DE3109123A1 - Process for the covalent immobilisation of biological detoxification systems on artificial surfaces - Google Patents
Process for the covalent immobilisation of biological detoxification systems on artificial surfacesInfo
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Abstract
Description
Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von biologischenProcess for the covalent immobilization of biological
Detoxikationssystemen auf künstlichen Oberflächen.Detoxication systems on artificial surfaces.
Die Entfernung von exogenen oder endogenen Toxinen aus Humanblut erfolgt in der Medizin entweder durch direkten Kontakt des zu reinigenden Blutes mit speziellen Adsorbentien (Hämoperfusion) oder nach dessen Auftrennung in Zellfraktion und Plasma bzw. Dialysat mittels einer Separationseinheit (Hämofiltration, Hämodialyse). Allen drei Systemen ist gemein, daß eine künstliche Oberfläche strömendem Blut ausgesetzt wird, was je nach verwendetem Material und Kontaktdauer zu mehr oder minder gravierenden Komplikationen durch die Induzierung von Thromben führen kann.Exogenous or endogenous toxins are removed from human blood in medicine either through direct contact of the blood to be purified with special ones Adsorbents (hemoperfusion) or after its separation into cell fraction and plasma or dialysate by means of a separation unit (hemofiltration, hemodialysis). All three systems have in common that an artificial surface is exposed to flowing blood becomes more or less serious depending on the material used and the duration of contact Complications from the induction of thrombi can result.
Untersuchungen, die sich damit beschäftigen, wie sich die Entstehung von Blutgerinseln und Thromben an diesen Oberflächen vermeiden läßt, führten zu der Erkenntnis, daß ein Zusammenhang zwischen der Blutverträglichkeit und der Adsorption spezieller Proteine an diese Materialien besteht. Bringt man nämlich Blut in Kontakt mit fremden Materialien, so führt dies in allen Fällen zu einer Adsorption von Plasmaproteinen. Die von Lyman, Metcalf et.al in dieser Richtung durchgeführten vergleichenden Untersuchungen diverser Kunststoffoberflächen weisen darauf hin, daß blutunverträgliche Schichten bevorzugt das Gerinnungsprotein Fibrinogen aus dem umgebenden Miieu anlagert, während mit Blut gut kompatible Oberflächen überwiegend Albumin adsorbieren. (D.J. Lyman, L.C.Metcalf, D. Albo Jr., K.F. Richards, J. Lam: Trans. Amer. Soc.Investigations that deal with how the emergence of blood clots and thrombi on these surfaces can be avoided, led to the knowledge that there is a connection between blood tolerance and adsorption special proteins attached to these materials. You bring blood into contact with foreign materials, this leads in all cases to adsorption of plasma proteins. The comparative studies carried out in this direction by Lyman, Metcalf et al various plastic surfaces indicate that blood-incompatible layers preferentially the coagulation protein fibrinogen accumulates from the surrounding Miieu, while Surfaces that are well compatible with blood mainly adsorb albumin. (D.J. Lyman, L.C. Metcalf, D. Albo Jr., K.F. Richards, J. Lam: Trans. Amer. Soc.
Artif. Int. Organs 20 B, 474 (1974).Artif. Int. Organs 20 B, 474 (1974).
Diese Erkenntnisse wurden in der folgenden Zeit immer häufiger dazu herangezogen, um Biomaterialien in Bezug auf ihre Blutverträglichkeit zu charakterisieren, andererseits nutzte man sie, um durch Vorbelegung der Oberfläche mit Humanserumalbumin die Kompatibilität zu Blut noch zu verbessern. Besonders bei der direkten Detoxikation ist es notwendig, zur schnellen Entfernung der toxischen Substanzen aus dem Blut, die adsorbierende Oberfläche groß zu dimensionieren, wodurch eine große Gefahr der Entstehung einer Thromboembolie oder die Anderung der Adsorptionseigenschaften der verwendeten Materialien durch Proteinablagerung besteht, Jedoch konnte Chang (T.M.S. Chang, Kidney Intern. 10, S 305 (1976) bei Verwendung von Collodium ummantelter Aktivkohle ebenso wie Ton (H.Y. Ton, R,D, Hughes, D,B,A. Silk, R. Williams, J. Biomedt Matt Res. 13, 407 (1979)) beim Einsatz von neutralen Adsorbentien nachweisen, daß das Aufbringen einer Albuminschicht auf die Oberfläche der Hämoperfusionsadsorbermaterialien, deren Kompatibilität mit Blut deutlich verbesserte.These findings became more and more common in the following time used to characterize biomaterials with regard to their blood compatibility, on the other hand, they were used to preallocate the surface with human serum albumin to improve the compatibility with blood. Especially with direct detoxification it is necessary for the rapid removal of toxic substances from the blood, to dimension the adsorbing surface large, creating a great risk of Development of a thromboembolism or the change in the adsorption properties of the materials used consists of protein deposition, however, Chang (T.M.S. Chang, Kidney Intern. 10, p 305 (1976) when using collodion coated Activated carbon as well as clay (H.Y. Ton, R, D, Hughes, D, B, A. Silk, R. Williams, J. Biomedt Matt Res. 13, 407 (1979)) demonstrate when using neutral adsorbents that applying a layer of albumin to the surface of the hemoperfusion adsorber materials, markedly improved their compatibility with blood.
Neben der eben beschriebenen direkten Detoxikation mittels spezieller Adsorbentien gehen in letzter Zeit die Bemühungen der Mediziner dahin, komplexe Entgiftungsprozesse, die im gesunden Organismus überwiegend in der Leber erfolgen, bei deren Versagen durch medizinische Unterstützungssysteme kurz- oder mittelfristig zu ersetzen. Leberversagen ist in allen Fällen ein Ausfall leberspezifischer Stoffwechsel leistungen, die von einer geringgradigen Funktionsstörung bis zum Zusammenbruch aller Funktionen (Leberkoma) reichen kann. Gerade das zuletzt erwähnte hepatische Koma ist für den betroffenen Patienten besonders gefährlich, da der Totalausfall der Leberfunktion zu einer raschen Ansammlung von Toxinen in den Körperflüssigkeiten und Geweben führt, welche wiederum die Funktionen anderer Organe (z.B. des Gehirns) negativ beeinflussen. Hämoperfusion über Aktivkohle ist ein brauchbares Verfahren zur Eliminierung eines breiten Spektrums derartiger Verbindungen. Die bisher damit gemachten Erfahrungen konnten zwar eine vorübergehende Besserung des Zustandes des Behandelten erzielen, die Nebenwirkungen sind jedoch immer noch gravierend. So werden neben den Toxinen von der Aktivkohle ebenfalls lebenswichtige Substanzen wie Aminosäuren, Hormone sowie Phospholipide dem Plasma entzogen.In addition to the direct detoxification just described using special Lately the efforts of medical professionals are going to make adsorbents complex Detoxification processes, which in a healthy organism mainly take place in the liver, in the event of their failure by medical support systems in the short or medium term to replace. Liver failure is in all cases a failure of liver-specific metabolism benefits ranging from a minor dysfunction to collapse of all functions (hepatic coma) can be enough. Just the last-mentioned hepatic one coma is particularly dangerous for the affected patient because the total failure of liver function leads to a rapid accumulation of toxins in the It carries body fluids and tissues, which in turn perform the functions of other organs (e.g. of the brain) negatively affect. Hemoperfusion over activated charcoal is a useful one Process for eliminating a wide variety of such compounds. the Experiences made with it so far have resulted in a temporary improvement in the Achieve the condition of the treated, but the side effects are still serious. In addition to the toxins, the activated charcoal also produces vital substances such as amino acids, hormones and phospholipids are withdrawn from the plasma.
Deshalb scheint es besonders dringend zu sein, ein spezielles Behandlungskonzept zu entwickeln, welches primär auf den Gesamtkomplex der Entgiftung ausgerichtel ist und das sich ebenfalls noch durch eine gute Blutverträglichkeit auszeichnet. Das Problem der Spezifität des Systems in Bezug auf ein Überwiegen von Detoxikationsreaktionen läßt sich nur mit Hilfe von Biokatalysatoren beherrschen. So wurde von verschiedenen Seiten der Einsatz von immobilisierten Lebexenzymen, Mikrosomenfraktionen, ganzen Leberzellen sowie Mikroorganismen für die Verwendung in Entgiftungseinheiten untersucht. (Y.Nose, PS.That is why it seems particularly urgent to have a special treatment concept to develop which is primarily geared towards the overall complex of detoxification and that is also characterized by good blood tolerance. The problem of the specificity of the system in terms of a predominance of detoxification reactions can only be controlled with the help of biocatalysts. So was different Pages of the use of immobilized liver enzymes, microsome fractions, whole Liver cells and microorganisms were studied for use in detoxification units. (Y.Nose, PS.
Malchesky, I.Koshino, F. Castino, F. Scheucher in: Artificial Organs, R.M. Kenedi, J.M. Courtney, J.D.S.Malchesky, I. Koshino, F. Castino, F. Scheucher in: Artificial Organs, R.M. Kenedi, J.M. Courtney, J.D.S.
Gaylor, T.Gilchrist (Edts.) MacMillan Press, London (1977) S.378-387), (G.Brunner, H.Loesgen, ebenda. S.388-394), (P.S. Malchesky, Y.NosE: Artificial Organs 3, 8 (1979).Gaylor, T. Gilchrist (Edts.) MacMillan Press, London (1977) pp.378-387), (G.Brunner, H.Loesgen, ibid. Pp.388-394), (P.S. Malchesky, Y.NosE: Artificial Organs 3, 8 (1979).
Ungelöst blieb jedoch bisher die Problematik der Kompatibilität des verwendeten Trägermaterials gegenüber Blut.However, the problem of the compatibility of the used carrier material against blood.
Die vorliegende Erfindung geht von den oben beschriebenen Vorteilen einer Verbesserung der Blutverträglichkeit von Oberzlächen durch Vorbelegung mit Humanserumalbumin aus Dieses ist, wie bereits oben beschrieben, von Ton et al, für das neutrale Adsorberharz-XAD-7 dargelegt worden.The present invention proceeds from the advantages described above an improvement in the blood tolerance of surfaces by pre-loading with Human serum albumin from This is, as already described above, by Ton et al, for the neutral adsorbent resin-XAD-7 has been presented.
Erfindungsgegenstand ist somit ein Verfahren zur Immobilisierung von biologischen Detoxikationssystemen an Oberflächen,wie sie zur Entgiftung von Blut und Blutbestandteilen angewandt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß a) die Oberfläche in an sich bekannter Weise mit einer Humanserumalbumin-Schicht, vorzugsweise adsorbtiv, vorbelegt sodann b) die Humanserumalbumin-Schicht in an sich bekannter Weise mit bifunktionellen Reagentien aktiviert und quervernetzt wird, und endlich c) an den aktivierten Stellen die Detoxikationssysteme kovalent angebunden werden.The subject of the invention is thus a method for immobilizing biological detoxification systems on surfaces such as those used to detoxify blood and blood components are applied. The inventive method is thereby characterized in that a) the surface in a known manner with a human serum albumin layer, preferably adsorbent, then pre-assigned b) the human serum albumin layer in on is activated and crosslinked in a known manner with bifunctional reagents, and finally c) the detoxication systems are covalently attached to the activated sites will.
Bifunktionelle Reagenzien sind z.B. Monomere, Dimere, Trimere und/oder Oligomere, die an zwei Enden zu einer Kopplung geeignete funktionelle Gruppen tragen.Bifunctional reagents are, for example, monomers, dimers, trimers and / or Oligomers which carry functional groups suitable for coupling at two ends.
Das biologische Detoxikationssystem kann ein Enzym oder eine Kombination verschiedener zusammenwirkender Enzyme sein. Bevorzugt ist das biologische Detoxikationssystem eine Kombination der drei Enzyme Urease (E.C 3.5.15), Alanindehydrogenase (E.C 1.4,11) und Glucosedehydrogenase (E.C 1.1.1.47).The biological detoxification system can be an enzyme or a combination different interacting enzymes. The biological detoxification system is preferred a combination of the three enzymes urease (E.C 3.5.15), alanine dehydrogenase (E.C 1.4,11) and glucose dehydrogenase (E.C 1.1.1.47).
Das biologische Detoxikationssystem kann erfindungsgemäß ein zellorganell sein, es kann ein von einer natürlichen und/oder künstlichen Membran.umschlossenes Multienzymsystem sein oder eine lebende Körper- und/oder Bakterienzelle.According to the invention, the biological detoxication system can be a cell organelle it can be one enclosed by a natural and / or artificial membrane Multi-enzyme system his or a living body and / or bacterial cell.
Ersichtlich ist es die Aufgabe der Erfindung, dem ganzen System eine Spezifität bezüglich der detoxikativen Eigenschaften zu verleihen. Dazu nutzt die Erfindung die auf die Oberfläche aufgebrachten Albuminmoleküle als Fixierungspunkte für die bereits angeführten Biokatalysatoren. Die Verbindung von z.B. Enzymen und Mikrosomen mit Albumin kann entsprechend den Anforderungen aufgrund der Proteinstruktur beider Komponenten unter anderem über eine Diazokopplung, die Bildung einer oder mehrerer Peptidbindungen oder der Kondensierung von Aminogruppen, Carboxylgruppen, Thiogruppen unter Zuhilfenahme bifunktioneller Reagentien erfolgen.Obviously it is the object of the invention, the whole system one To give specificity with regard to the detoxicative properties. To do this, the Invention, the albumin molecules applied to the surface as fixing points for the biocatalysts already mentioned. The connection of e.g. enzymes and Microsomes with albumin can according to the requirements due to the protein structure both components, among other things, via a diazo coupling, the formation of an or multiple peptide bonds or the condensation of amino groups, carboxyl groups, Thio groups take place with the aid of bifunctional reagents.
Die Abbildung 1 veranschaulicht dieses noch einmal.Figure 1 illustrates this again.
Auf einer Oberfläche 1 wird unter Ausnutzung adsorptiver Kräfte durch Einwirken las sen einer Lösung von Humanserumalbumin in einem geeigneten wässrigen Lösungsmittel Humanserumalbumin 2 aufgebracht. Dieses bis hierher bekannte, von Ton et al. verwendete Verfahren, führte zwar zu guten Ergebnissen in Bezug auf die Blutverträglichkeit derartig modifizierter Oberflächen, hat jedoch den Nachteil, daß das adsorptiv fixierte Albumin unter geeigneten Bedingungen (z.B. Änderung des pH-Wertes, der Ionenstärke oder der Proteinumgebung) wieder von der Bindungsstelle abgelöst werden kann. Im Extremfall kann dies zu einem kompletten Austausch der Albuminmoleküle auf der Oberfläche gegen solche Proteine führen, die eine höhere Affinität zu den Oberflächenstrukturen besitzen. Damit käme es - entsprechend dem Fortschreiten dieses Prozesses -gleichzeitig zu einer Aufhebung der Kompatibilität gegenüber Blut. Erfindungsgemäß wird, wie in Abbildung 2 verdeutlicht, auf dem an die Oberfläche 1 adsorbierten Humanserumalbumin 2 nach einem ein- oder mehrstufigen Aktivierungsschritt der gewünschte Biokatalysator 3 kovalent über die Bindung 4 gekoppelt. Dieses führt jedoch gleichzeitig dazu, daß benachbarte Albuminmoleküle 5 kovalent quervernetzt werden. Dieses wird vor allem bei Anwendung längerer a2#'hatischer bifunktioneller Reagentien bevorzugt auftreten. Dieser Effekt ist jedoch besonders vorteilhaft, da er den oben beschriebenen Nachteil einer Ablösung von adsorptiv gebundenem Albumin durch die Ausbildung eines stabilen, dreidimensionalen Maschenwerkes behebt Dadurch bedingt erhält man eine unter physiologischen Bedingungen nicht mehr von der Oberfläche entfernbare blutverträgliche Albuminbeschichtung, die dazu noch den speziellen Katalysator fUr das Detoxikationssystem trägt (1).On a surface 1 is made by utilizing adsorptive forces Let a solution of human serum albumin in a suitable aqueous solution act Solvent human serum albumin 2 applied. This one known so far, from Ton et al. method used, led to good results in terms of the Blood compatibility of such modified surfaces, but has the disadvantage that the adsorptively fixed albumin under suitable conditions (e.g. change of the pH value, the ionic strength or the protein environment) from the binding site can be replaced. In extreme cases, this can lead to a complete replacement of the Albumin molecules on the surface lead against those proteins that have a higher level Have an affinity to the surface structures. So it would come about - according to that Progress of this process - at the same time to a loss of compatibility versus blood. According to the invention, as illustrated in Figure 2, on the the surface 1 adsorbed human serum albumin 2 after one or multi-stage activation step of the desired biocatalyst 3 covalently via the bond 4 coupled. However, this also leads to neighboring Albumin molecules 5 are covalently crosslinked. This is especially important when using longer a2 # 'hatic bifunctional reagents occur preferentially. This effect however, it is particularly advantageous because it has the above-described disadvantage of detachment of adsorptively bound albumin through the formation of a stable, three-dimensional Corrected meshwork As a result, one obtains one under physiological conditions blood-compatible albumin coating that can no longer be removed from the surface, which also carries the special catalyst for the detoxification system (1).
Der Grad der Quervernetzung der Albuminmoleküle sowie die Quantität des auf der Albuminschicht immobilisierten Biokatalysators können durch Variation der Parameter (Dichte der Albuminbelegung, Konzentration der Vernetzungsreagentien, Dauer der Reaktion, Konzentration des zu fixie-~rennen Biokatalysators) in weiten Grenzen den Erfordernissen angepaßt werden. Welche Mdhode zur kovalenten Immobilisierung herangezogen wird und welches Reagenz im speziellen Anwendung findet, ist unter anderem von der spezifischen Aktivität des biologischen Detoxikationssystems, dessen Anzahl einzelner zur Kopplung zur Verfügung stehender Gruppen, sowie der Stabilität des Biokatalysators unter gewissen Bedingungen abhängig. Hierfür kann keine vereinheitlichende Empfehlung gegeben werden. Jedoch sind in allen Fällen die Kopplungsbedingungen bezüglich des pH-Wertes, der Ionenstärke sowie der Reaktionstemperatur so zu wählen, daß es nicht zu einer irreversiblen Schädigung oder Dgaturierung des Albumins oder des Biokatalysators kommen kann. Im folgenden sind drei Beispiele angeführt, in denen die kovalente Immobilisierung verschiedener Enzyme auf einerffiklbumin beschichteten neutralen Adsorber mit Hilfe des bifunktionellen Reagenzes Glutardialdehyd demonstriert wird.The degree of cross-linking of the albumin molecules as well as the quantity of the biocatalyst immobilized on the albumin layer can be varied by variation the parameters (density of albumin coverage, concentration of crosslinking reagents, Duration of the reaction, concentration of the biocatalyst to be fixed) to a large extent Limits are adapted to the requirements. Which method for covalent immobilization is used and which reagent is used in particular is under the specific activity of the biological detoxification system, its Number of individual groups available for coupling, as well as the stability of the biocatalyst under certain conditions. There can be no unifying Recommendation will be given. However, in all cases the coupling conditions are to be chosen with regard to the pH value, the ionic strength and the reaction temperature, that there is no irreversible damage or dgaturation of the albumin or of the biocatalyst can come. Three examples are given below, in which the covalent immobilization of various Enzymes on a ffiklbumin coated neutral adsorber with the help of the bifunctional reagent glutaraldehyde is demonstrated.
Das neutrale Adsorberharz XAD-7 wird mit physiologischer Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) äquilibriert und anschließend für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Bewegen mit einer Lösung von Humanserumalbumin (HSA) in PBS in Verbindung gebracht. Das Verhältnis von Naßschüttvolumen des Harzes zu dem zugegebenen Volumen der Albuminlösung kann 1:2 - 1:20, vorzugsweise 1:4 betragen. Die HSA-Konzentration liegt im Bereich von 1 - 100 mg, vorzugsweise bei 50 - 100 mg/ml. Nach dem Auswaschen des überschüssigen Albumins wird durch Wahl der Glutardialdehydkonzentration sowie der zugegebenen Menge eine gewünschte Anzahl freier Aminogruppen aktiviert, sowie gleichzeitig eine Quervernetzung der HSA-Moleküle erreicht. Das Verhältnis Naßschüttvolumen des HSA-beladenen XAD-7 Harzes zu dem Volumen der addierten Glutardialdehydlösung beläuft sich auf 1 : 2- 1 :20, vorzugsweise 1 : 4. Die Konzentration des Glutardialdehydes in der Lösung (v/v) beträgt 0,01 - 1,0 %, vorzugsweise 0.05 - 0.2 %. Die so aktivierten Gruppen läßt man nach der Entfernung des nicht gebundenen bifunktionellen Reagenzes mit den Aminofunktionen des zu koppelnden Biokatalysators für 10 - 20 Stunden, vorzugsweise 20 Stunden, bei 40 C, wobei man die Proben bewegt, reagieren.The neutral adsorber resin XAD-7 is buffered with physiological phosphate Saline solution (PBS) and then equilibrated for 2 hours at room temperature in contact with a solution of human serum albumin (HSA) in PBS with gentle agitation brought. The ratio of the wet bulk volume of the resin to the volume added the albumin solution can be 1: 2 - 1:20, preferably 1: 4. The HSA concentration is in the range from 1 to 100 mg, preferably 50 to 100 mg / ml. After washing out of the excess albumin is determined by choosing the glutaraldehyde concentration as well the amount added activates a desired number of free amino groups, as well as at the same time a cross-linking of the HSA molecules is achieved. The wet bulk volume ratio of the HSA-loaded XAD-7 resin to the volume of the added glutaraldehyde solution amounts to 1: 2- 1:20, preferably 1: 4. The concentration of glutaraldehyde in the solution (v / v) is 0.01-1.0%, preferably 0.05-0.2%. The so activated Groups are left after the unbound bifunctional reagent has been removed with the amino functions of the biocatalyst to be coupled for 10-20 hours, preferably React for 20 hours at 40 ° C. while moving the samples.
Es schließt sich eine Waschung der Präparation sowie ein Reaktionsschritt an, in dem durch Einwirkenlassen von Glycin oder einer anderen Monoaminosäure nicht reagiert habendes Glutardialdehyd abgesättigt wird. Nach erneutem, mehrmaligem Waschvorgang ist das so erhaltene Präparat nach einem Sterilisationsprozeß zum Einsatz bei der Detoxikation verwendbar.This is followed by a washing of the preparation and a reaction step in which by exposure to glycine or another monoamino acid not reacted glutaraldehyde is saturated. After repeated, repeated washing is the preparation thus obtained after a sterilization process for use in the Detoxication can be used.
Nach dom oben beschriebenen Schema wurden die drei Enzyme Alanindehydrogenase, Glucosedehydrogenase sowie Urease an Albumin überzogenes XAD-7 Harz kovalent gekoppelt. Die Abbildungen 3 - 5 geben die im batch-Test durchgeführten Aktivitätstests für diese drei Enzyme wieder. Für diese Tests wurden jeweils 100 mg des mit den diversen Enzymen präparierten HSA-beladenen XAD-Harzes mit jeweils 20 ml der entsprechenden Substratlösung bei 379 C im Schüttelwasserbad inkubiert. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben aus den Inkubationsgefäßen entnommen und auf qie Menge umgesetzten Substrates hin untersucht. Werden diese drei Einzeipräparationen zusammen mit den notwendigen Substraten inkubiert, so ist das Gesamtsystem in der Lage, aus Blut oder Dialysat Harnstoff nach folgenden Reaktionsschemen zu entfernen: Dieses Enzymsystem hat gegenüber dem bisher bekannten (T.M.S. Chang, C. Malouf: Artificial Organs 3,38-43 (1979)) den entscheidenden Vorteil, daß es als o6-Ketosäure nicht das vom menschlichen Körper nur bedingt tolerierte «-Ketoglutarat verwendet, sondern Pyruvat einsetzt, welches als natürliches Endprodukt der Glykolyse schnell metabolisiert werden kann.According to the scheme described above, the three enzymes alanine dehydrogenase, glucose dehydrogenase and urease were covalently coupled to albumin-coated XAD-7 resin. Figures 3 - 5 show the activity tests carried out in the batch test for these three enzymes. For these tests, 100 mg of the HSA-loaded XAD resin prepared with the various enzymes were incubated with 20 ml of the corresponding substrate solution at 379 ° C. in a shaking water bath. After the specified times, samples were taken from the incubation vessels and examined for the amount of reacted substrate. If these three individual preparations are incubated together with the necessary substrates, the overall system is able to remove urea from blood or dialysate according to the following reaction schemes: This enzyme system has the decisive advantage over the previously known (TMS Chang, C. Malouf: Artificial Organs 3,38-43 (1979)) that it does not use ketoglutarate, which is only partially tolerated by the human body, as the o6-keto acid, but Pyruvate is used, which as a natural end product of glycolysis can be quickly metabolized.
Die Abbildung 6 zeigt die Abnahme der Harnstoffkonzentration in 100 ml Dialysat, welches gleichzeitig mit den drei nach der erfindungsgemäßen Methode lmmobiw lisierten Enzymen inkubiert wurde. Die eingesetzten Enzymaktivitäten betrugen 15 U Urease, 150 U Alanindehydrogenase und 15 U Glucosedehydrogenase. Die Konzentrationen der Substrate waren NAD 1 mM, Pyruvat 30 mM, Glucose 100 mM, Harnstoff 10 mM. In gleicher Art und Weise kann das hier b ffiriebene Harnstoffentfernungssystem auch im Makromaßstab zur kontinuierlichen Regeneration von Dialysat im medizinischen Bereich eingesetzt werden, wobei die Aufbereitungseinheit mit granulären bzw. flächigen Elementen gefüllt sein kann.Figure 6 shows the decrease in urea concentration in 100 ml dialysate, which simultaneously with the three according to the method according to the invention Immobiw lized enzymes was incubated. The enzyme activities used were 15 U urease, 150 U alanine dehydrogenase and 15 U glucose dehydrogenase. The concentrations the substrates were NAD 1 mM, pyruvate 30 mM, glucose 100 mM, urea 10 mM. In The urea removal system used here can also do the same on a macro scale for the continuous regeneration of dialysate in medical Area can be used, the processing unit with granular or flat Elements can be filled.
In ähnlicher Weise können mit Hilfe der in dieser Erfindung beschriebenen Methode auch andere spezifische Leberenzyme kovalent immobilisiert werden, um in vitro Entgiftungsreaktionen nachzuvollziehen. Als Beispiele seien genannt: - Glucoronyltransferase Glutathiontransferasen Sulfattransferasen - Epoxidhydratase - Methyltransferase - Cytochrom-P-450-System Acetyltransferasen - Glycyltransferasen Aber auch Hepatocyten, Sternzellen, Gallengangzellen oder Mikrosomenfraktionen (von einem Teil der natürlichen Zellwand umschlossenen Cytoplasmafraktionen) sowie diverse Organeilen dieser Zellarten lassen sich erfindungsgemäß an einen Träger koppeln. Einsatzgebiete solcher Systeme sind die Hämoperfusion, die Plasmaseparation sowie die H#mofiltration.Similarly, using those described in this invention Method, other specific liver enzymes can also be covalently immobilized in order to enter To understand vitro detoxification reactions. Examples are: - Glucoronyltransferase Glutathione transferases sulfate transferases - epoxide hydratase - methyltransferase - Cytochrome P-450 system Acetyltransferases - Glycyltransferases But also hepatocytes, Star cells, bile duct cells or microsomal fractions (from part of the natural Cell wall enclosed cytoplasm fractions) as well as various parts of the organs of these cell types can be coupled to a carrier according to the invention. Areas of application for such systems are hemoperfusion, plasma separation and hemofiltration.
L e e r s e i t eL e r s e i t e
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| DE19813109123 DE3109123A1 (en) | 1981-03-11 | 1981-03-11 | Process for the covalent immobilisation of biological detoxification systems on artificial surfaces |
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