DE2953524C2

DE2953524C2 -

Info

Publication number: DE2953524C2
Application number: DE2953524A
Authority: DE
Inventors: Howard Maurice West Newton Mass. Us Shapiro
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1978-04-20
Filing date: 1979-04-12
Publication date: 1990-03-29
Also published as: SE8008648L; GB2097530A; EP0005032A3; NL7915051A; CA1132890A; IT8086278A0; FR2467402A1; IE47975B1; US4343782A; IE790802L; GB2097530B; IT1148234B; FR2467402B1; BE84T1; SE455343B; CH639776A5; JPH0152699B2; JPS54151895A; DE2953524A1; EP0005032A2

Description

Die Erfindung betrifft ein nicht-intrusives Verfahren zur Bestimmung von Zellmembranpotentialen, wobei nicht erregbare Zellen mit einem membran-durchlässigen ionischen Farbstoff inkubiert werden und durch Messen einer optischen Eigenschaft der gefärbten Zellen deren Membranpotential bestimmt wird.

Es ist bekannt, daß der Zellinhalt von tierischen und pflanzlichen Zellen in bezug auf die Umgebung elektrisch negativ geladen ist. Die Größe dieser Potentialdifferenz liegt im allgemeinen zwischen 5 und 90 mV, wobei der größte Teil des Potentials über die Zellmembran entwickelt wird.

Die Zellmembranpotentiale ändern sich in unterschied licher Weise mit dem physiologischen Zustand der Zelle. Da metabolische Energie verbraucht wird, um die Potentiale aufrechtzuerhal ten, verringert sich die Höhe des Potentials über die Membran bei einer verletzten oder einer toten Zelle. Zu größeren Änderungen im Membranpotential kommt es innerhalb von Minuten bei der Wechselwirkung der Zellen mit sehr vielen unterschiedlichen Substanzen oder Liganden, die mit relativ hoher Affinität eine Bindung mit spezifischen Transmembranrezeptoren ein gehen.

In der Zellbiologie hat sich vor kurzem gezeigt, daß hinsichtlich der Liganden und Rezeptoren eine Basis form des Austausches zwischen den Zellen von leben den Vielzellersystemen ausgelöst wird durch extra zelluläre Liganden oder chemische Überträger bzw. Wirkstoffe. Diese chemischen Überträger können so wohl aus speziellen Geweben innerhalb des Organismus oder auch von externen Quellen stammen. Ihre chemischen Strukturen und die Orte der Wirkung variieren stark. Sie können eine Beeinflussungszone über einen schmalen Bereich von wenigen 100 Angström (z. B. bei neuromusku lären Verbindungen) oder über den gesamten Organismus (z. B. Blutwirkstoffe, wie Hormone) aufweisen.

Bei neuen biochemischen Untersuchungen ist nun gefun den worden, daß viele dieser chemischen Überträger eine Zwischenfläche zwischen der Zelle, die den Reiz bzw. den Impuls über die selektive Kupplung erhält und den Rezeptoren, die sich an der Außen fläche der Zelle befinden, bilden. Es wird angenommen, daß der Rezeptor den chemischen Überträger aufgrund dessen stereochemischen Aufbaus und/oder der räumlichen Verteilung seiner geladenen oder chemisch aktiven Gruppen erkennt. Auf diese Weise wird der Ligand und der Rezeptor über eine Schloß-Schlüssel-Beziehung nicht kovalent gebunden. Als Ergebnis des Bindungsvorganges kommt es zu einer intrazellulären biochemischen oder biophysikalischen Änderung, so daß in der Zelle ein metabolischer oder physiologischer Prozeß ausge löst oder beendet wird. Als Liganden sind z. B. Substan zen, wie Acetylcholin, Epinephrin und Norepine phrin (Neurotransmitter), Insulin, Wachstumshormon und Thyrotropin (Hormone), Histamin, Antigene, Proteine des Immunsystems oder Proteine davon, Viren, Bakterien, einige Zellgifte und Sperma geeignet. Für viele dieser Substanzen gibt es natürliche oder synthetische Antagonisten, d. h. eine Substanz, die die physiologische Wirkung der korrespondierenden Substanz aufhebt oder an die Rezep toren gebunden wird, wodurch die Bindung der natürli chen Substanz ausgeschlossen wird. Natürliche oder synthetische Agonisten sind bekannt. Ein Agonist ist eine Substanz, die gebunden an den Rezeptor eine physiologi sche Zellreaktion ähnlich der des natürlichen Liganden auslöst. Viele Drogen, die üblicherweise in der medi zinischen Praxis verwendet werden, sind Agonisten oder Antagonisten der natürlichen Liganden.

In vielen Fällen kann die Reaktion, die in Zellen nach dem Bindungsvorgang des Liganden an die spezifischen Rezeptoren ausgelöst wird, durch eine Reaktion der Zellen mit anderen Substanzen, die mit den Rezeptoren verbindbar sind, z. B. mit einigen Pflanzenlectinen oder mit Antikörpern, hergestellt gegen isolierte Rezeptoren, verdoppelt werden. Es ist auch möglich, eine derartige Zellreaktion durch Addition von Mitteln auszulösen, die das Membranpotential in der gleichen Richtung ändern, wie bei der folgenden Ligand-Rezeptor-Wechsel beziehung.

Es wird daher ein schnelles und zuverlässiges Verfah ren zur Ermittlung und Messung des intrazellulären Effekts einer Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehung ge wünscht, da dieses Verfahren außerordentlich nützlich für die biochemische Forschung und für diagnostische Untersuchungen ist. Aufgrund der Unterschiedlichkeit der Rezeptorspezifität bei ansonsten homogenen Zellkulturen und wegen der sehr großen Zahl unter schiedlicher chemotaktischer Mittel wäre ein solches Meßverfahren ideal für die Prüfung individu eller Zellen.

Es sind verschiedene direkte und indirekte Verfahren für die Bestimmung der Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehun gen bekannt. Bei einer Klasse von bekannten Verfahren werden radioaktiv markierte oder fluoreszierende Ligan den verwendet. Diese Liganden werden in eine Zell suspension inkubiert und nach dem Herauswaschen der nicht gebundenen Liganden wird die Radioaktivität oder die Fluoreszenz der Zellmasse geprüft. Da bei diesen Verfahren markierte Liganden eingesetzt werden, ist dieses Verfahren in seiner Einsatzmöglichkeit er heblich begrenzt. Bei einer anderen Klasse von Meß verfahren wird der Umstand zur Beobachtung genutzt, daß die Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehungen oft von einem Ansteigen der intrazellulären Bildung von Des oxyribonucleinsäure (DNA) begleitet ist. Bei einigen Systemen kann man nach der Bindung der Liganden an den Rezeptor, z. B. wenn man Lymphocyten mit einem Antigen oder Mitogenen wie z. B. Phythohemagglutinin stimuliert, das DNA-Niveau messen und dann mit dem DNA-Niveau einer Vergleichszellmasse, in der keine Ligand-Rezeptor- Wechselbeziehung stattgefunden hat, vergleichen. Das relative Niveau der Desoxyribonucleinsäure ist ein Maß für die Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehung. Dieses be kannte Verfahren ist in seiner Anwendung ebenfalls begrenzt, da die Bildung der DNA im allgemeinen nicht für einige Stunden oder noch nach Tagen nach der Ligan denbindung bzw. -kupplung meßbar ist.

Eine andere bekannte Klasse von Verfahren für die Bestimmung einiger Arten von Ligand-Rezeptor-Wechsel beziehungen basiert auf Änderungen in der Struktur der Cytoplasmamatrix, die bestimmt wird durch die Messung der Polarisation der Fluoreszenz des intra zellulären Fluoresceins. Um eine Analyse nach diesen Methoden durchzuführen, müssen die Zellen in der Lage sein, intrazelluläres Fluorescein durch enzymatische Hydrolyse von Fluoresceindiacetat oder einer ähnlichen Verbindung zu bilden. Diese Verfahren sind technisch schwierig durchzuführen und die Ergebnisse sind sehr schwierig zu interpretieren. Außerdem erfordert dieses Verfahren eine metabolische Modifikation eines Mittels durch die Zellen, das noch nicht vollständig erforscht ist.

Es ist seit langem bekannt, daß erregbare Zellen, z. B. Nervenzellen und Muskelzellen, eine sehr schnelle Änderung des Membranpotentials anzeigen, wenn sie mit einem Neurotransmitter stimuliert werden. Seit kurzem ist jedoch auch bekannt, daß die Membranpotential änderungen, die durch eine physiologische Stimulation induziert werden, nicht auf diese speziellen Zellen begrenzt sind. Es ist festgestellt worden, durch Einführung einer Mikroelektrode in nicht erregbare Zellen, daß Membranpotentialänderungen verbunden sind mit einer Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung. Es ist beobachtet worden, daß die physiologische Reaktion, die bei nicht erregbaren Zellen nach dem Bindungsvor gang eines Liganden an einen Rezeptor eintritt, manchmal verdoppelt werden kann durch die Zugabe von Mitteln zu der Zellsuspension, die das Membranpotential in der gleichen Richtung verändern wie die nachfolgende Ligand-Rezeptor-Kupplung. Es sind auch neue Methoden zur Beobachtung dieser Änderungen entwickelt worden. In Biochemistry, Vol. 13, Nr. 16, 1974, Seite 3315 ist z. B. ein photometrisches Verfahren zur Messung der Änderungen im Membranpotential von Zellsuspensions ansätzen beschrieben. Nach diesem Verfahren wird die Zellsuspension mit einem Cyanin oder einem anderen Farbstoff, der positiv geladen ist, und der geeignet ist, die Lipidschicht der Zellmembran zu durchqueren, inkubiert. Die Verhältnisse der intrazellulären zu den extrazellulären Farbstoffkonzentrationen ändern sich mit den Änderungen der Zellmembranpotentiale. Wenn die Zellen hyperpolarisiert werden, d. h. je negativer das Zellinnere wird, desto mehr Farbstoff- Moleküle treten in die Zellen ein. Bei diesem bekannten Verfahren werden die Farbstoffe in Konzentrationen verwendet, daß die intrazellulären Farbstoffmoleküle nicht-fluoreszierende Aggregate bilden und die Fluores zenz der freien Farbstoffmoleküle im Suspensionsmedium gegen den dunkleren Hintergrund der Zellen gemessen wird. Die Fluoreszenz fällt mit der Hyperpolarisation der Zellen ab. Wenn nur ein kleiner Teil der Zellen in der Suspension gegenüber einem gegebenen Liganden sensibilisiert ist, dann zeigt nur dieser Teil der Zellen eine Änderung im Membranpotential. In diesem Fall ändert sich die Farbstoffkonzentration in dem Medium nicht merkbar, so daß die Änderung in der Fluoreszenz des extrazellulären Farbstoffs nicht meßbar ist. Darüber hinaus ist dieses Verfahren nicht geeignet für die Identifizierung von hinsichtlich eines Liganden sensibilisierten individuellen Zellen.

Aus Journal of Membrane Biology, Vol. 33, Seite 141 (1977) ist die Verwendung von Merocyaninen, Oxonol und Cyaninfarbstoffen zur Messung schneller Änderungen von Membranpotentialen in erregbaren Zellen, z. B. Riesenaxonen des Squid-Nervensystems, bekannt. Es wurde beobachtet, daß lineare Änderungen in der Absorption, Fluoreszenz, Dichroismus und der Doppelbrechung der Farbstoffe zusammen mit den Änderungen im Membranpotential vorkommen. Die geeignetsten Farbstoffe für diese Messungen sind die Merocyanine, die negativ geladen sind und daher nicht zu leicht durch die Zellwände hindurchtreten. Im allgemeinen färben diese Farbstoffe außer den erregbaren Nervenzellen und Muskelzellen keine anderen Zellmembranen. Merocyanine färben jedoch auch einige nicht erregbare Zellmembranen, z. B. Immatur- und Leukämieblutzellen, wobei die Anfärbung unabhängig von einer Änderung des Zellmembranpotentials ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein biologisches Meßverfahren auf der Basis einer nicht intrusiven Messung der Änderungen des Membranpotentials von individuellen nicht erregbaren Zellen zur Verfügung zu stellen.

Die Erfindung löst die Aufgabe gemäß dem kennzeichnenden Teil von Patentanspruch 1.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angeführt.

Das erfindungsgemäße Meßverfahren hat gegenüber bekannten Verfahren den Vorteil, schneller, empfindlicher und vielseitiger anwendbar zu sein. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß es auf einzelne, nicht erregbare Zellen angewandt werden kann. Bisher bekannte Verfahren konnten Meßcharakteristika nur in Zellsuspensionsansätzen bestimmen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch möglich, potentielle aktive Drogen aufzuzeigen, unterstützend bei der Diagnose physiologischer Fehlfunktionen von Geweben einzugreifen sowie Allergie- und Gewebeverträglichkeits-Tests durchzuführen.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet die Möglichkeit, nicht nur pharmakologisch, biologisch oder chemisch modifizierte Zellen auf ihre physiologischen Reaktionen zu untersuchen, sondern auch physikalisch modifizierte Zellen mit Hilfe von Zellmembranpotentialänderungen zu charakterisieren.

Die Erfindung findet Anwendung

1) für die Bestimmung der Anwesenheit oder der Ab wesenheit von spezifischen Rezeptoren für einen bestimmten Liganden in einer Zelle oder allen Zellen einer Zellkultur,
2) für die Bestimmung der Anwesenheit oder der Abwesen heit einer Mischung von Substanzen eines spezifischen Liganden von dem bekannt ist, daß er mit Teilen einer gegebenen Zellkultur in Wechselwirkung tritt,
3) für das Studium der kumulativen Effekte von Kombi nationen von Liganden auf Zellen,
4) für den Vergleich der Effekte von zwei oder mehreren Liganden auf eine vorgegebene Zellkultur und
5) zur Bestimmung der Anzeige des physiologischen Zu stands einer Zellkultur oder Zellsubkultur nach der Behandlung mit einem vermutlichen Gift oder einer anderen Substanz.

Da viele der Verfahren zur Bestimmung der Änderungen des Membranpotentials nicht zerstörend sind, können die Verfahren in Kombination mit einer Zellsortierung verwendet werden zur Herstellung von Zellkulturen, die reich sind an Zellen mit den gewünschten Rezeptor spezifitäten, um so das Zellwachstum zu garantieren.

Man kann das erfindungsgemäße Verfahren durchführen, indem man nicht erregbare Zellen, wie sie typischerweise in Suspensionen vorliegen, mit einer Lösung in Kontakt bringt, die einen oder mehrere aktive Liganden enthält oder von der man annimmt, daß sie diese Liganden enthält. Die Mischung wird unter Bedingungen, bei denen sich Komplement- Zellrezeptoren und Liganden miteinander verbinden, inkubiert, um eine physiologische Änderung in den Zellen, in denen es zur Kupplung kommt, zu induzieren. Vor, nach oder während der Inkubation wird eine Charakteristik, dargestellt durch das Zellmembran potential der individuellen Zellen, aufgenommen. Die ermittelte Charakteristik wird verglichen mit einer Standardprobe, um die Veränderungen in den Membranpotentialen zu bestimmen und so die gewünschte Information zu erhalten.

Die Gegenwart oder Abwesenheit eines Liganden in einer Lösung kann bestimmt werden durch die Inkubation der Lösung mit einer Zellkultur einschließlich wenigstens einer Zellsubkultur, von der bekannt ist, daß sie Rezeptoren für die fraglichen Liganden enthält. Es folgen weiterhin die Auf zeichnung der Änderungen des Zellmembranpotentials in jeder Zelle der Zellkultur und ein Vergleich der Verteilung der Membranpotentialänderungen, sofern welche auftre ten, dieser Zellen mit den Ergebnissen einer parallelen Standardprobe, die eine authentische Probe des fraglichen Liganden enthält. Mit der erfindungsgemäßen Methode kann auch die Ligandenkonzentration in der zu unter suchenden Probe bestimmt werden.

Die Gegenwart und die Zahl der Zellen, die mit einem bekannten Liganden in einer heterogenen Zellkultur rea gieren, kann in ähnlicher Weise dadurch bestimmt wer den, daß man die Änderungen des Membranpotentials zwi schen den Zahlen der Kultur vergleicht. Durch die Kombination dieses erfindungsgemäßen Verfahrens mit bekannten Verfahren zur Zellsortierung ist dem Forscher eine Möglichkeit an die Hand gegeben, Zell kulturen herzustellen, die relativ homogen hinsicht lich der Sensibilisierung gegenüber einem spezifischen Liganden sind.

Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung kann die physiolo gische Reaktion einer Zellkultur mit nicht erregbaren Zellen auf die Behandlung mit zwei oder mehreren chemisch be stimmten Liganden vorhergesagt werden und verglichen werden durch die Inkubation von Lösungen entsprechender Liganden in mehrzelligen Proben, Aufzeichnung der Richtung der Höhe und/oder der Zeit des Ablaufs der Änderungen im Membranpotential in den individuellen Zellen hinsichtlich der Zellproben und Vergleich der Messungen der Proben. Diese Technik kann z.B. verwendet werden zur Auslese von synthetischen Substanzen, bei denen man erwartet, daß sie Agonisten oder Antagonisten zu den natürlichen Liganden sind und um die Veränderung in der Zellreaktion von ähnlichen Zellen gegenüber funktionell oder strukturell ähnlichen Liganden zu bestimmen.

Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung kann der kumulative Effekt der Behandlung von zwei oder mehreren bestimmten chemischen Liganden zu einer Kultur von nicht erregbaren Zellen sehr schnell ge prüft werden durch die Inkubation der Liganden und der Zellkultur, der Aufnahme der Änderungen im Zell membranpotential der individuellen Zellen und Ver gleich der aufgenommenen Potentialänderungen z.B. mit den Ergebnissen von Parallelversuchen mit individuellen Liganden oder der Aufzeichnung der vorherbestimmten Zellreaktion gegenüber einem oder mehreren der individuellen Liganden. Dieses Ver fahren dient zur Entdeckung von Drogen, die als Agonisten oder Antagonisten zu natürlichen Liganden wirken sowie zur Ermittlung ihrer optimalen Dosen.

Nach einer Ausgestaltung der Erfindung kann die Giftwirkung verschiedener Mittel auf Zellen abge schätzt werden durch die Messung des Membranpotentials nach der Behandlung der Zellen mit diesen Mitteln. Das Membranpotential einer verletzten Zelle muß innerhalb der Zeit auf Null abfallen, in der die Membran zer stört ist. Geringere Verletzungen sind durch einen Abfall der Höhe des Membranpotentials im Vergleich zu unverletzten Zellen feststellbar.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verteilen sich ionische, membranpermeable Farb stoffe, wenn sie in Zellen inkubiert sind, sehr schnell gleichmäßig auf den gegenüberliegenden Seiten der Zellmembranen in Abhängigkeit vom Membranpotential. Dann wird eine Messung der intrazellulären Farbstoff konzentration vorgenommen über eine photometrische Messung der Fluoreszenz, der Absorption oder anderer optischer Eigenschaften des Farbstoffs innerhalb der individuellen Zelle und es werden andere Daten der individuellen Zelle, die ebenfalls bekannt sein müssen, wie z. B. das Zellvolumen, über die intrazelluläre Farbstoffkonzentration bestimmt. Dort wo die verglichenen Zellen hinsichtlich des Volumens homogen sind, ist die Messung der Menge des intrazellulären Farbstoffs proportional dem Membranpotential. Die photometrische Messung kann durchgeführt werden durch übliche Mikrophotometrie oder durch Fließcytometrie. Wenn es sich bei der zu bestimmenden optischen Eigenschaft um die Fluoreszenz handelt, dann wird vorzugsweise ein Farbstoff verwen det, der ein an steigendes Fluoreszenzquantum in Lösungsmitteln mit abfallender Polarität aufweist und die Konzentration des Farbstoffs in dem Medium wird so eingestellt, daß die intrazelluläre Fluores zenz-Inaktivierung durch die Bildung von Komplexen mit verringerter Fluoreszenz verhindert wird. Geeigne te fluoreszierende Farbstoffe sind die kationischen Cyaninfarbstoffe, z. B. das 3,3′-Dihexyl-2,2′-oxacarbo cyanin (diO-C₆-(3)).

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der folgen den Zeichnungen näher erläutert

Fig. 1 zeigt die graphische Darstellung der Ver teilung der Zellfluoreszenzintensität eines ersten Anteils einer menschlichen Lymphocyten- Zellsuspension, inkubiert mit 5 · 10^-8M 3,3′- Dihexyl-2,2′oxacarbocyanin (diO-C₆-(3)). In dieser graphischen Darstellung und in den folgenden Darstellungen zeigt die Ordinate die Zahl der Zellen mit einer be stimmten Intensität an und auf der Abszisse ist die Fluoreszenzintensität aufgetragen;

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Ver teilung der Zellfluoreszenzintensität eines zweiten Anteils der Zellsuspension, inkubiert gleichzeitig mit 2 · 10^-5M depolarisierendem ionophoren Gramicidin und 5 · 10^-8M diO-C₆-(3);

Fig. 3 zeigt eine graphische Darstellung der Ver teilung der zellulären Fluoreszenzintensität eines dritten Teils der Zellsuspension, in kubiert gleichzeitig mit 6 · 10^-6M hyperpolari sierendem ionophoren Valinomycin und 5 · 10^-8M diO-C₆-(3);

Fig. 4 zeigt die graphische Darstellung der Ver teilung der zellulären Fluoreszenzintensität eines vierten Anteils der Zellsuspension, in kubiert gleichzeitig mit 10 µg/ml einer Lösung des Liganden Concanavalin A und 5 · 10^-8M diO-C₆-(3);

Fig. zeigt die graphische Darstellung der Verteilung der zellulären Fluoreszenzintensität eines fünften Anteils der Zellsuspension, inkubiert gleichzeitig mit 20 µg/ml einer Lösung des Liganden Phytohemagglutinin und 5 · 10^-8M diO-C₆-(3);

Fig. 6 zeigt die graphische Darstellung der Vertei lung der zellulären Fluoreszenzintensität einer Anzahl von Zellen mit einem gegebenen Fluoreszenzsignal gegenüber der Fluoreszenz intensität, gemessen an einem Anteil von T-Lymphocyten, im Gleichgewicht stehend mit 5 · 1^-8M diO-C₆-(3);

Fig. 7 zeigt die graphische Darstellung der Ver teilung einer zellulären Fluoreszenzintensi tät nach der Zugabe von Phytohemagglutinin in einer Konzentration von 20 µg/ml, wobei der Depolarisierungseffekt dieses Lectins an einer Subkultur der T-Zellen gezeigt ist;

Fig. 8 zeigt die graphische Darstellung der Verteilung der zellulären Fluoreszenzintensität einer B-Lymphocytenzellsuspension mit 5 · 10^-8M diO-C₆-(3) und

Fig. 9 zeigt die graphische Darstellung des hyper polarisierenden Effekts von Phytohemagglutinin an der B-Zellsuspension gemäß Fig. 8, 20 min nach der Zugabe von Phytohemagglutinin in einer Konzentration von 20 µg/ml.

Die graphischen Darstellungen wurden aufgezeichnet mit einem Fließcytometer (Cytofluorograph der Firma Ortho Instruments), das mit einem Impulshöhenanalysator verbunden war.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf nicht erregbare Zellen anwendbar, d. h. also nicht nur auf Zellen aus Muskelgewebe und Nervengewebe. Die Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert bzw. geprüft werden sollen, werden nach üblichen Verfahren isoliert und in einem Medium suspen diert, das geeignet ist einen normalen Zellstoffwechsel zu fördern, z.B. eine ausgewogene, sauerstoffhaltige isotonische gepufferte Salzlösung mit einem pH- Wert von 7,2 bis 7,6, enthaltend Glucose oder andere Nährstoffe und etwa physiologische Konzentrationen an Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumionen. Die Zellen sollten vorzugsweise frei von externen Proteinen; z.B. Albumin usw. und anderen Substanzen sein, die eine starke Affinität zu den Farbstoffen aufwei sen, die verwendet werden, um die Membranpotential änderungen gemäß dem vorliegenden Verfahren zu be stimmen.

Dem Ziel des Tests entsprechend können die Zellen eine Zellkultur enthalten, die relativ homogen hinsicht lich der physiologischen Funktion (z. B. T-Lymphocyten) oder hinsichtlich der Ligandenspezifität (z. B. Mast zellen sensibilisiert gegenüber IgE Allergenkomplexen) sind. Falls gewünscht, können die Zellen eingeteilt werden in viele Aliquote, so daß mehrere Bestimmungen des Membranpotentials parallel nebeneinander durchge führt werden können. Das Membranpotential der Zellen in jedem Teil wird dann nach der Behandlung, z. B. mit einer Lösung von verschiedenen Liganden, verschiedenen Konzentrationen von einzelnen Ligandenarten oder einer ligandenfreien Lösung, bestimmt, so daß ein Vergleich durchgeführt werden kann. In Abhängigkeit von der Ziel richtung der Untersuchung kann die Lösung, die für die Behandlung der Zellen eingesetzt wird, eine unbekannte Lösung sein, bei der man vermutet, daß sie einen Ligan den enthält, der für die Zellen in der Probe spezifisch ist, eine authentische Probe eines bekannten Liganden einer bekannten oder unbekannten Konzentration sein, ein unreines Ligandenpräparat sein oder eine Lösung sein, die eine Substanz enthält, bei der man vermutet, daß sie ein Gift für die Zellen oder für eine Subkultur davon darstellt.

Zusätzlich zu der Feststellung bzw. Bestimmung des Ablaufs einer Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung bzw. Bindung ist das erfindungsgemäße Verfahren geeignet für die Ermittlung der folgenden Kategorien von Infor mationen:

1) Die Anwesenheit einer Subkultur von Zellen in der Suspension, enthaltend Membranoberflächenrezeptoren als Komplement zu einem spezifischen Liganden,
2) die Anwesenheit einer spezifischen Ligandenart in einer Lösung, die geeignet ist, eine Bindung ein zugehen mit Rezeptoren, die sich an den Zellen in der Suspension oder einer Subkultur davon befinden,
3) zur Bestimmung des kumulativen Effekts von multiplen Liganden, die in Wechselwirkung treten mit einer ge gebenen Zellkultur,
4) ein Vergleich der Reaktion einer Zellkultur oder einer Subkultur davon zur Differenzierung der Arten der Liganden,
5) des Effekts der Zellebensfähigkeit verschiedener Konzentrationen von toxischen Substanzen oder
6) der Simulation von Zellmetabolismen durch verschie dene Konzentrationen von Nährstoffen, z.B. Aminosäuren oder Zucker.

Hinsichtlich der Systeme, bei denen sich eine Liganden- Rezeptor-Wechselwirkung abspielt, wird die Information erhalten durch die Inkubation der Zellen mit der Ligan denlösung für eine ausreichende Zeit und bei einer geeigneten Temperatur (z. B. Normaltemperatur der Zellen in ihrer natürlichen Umgebung), damit die Liganden- Rezeptor-Wechselwirkung eintreten kann und es zu einer entsprechenden Änderung im Ionenstrom über die Zell membranen kommt.

Dann wird eine Charakteristik jeder Zelle in der Suspension oder jeder Zelle in einem repräsentativen Teil der Suspension, dargestellt durch das Membran potential, erhalten, ggf. in Intervallen, so daß ein Profil von Potentialänderungen über die Zeit erhalten wird.

Die gemessene Charakteristik wird dann mit einer Standardprobe verglichen, um festzustellen, ob eine Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehung bzw. -Kupplung stattgefunden hat und ob die Richtung, die Höhe oder der zeitliche Verlauf der Änderungen nach geahmt oder antagoniert wurden bei den Änderungen, die in den Zellen bei der Behandlung mit einem bekannten Liganden induziert wurden, oder ob der kumulative Effekt am Membranpotential von zwei oder mehreren Liganden sich unterscheidet von dem eines einzelnen Liganden oder einer unterschiedlichen Mischung von Liganden.

Die Art der Standardprobe muß notwendiger weise variiert werden in Abhängigkeit von der gewünsch ten spezifischen Information. Die Standardprobe kann aus den Ergebnissen von einer oder mehreren Parallel versuchen mit der Testprobe bestehen. Alternativ dazu kann die Standardprobe die Auf zeichnung eines solchen Meßverfahrens sein, z. B. einer graphischen Darstellung einer Zahl von Zellen, die ein bestimmtes Potential gegenüber der Höhe des Potentials aufweisen.

Die Liganden und ihre Antagonisten verursachen im all gemeinen entgegengesetzte Wirkungen bei den Zellmembran potentialen. Es werden daher Substanzen gesucht, die geeignet sind den Effekt der natürlichen Liganden an Zellen eines besonderen Gewebes zu kopieren, blockieren oder zu negativieren. Die Richtung, Höhe und/oder der zeitliche Verlauf der Membranpotentialänderungen in einer Zellprobe eines Gewebes können bestimmt werden durch mehrere Messungen nach der Behandlung der Zellen mit dem natürlichen Liganden. Danach werden verschie dene Substanzen zu Aliquoten der gleichen Zellsuspension hinzugefügt. Durch den Vergleich der Membranpotential änderungen, die in den entsprechenden Proben induziert werden, kann der Forscher die Proben identifizieren, die für weitere spezifische Untersuchungen geeignet sind, z.B. die gewünschte physiologische Wirkung aufweisen, und kann die anderen Proben eliminieren. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch geeignet zur Bestimmung der Parameter, wie der Konzentration des Antagonisten, die benötigt wird, um den Effekt des Membranpotentials einer bestimmten Zellart auf eine gegebene Konzentration des Agonisten zu beseitigen. Diese Messungen sind nützlich für die Entwicklung der Liganden und ihrer Antagonisten als Pharmazeutika.

In einigen Fällen existieren verschiedene Arten von spezifischen Rezeptoren für einen bestimmten Liganden. So kann z. B. die Kupplung eines Liganden an Rezeptoren einer Zellart zu einer Hyperpolarisation führen, während die Kupplung bzw. Bindung des gleichen Liganden an Rezeptoren einer zweiten Zellart zu einer Depolarisation führen kann. Das er findungsgemäße Verfahren ist geeignet zwischen diesen beiden Arten von Wechselwirkungen zu unterscheiden. Bekannte Zellsortiermethoden in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die Isolierung von Zellinien mit der gewünschten Rezeptorspezifität aus heterogenen Zellkulturen. Die Verwendung des er findungsgemäßen Verfahrens führt in diesem Zusammen hang zu einer erhöhten Selektivität im Vergleich zu üblichen Verfahren für die Sortierung von Zellen auf Basis der Kupplung von fluoreszierend gemachten Liganden, weil sowohl der physiologische Effekt als auch die Ligandenkupplung eingearbeitet sind in die Selektions kriterien. Eine zusätzliche Spezifität kann dadurch erhalten werden, daß man die direkte Messung der Kupplung mit optisch markierten Liganden mit der Bestimmung der Änderung im Membranpotential nach der Ligandenkupplung kombiniert.

Wenn die Gegenwart einer besonderen Ligandenart in einer Lösung oder die Gegenwart von Zellen mit einer besonderen Ligandenspezifität von Interesse ist, kann das Membranpotential vor und nach dem Mischen des Liganden mit der Zellsuspension abgelesen und die Resultate verglichen werden. Entsprechende Anteile der Zellsuspension können inkubiert werden mit z. B.

1) einer Lösung, enthaltend eine unbekannte Konzentration eines bestimmten Liganden,
2) einer ligandenfreien Lösung und
3) einer Lösung, enthaltend eine bekannte Konzentration des Liganden.

Nach der Inkubaktion kann ein Wert für die Liganden konzentration in der unbekannten Lösung erhalten werden durch den Vergleich der Membranpotentiale der Zellen in den entsprechenden Proben. Wenn das Membranpotential der individuellen Zellen bestimmt ist, ist es möglich eine Subkultur von Zellen in der Suspension mit einer ausgewählten Ligandenspezifität zu identifizieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die qualitative und quantitative Bestimmung der zellulären Immunreaktion verwendet werden, durch das Messen der Potentialänderun gen in Lymphocyten, Macrophagen oder anderen Zellen des Immunsystems, nachdem die Zellen Substanzen wie Antigenen, Antikörpern, Haptenen, Allergenen und Komple mentverbindungen ausgesetzt worden sind. Da die Lymphocyten üblicherweise eine heterogene Zellkultur hinsichtlich ihrer Reaktivität gegenüber einem bestimm ten Antigen darstellen, liefert die Fraktion der Zellen, die auf ein bestimmtes Antigen reagieren, ein nützliches Maß für die zelluläre Immunreaktion bzw. -antwort. Abweichungen vom üblichen Muster der Potentialänderungen in leicht reagierenden Zellen können Defekte in der Immunfunktion anzeigen. In ähnlicher Weise kann die Einführung von verschiedenen Allergenen in eine Vielzahl von Proben eines individuellen Serums und die nachfolgende Inkubation der Proben mit Zellen, die an der Exkretion des Histamins beteiligt sind, als nicht-intrusives Verfahren für die Bestimmung der Sensibilität eines Individuums gegenüber verschiedenen Allergenen verwendet werden.

Da beim erfindungsgemäßen Verfahren die Isolierung und Markierung einer speziellen Ligandenspezies für die Bestimmung der Substanzen für die Bindungs reaktion in den Zellen mit bestimmter Rezeptorspezifi tät nicht notwendig ist, ist es möglich, das erfin dungsgemäße Verfahren für die Bestimmung der Ligandenaktivität in unreinen Ligandenpräparaten zu verwenden und die Ligandenaktivität in verschiedenen Fraktionen solcher unreinen Präparate, die zur Reinigung oder Isolierung des gewünschten spezifischen Liganden erhalten wer den, zu verfolgen und aufzuzeigen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als Hilfsmittel zur Definierung der chemischen Struktur der Oberfläche der Rezeptoren verwendet werden, etwa durch die Demonstration der Konkurrenz zwischen den verschiedenen Liganden bekannter Spezifi tät für die Bindungsplätze an den Zelloberflächen.

Die toxischen Wirkungen verschiedener Substanzen auf die Zellen kann abgeschätzt werden durch eine Messung der Membranpotentiale der Zellen nach der Behandlung der Zellen mit diesen Mitteln. Es ist bekannt, daß die Tests für die Lebensfähigkeit der Zellen, basierend auf den Zutritt normalerweise impermeabler Farbstoffe, wie Propidiumjodid, nur jene Zellen ermitteln, die zerstört sind. Für viele Fälle, z. B. für die Entwicklung von Pharmazeutika für die Krebsbehandlung, ist es sinnvoll zu bestimmen, ob die zukünftige reproduktive Kapazität der Zelle beeinträch tigt ist oder ob eine teilweise Beschädigung durch einen Riß in der Zellmembran stattgefunden hat. Das Potential einer verletzten Zelle muß auf Null abfallen, sobald die Membran zerstört ist.

Geringere Verletzungen sind bestimmbar durch ein Abfallen des Membranpotentials im Vergleich zu den unverletzten Zellen. Die Verringerung oder die Verhinderung der Zellantwort bzw. Zellreaktion auf Liganden und andere Substanzen, die normalerweise bekannte Änderungen des Potentials verursachen, kann auch durch die Messung der Zellmembranpotentiale er mittelt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Voraussage von Unterschieden bei der Aufnahme von Pharmazeutika in unterschiedlichen Zellarten verwendet werden, da die Aufnahme der Permeablen bzw. durchringenden ionischen Verbindungen (z. B. der Pharmazeutika) durch die Zellmembran abhängig ist von dem Membranpotential. Das erfindungs gemäße Verfahren kann auch als Korrekturfaktor verwen det werden aufgrund der unterschiedlichen Farbstoff aufnahme, die durch die gemessenen Potentialunterschiede vorherbestimmt, ist wodurch verschiedene durchdringende ionische Farbstoffe, z. B. Acridine für lebende Anfärbungen verwendet werden können, sowie für die quantitiative Bestimmung verschiedener intrazellulärer Bestandteile, z. B. der Nucleinsäuren und der Glycosamino glycane.

Alle oben genannten Verfahren erfordern eine schnelle, nichtintrusive und vorzugsweise nicht zerstörende Methode zur Bestimmung des Membranpotentials oder eine Messung, die proportional ist dem Membranpotential von 10³ bis 10⁶ individuellen Zellen in einer üblichen Zellprobe. Die Einführung einer Mikroelektrode in die individuellen Zellen beschädigt notwendigerweise die Zellmembranen und kann daher nicht verwendet werden um das Membranpotential in jeder der vielen Zellen in der Zellsuspension zu bestimmen. Bei einer bevorzugten Bestimmungsmethode werden kationische zellmembranpermeable fluoreszierende Farbstoffe ver wendet, die sich während der Inkubation zwi schen den Innen- und den Außenseiten der Zellmembranen als Funktion des Membranpotentials aufteilen. Dann wird die intrazelluläre Konzentration des Farbstoffs oder ein Parameter, der der Konzentration proportional ist, mittels eines optischen Verfahrens mit einem Mikro photometer oder einem Fließcytometer gemessen. Bei einer Hyperpolarisation wird die Affinität des Zell inneren für den Farbstoff erhöht, während bei einer Depolarisation die Affinität des Zellinneren für den Farbstoff herabgesetzt wird.

Geeignete Farbstoffe für diese Methode sind z. B. kationische Cyaninfarbstoffe, wie 3,3′-Di-n-butyl- 9-methyl- und 3,3′-Diethyl-thiacarbocyanine, 3,3′-Diethyl-2,2′-oxacarbocyanin, 2,3,3,1′,3′,3′- Hexamethylindocarbocyanin und Dicarbocyanin, 3,3′-Di ethylthiadicarbocyanin und vorzugsweise 3,3′-Dihexyl- 2,2′-oxacarbocyanin (diO-C₆-(3)). Bei diesen Farb stoffen handelt es sich um handelsübliche Farbstoffe (Fa. Eastman Kodak).

Es ist von Vorteil, wenn die ausgewählten Farbstoffe ein erhöhtes Fluoreszenz quantum in Lösungsmitteln mit abfallender Polarität aufweisen und daß die Fluoreszenz und die Absorptions maxima des Farbstoffes sich mit den Änderungen der Polarität des Lösungsmittels verschieben. Diese Eigenschaften erhöhen die Selektivität der Bestimmung der membranassoziierten Farbstoffe innerhalb der Zellen gegenüber dem Hintergrund der farbstofffreien Zellen in der Lösung. Es ist auch von Vorteil, die ausgewählten fluoreszierenden Farbstoffe in einer aus reichend geringen Konzentration zu verwenden, um die Auslöschung der Fluoreszenz der intrazellulären Farb stoffe aufgrund der Bildung von Aggregaten zu ver ringern. Bei der Verwendung des bevorzugt eingesetzten Cyaninfarbstoffs (DiO-C₆-(3)) liegt die Konzentration bei oder unterhalb etwa 3 × 10^-7M.

Der Farbstoff diO-C₆-(3) ist charakterisiert durch einen Anstieg des Quantums auf etwa 4,5 in n-Octanol gegenüber wäßrigen Lösungen. Die Absorptions- und Emissionsmaxima in n-Octanol sind um etwa 10 nm höher als in einer wäßrigen Lösung. Die Menge des diO-C₆-(3) in individuellen Zellen wird bestimmt durch das Fluoreszenzquantum im Bereich von 504 nm nach der Anregung bei etwa 488 nm. Bei den Cyaninfarbstoffen tritt der gewünschte Ein fluß des Lösungsmittels auf das Quan tums im allgemeinen mehr bei den Carbocyaninfarbstoffen in Erscheinung, die die allgemeine Formel R-(CH)₃-R′ aufweisen und weniger bei den Di- und Tricarbocya ninen mit der allgemeinen Formel R-(CH)₅-R′ und R-(CH)₇-R′.

Für die Messung der Fluoreszenz kann ein Mikrofluoro meter verwendet werden; besonders schnell und besonders präzise arbeitet jedoch das Fließcytometer. Die Arbeits weise der Fließcytometrie und der Zellsortierung ist z. B. in Science, Vol. 198, Seiten 149-157 (1977) beschrieben. Die Fließcytometer, die Argonionenlaser lichtquellen verwenden, sind für die obigen Messungen besonders geeignet. Diese Instrumente werden von ver schiedenen Firmen hergestellt. Diese Geräte sind für das automatische Sortieren von Zellen auf der Basis der verschiedenen Kriterien wie der Fluoreszenzintensität, der Zellgröße, der Wellenlänge der Fluoreszenz und der Wellenlänge oder der Intensität der Absorption geeignet.

Wenn die zu untersuchende Zellkultur relativ homogen hinsichtlich der Größe und der inneren Struktur ist und wenn die Konzentration des zugegebenen Farbstoffs und die Zahl der suspendierten Zellen in dem vorge gebenen Volumen des Mediums relativ konstant gehalten werden, ist die Gesamtmenge des Farbstoffs in einer bestimmten Zelle, gemessen durch die Intensität der Fluoreszenz dieser Zelle, direkt proportional der Konzentration und damit des Membranpotentials. Wenn jedoch gemischte Zellkulturen oder unterschiedliche Zellkonzentrationen und/oder Farbstoffkonzentrationen vorliegen, sind zusätzllche Messungen notwendig. Da die intrazelluläre Konzentration des Farbstoffs gleich ist der Gesamtmenge des Farbstoffs in der Zelle ge teilt durch das Zellvolumen, wird ein Wert der proportional zur Konzentration des Farbstoffs in einer bestimmten Zelle ist, dadurch erhalten, indem die Gesamtmenge des Farbstoffs wie oben beschrieben durch eine Größe die proportional dem Zell volumen ist, geteilt wird. Die Messung des Zellvolumens kann gleich zeitig mit der Ablesung der intrazellulären Fluores zenz im Fließcytometer durch eine elektronische oder optische Messung der Zellgröße vorgenommen werden, in den z. B. 3/2 der Stärke des Zellquerschnitts, gemessen durch die Streuung des Lichts in einem Winkel nahe der Achse der Illumination, bestimmt werden. Es ist von Vorteil, daß bei der Fließcytometrie die Informationen gesammelt, elektronisch manipuliert und automatisch aufgezeigt werden können. Das Cytometergerät bildet ein Signal, das der Fluoreszenzintensität entspricht, ein zweites Signal für das Zellvolumen und berechnet dann das Verhältnis der Signale. Dieses Verhältnis, das dem Membranpotential proportional ist, kann dann als Zellsortierungskriterium verwendet und/oder aufgezeichnet werden.

Bei den zu untersuchenden Zellkulturen, die hinsichtlich des Zellvolumens oder der Menge des farbstoffbindenden Materials sehr heterogen sind, kann die Messung, die dem Membranpotential entspricht, dadurch erhalten wer den, daß man zwei Farbstoffe mit unterschiedlichen Affinitäten zu den intrazellulären Komponenten ver wendet. In diesem Fall kann die intrazelluläre Fluores zenz von beiden Farbstoffen gemessen werden. Der An stieg oder der Abfall im Verhältnis der intrazellulären Farbstoffgehalte ist dann proportional zur Änderung des Membranpotentials und ist unabhängig vom Zell volumen und Veränderungen hinsichtlich des Gehalts des farbstoffbindenden Materials in den Zellen.

Auch wenn es nach den Prinzipien der Chemie möglich ist, die Effekte und die Änderungen in der Zelle und in den Farbstoffkonzentrationen in den Medien und die intra zelluläre Konzentration der Farbstoffe zu berechnen, so ist es doch einfacher für die Praxis, die Verdünnungen so einzustellen, daß die Zellkonzentrationen und die Konzentration des Farbstoffs in allen Proben, die mit einander verglichen werden, etwa gleich sind.

Es kann zu einer Interferenz mit photometrischen Poten tialmessungen kommen, die verursacht werden durch die nicht spezifische Anfärbung des Cytoplasmas von toten Zellen, bei denen die Zellmembranen zerstört sind. Wenn eine kleine Menge eines normalerweise nicht durchlässigen Farbstoffs, z. B. Ethidiumbromid oder Propidiumjodid zu dem Medium hinzugegeben wird, wird der Zellkern der Zellen mit den zerstörten Membranen angefärbt, während der Farbstoff nicht in die lebenden Zellen eindringt. Da der durchdringende bzw. perme able Farbstoff, der für die Messung des Potentials verwendet wird und der nicht durchdringende Farbstoff, der für die Entdeckung geschädigter Membranen ver wendet wird, unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen, ist es möglich, Korrelationsmessungen von einer oder mehreren optischen Eigenschaften jedes Farbstoffs in jeder Zelle vorzunehmen und so die geschädigten Zellen, die auf diese Weise er mittelt werden, zu eliminieren und von der weiteren Analyse auszuschließen. Wenn als durchdringender Farb stoff vorzugsweise diO-C₆-(3) und als nicht durch dringender Farbstoff Propidiumjodid verwendet waren, dann emitiert der Zellkern der geschädigten Zellen eine rote Fluoreszenz im Bereich von 610 nm nach An regung bei 488 nm. Diese Fluores zenz ist von einem Beobachter oder von einem Photo meter leicht von der grünen Fluoreszenz des diO-C₆-(3) zu unterscheiden.

Die photometrischen Messungen des Membranpotentials können kombiniert werden mit anderen Messungen der gleichen Zellen, um die analytische Aussage des Ver fahrens zu erhöhen. So kann z. B. die Antwort bzw. die Reaktion der Zellen in verschiedenen Phasen des Zell zykluses gegenüber einem bestimmten Liganden bestimmt werden durch das gleichzeitige Anfärben mit diO-C₆-(3) und mit einem DNA-Fluorochrom (z. B. Nr. 33342 der Fa. Hoechst AG).

Es ist auch möglich, andere optische Eigenschaften als die Fluoreszenz zu messen, z. B. die Absorption, um so ein Anzeichen für die Menge des Farbstoffs in den individuellen Zellen zu erhalten. In diesem Fall ist es von Vorteil, Farbstoffe zu verwenden, die intra zelluläre Aggregate mit Absorptionsmaxima bei Wellen längen bilden, die sich von denen des freien Farbstoffs unterscheiden und wobei diese Farbstoffe in ausreichend hoher Konzentration verwendet werden, so daß eine relativ hohe Fraktion in den Zellen in Form der Aggregate besteht. Auf diese Weise wird die Selektivität der Bestimmung des intrazellulären Farbstoffs gegenüber dem Hintergrund des freien Farb stoffs in der Lösung verstärkt. Diese Eigenschaften weisen unter bestimmten Bedingungen z. B. die Thia carbocyaninfarbstoffe auf, z. B. das 3,3′-Diethyl- und 3,3′-Dipropylthiadicarbocyanin. An rote Blutkörper chen gebunden, weisen die obigen Farbstoffe eine neue Absorptionsbande von 590 nm auf, die wahrscheinlich durch einen Komplex des intrazellulären Farbstoffs mit Hämoglobin bewirkt wird. Die Absorption der Zellen bei dieser Wellenlänge kann daher zur Bestimmung der Menge des Farbstoffs innerhalb der individuellen Zellen verwendet werden.

Auch wenn die photometrische Bestimmung der Aufnahme der kationischen Farbstoffe die bevorzugte Methode für die Messung der Änderungen des Membranpotentials ist, können aber auch andere Verfahren verwendet werden. So können z. B. dann, wenn das Zellinnere von nicht erregbaren Zellen negativ gegenüber der Umgebung ist, anionische Farbstoffe, die eine Affinität für Lösungs mittel mit steigender Polarität aufweisen, verwendet werden. In diesem Fall weist der Farbstoff eine Affinität zu intrazellulären Verbindungen unabhängig von ihrer Ladung auf und wird in der Zelle absorbiert. Die Konzentration dieses Farbstoffs wird herabgesetzt bei einer Zell-Hyperpolarisation und erhöht sich bei einer Zell-Depolarisation.

Die Erfindung wird anhand der Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Peripherische Blutlymphocyten wurden aus Spenderblut erhalten und durch Zentrifugieren über Hypaque-Ficoll- Dichtegradienten isoliert. Mittels cytographischer Ana lyse der roten und grünen Fluoreszenzsignale der Zel len in Anteilen, die mit Acridinorange angefärbt waren, wurden die Prozentzahlen an Erythrocyten, Monocyten und Granulocyten in dem Lymphocytenpräparat grob bestimmt. Die Zellzahlen wurden ermittelt und die Zell-Lebensfähigkeit durch einen Trypanblau-Ausschluß bestimmt.

Es wurden Versuchslösungen mit diO-C₆-(3) aus den ent sprechenden Arbeitslösungen in Ethanol mit Konzentrationen von 10^-3M oder 5 · 10^-4M hergestellt. Die Konzentrati onen der Versuchslösungen bzw. Arbeitslösungen wurden so eingestellt, daß die Farbstoffkonzentration zwi schen 10^-8M und 5 · 10^-7M liegen, wenn 10 ml der Farbstoff lösung zu 1,0 ml der Zellen, verdünnt mit dem Medium 199 (Gibco), gegeben wurden.

Dann wurde Valinomycin (Sigma Chemical Company), ein bekanntes Ionophor für die Hyperpolarisierung von Lymphocyten, in Ethanol in einer Konzentration von 0,66 mg/ml gelöst. Dann wurde Gramicidin (ICN), ein be kanntes Ionophor für die Depolarisierung von Lympho cyten, ebenfalls in Ethanol mit einer Konzen tration von 0,4 mg/ml gelöst. In einer Phosphat gepufferten Salzlösung wurden Phytohemagglutinin (PHA, Difco, 2 mg/ml) und Concanavalin A (Con-A, Sigma, 1 mg/ml) gelöst. PHA und Con-A sind bekannte Lectine (Liganden), die geeignet sind menschliche peripherische Lympho cyten zu binden.

Bevor weitere Experimente durchgeführt wurden, wurde die Kinetik der Farbstoffaufnahme der Zellen unter sucht. 20 ml einer Farbstofflösung wurden zu 20 ml einer verdünnten Zellsuspension, enthaltend 1 bis 2 · 10⁵ Zellen/ml gegeben. Die Fluoreszenz der Zellen wird dann mit einem Fließcytometer gemessen. Die Bande der Fluoreszenzverteilung wird bestimmt und ihre Position in 1-Minutenintervallen aufgezeichnet, bis sie stabil ist. Dieser Vorgang dauert etwa 12 min, wenn diO-C₆-(3) als Indikatorfarbstoff verwendet wird.

Die nachfolgenden Versuche dienen dazu, das Inter vall zwischen der Zugabe des Farbstoffs und des Lectins oder des Ionophors und der Messung der Fluoreszenz konstant zu halten, wobei das Intervall vorzugsweise etwas länger sein sollte als die beobachtete Gleichge wichtszeit. Bei den hier verwendeten Konzentrationen ist für das diO-C₆-(3) eine Periode von 15 bis 20 min ausreichend.

In einem weiteren Experiment wurden die Fluoreszenzverteilungen von 5 Aliquoten der Zellsuspension verglichen. Während der Zeit der Farbstoffzugabe (10 µl Versuchslösung diO-C₆-(3)/ ml Zellen) wurden außerdem die folgenden Substanzen hinzugegeben:

a) Keine Zugabe (Kontrollprobe)
b) PHA (10 ml Arbeitslösung; Endkonzentration 20 µg/ml)
c) Con-A (10 ml Arbeitslösung bzw. Versuchslösung; Endkonzentration 10 µg/ml)
d) Valinomycin (10 ml Arbeitslösung; Endkonzentration 6 · 10^-6M) und
e) Gramicidin (10 ml Arbeitslösung; Endkonzentration 2 · 10^-5M).

Die Proben wurden in Abständen von 3 bis 6 min herge stellt, damit genügend Zeit zur Reinigung des Fließ systems des Fließcytometers zwischen den einzelnen Proben ver bleibt. Die Fluoreszenzmessungen aller Proben wurden unter Verwendung der gleichen Laserapparatur mit den gleichen Verstärkereinrichtungen vorgenommen. Es wurde etwa die gleiche Zahl von Zellen in jeder Probe ge messen und die Fluoreszenzverteilung von allen Proben auf der gleichen Skala des Impulshöhenanalysators auf gezeichnet.

Die Ergebnisse der Experimente sind in den Fig. 1 bis 5 wiedergegeben. Die Flecken bzw. Pünktchen wurden erhalten, wenn die Fluoreszenzeigenschaften der Zelle 15 min nach der Zugabe des Farbstoffs und der Lectine oder der Ionophoren gemessen wurden. Das diO-C₆-(3) wurde in einer Endkonzentration von 5 · 10^-8M verwendet. Die Fig. 1 (Kontrollprobe) zeigt eine Verteilung der intrazellulären Konzentration des Cyaninfarbstoffs zwischen den Zellen der Kultur, dargestellt durch die Verteilung der Intensität der Fluoreszenz (siehe x-Achse). Das beobachtete Membranpotential der individuellen Zellen in der Kultur variiert je nach der Stimula tion. Die Membranpotentiale sind jedoch verteilt über einen Peak, angezeigt durch die Linie A; dieser Peak stellt eine große Subkultur der Zellen mit einem Zwischenwert des Membranpotentials dar.

Fig. 2 zeigt den Effekt der Zugabe des depolarisieren den Ionophorsgramicidin, wie Fig. 2 zeigt, ist die Zahl der Zellen, die eine Verringerung der Fluoreszenzintensität aufweisen, die durch die depolarisierende Wirkung des Gramicidins induziert wird, er heblich erhöht und außerdem ist eine Verschiebung des Peaks in Richtung des Punkts zu erkennen, der mit B gekennzeichnet ist. Im Gegensatz dazu weisen die Zellen, die mit dem hyperpolarisierenden Ionophor Valinomycin versetzt worden sind (siehe Fig. 3), eine Erhöhung der Zahl der Zellen mit einer höheren Fluoreszenzintensität auf (vgl. C).

Wenn man die Fluoreszenzintensitätsverteilung der mit Gramicidin und Valinomycin behandelten Proben mit der Kontrollprobe vergleicht, erhält man einen Wert für die Veränderung der Fluoreszenzsignale, die man nach der maximalen Depolarisation und Hyperpolarisation erhält. Dieses Beispiel zeigt, daß die kationischen Cyaninfarbstoffe in den intrazellulären Volumina der individuellen Zellen in Abhängigkeit des Membranpotentials gesammelt werden.

Beispiel 2

In Fig. 4 ist der Effekt der Zugabe von Con-A zu menschlichen Lymphocyten wiedergegeben. Die Lympho cytensuspension ist heterogen hinsichtlich ihrer Antwort bzw. Reaktion auf dieses Lectin. Sie enthält eine Zellsubkultur, die bei der Bindung an Con-A hyperpolarisiert wird und eine andere, die depolari siert wird. Die hyperpolarisierten Zellen weisen einen Anstieg in der Fluoreszenzintensität auf (vgl. C), die depolarisierten Zellen weisen einen Abfall in der Fluoreszenzintensität auf, wie der schwache aber deutlich erkennbare Peak D′ zeigt. Die Größe der hyperpolarisierten Zellsubkultur ist erheblich größer als die der depolarisierten Zellsubkultur.

Die Zugabe von PHA zu den Zellen führt zu einer Auf teilung in zwei Gruppen von Zellen. Die Breite bimodale Verteilung in Fig. 5 zeigt an, daß eine Subkultur der Zellen depolarisiert wurde durch die Bindung an PHA und zwar in einem Ausmaß, daß das Fluoreszenzsignal der individuellen Zellen herabgesetzt wurde bis zu einem Punkt, der mit E bezeichnet ist. Eine zweite Subkultur der Zellen weist eine noch stärkere Depolari sierung auf, dargestellt durch ein niedrigeres Fluoreszenzsignal bei Punkt E′.

Beispiel 3

Es wurde eine Vorratslösung von PHA und diO-C₆-(3) zu einer Lymphocytenzellsuspension, hergestellt gemäß Beispiel 1, hinzugegeben. Mittels eines Fließ cytometers wurden dann die Zellen abgetrennt, die eine Fluoreszenzintensität aufweisen, die den Intensi täten von Punkt E und Punkt E′ in Fig. 3 entspricht. Nach einer etwa 15minütigen Inkubation wurde die Suspension in einem Fließcytometer gemessen und er neut zu 3 Zellsuspensionen gelöst. Zwei der Zell suspensionen sind reich an homogenen Zellen hinsicht lich ihrer physiologischen Reaktion bezüglich der Bindung an PHA.

Beispiel 4

Es wurden B-Zellen-angereicherte und T-Zellen-ange reicherte Lymphocytenkulturen (Reinheit etwa 85%) durch Rosetting (Rosettendifferenzierung), geprüft hinsichtlich ihrer Sensibilisierung gegenüber PHA, hergestellt. Fig. 6 zeigt die Fluoreszenzverteilung der T-Zellen in der Suspension vor der Zugabe von Lectin. Fig. 7 zeigt die Fluoreszenzverteilung der gleichen Zellsuspension 20 min nach der Behand lung mit PHA der Stammlösung von Beispiel 1. Wie der Fig. 7 zu entnehmen ist, führt die Zugabe des Lectins zu einer gleichförmigen Depolarisation der T-Lymphocyten. Im Gegensatz dazu führt, gezeigt in den Fig. 8 (Vergleichsprobe) und 9 (25 min nach der Zugabe von PHA), die PHA-Rezeptor-Wechselwirkung bei den B-Zellen zu einer gleichförmigen Hyperpolari sation.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Verfahren der Er findung verwendet werden kann, um die physiologischen Reaktionen von unterschiedlichen Zellarten gegenüber einem bestimmten Liganden vergleichen zu können. Die Ergeb nisse zeigen weiterhin, daß unterschiedliche Zell arten aufgrund dieser physiologischen Reaktionen gegenüber einem bestimmten Liganden voneinander unter schieden werden können.

Claims

1. Nicht-intrusives Verfahren zur Bestimmung von Zellmembranpotentialen, wobei nicht erregbare Zellen mit einem membrandurchlässigen ionischen Farbstoff inkubiert werden und durch Messen einer optischen Eigenschaft der gefärbten Zellen deren Membranpotential bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis einer Änderung des Zellmembranpotentials von Einzelzellen deren intrazelluläre Farbstoffkonzentration optisch gemessen und mit der einer Standardprobe verglichen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor der Messung derart modifiziert werden, daß ein Wechsel im Zellmembranpotential stattfindet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellmodifikation pharmakologisch, chemisch oder biologisch vornimmt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen modifiziert, indem man sie in eine Lösung von Liganden unter Bedingungen inkubiert, bei denen sich die Komplement-Zellrezeptoren und die Liganden verbinden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Liganden Neurotransmitter, Hormone, pharmakologische Mittel, natürliche oder synthetische Agonisten und Antagonisten davon, Antigene, Antikörper, Haptene, Allergene und/oder Faktoren des Komplementsystems verwendet.

6. Verfahrem nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen auf physikalischem Wege modifiziert werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkubieren der Zellen vor der Modifikation erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkubieren der Zellen nach dem Modifizieren derselben erfolgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Standardprobe eine vorgegebene Farbstoffkonzentration dient und durch einen Vergleich des Meßwerts mit der Standardprobe die Differenz der beiden bestimmt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Standardprobe eine vorgegebene Farbstoffkonzentration dient und durch einen Vergleich der bestimmten bzw. ermittelten Farbstoffkonzentration mit der vorgegebenen Farbstoffkonzentration die Richtung und die Höhe der Differenz ermittelt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Standardprobe ein Satz von Werten für einen vorgegebenen Konzentrations-Zeit- Verlauf dient und durch einen Vergleich die Unterschiede in der Höhe der ermittelten Konzentration und des vorgegebenen Konzentrations-Zeit-Verlaufs ermittelt werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff einen fluoreszierenden Farbstoff verwendet, wobei die Farbstoffkonzentration über die Fluoreszenz einer oder mehrerer individueller Zellen bestimmt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff einen fluoreszierenden Farbstoff verwendet und die Spektralverschiebung der Fluoreszenz einer oder mehrerer individueller Zellen mißt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Bestimmung der Farbstoffkonzentration die optische Absorption einer oder mehrerer individueller Zellen ermittelt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Meßcharakteristik die Spektralverschiebung der optischen Absorption einer oder mehrerer individueller Zellen nach der Aggregation des Farbstoffs verwendet wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff ein kationischer fluoreszierender Farbstoff mit einem ansteigenden Fluoreszenzquantum in Lösungsmitteln mit abfallender Polarität ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff einen fluoreszierenden kationischen Cyaninfarbstoff verwendet.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff ein Salz des 3,3′- Dihexyl-2,2′-oxacarbocyanins ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Farbstoffs in der extrazellulären Lösung so groß gehalten wird, daß die intrazelluläre Fluoreszenzauslöschung durch die Bildung von Komplexen mit verringerter Fluoreszenz möglichst klein ist.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennnzeichnet, daß man zur Ermittlung der Anwesenheit eines Liganden in der Lösung eine oder mehrere nicht erregbare Zellen, die ein membrangebundenes Rezeptorkomplement zu dem Ligand enthalten mit der Lösung inkubiert unter Bedingungen, bei denen sich die Liganden und die Rezeptoren verbinden, wobei die Anwesenheit eines solchen Liganden in der Lösung angezeigt wird durch einen Wechsel des Membranpotentials in den Zellen, die den Rezeptor enthalten.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Anwesenheit von Zellen mit Rezeptorkomplement für einen ausgewählten spezifischen Liganden in einer Vielzahl von Zellen, die heterogen hinsichtlich der Ligandenspezifität sind, ermittelt, und eine Vielzahl von Zellen in eine Lösung inkubiert, die den spezifischen Liganden enthält und zwar unter Bedingungen, bei denen sich die Komplement- Zellrezeptoren und die Liganden binden, wobei die Anwesenheit der Zellen mit den Rezeptorkomplementen zu diesem Liganden durch eine Änderung des Membranpotentials der Zellen angezeigt wird.

22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Anwesenheit von Zellen mit Rezeptorlagekomplement zu einem ausgewählten Ligand, aber mit einer unterschiedlichen physiologischen Reaktion dazu in einer Zellkultur bestimmt, und daß man die Zellkultur in eine Lösung inkubiert, die den ausgewählten Ligand enthält, um in den Zellen Membranpotentialänderungen mit deutlicher Höhe oder Richtung zu induzieren.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen, die ähnliche Membranpotentialänderungen aufweisen, abtrennt, um eine Zellkultur herzustellen, die reich an sensitiven Zellen hinsichtlich des ausgewählten Ligands ist.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die physiologische Reaktion einer Zellkultur, die einer Vielzahl von verschiedenen chemischen Liganden ausgesetzt ist, vergleicht und daß man Zellkulturproben mit den entsprechenden Liganden unter Bedingungen inkubiert, bei denen sich die Rezeptoren und Liganden binden und man die Änderungen des Membranpotentials in den individuellen Zellen der entsprechenden Zellkulturen aufzeichnet.

25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Behandlung von Zellkulturen mit einer Vielzahl von chemisch bestimmten Liganden den kumulativen Effekt bestimmt, und daß man die Liganden und die Zellkultur unter Bedingungen inkubiert, bei denen sich die Komplement-Zellrezeptoren und die Liganden miteinander verbinden.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lebensfähigkeit einer Zellkultur dadurch bestimmt, daß man in die Zellkultur ein Zellgift inkubiert.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Wirkung eines Nährstoffs auf die Zellkultur dadurch bestimmt, daß man in die Zellkultur einen Nährstoff inkubiert.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit zwei oder mehreren der Farbstoffe inkubiert, wobei das optische Aussehen bzw. die optische Eigenschaft das Verhältnis der intrazellulären Konzentrationen der Farbstoffe anzeigt.