eines Mittels durch die Zellen, das noch nicht vollständig erforscht ist.

Es ist seit langem bekannt, daß erregbare Zellen z.B. Nervenzellen und Muskelzellen ^ine sehr schnelle Änderung des Membranpotentials anzeigen, wenn sie mit einem Neurotransmitter stimuliert werden. Seit kurzem ist jedoch auch bekannt, daß die Membranpotentialänderungen, die durch eine physiologische Stimulation induziert werden, nicht auf diese speziellen Zellen begrenzt sind. Es ist festgestellt worden, durch Einführung einer Mikroelektrode in nicht erregbare Zellen, daß Membranpotentialänderungen verbunden sind mit einer Ligand-Rezeptor-Wechse!wirkung. Es

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ist beobachtet worden, daß die physiologische Reaktion, die bei nicht erregbaren Zellen nach dem Bindungsvorgang eines Liganden an einen Rezeptor eintritt, manchmal verdoppelt werden kann durch die Zugabe von Mitteln zu der Zellsuspension, die das Membranpotential in der gleichen Richtung verändern wie die nachfolgende Ligand-Rezeptor-Kupplung. Es sind auch neue Methoden zur Beobachtung dieser Änderungen entwickelt worden. In Biochemistry, Vo. 13, Nr. 16, 1974, Seite 3315 ist z.B. ein photometrisches Verfahren zur Messung der Änderungen im Membranpotential von Zellsuspensionsansätzen beschrieben. Nach diesem Verfahren wird die Zellsuspension mit einem Cyanin oder einem anderen Farbstoff, der positiv geladen ist, und der geeignet ist, die Lipidschicht der Zellmembran zu durchqueren, inkubiert. Die Verhältnisse der intrazellulären zu den extrazellulären Farbstoffkonzentrationen ändern sich mit den Änderungen der Zellmembranpotentiale. Wenn die Zellen hyperpolarisiert werden, d.h. je negativer das Zellinnere wird, desto mehr Farbstoff-Moleküle treten in die Zellen ein. Bei diesem bekannten Verfahren werden die Farbstoffe in Konzentrationen verwendet, so daß die intrazellulären Farbstoffmoleküle nicht-fluoreszierende Aggregate bilden und die Fluoreszenz der freien Farbstoffmoleküle im Suspensionsmedium gegen denjdunkleren Hintergrund der Zellen gemessen wird. Die Fluoreszenz fällt mit der Hyperpolarisation der Zellen ab. Wenn nur ein kleiner Teil der Zellen in der Suspension gegenüber einem gegebenen Liganden sensibilisiert ist, dann zeigt nur dieser Teil der Zellen eine Änderung im Membranpotential. In diesem Fall ändert sich die Farbstoffkonzentration in dem Medium nicht merkbar, so daß die Änderung in der Fluoreszenz des extrazellulären Farbstoffs nicht

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meßbar ist. Darüber hinaus ist dieses Verfahren nicht geeignet, für die Identifizierung von hinsichtlich eines Liganden sensibilisierter individuleller Zellen.

Aus Journal of Membrane Biology, Vol. 33, Seite 141 (1977) ist die Verwendung von Merocyaninen, Oxonol und Cyaninfarbstoffen zur Messung schneller Änderungen von Membranpotentialen in erregbaren Zellen z.B. Riesenaxonen des Squid-Nervensystems bekannt. Es wurde beobachtet, daß lineare Änderungen in der Absorption, Fluoreszenz, Dichroismus und der Doppelbrechung der Farbstoffe zusammen mit den Änderungen im Membranpotential vorkommen. Die geeignetsten Farbstoffe für diese Messungen sind die Merocyanine, die negativ geladen sind und daher nicht zu leicht durch die Zellwände hindurchtreten. Im allgemeinen färben diese Farbstoffe außer den erregbaren Nervenzellen und Muskelzellen keine anderen Zellmembranen. Merocyanine färben jedoch auch einige nicht erregbare Zellmembranen, ζ,Β. Immatur-und Leukemieblutzellen, wobei die Anfärbung unabhängig von einer Änderung des Zellmembranpotentials ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein biologisches Meßverfahren auf Basis einer nicht intrusiven Messung der Änderungen des Membranpotentials von individuellen Zellen zur Verfügung zu stellen, insbesondere ein schnelles empfindliches und vielseitiges biologisches Meßverfahren, daß die Ermittlung des Auftretens und der Vorherbestimmung der Zellreaktion bei Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehungen betrifft. Es soll ein Verfahren zur Ermittlung der Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehungen in individuellen, nicht erregbaren Zellen zur Verfügung gestellt werden. Aufgabe der Erfindung ist es weiterhin, neue Verfahren zur Aufzeichnung

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potentieller aktiver Drogen, für die Diagnose physiologischer Fehlfunktionen von Geweben und für Allergietests und Gewebeverträglichkeit-Tests zur Verfügung zu stellen. Die Erfindung betrifft ein biologisches Meßverfahren, das gekennzeichnet ist durch die folgenden Verfahrensschritte:

a) Bestimmung einer individuellen Charakteristik einer oder mehrerer nicht erregbarer Zellen über eine nicht intrusive Methode, wobei die Charakteristik wiedergegeben ist durch das Membranpotential und

b) Vergleich der Zellcharakteristik mit einer Vergleichscharakteristik zur Bestimmung der Unterschiede in den Membranpotentialen der individuellen Zellen.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung betreffen ein schnelles, empfindliches und nicht intrusives Verfahren für die Ermittlung der Zellmembranpotentialänderungen in nicht erregbaren Zellen und die Vorbestimmung der physiologischen Reaktion von nicht erregbaren Zellen auf die Modifikation durch physikalische, pharmakologische, biologische oder chemische Mittel. In einem Fall ist die Potentialänderung begründet durch die Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehung und in einem anderen Fall ist die Änderung nicht spezifisch, z.B. nach einer Verletzung der Zellen.

Der Nachteil der bekannten Verfahren liegt darin, daß die physiologische Reaktion einer gegebenen Zelle auf die Bindung eines spezifischen Liganden oft schwierig oder gar nicht bestimmbar ist und oft erst nach Stunden oder Tagen nach der Wechselwirkung in Erscheinung tritt. Dagegen kommt es zur Änderung des Ionenstroms über die Membran der Zelle und der sich daraus ergebenden Änderung des Membranpotentials innerhalb einer

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kurzen Zeit, üblicherweise in einer Zeit weniger als eine Stunde. Diese Ausgestaltung der Erfindung betrifft die Bestimmung der Charakteristik von individuellen Zellen, dargestellt durch das Membranpotential der Zellen, dem Vergleich der Charakteristik zu einer Vergleichscharakteristik zur Ermittlung der Unterschiede im Membranpotential und Verwendung der beobachteten Änderungen als Anzeichen für den Ablauf einer Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung. Unter Berücksichtigung der großen Zahl von Substanzen, die als chemische Überträger aktiv sind, der beobachteten Vielfalt der Rezeptororte an individuellen Zellen von gegebenen Zellkulturen und der Vielzahl der physiologischen Reaktionen von individuellen Zellen auf spezifische Liganden ist es ein wesentlicher Vorteil, daß die Reaktion bzw. die Antwort von individuellen Zellen im Gegensatz zu Zeilsuspensionsansätzen auf die Behandlung mit Liganden bestimmbar ist.

Die Erfindung betrifft daher Verfahren

1) für die Bestimmung der Anwesenheit oder der Abwesenheit von spezifischen Rezeptoren für einen bestimmten Liganden in einer Zelle oder allen Zellen einer Zellkultur,

2) für die Bestimmung der Anwesenheit oder der Abwesenheit einer Mischung von Substanzen eines spezifischen Liganden von dem bekannt ist, daß er mit Teilen einer gegebenen Zellkultur in Wechselwirkung tritt,

3) für das Studium der kumulativen Effekte von Kombinationen von Liganden auf Zellen,

4) für den Vergleich der Effekte von zwei oder mehreren Liganden auf eine vorgegebene Zellkultur und

5) zur Bestimmung der Anzeige des physiologischen Zustands einer Zellkultur oder Zellsubkultur nach der Behandlung mit einem vermutlichen Gift oder

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einer anderen Substanz.

Da viele der Verfahren zur Bestimmung der Änderungen des Membranpotentials nicht zerstörend sind, können die Verfahren in Kombination mit einer Zellsortierung verwendet werden zur Herstellung von Zellkulturen/ die reich sind an Zellen mit den gewünschten Rezeptorspezifitäten,um ί so das Zellwachstum zu garantieren.

Erfindungsgemäß werden nicht erregbare Zellen, wie sie typischerweise in Suspensionen vorliegen, mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die einen oder mehrere aktive Liganden enthält oder von der man annimmt, daß sie diese Liganden enthält. Die Mischung wird unter Bedingungen, bei denen sich Komplement-Zellrezeptoren und Liganden miteinander verbinden, inkubiert, um eine physiologische Änderung in den Zellen, in denen es zur Kupplung kommt, zu induzieren. Vor, nach oder während der Inkubation wird eine Charakteristik, dargestellt durch das Zellmembranpotential der individuellen Zellen, aufgenommen. Die ermittelte Charakteristik wird verglichen mit einer Vergleichscharakteristik, um die Veränderungen in den Membranpotentialen zu bestimmen und so die gewünschte Information zu erhalten.

Die Gegenwart oder Abwesenheit eines Liganden in einer Lösung kann bestimmt werden durch die Inkubation der Lösung mit einer Zellkultur einschließlich wenigstens einer Zellsubkultur, von der bekannt ist, daß sie Rezeptoren für die fraglichen Liganden enthält, Aufzeichnung der Änderungen des Zellmembranpotentials in jeder Zelle der Zellkultur und Vergleich der Verteilung der Membranpotentialänderungen, sofern welche auftreten, der Zellen mit den Ergebnissen einer Vergleichscharakteristik einer parallelen Vergleichsprobe, die

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eine authentische Probe des fraglichen Liganden enthält. Durch die erfindungsgemäße Methode wird auch ein Anzeichen für die Ligandenkonzentration in der zu untersuchenden Probe gegeben.
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Die Gegenwart und die Frequenz der Zellen, die mit einem bekannten Liganden in einer heterogenen Zellkultur reagieren, kann in ähnlicher Weise dadurch bestimmt werden, daß man die Änderungen im Membranpotential zwisehen den Teilnehmern der Zellkultur vergleicht. Durch die Kombination dieses erfindungsgemäßen Verfahrens mit bekannten Verfahren zur Zellsortierung ist dem Forscher eine Möglichkeit an die Hand gegeben, Zellkulturen herzustellen, die relativ homogen hinsichtlieh der Sensibilisierung gegenüber einem spezifischen Liganden sind.

Nach einer Ausgestaltung der Erfindung kann die physiologische Reaktion einer nicht erregbaren Zellkultur auf die Behandlung mit zwei oder mehreren chemisch bestimmten Liganden vorhergesagt werden und verglichen werden durch die Inkubation von Lösungen entsprechender Liganden in mehrzelligen Proben, Aufzeichnung der Richtung der Höhe und/oder der Zeit des Ablaufs der Änderungen im Membranpotential in den individuellen Zellen hinsichtlich der Zellprooen und Vergleich der Messungen der Proben. Diese Technik kann z.B. verwendet werden zur Auslese von synthetischen Substanzen, bei denen man erwartet, daß sie Agonisten oder Antagonisten zu den natürlichen Liganden sind und um die Veränderung in der Zellreaktion von ähnlichen Zellen gegenüber funktionell oder strukturell ähnlichen Liganden zu bestimmen.

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Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung kann der kumulative Effekt der Behandlung von zwei oder mehreren bestimmten chemischen Liganden zu einer Kultur von nicht erregbaren Zellen sehr schnell geprüft werden durch die Inkubation der Liganden und der Zellkultur, der Aufnahme der Änderungen im Zellmembranpotential der individuellen Zellen und Vergleich der aufgenommenen Potentialänderungen z.B. zu den Ergebnissen von Parallelversuchen mit individuellen Liganden oder der Aufzeichnung der vorherbestimmten Zellreaktion gegenüber einem oder mehreren der individuellen Liganden. Dieses Verfahren dient zur Entdeckung von Drogen, die als Agonisten oder Antagonisten zu natürlichen Liganden wirken und zur Ermittlung ihrer optimalen Dosen.

Nach einer Ausgestaltung der Erfindung kann die Giftwirkung verschiedener Mittel auf Zellen abgeschätzt werden durch die Messung des Membranpotentials nach dei^Behandlung der Zellen mit diesen Mitteln. Das Membranpotential einer verletzten Zelle muß innerhalb der Zeit auf Null abfallen, in der die Membran zerstört ist. Geringere Verletzungen sind durch einen Abfall der Höhe des Membranpotentials im Vergleich zu unverletzten Zellen feststellbar.

Es sind verschiedene nicht intrusive Verfahren geeignet für die Bestimmung und Messung des Membranpotentials in individuellen nicht erregaren Zellen. Bei einem besonders geeigneten Verfahren werden entweder membrandurchlässige oder membrangebundene Farbstoffe, die sich mit individuellen Zellen assoziieren, verwendet und die merkliche optische Charakteristiken aufweisen,

die sich änderny wenn sich das Membranpotential ändert. 35

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So verteilen sich z.B. ionische membranpermeante Farbstoffe, wenn sie in Zellen inkubiert sind, sehr schnell gleichmäßig auf den gegenüberliegenden Seiten der Zellmembranen in Abhängigkeit von dem Membranpotential. Dann wird eine Messung der intrazellulären Farbstoffkonzentration vorgenommen über eine photometrische Messung der Fluoreszenz, der Absorption oder anderer optischer Eigenschaften des Farbstoffs innerhalb der individuellen Zelle und anderer Daten der individuellen Zelle, z.B. des Zellvolumens, die ebenfalls bekannt sein müssen, um die intrazelluläre Farbstoffkonzentration zu bestimmen. Dort wo die verglichenen Zellen homogen hinsichtlich des Volumens sind, ist die Messung der Menge des intrazellulären Farbstoffs proportional dem Membranpotential. Die photometrische Messung kann durchgeführt werden durch übliche Mikrophotometrie oder durch Fließzytometrie. Wenn es sich bei der zu bestimmenden optischen Eigenschaft um die Fluoreszenz handelt, dann wird vorzugsweise ein Farbstoff verwendet, der ausgewählt ist aus Farbstoffe, die eine ansteigende Wirksamkeit des Fluoreszenzquantums in Lösungsmitteln mit abfallender Polarität aufweisen und die Konzentration des Farbstoffs in dem Medium wird so eingestellt, daß die intrazelluläre Fluoreszenz-Inaktivierung durch die Bildung von Komplexen mit verringerter Fluoreszenz verhindert wird. Geeignete fluoreszierende Farbstoffe sind die kationischen Cyaninfarbstoffe, z.B. das 3,3'-Dihexyl-2,2^l-oxacarbo-

cyanin (diO-C,-(3)).
ο

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der folgenden Zeichnungen näher erläutert, wobei diese Zeichnungen nur beispielhaft sind und keine Beschränkung

des Anmeldungsgegenstandes darstellen. 35

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Fig. 1 zeigt die graphische Darstellung der Verteilung der Zellfluoreszenzintensität eines ersten Anteils einer menschlichen Lymphocyten-Zellsuspension,inkubiert mit 5.10~ M 3,3'-Dihexyl-2,2'-oxacarbocyanin (diO-C,-(3)). In dieser graphischen Darstellung und in den folgenden Darstellungen zeigt die Ordinate die Zahl der Zellen mit einer besonderen Intensität an und auf der Abszisse ist die Fluoreszenzintensität aufgetragen;

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Verteilung der Zellfluoreszenzintensität eines zweiten Anteils der Zellsuspension,inkubiert simultan mit 2 · 10 M depolarisierendem

_Q

ionophoren Gramicidin und 5 · 10 M diO-C_£-(3));

Fig. 3 zeigt eine graphisphe Darstellung der Verteilung der zellulären Fluoreszenzintensität eines dritten Teils der Zellsuspension,in

kubiert simultan mit 6 · 10~ M hyperpolari-

sierendem ionophoren Valinomycin und 5 . 10 M

diO-C⁶-(3));

Fig. 4 zeigt die graphische Darstellung der Verteilung der zellulären Fluoreszenzintensität eines vierten Anteils der Zellsuspension,inkubiert gleichzeitig mit 10 jig/ml einer Lösungdes Liganden Contanavalin A und 5 · 10 M diO-C^.-(3)) ;

Fig. 5 zeigt die graphische Darstellung der Verteilung der zellulären Fluoreszenzintensität eines fünften Anteils der Zellsuspension, inkubiert gleichzeitig mit 20 ug/ml einer Lösung des

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— 8 Liganden phytohemagglutinin und 5 · 10 M

diO-C₆-(3));

Pig. 6 zeigt die graphische Darstellung der Verteilung der zellulären Fluoreszenzintensität

einer Anzahl von Zellen mit einem gegebenen Fluoreszenzsignal gegenüber der Fluoreszenzintensität_/gemessen an einem Anteil von T-Lymphocyten, im Gleichgewicht stehend mit

5 · ICf⁸M diO-C,-(3));

Fig. 7 zeigt die graphische Darstellung der Verteilung einer zellulären Fluoreszenzintensität nach der Zugabe von Phytohemagglutinin unter Bildung einer Konzentration von 20 jug/ml,

wobei der Depolarisierungseffekt dieses Lectins an einer Subkultur der T-Zellen gezeigt ist;

Fig. 8 zeigt die graphische Darstellung der Verteilung der zellulären Fluoreszenzintensität einer

— 8 B-Lymphocytenzellsuspension mit 5 * 10 M

diO-C_c-(3)) und

Flg. 9 zeigt die graphische Darstellung des hyperpolarisierenden Effekts von Phytohemagglutinin

an der B-Zellsuspension gemäß Fig. 8, 20 Min. nach der Zugabe von Phytohemagglutinin in einer Konzentration von 20 ug/ml.

Die graphischen Darstellungen wurden aufgezeichnet mit einem Fließcytometer (Cytofluorograph der Firma Ortho Instruments), das mit einem Impulshöhenanalysator verbunden war.

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Das erfindungsgemMße Verfahren ist auf nicht erregbare Zellen anwendbar, d.h. also auch auf andere Zellen als die Zellen von Muskelgewebe und Nervengewebe. Die Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert bzw. geprüft werden sollen, werden nach üblichen Verfahren isoliert und in einem Medium suspendiert, das geeignet ist einen normalen Zellstoffwechsel zu fördern, z.B. eine ausgewogene, sauerstoffhaltige isotonische gepufferte Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,S_f enthaltend Glucose oder andere Nährstoffe und etwa physiologische Konzentrationen an Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumionen. Die Zellen sollten vorzugsweise frei von externen Proteinen z.B. Albumin usw. und anderen Substanzen sein, die eine starke Affinität zu Farbstoffen aufweisen, die verwendet werden, um die Membranpotentialänderungen gemäß dem vorliegenden Verfahren zu bestimmen.

Dem Ziel des Tests entsprechend können die Zellen eine Zellkultur enthalten, die relativ homogen hinsichtlich der physiologischen Funktion (z.B. T-Lynphocyten) oder hinsichtlich der Ligandenspezifität (z.B. Mastzellen sensibilisiert gegenüber IgE Allergenkonplexen) sind. Falls gewünscht, können die Zellen eingeteilt werden in viele Teile, so daß mehrere Bestimmungen des Membranpotentials parallel nebeneinander durchgeführt werden können. Das Membranpotential der Zellen in jedem Teil wird dann nach der Behandlung z.B. mit einer Lösung von verschiedenen Liganden, verschiedenen Konzentrationen von einzelnen Ligandenarten oder einer ligandenfreien Lösung bestimmt, so daß ein Vergleich durchgeführt werden kann. In Abhängigkeit von der Zielrichtung der Untersuchung kann die Lösung,die für die

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Behandlung der Zellen eingesetzt wird, eine unbekannte Lösung sein, bei der man vermutet, daß sie einen Liganden enthält, der für die Zellen in der Probe spezifisch ist, eine authentische Probe eines bekannten Liganden einer bekannten oder unbekannten Konzentration sein, ein unreines Ligandenpreparat sein oder eine Lösung sein, die eine Substanz enthält, bei der man vermutet, daß sie ein Gift für die Zellen oder für eine Subkultur davon darstellt.

Zusätzlich zu der Feststellung bzw. Bestimmung des Ablaufs einer Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung bzw. Bindung ist das erfindungsgemäße Verfahren geeignet für die Ermittlung der folgenden Kategorien von Informationen:

1) Die Anwesenheit einer Subkultur von Zellen in der Suspension, enthaltend Membranoberflächenrezeptoren als Komplement zu einem spezifischen Liganden,

2) die Anwesenheit einer spezifischen Ligandenart in einer Lösung, die geeignet ist, eine Bindung einzugehen mit Rezeptoren, die sich an den Zellen in der Suspension oder einer Subkultur davon befinden,

3) zur Bestimmung des kumulativen Effekts von multiplen Liganden, die in Wechselwirkung treten mit einer gegebenen Zellkultur,

4) ein Vergleich der Reaktion einer Zellkultur oder einer Subkultur davon zur Differenzierung der Arten der Liganden,

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5) des Effekts der Zellebensfähigkeit verschiedener Konzentrationen von toxischen Substanzen oder

6) der Simulation von Zellmetabolismen durch verschiedene Konzentrationen von Nährstoffen, z.B. Aminosäuren oder Zucker.

Hinsichtlich der Systeme, bei denen sich eine Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung abspielt, wird die Information erhalten durch die Inkubation der Zellen mit der Ligandf!nLösung für eine ausreichende Zeit und bei einer geeigneten Temperatur (z.B. Normaltenperatur der Zellen in ihrer natürlichen Umgebung), damit die Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung eintreten kann und es zu einer entsprechenden Änderung im Ionenstrcm über die Zellmembranen kommt.

Dann wird eine Charakteristik jeder Zelle in der Suspension oder jeder Zelle in einem representativen Teil der Suspension, dargestellt durch das Membranpotential,erhalten, ggf. in Intervallen, so daß ein Profil von Potentialänderungen über die Zeit erhalten wird.

Die gemessene Charakteristik wird dann mit einer Vergleichscharakteristik verglichen, um festzustellen, ob eine Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehung bzw. -Kupplung stattgefunden hat und ob die Richtung, die Höhe oder der zeitliche Verlauf der Änderungen nachgeahmt oder antagoniert wurden bei den Änderungen, die in den Zellen bei der Behandlung mit einem bekannten Liganden induziert wurden, oder ob der kumulative Effekt am Membranpotential von zwei oder mehreren Liganden sich unterscheidet von dem eines einzelnen Liganden oder einer unterschiedlichen Mischung von Liganden.

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Die Natur der Vergleichscharakteristik muß notwendigerweise variiert werden in Abhängigkeit von der gewünschten spezifischen Information. Die Vergleichscharakteristik kann aus den Ergebnissen von einer oder mehreren Parallelversuchen mit der Testprobe bestehen. Alternativ dazu kann die Vergleichscharakteristik die Form einer Aufzeichnung einer solchen Prüfung haben, z.B. einer graphischen Darstellung einer Zahl von Zellen, die ein bestimmtes Potential gegenüber der Höhe des Potentials aufweisen.

Die Liganden und ihre Antagonisten verursachen im allgemeinen entgegengesetzte Wirkungen bei den Zellmembranpotentialen. Es werden daher Substanzen gesucht, die geeignet sind den Effekt der natürlichen Liganden an Zellen eines besonderen Gewebes zu kopieren, blockieren oder zu negativieren. Die Richtung, Höhe und/oder der zeitliche Verlauf der Membranpotentialänderungen in einer Zellprobe eines Gewebes können bestimmt werden durch mehrere Messungen nach der Behandlung der Zellen mit dem natürlichen Liganden. Danach werden verschiedene Substanzen zu Teilen der gleichen Zellsuspension hinzugefügt. Durch den Vergleich der Membranpotentialänderungen, die in den entsprechenden Proben induziert werden, kann der Forscher die Proben identifizieren, die für weitere spezifische Untersuchungen geeignet sind, die z.B. die gewünschte physiologische VJirkung aufweisοn, kann die anderen Verbindungen eliminieren. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch geeignet zur Der.t inunung der Parameter, wie der Konzentration des Antagonisten, die benötigt wird, um den Effekt des Membranpotentials einer bestimmten Zellart auf eine gegebene Konzentration des Agonisten zu beseitigen. Diese Messungen sind nützlich für die Entwicklung

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der Liganden und ihrer Antagonisten als Pharmazeutika.

In einigen Fällen existieren verschiedene Arten von spezifischen Rezeptoren für einen bestimmten Liganden. So kann z.B. die Kupplung eines Liganden an Rezeptoren einer Klasse von Zellen zu einer Hyperpolarisation führen, während die Kupplung bzw. Bindung des gleichen Liganden an Rezeptoren einer zweiten Klasse von Zellen zu einer Depolarisation führen kann. Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet zwischen diesen beiden Arten von Wechselwirkungen zu unterscheiden. Bekannte Zeilsortiermethoden in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die Isolierung von Zellinien mit der gewünschten Rezeptorspezifität aus heterogenen Zellkulturen. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens führt in diesem Zusammenhang zu einer erhöhten Selektivität im Vergleich zu üblichen Verfahren für die Sortierung von Zellen auf Basis der Kupplung von fluoreszierend gemachter Liganden, weil der physiologische Effekt als auch die Ligandenkupplung eingearbeitet ist in die Selektionskriterien. Eine zusätzliche Spezifität kann dadurch erhalten werden, daß man die direkte Messung der Kupplung mit optisch markierten Liganden mit der Bestimmung der Änderung im Membranpotential nach der Ligandenkupplung kombiniert.

Wenn die Gegenwart einer besonderen Ligandenart in einer Lösung oder die Gegenwart von Zellen mit einer besonderen Ligandenspezifität von Interesse ist, kann das Membranpotential vor und nach dem Mischen des Liganden und der Zellsuspension abgelesen und die Resultate verglichen werden. Entsprechende Anteile der Zellsuspension können inkubiert werden mit z.B.

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1) einer Lösung, enthaltend eine unbekannte Konzentration eines bestimmten Liganden,

2) einer ligandenfreien Lösung und

3) einer Lösung,enthaltend eine bekannte Konzentration des Liganden.

Nach der Inkubaktion kann ein Anzeichen der Ligandenkonzentration in der unbekannten Lösung erhalten werden durch den Vergleich der Membranpotentiale der Zellen in den entsprechenden Proben. Wenn das Membranpotential der individuellen Zellen bestimmt ist, ist es möglich eine Subkultur von Zellen in der Suspension mit einer ausgewählten Ligandenspezifität zu identifizieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die qualitative und quantitative Bestimmung der zellulären Immunreaktion verwendet werden durch das Messen der Potentialänderungen in Lymphocyten, Macrophagen oder anderen Zellen des Immunsystems nachdem die Zellen mit Substanzen wie Antigenen, Antikörpern, Haptenen, Allergenen und Komplementverbindungen ausgesetzt worden sind. Da die Lymphocyten üblicherweise eine heterogene Zellkultur hinsichtlich ihrer Reaktivität gegenüber einem bestimmten Antigen darstellen, liefert die Fraktion der Zellen, die auf ein bestiumtes Antigen reagieren , ein nützliches Maß für die zelluläre Immunreaktion bzw. -Antwort. Änderungen vom üblichen Bild von Potentialänderungen in leicht reagierenden Zellen können Defekte in der Immunfunktion anzeigen. In ähnlicher Weise kann die Einführung von verschiedenen Allergenen in eine Vielzahl von Proben eines individuellen Serums und die nachfolgende Inkubation der Proben mit Zellen, die an der Excretion des Histamins beteiligt sind, verwendet werden als nicht intrusives Verfahren für die Bestimmung der Sensibilität eines Individuums gegenüber verschiedenen allergenischen Materialien.

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Da beim erfindungsgemäßen Verfahren die Isolierung und Markierung einer speziellen Ligandenspezies für die Bestimmung der Substanzen die für die Bindungsreaktion in den Zellen mit bestimmter Rezeptorspezifitat nicht notwendig ist, ist es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren zu der Ligandenaktivität in unreinen Ligandenpräparaten zu verwenden und die Ligandenaktivität in verschiedenen Fraktionen solcher unreinen Präparate, die zur Reinigung oder Isolierung des gewünschten spezifischen Liganden erhalten werden, zu verfolgen und aufzuzeigen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als Hilfe in der Definierung der chemischen Struktur der Oberfläche der Rezeptoren für die Demonstration der Konkurrenz zwischen den verschiedenen Liganden bekannter Spezifität für die Bindungsplätze an den Zelloberflächen verwendet werden.

Die toxischen Wirkungen verschiedener Substanzen auf die Zellen kann abgeschätzt werden durch die nachfolgende Messung der Membranpotentiale der Zellen nach der Behandlung der Zellen mit diesen Mitteln. Es ist bekannt, daß die Tests für die Lebensfähigkeit der Zellen, basierend auf den Zutritt normalerweise impermeanter Farbstoffe, wie Propidiumjodid nur jene Zellen ermitteln, die zerstört sind. Für viele Fälle, z.B. für die Entwicklung von Pharmazeutika für die Krebsbehandlung ist es sinnvoll zu bestimmen, ob die zukünftige reproduktive Kapazität der Zelle beeinträchtigt ist oder ob eine teilweise Beschädigung durch einen Riss in der Zellmembran stattgefunden hat. Das Potential einer verletzten Zelle muß in der Zeit auf Null abfallen, in der die Membran zerstört ist.

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Geringere Verletzungen sind bestimmbar durch eine Herabsetzung der Höhe des Membranpotentials im Vergleich zu den unverletzten Zellen. Die Verringerung oder die Verhinderung der Zellantwort bzw. Zellreaktion auf Liganden und andere Substanzen, die normalerweise bekannte Änderungen des Potentials verursachen, kann auch durch die Messung der Zellmembranpotentiale ermittelt werden.

Das erfiridungsgemäße Verfahren kann für die Vorherbestimmung der Unterschiede der Aufnahme von Pharmazeutika von unterschiedlichen Zellarten verwendet werden, da die Verteilung der Permeanten bzw. durchdringenden ionischen Verbindungen (z.B. der Pharmazeutika) durch die Zellmembran abhängig ist von dem Membranpotential. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als Korrekturfaktor verwendet werden aufgrund der Unterschiede in der Farbstoffaufnahme, die vorherbestimmt ist auf der Basis der gemessenen Potentialunterschiede, wodurch verschiedene durchdringende ionische Farbstoffe, z.B. Acridine verwendet werden können,für lebende Anfärbungen, für die quantitative Bestimmung verschiedener intrazellulärer Bestandteile, z.B. der Nucleinsäuren und der GlycosaminogIycane.

Alle oben genannten Verfahren erfordern eine schnelle, nicht intrusive und vorzugsweise nicht zerstörende Methode zur Bestimmung des Membranpotentials oder zur Erstellung einer Messung,die proportional ist dem Membranpotential von 10 bis 10 individuellen Zellen in einer üblichen Zellprobe. Die Einführung einer Mikroelektrode in die individuellen Zellen beschädigt notwendigerweise die Zellmembranen und kann daher nicht verwendet werden um das Membranpotential in jeder der

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vielen Zellen in der Zellsuspension zu bestimmen. Bei einer bevorzugten Bestimmungsmethode werden kationische zellmembranpermeante fluoreszierende Farbstoffe verwendet, die sich während der Inkubation aufteilen zwisehen den gegenüberliegenden Seiten der Zellmembranen als Funktion des Membranpotentials. Dann wird die intrazelluläre Konzentration des Farbstoffs oder ein Parameter,der der Konzentration proportional ist, mittels eines optischen Verfahrens mit einem Mikrophotometer oder einem Fließcytometer gemessen. Bei

einer Hyperpolarisation wird die Affinität des Zellinneren für den Farbstoff erhöht, während bei einer Depolarisation die Affinität des Zellinneren für den Farbstoff herabgesetzt wird.
15

Geeignete Farbstoffe für diese Methode sind z.B. kationische Cyaninfarbstoffe, wie 3,3'-Di-n-butyl-9-methyl- und 3,3'-Diethyl-thiacarboeyanine, 3,3'-Diethy1-2,2·-oxaearboeyanin, 2,3,3,1·,3',3'-Hexamethylindocarbocyanin und Dicarbocyanin, 3,3*-Diethylthiadicarbocyanin und vorzugsweise 3,3'-Dihexyl-2,2'-oxaearboeyanin (diO-C_g-(3)). Bei diesen Farbstoffen handelt es sich um handelsübliche Farbstoffe (Fa. Eastman Kodak).
25

Es ist von Vorteil, wenn die ausgewählten Farbstoffe eine erhöhte Wirksamkeit hinsichtlich des Fluoreszenzquantums in Lösungsmitteln mit abfallender Polarität aufweisen und daß die Fluoreszenz und die Absorptionsmaxima des Farbstoffes sich mit den Änderungen in der Polarität des Lösungsmittels verschieben. Diese Eigenschaften erhöhen die Selektivität der Bestimmung der membranassoziierten Farbstoffe innerhalb der Zellen gegenüber dem Hintergrund der farbstofffreien Zellen in der Lösung. Es ist auch von Vorteil, die

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ausgewählten fluoreszierenden Farbstoffe in einer ausreichend geringen Konzentration zu verwenden, um die Auslöschung der Fluoreszenz der intrazellulären Farbstoffe aufgrund der Bildung von Aggregaten zu verringern. Bei der Verwendung des bevorzugt eingesetzten Cyaninfarbstoffs (DiO-C-O)) liegt die Konzentration

⁶ -7 bei oder unterhalb etwa 3 χ 10 M.

Der Farbstoff diO-C,-(3) ist charakterisiert durch

einen Anstieg in der Wirksamkeit des Quantums auf etwa 4,5 in n-Octanol gegenüber wässrigen Lösungen. Seine Absorptions- und Emissionsmaxima in n-Octanol sind um etwa 10 nm höher als in einer wässrigen Lösung. Die Menge des diO-C--(3) in individuellen Zellen wird

bestimmt durch das Maß der Fluoreszenz im Bereich von 504 nm nach der Erregung bei etwa 488 nm. Bei den Cyaninfarbstoffen tritt der gewünschte Einfluß des Lösungsmittels auf die Wirksamkeit des Quantums im allgemeinen mehr bei den Carbocyaninfarbstoffen in Erscheinung, die die allgemeine Formel R-(CH)₃-R¹ aufweisen und nicht zu sehr bei den Di- und Tricarbocyaninen mit der allgemeinen Formel R-(CH)₅-R' und R-(CH)₇-R¹ auf.

Für die Messung der Fluoreszenz kann ein Mikrofluorometer verwendet werden/ besonders schnell und besonders präzise arbeitet jedoch das Fließcytometer. Die Arbeitsweise der Fließcytometrie und der Zellsortierung ist z.B. in Jr. in Science, Vol. 198, Seiten 149 - 157 (1977) beschrieben. Die Fließcytometer, die Argonionenlaserlichtquellen verwenden, sind für die obigen Messungen besonders geeignet. Diese Instrumente werden von verschiedenen Firmen hergestellt. Diese Geräte sind für das automatische Sortieren von Zellen auf der Basis der

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verschiedenen Kriterien wie der Fluoreszenzintensität, der Zellgröße, der Wellenlänge der Fluoreszenz und der Wellenlänge oder der Intensität der Absorption geeignet.
5

Wenn die zu untersuchende Zellkultur relativ homogen hinsichtlich der Größe und der inneren Struktur ist und wenn die Konzentration des zugegebenen Farbstoffs und die Zahl der suspendierten Zellen in dem vorgegebenen Volumen des Mediums relativ konstant gehalten werden, ist die Gesamtmenge des Farbstoffs in einer bestimmten Zelle, gemessen durch die Intensität der Fluoreszenz dieser Zelle direkt proportional der Konzentration und damit des Membranpotentials. Wenn jedoch gemischte Zellkulturen oder unterschiedliche Zellkonzentrationen und/oder Farbstoffkonzentrationen vorliegen, sind zusätzliche Messungen notwendig. Da die intrazelluläre Konzentration des Farbstoffs gleich ist der Gesamtmenge des Farbstoffs in der Zelle geteilt durch das Zellvolumen, wird ein Wert erhalten, der proportional zur Konzentration des Farbstoffs in einer bestimmten Zelle ist, durch die Messung der Gesamtmenge des Farbstoffs wie oben beschrieben und Teilung durch eine Menge die proportional dem ZeIlvolumen ist. Die Messung des Zellvolumens kann gleichzeitig mit der Ablesung der intrazellulären Fluoreszenz im Fließcytometer durch eine elektronische oder optische Messung der Zellgröße vorgenommen werden, z.B. 3/2 der Stärke des Zellquerschnitts, gemessen durch die Streuung des Lichts in einem,Winkel nahe der Achse der Illumination. Es ist von Vorteil, daß bei der Fließcytometrie die Informationen gesammelt, elektronisch manipuliert und automatisch aufgezeigt werden können. Das Cytometergerät bildet ein Signal,

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das der Fluoreszenzintensität entspricht, ein zweites Signal für das Zellvolumen und berechnet dann das Verhältnis der Signale. Dieses Verhältnis, das dem Membranpotential proportional ist, kann dann als Zeilsortierungskriterium verwendet werden und/oder aufgezeichnet werden.

Bei den zu untersuchenden Zellkulturen, die hinsichtlich des Zellvolumens oder der Menge des farbstoffbindenden Materials sehr heterogen sind, kann die Messung, die dem Merabranpotential entspricht, dadurch erhalten werden, daß man zwei Farbstoffe mit unterschiedlichen Affinitäten zu den intrazellulären Komponenten verwendet. In diesem Fall kann die intrazelluläre Fluoreszenz von beiden Farbstoffen gemessen werden. Der Anstieg oder der Abfall im Verhältnis der intrazellulären Farbstoffgehalte ist dann proportional zur Änderung des Membranpotentials und ist unabhängig vom Zellvolumen und Veränderungen hinsichtlich des Gehalts des farbstoffbindenden Materials in den Zellen.

Auch wenn es nach den Prinzipien der Chemie möglich ist, die Effekte und die Änderungen in der Zelle und in den Farbstoffkonzentrationen in den Medien und die intrazelluläre Konzentration der Farbstoffe zu berechnen, so ist es doch einfacher für din Praxis die Verdünnungen so einzustellen, daß' die Zellkonzentrationen und die Konzentration des Farbstoffs in allen Proben, die miteinander verglichen werden, etwa gleich sind.

Es kann zu einer Interferenz mit photometrischen Potentialmessungen kommen, die verursacht werden durch die nicht spezifische Anfärbung des Cytoplasmas von toten Zellen, in denen die Zellmembranen zerstört sind. Wenn

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eine kleine Menge eines normalen nicht durchlässigen Farbstoffs, z.B. Ethidiumbromid oder Propidiumjodid zu dem Medium hinzugegeben wird, wird der Zellkern dieser Zellen mit den zerstörten Membranen angefärbt, während der Farbstoff nicht in die lebensfähigen Zellen eindringt. Da der durchdringende bzw. permeante Farbstoff, der für die Messung des Potentials verwendet wird und der nicht durchdringende Farbstoff, der für die Entdeckung geschädigter Membranen ver wendet wird,unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen, ist es möglich, Korrelationsmessungen von einer oder mehreren optischen Eigenschaften jedes Farbstoffs in jeder Zelle vorzunehmen und so die geschädigten Zellen, die auf diese Weise er mittelt werden, zu eliminieren und von der weiteren Analyse auszuschließen. Wenn als durchdringender Farbstoff vorzugsweise das diO-C_r-(3) und als nicht durch-

dringender Farbstoff das Propidiumjodid verwendet wird, dann emitiert der Zellkern der geschädigten Zellen eine rote Fluoreszenz im Bereich von 610 nm nach der Erregung mit einer Strahlung von 488 nm. Diese Fluoreszenz ist von einem Beobachter oder von einem Photometer leicht von der grünen Fluoreszenz des diO-Cg-(3) zu unterscheiden.

Die photometrischen Messungen des Membranpotentials können kombiniert werden mit anderen Messungen der gleichen Zellen, um die analytische Aussage des Verfahrens zu erhöhen. So kann z.B. die Antwort bzw. die Reaktion der Zellen in verschiedenen Phasen des ZeIlzykluses gegenüber einem bestimmten Liganden bestimmt werden durch das gleichzeitige Anfärben mit diO-C -(3)

und mit einem DNA-Fluorochrom (z.B. Nr. 33342 der Fa. Hoechst AG). 35

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Es ist auch möglich, andere optische Eigenschaften als die Fluoreszenz zu messen, z.B. die Absorption, um so ein Anzeichen für die Menge des Farbstoffs in den individuellen Zellen zu erhalten. In diesem Fall ist es von Vorteil Farbstoffe zu verwenden, die intrazelluläre Aggregate mit Absorptionsmaxima bei Wellenlängen bilden, die unterschiedlich von denen des freien Farbstoffs sind und wobei diese Farbstoffe in ausreichend hoher Konzentration verwendet werden sollten, so daß eine relativ hohe Fratkion in den Zellen in Form der Aggregate besteht. Auf diese Weise wird die Selektivität der Bestimmung des intrazellulären Farbstoffs gegenüber dem Hintergrund des freien Farbstoffs in der Lösung verstärkt. Die Eigenschaften weisen unter bestimmten Bedingungen z.B. die Thiacarbocyaninfarbstoffe auf, z.B. das 3,3'-Diethyl- und S^'-Dipropylthiadicarbocyanin. An rote Blutkörperchen gebunden_/weisen die obigen Farbstoffe eine neue Absorptionsband von 590 nm auf, die wahrscheinlich durch einen Komplex des intrazellulären Farbstoffs mit Hemoglobin bewirkt wird. Die Absorption der Zellen bei dieser Wellenlänge kann daher zur Bestimmung der Menge des Farbstoffs innerhalb der individuellen Zellen verwendet werden.

Auch wenn die photometrische i1«ssung der Aufnahme der kationischen Farbstoffe die bevorzugte Methode für die Messung der Änderungen des Membranpotentials ist, können aber auch andere Verfahren verwendet werden.

so können z.B. dann wenn das Zellinnere von nicht erregbaren Zellen negativ gegenüber der Umgebung ist, anionische Farbstoffe, die eine Affinität für Lösungsmittel mit steigender Polarität aufweisen, verwendet werden. In diesem Fall weist der Farbstoff eine

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Affinität zu intrazellulären Verbindungen unabhängig von ihrer Ladung auf und wird in der Zelle absorbiert. Die Konzentration dieses Farbstoffs wird herabgesetzt bei einer Zell-Hyperpolarisation und erhöht sich bei einer Zell-Depolarisation.

Es können auch nicht photometrische Verfahren zur Bestimmung des Membranpotentials verwendet werden. In diesem Fall sind die Änderungen im Membranpotential in an sich bekannter Weise durch Verwendung von

14 radioaktiv markierten Kationen, z.B. C oder mit Tritium markierten quartären Ammoniumsalzen oder Phosphoniumsalzen bestimmt werden. Diese Bestimmungsverfahren sind z.B. beschrieben in Methods of

Enzymology, H.R. Kaback, Academic Press, 1974

(Seite 698) und Changes in Membrane Potential of Human Granulocytes Antecede der Metabolie Response to Surface Stimulation, Proc. Natl. Acad. Sei. Vol. 75, Nr. 8, Seiten 3818-3822, Aug. 1978 (H.M. Korchak et al)und Biochemistry 14:25, 1975 (Schuldiner et al). Die Aufnahme dieser Kationen sowie die Aufnahme der kationischen Farbstoffe ist eine Funktion des Membranpotentials der Zelle. Die intrazelluläre Radioaktivität kann nach dem Waschen der Zellen geprüft werden durch

Ausbreiten einer einzelligen Schicht der Zellen auf

einer Scheibe und Behandlung der Schicht mit einer photographischen Emulsion. Die Vergleiche werden z.B. dadurch hergestellt, daß man eine Kontrollprobe der gleichen Methode aussetzt und dann die erhaltenen Aiioradiographien vergleicht.Der Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, daß die Messung der Änderung des Zellmembranpotentials operativ ist, relativ lange Versuchszeiten für die Bestrahlung der photographischen Emulsion notwendig sind und die Lebensfähigkeit der

Zellen nicht gewährleistet ist.

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■-- ίο -.

Als weiteres nicht photometrisches Verfahren für die Messung des Membranpotentials ist eine Modifikation vorgeschlagen worden, das bei den üblichen elektronischen Zellzählern verwendet wird. In diesen Vorrichtungen werden die individuellen Zellen,suspendiert in einer Salzlösung, durch eine Öffnung geleitet, die zwischen einem Elektrodenpaar angeordnet ist, wobei zwischen den Elektroden und in der suspendierten Lösung ein Strom aufrechterhalten wird. Beim Durchtritt einer Zelle durch die Öffnung wird die Leitfähigkeit der Lösung verändert, was sich in einem bemerkbaren Spannungsimpuls anzeigt. Die Höhe des Impulses zeigt das Zellvolumen an. Da die Zellmembranen mit unterschiedlichen Membranpotentialen üblicherweise auch unterschiedliche Ionenleitfähigkeiten aufweisen, können unter Verwendung von Wechselstrom Signale erhalten werden, die Informationen enthalten, die die Unterschiede in der Ionenleitfähigkeit der Membran der individuellen Zellen, die durch die Düse hindurchgeleitet werden, aufzeigen. Diese Signale können verwendet werden, um die Membranpotentiale der individuellen Zellen zu vergleichen, z.B. mit Hilfe eines Impulshöhenanalysators.

Die Erfindung wird anhand der Beispiele näher erläutert. 25

Beispiel ^

Peripherische Blutlymphocyten wurden aus Spenderblut erhalten und durch Zentrifugieren über Hypaque-Ficoll-Dichtegradienten isoliert. Mittels cytographischer Analyse der roten und grünen Fluoreszenzsignale der Zellen in Anteilen, die mit Acridinorange angefärbt waren wurden die Prozentzahlen an Erythrocyten, Monocyten und Granulocyten in dem Lymphocytenpräparat roh bestimmt. Die Zellzahlen wurden ermittelt und die

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Zeil-*Lebensfähigkeit durch einen Trypanblau-Ausschluß bestimmt.

Es wurden Versuchslösungen mit diO-C_£-(3) aus den ent-

sprechenden Arbeitslösungen in Ethanol mit Konzentrationen

-3 -4

von 10 M oder 5 * 10 M hergestellt. Die Konzentrationen der Versuchslösungen bzw. Arbeitslösungen wurden so eingestellt, daß die Farbstoffkonzentration zwi-

—8 —7

sehen 10 M und 5 · 10 M,wenn 10 ml der Farbstoff lösung zu 1,0 ml der Zellen, verdünnt mit dem Medium 199 (Gibco) gegeben werden, liegen.

Dann wurde Valinomycin (Sigma Chemical Company),ein bekanntes Ionophor für die Hyperpolarisierung von Lymphocyten in Ethanol gelöst, in einer Konzentration von 0,66 mg/ml. Dann wurde Gramicidin (ICN),ein bekanntes Ionophor für die Depolarisierung von Lymphocyten ebenfalls in Ethanol gelöst mit einer Konzentration von 0,4 mg/ml. In einer Phosphat gepufferten

Salzlösung wurden Phytohemagglutinin (PHA, Difco,

2 mg/ml) und Concanavalin A (Con-Α, Sigma, I mg/ml) gelöst. PHA und Con-Α sind bekannte Lectine (Liganden), die geeignet sind menschliche peripherische Lymphocyten zu binden.

Bevor weitere Experimente durchgeführt wurden, wurde die Kinetik der Farbstoffaufnähme der Zellen untersucht. 20 ml einer Farbstofflösung wurden zu 20 ml einer verdünnten Zellsuspension, enthaltend 1 bis 2 ♦ 10

Zellen/ml gegeben. Die Fluoreszenz der Zellen wird

dann mit einem Fließcytometer gemessen. Die Bande der Fluoreszenzverteilung wird bestimmt und ihre Position in 1-Minutenintervallen aufgezeichnet, bis es stabil ist. Dieser Vorgang dauert etwa 12 min, wenn diO-Cg-(3) als Indikatorfarbstoff verwendet wird.

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Die nachfolgenden Versuche sind bestimmt, um das Intervall zwischen der Zugabe des Farbstoffs und des Lectins oder des Ionophors und der Messung der Fluoreszenz konstant zu halten, wobei das Intervall vorzugsweise etwas länger sein sollte als die beobachtete Gleichgewichtszeit. Bei den hier angewendeten Konzentrationen ist für das diO-C,.-(3) eine Periode von 15 bis 20 min ausreichend.

In einem Experiment werden die Fluoreszenzverteilungen von 5 Teilen der Zellsuspension verglichen. Während der Zeit der Farbstoffzugabe (10 ul Versuchslösung diO-C_ß-(3)/ ml Zellen) werden die folgenden Substanzen außerdem hinzugegeben:

a) Keine Zugabe (Kontrollprobe)

b) PHA (10 ml Arbeitslösung; Endkonzentration 20 ug/ml)

c) Con-A (10 ml Arbeitslösung bzw. Versuchslösung; Endkonzentration 10 ug/ml)

d) Valinomycin (10 ml Arbeitslösung; Endkonzentration 6 · 10 M) und

e) Gramicidin (10 ml Arbeitslösung; Endkonzentration 2 · 1O^-5M).

Die Proben werden in Abständen von 3 bis 6 min hergestellt, damit genügend Zeit zur Reinigung des Fließsystems des Fließcytometers zwischen den Proben verbleibt. Die Fluoreszenzmessungen aller Proben wurden unter Verwendung der gleichen Laserapparatur mit den gleichen Verstärkereinrichtungen vorgenommen. Es wurde etwa die gleiche Zahl von Zellen in jeder Probe ge-

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messen und die Fluoreszenzverteilung von allen Proben auf der gleichen Skala des Impulshöhenanalysators aufgezeichnet.

Die Ergebnisse der Experimente sind in den Fig. 1 bis 5 wiedergegeben. Die Flecken bzw. Pünktchen werden erhalten, wenn die Fluoreszenzinformation der Zelle gemessen wird 15 min nach der Zugabe des Farbstoffs und der Lectine oder der Ionophoren. Das diO-C_f-(3)

-8 wird in einer Endkonzentration von 5 · 10 M verwendet.

Die Fig. 1 (Kontrollprobe) zeigt eine Verteilung der intrazellulären Konzentration des Cyaninfarbstoffe zwischen den Zellen der Kultur, dargestellt durch die Verteilung der Intensität der Fluoreszenz (sh. x-Achse).

Das beobachtete Membranpotential der individuellen Teilnehmer der Zellkultur variiert je nach der Stimulation. Die Membranpotentiale sind jedoch verteilt über einen Peak, angezeigt durch die Linie A; dieser Peak stellt eine große Subkultur der Zellen mit einem Zwischenwert des Membranpotentials dar.

In Fig. 2 ist der Effekt der Zugabe des depolarisierenden Ionophorgramicidins wiedergegeben. Die Fig. 2 zeigt, daß die Zahl der Zellen, die eine Verringerung der Fluoreszenzintensität aufweisen, die induziert wird durch die depolarisierende Wirkung des Gramicidins erheblich erhöht ist und außerdem ist eine Verschiebung des Peaks in Richtung des Punkts zu erkennen, der mit B gekennzeichnet ist. Im Gegensatz dazu weisen die Zellen, die mit dem hyperpolarisierenden Ionophor Valinomycin versetzt worden sind (sh. Fig. 3), eine Erhöhung der Frequenz der Zellen mit einer höheren Fluoreszenzintensität auf (vgl. C).

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Wenn man die Fluoreszenzintensitätsverteilung der mit Gramicidin und Valinomycin behandelten Proben mit der Kontrollprobe vergleicht, erhält man ein Anzeichen für die Veränderung der Fluoreszenzsignale, die man erhält nach der maximalen Depolarisation und Hyperpolarisation. Dieses Beispiel zeigt, daß die kationischen Cyaninfarbstoffe in den intrazellulären Volumina der individuellen Zellen als Funktion des Membranpotentials gesammelt werden. 10

Beispiel 2

In Fig. 4 ist der Effekt der Zugabe von Con-Α zu menschlichen Lymphocyten wiedergegeben. Die Lymphocytensuspension ist heterogen hinsichtlich ihrer Antwort bzw. Reaktion auf dieses Lectin. Es enthält eine Zellsubkultur, die bei der Bindung an Con-A hyperpolarisiert wird und eine andere, die depolarisiert wird. Die hyperpolarisierten Zellen weisen einen Anstieg in der Fluoreszenzintensität auf (vgl. B); die depolarisierten Zellen weisen einen Abfall in der Fluoreszenzintensität auf, wie der schwache aber deutlich erkennbare Peak D' zeigt. Die Größe der hyperpolarisierten Zellkultur ist erheblich größer als die der depolarisierten Zellkultur.

Die Zugabe von PHA zu den Zellen führt zu einer Zerteilung in zwei Gruppen von Zellen. Die Breite bimodale Verteilung in Fig. 5 zeigt an, daß eine Subkultur der Zellen depolarisiert wurde durch die Bindung an PHA und zwar in einem Ausmaß, daß das Fluoreszenzsignal der individuellen Zellen herabgesetzt wird und zwar bis zu einem Punkt, wie bei E angegeben. Eine zweite Subkultur der Zellen weist eine noch stärkere Depolari-

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sierung auf, dargestellt durch ein niedrigeres Fluoreszenzsignal bei Punkt E¹.

Beispiel 3

Es wird eine Vorratslösung von PHA und diO-Cg-(3) zu einer Lymphocytenzellsuspension , hergestellt gemäß Beispiel 1, hinzugegeben.Mittels eines Fließcytometers werden dann die Zellen abgetrennt, die eine Fluoreszenzintensität aufweisen, die den Intensitäten von Punkt E und Punkt E¹ in Fig 3 entspricht. Nach einer etwa 15 minütigen Inkubation wird die Suspension in einem Fließcytometer gemessen und erneut zu 3 Zellsuspensionen gelöst. Zwei der Zellsuspensionen sind reich an homogenen Zellen hinsichtlich ihrer physiologischen Reaktion bezüglich der Bindung an PHA.

Beispiel 4

Es wurden B-Zellen-angereicherte und T-Zellen-angereicherte Lymphocytenkultüren (Reinheit etwa 85 %) durch Rosetting (Rosettendifferenzierung), geprUft hinsichtlich ihrer Sensibilisierung gegenüber PHA, hergestellt. Figur 6 zeigt die Fluoreszenzverteilung der T-Zellen in der Suspension vor der Zugabe von Leetin. Figur 7 zeigt die Fluoreszenzverteilung der gleichen Zellsuspension 2o Minuten nach der Behandlung mit PHA der Stammlösung von Beispiel 1. Wie der Figur zu entnehmen ist, führt die Zugabe des Lectins zu einer gleichförmigen Depolarisation der T-Lymphocyten. Im Gegensatz dazu führt, gezeigt in den Figuren 8 (Vergleichsprobe) und 9 (25 Minuten nach der Zugabe von PHA), die PHA-Rezeptor-Wechselwlrkung bei den B-Zellen zu einer gleichförmigen Hyperpolarisation.

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Diese Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren der Erfindung verwendet werden kann, um die physiologischen Reaktionen von unterschiedlichen Zellarten gegenüber einem bestimmten Liganden zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass unterschiedliche Zellarten aufgrund dieser physiologischen Reaktionen gegenüber einem bestimmten Liganden voneinander unterschieden werden können.

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Claims

Patentansprüche

1. Biologisches Meßverfahren,

gekennzeichnet durch

die folgenden Verfahrensschritte:

a) Bestimmung der individuellen Charakteristik einer oder mehrerer nicht erregbarer Zellen, dargestellt durch die Membranpotentiale davon durch ein nicht intrusives Verfahren und

b) Vergleich dieser Zellcharakteristik mit einer Vergleichscharakteristik zur Bestimmung der Unterschiede im Membranpotential der individuellen Zellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt a) die folgenden Verfahrensschritte enthält:

i) Inkubierung der Zellen mit einem Farbstoff, welcher sich mit den individuellen Zellen assoziiert und

ii)Bestimmung des optischen Aussehens bzw. der optischen Eigenschaft des Farbstoffs, der mit den individuellen Zellen assoziiert ist, wobei die optische Eigenschaft das Zellmembranpotential der individuellen Zelle anzeigt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt a) die folgenden Verfahrensschritte enthält:

i) Inkubierung der Zellen mit einem membrandurchlässigen ionischen Farbstoff und

ii)Erfassung des optischen Aussehens bzw. der optischen Eigenschaft der Zellen, wobei das optische Aussehen die intrazelluläre Farbstoffkonzentration angibt und Ermittlung der Zellcharakteristik über die optische Eigenschaft.

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ORIGINAL INSPECTED

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor dem Erfassen der optischen Eigenschaft modifziert werden, wobei ein Wechsel im Zellmembranpotential stattfindet, bevor die optische Eigenschaft erfaßt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellmodifikation pharmakologisch, chemisch oder biologisch vornimmt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt der Modifikation darin besteht, daß man die Zellen in eine Lösung von Liganden inkubiert unter Bedingungen, bei denen sich die Komplement-Zellrezeptoren und die Liganden verbinden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Liganden Neurotransmitter, Hormone, pharmakologische Mittel, natürliche oder synthetische Agonisten und Antagonisten davon, Antigene, Antikörper, Haptene, Allergene und/oder Faktoren des Komplementsystems verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellmodifikation auf physikalischem Wege vorgenommen wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation dem Verfahrensschritt der Modifizierung vorgeschaltet ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt der Modifizierung der Inkubation nachgeschaltet ist.

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11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Vergleichscharakteristik ein Wert für die vorgegebene Farbstoffkonzentration ist und durch den Verfahrensschritt des Vergleichs die Differenz in der Höhe der bestimmten Farbstoffkonzentration und der vorgegebenen Konzentration bestimmt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10,

dadurch gekennzeichnet, daß die Vergleichscharakteristik ein Wert für die vorgegebene Farbstoffkonzentration ist und durch den Verfahrensschritt des Vergleichs die Richtung der Änderung der Differenz in der Höhe der bestimmten bzw. ermittelten Farbstoffkonzentration und der vorgegebenen Farbstoffkonzentration ermittelt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Vergleichscharakteristik ein Satz von Werten für einen vorgegebenen Konzentration-Zeit-Verlauf ist und durch den Verfahrensschritt des Vergleichs die Unterschiede in der Höhe der ermittelten Konzentration und des vorgegebenen Konzentration-Zeit-Verlaufs ermittelt werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff einen fluoreszierenden Farbstoff verwendet, wobei der Verfahrensschritt zur Bestimmung des Farbstoffs die Be-Stimmung der Fluoreszenz einer oder mehrerer individueller Zellen umfaßt.

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15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff einen fluoreszierenden Farbstoff verwendet, wobei der Verfahrensschritt der Ermittlung des Farbstoffs die Ermittlung der Spektralverschiebung der Fluoreszenz einer oder mehrerer individueller Zellen umfaßt.

16. Verfahren nach einem derAnsprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt der Ermittlung des Farbstoffs bzw. der Farbe die Ermittlung der optischen Absorption einer oder mehrerer individueller Zellen umfaßt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt der Ermittlung der Farbe die Ermittlung der Spektralverschiebung der optischen Absorption einer oder mehrerer

individueller Zellen nach der Aggregation des Farbstoffs umfasst.
20

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff ein kationischer fluoreszierender Farbstoff mit einer ansteigenden Wirksamkeit des Fluoreszenzquantums in Lösungs-

mitteln mit abfallender Polarität ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff einen fluoreszierenden kationischen Cyaninfarbstoff verwendet.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff ein Salz des 3,3'-Dihexy1-2,2'-Oxacarbocyanins ist.

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21. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Farbstoffs in der extrazellulären Lösung so groß ist, daß die intrazelluläre Fluoreszenzauslöschung durch die Bildung von Komplexen mit verringerter Fluoreszenz möglichst klein ist.

22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche für die Ermittlung der Anwesenheit eines Liganden in einer Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere nicht erregbare Zellen, die ein membrangebundenes Rezeptorkomplement zu dem Ligand enthalten mit der Lösung inkubiert unter Bedingungen, bei denen sich die Liganden und die Rezeptoren verbinden, wobei die Anwesenheit eines solchen Liganden in der Lösung angezeigt wird durch einen Wechsel des Membranpotentials in den Zellen, die den Rezeptor enthalten.

23. Verfahren zur Ermittlung der Anwesenheit von Zellen mit Rezeptorkomplement für einen ausgewählten spezifischen Liganden in einer Vielzahl von Zellen, die heterogen hinsichtlich der Ligandenspezifität sind, insbesondere nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vielzahl von Zellen in eine Lösvng inkubiert, die den spezifischen Liganden enthält und zwar unter Bedingungen, bei denen sich die Komplement- Zellrezeptoren und die Liganden binden, wobei die Anwesenheit der Zellen mit den Rezeptorkomplementen zu diesem Liganden angezeigt wird,durch eine Änderung des Membranpotentials der Zellen.

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24. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Zellen mit Rezeptorlagekomplement zu einem ausgewählten Ligand aber mit einer unterschiedlichen physiologischen Reaktion dazu in einer Zellkultur, insbesondere nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß

man die Zellkultur in eine Lösung inkubiert, die den ausgewählten Ligand enthält, um in den Zellen Membranpotentialänderungen mit deutlicher Höhe oder Richtung zu induzieren.
10

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen, die ähnliche Membranpotentialänderungen aufweisen, abtrennt, um eine Zellkultur herzustellen, die reich an sensitiven Zellen hinsichtlich des ausgewählten Ligands ist.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 für den Vergleich der physiologischen Reaktion einer ZeIlkultur, die einer Vielzahl von verschiedenen chemischen Liganden ausgesetzt ist, insbesondere nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet ,daß man Zellkulturproben mit den entsprechenden Liganden unter Bedingungen inkubiert bei denen sich die Rezeptoren und Liganden binden und man die Änderungen des Membranpotentials in den individuellen Zellen der entsprechenden Zellkulturen aufzeichnet.

27. Verfahren zur Bestimmung des kumulativen Effekts bei der Behandlung von Zellkulturen mit einer Vielzahl von chemisch bestimmten Liganden, insbesondere nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Liganden und die Zellkultur unter Bedingungen inkubiert, bei denen sich die Komplement-Zellrezeptaren und die Liganden miteinander verbinden.

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28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lebensfähigkeit einer Zellkultur dadurch bestimmt, daß man in die Zellkultur ein Zellgift inkubiert.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Wirkung eines Nährstoffs auf die Zellkultur dadurch bestimmt, daß man in die Zellkultur einen Nährstoff inkubiert.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit zwei oder mehreren der Farbstoffe inkubiert, wobei das optische Aussehen bzw. die optische Eigenschaft das Verhältnis der intrazellulären Konzentrationen der Farbstoffe anzeigt.

130032/0010