DE3138194A1

DE3138194A1 - Wasserunloesliches poroeses proteinmaterial, dessen herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE3138194A1
Application number: DE19813138194
Authority: DE
Inventors: Hans-Helmut Dipl.-Chem. Dr. Goertz; Stefan Dipl.-Chem. Dr. 6700 Ludwigshafen Marcinowski; Axel Dipl.-Chem. Dr. 6710 Frankenthal Sanner
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1981-09-25
Filing date: 1981-09-25
Publication date: 1983-04-14
Also published as: EP0075815A3; JPH0412952B2; EP0075815B1; JPS5869230A; DE3269997D1; EP0075815A2; US4478976A

Description

SASF Aktiengesellschaft , 3 Ο.Ζ.ΟΟ5Ο/Ο35449

'"Wasserunlösliches poröses Proteinmaterial, dessen Herstellung und Verwendung

Die Erfindung betrifft ein wasserunlösliches poröses Proteinmaterial, dessen Herstellung sowie die Verwendung dieses Materials zur Durchführung enzymatischer Reaktionen,

Träger zur Bindung bzw. Immobilisierung von Enzymen an Träger sind bereits bekannt (Dechema Monographie Vol.84, Verlag Chemie (1979), Seite 145 ff; "Immobilized Enzymes" John Wiley & Sons, New York, 1978). Zur Adsorption von Enzymen wurden bislang Träger auf der Basis von Biopolymeren oder modifizierten Biopolymeren, wie DEAE-Cellulose oder DEAE-Sepharose, verwendet (Enzymologla 3I₁* 214

15' (.1969); Biotechnol. Bioeng. £, 603 (1967)). Diese Träger besitzen jedoch nur eine geringe mechanische Stabilität und schlechte hydrodynamische Eigenschaften. Weiter ist ihre Herstellung sehr aufwendig und kompliziert. Schließlich werden sie leicht durch Mikroorganismen angegriffen und verändert.

Es wurde nun eine Kombination aus einem Polymerisat und einem aktiven Protein gefunden, welche die oben geschilderten Nachtelle weitgehend vermeidet.

Gegenstand der Erfindung ist ein wasserunlösliches poröses und/oder quellbares Proteinmaterial, bestehend aus einem biologisch aktiven Protein auf einem wasserunlöslichen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß es das Protein gebun-3Q den an ein wasserunlösliches, poröses und/oder quellbares Copolymerisat auf der Basis eines Copolymeren von N-Vinylimidazol und/oder substituierter N~Vinylimidazole und mit diesen copolymerisierbaren Monomeren enthält.

BASF Aktiengesellschaft - /- 0.2.0050/035449

^pDas Copolymerisat, welches als Träger für das Proteinmaterial dient, enthält mindestens 10 %, vorzugsweise mindestens 30 % N-Vinylimidazol oder substituierte N-Vinylimidazole. Als substituierte N-Vinylimidazole kommen insbesondere in ; Betracht: 2-Methyl-, 4-Methyl-, 2-Ethyl-, 2-Propyl-, 2-Isopropyl- und 2-Phenyl-l-vinylimidazole.

Das Copolymerisat enthält vorzugsweise IQ bis 99 % der genannten Imidazolderivate und 1 bis 70 % Divinylbenzol. Die Unlöslichkeit der Polymeren in Wasser wird insbesondere durch Zugabe von 1 bis 70 %, vorzugsweise 3 bis 20 %, mehrfach olefinisch ungesättigter, mit den Vinylgruppen des N-Vinylimidazols bzw. der entsprechenden Derivate copolymerisierbarer Monomerer erreicht. Speziell eignen sich folgende Monomere: 2 oder mehr Vinylgruppen enthaltende Benzolderivate - z.B. Divinylbenzol-, mehrfunktionelle Ester der Acryl- oder Methacrylsäure - wie Butandioldiacrylat -, mehrfach ungesättigte Harnstoffderivate - wie Divinylethy- i 1enharnstoff oder Divinylpropylenharnstoff - oder Bisacrylamide - wie Methylenbisacrylamid oder Ethylenbisacrylamid.

Es ist auch möglich, weitere Monomere, die mit dem N-Vinylimidazol und Divinylbenzol copolymerisierbar sind, in einer Menge bis zu 89 % einzupolymerisieren.. Solche Monomere sind z.B. Styrol, (C n-Alkyl ^styrole, Acryl- und Methacrylsäure, deren Allylester, insbesondere hydrophile , Ester wie Hydroxyalkyl- oder Aminoalkyl ester, andere Vinylheterozyklen wie N-Vinylpyrrolidon und Vinylpyridin. Allerdings führt der Zusatz eines Coiflonomeren in Mengen über 20 % in der überwiegenden Zahl der Fälle nicht zu einer Verbesserung der Adsorptionseigenschaften. Auch der Ersatz des Divinylbenzols durch andere Vernetzer wie z.B. Butandioldiacrylat, Divinylethylenharnstoff oder Methylenbisracrylamid kann zu weniger guten Ergebnissen führen.

BASF Aktiengesellschaft - /. O.2.OO5O/O35449

Träger der genannten Art, die zur Adsorption von Proteinen geeignet sind, können durch radikalIsche Polymerisation gewonnen werden. Beispielsweise kann eine Mischung der Monomeren, gegebenenfalls unter Zugabe eines nicht polymerisierbaren Zusatzstoffes, mit Hilfe eines geeigneten Radikalbildners, z.B. einer Azoverbindung oder eines Peroxids,, bei er- - höhter Temperatur polymerisiert werden. Eine solche Substanzpolymerisation ist in der DE-OS 25 06 085 beschrieben» Wird die Polymerisation in einem Lösungsmittel durchgeführt, wobei im Falle der Vinyl imidazole z.B., Wasser In Präge kommt (bei gleichzeitiger Verwendung eines wasserlöslichen Initiators), so erhält man das Polymerisat als Gel (US-PS 2 878 183). Auch eine Polymerisation in Lösung, bei der nur das Monomere, nicht jedoch das Polymere im Lösungsmittel löslich 1st (Fällungspolymerisation), kommt in Betracht. Ganz besonders geeignet ist die Suspensionspolymerisation, da bei diesem Verfahren das Polymerisat in der für die Verwendung besonders geeigneten Perlform entfällt«, Hierbei wird die Monomerenmischung, gegebenenfalls zusammen mit einem organischen Zusatzstoff, unter Verwendung eines geeigneten Hilfsmittels (z.B. eines hochmolekularen Polyvinylpyrrolidon) in Wasser emulgiert und mit Hilfe eines in der Monomerenmischung gelösten Radikalbildners polymerisiert. Wegen der teilweisen Wasserlöslichkeit der VinylImidazole empfiehlt sich ein Salzzusatz zur Wasserphase (DE-AS 19 29 501). Auch das Verfahren der umgekehrten Suspension, bei dem die wäßrige Monomerphase in einer inerten äußeren Phase, z.B. einem Kohlenwasserstoff, suspendiert ist, kann mit Erfolg angewandt werden (DE-OS 23 24 204).

■

: Die folgenden Beispiele A bis H schildern die Herstellung geeigneter Polymerer,

BASF Aktiengesellschaft' - A 0.2. OO5O/O35449

'"Beispiel A

Eine Mischung aus 200 Teilen 2-Methyl-l-vinylimidazol, 100 Teilen technischem Divinylbenzol (technisches Divinylbenzol bestehend aus 50 % Divinylbenzol, 50'% Ethylvinylbenzol) und 300 Teilen Butylacetat, in der 12 Teile Lauroylperoxid gelöst sind, wird in einer Lösung von 500 Teilen Na SO₁, '10 H₂O in 2500 Teilen Wasser, das 3 Teile Polyvinylpyrrolidon (M = 10 ) enthält, dispergiert und unter Rühren 8h auf 80⁰C erhitzt. Das perlförmige Polymerisat wird abfiltriert, mit Wasser und Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Beipsiel B

Eine Mischung aus 100 Teilen N-Vinylimidazol, 50 Teilen technischem Divinylbenzol und 150 Teilen Ethylacetat, in der 6 Teile Azoisobutyrodinitril gelöst sind, wird in einer Lösung von 250 Teilen Na₃SO₁. '10 H₃O in 15OO Teilen Wasser, das 3 Teile Polyvinylpyrrolidon (M = 10 ) enthält, dispergiert und wie in Beispiel A polymerisiert.

•Beispiel C

Eine Mischung aus 50 Teilen N-VinylImldazol, 31 Teilen technischem Divinylbenzol und 75 Teilen Ethylacetat, die 3 Teile Azoisobutyrodinitril enthält, wird in 1500 Teilen Wasse.r, in dem 125 Teile Ma SO^ '10 HpO und 2 Teile Polyvinylpyrrolidon (M = 10 ) gelöst sind, dispergiert und wie in

Beispiel A polymerisiert. .

BASF Aktiengesellschaft - * - Q. Z. OO5O/O35449

"Beispiel D.

Eine Mischung aus 100 Teilen 2-Methyl-l-vlnylimidazol, 100 Teilen N-Vinylpyrrolidon, 100 Teilen technischem Divinylbenzol und 400 Teilen Toluol, die 10 Teile Benzoylperoxid enthält, wird in einer Lösung von 500 Teilen Natriumchlorid und 3 Teilen Polyvinylpyrrolidon (M = 10 ) in 2500 Teilen Wasser dispergiert und wie in Beispiel A polymerisiert.

Beispiel R

Eine Mischung aus 45 Teilen 2-Methyl-l-vinylimldazol, 45 Teilen 2-Hydroxyethylmethacrylat, 10 Teilen technischem Divinylbenzol und 100 Teilen n-Oetan, die 4 Teile Benzoylperoxid enthält, wird in einer Lösung von 200 Teilen Kochsalz und 1 Teil Polyvinylpyrrolidon (M = 10 ) in 750 Teilen V/asser dispergiert und wie in Beispiel A polymerisiert.

Beispiel F

Eine Mischung-aus 90 Teilen 2-Methyl~l-vlnylimidazol₃ 10 Teilen N,N'-Divinylethylenharnstoff und 100 Teilen Ethylacetat, die 4 Teile Lauroylperoxid enthält, wird in einer Lösung von 1 Teil Xanthan und 200 Teilen Kochsalz in 750 Teilen Wasser dispergiert und wie in Beispiel A polymerisiert.

Beispiel G

3Q Eine Lösung von 40 Teilen N-Vinylimidazol, 20 Teilen Methylenbisacrylamid und 5 Teilen Kallurnperoxodisulfat in 40 Teilen Wasser wird unter Stickstoff 7 h auf 70⁰C erwärmt. Das erhaltene Gel wird zerkleinert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.

BASF Aktiengesellschaft - \ί ■ O.Z. ΟΟ5Ο/Ο35449

^r Beisplel H ■ - -

Eine Mischung aus 100 Teilen N-Vinylimidazol, 50 Teilen technischem Divinylbenzol und 150 Teilen Ethylacetat, die κ 1 Teil Azoisobutyrodinitril enthält, wird unter Stickstoff 3 h auf 7O⁰C erwärmt. Das erhaltene Polymerisat wird zerkleinert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Die Polymerisate können Quellbarkeiten in Wasser von ca. 2 bis über 25 ml Feuehtvolumen pro Gramm Trockensubstanz aufweisen. Die Prdteinaufnahme ist im allgemeinen bei besser quellbaren Polymerisaten höher als bei vergleichbaren weniger quellbaren, jedoch besteht kein unmittelbarer Zusammenhang zwischen Proteinaufnahme und Quellbarkeit.

Das Proteinaufnahmevermögen vinylimidazolhaltlger Polymerisate variiert je nach Zusammensetzung und Vernetzungsdichte. Es ist außerdem von Protein zu Protein verschieden. Je nach Protein kann die Zugabe eines inerten organischen Lösungsmittels, in dem die Monomeren löslich und die Polymeren unlöslich sind, wie z.B. Ligroin, Octan, Toluol, Essigsäureethylester oder -butylester, zur Polymerisationsmischung das Adsorptionsvermögen verbessern. Geeignete derartige Zusätze können in Stichversuchen einfach ermittelt werden. In günstigen Fällen können Adsorptionswerte von über 5 g gebundenes Protein pro g trockenes Polymerisat erreicht werden.

Die Beladung der polymeren Adsorbentien mit Protein bzw. .die Entfernung eines Proteins aus einer Lösung kann entweder batchweise durch Einrühren des Polymeren in die Proteinlösung oder kontinuierlich durch überleiten der Proteinlösung über das Polymere, z.B. in einer Säule, erfolgen. Handelt es sich bei dem adsorbierten Protein um ein Enzym,

BASF Aktltneweüaetwft - i~- °· ^ζ- 0050/035*49

* so behält dieses im adsorbierten Zustand im allgemeinen zumindest einen Teil seiner ursprünglichen Aktivität. Dies erlaubt seine Verwendung als heterogener Katalysator zur Durchführung der entsprechenden Enzymreaktion. Z.B. weist das Enzym Invertase nach seiner Adsorption an einem ein Vinylimidazol enthaltenden Polymeren eine Restaktivität von ca» 20 % auf„ Um die Stabilität des adsorbierten Enzyms zu erhöhen, ist eine Vernetzung des Enzyms auf dem Träger vorteilhaft. Ein hierfür geeignetes Reagenz 1st z.B. GlUtar-IQ d ialdehyd.

Enzyme, die an ein ein Vinylimidazol enthaltendes Polymeres adsorbiert werden können, sind vorzugsweise Invertase, Qlucoseisomerase, Amyloglucosidase, alpha- und Jg beta-Amylase, Aminosäureacylase, Penlcillinacylase und Hydantolnase. Ferner sind geeignet: Oxidoreduktasen - wie Alkoholdehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Arninosäureoxidase, Peroxidase, Ka-talase, Glucoseoxldase, Alkoholoxidase,

Succinatdehydrogenase, Glutamatdehydrogenase, Uricase,

ig Phenoloxidase, Catecholoxidase, Monoaminooxidase, Lipoxygenase. Luciferase, Mitratreduktase, Mitritreduktass, Chlorperoxidase, Acetaldehyddehydrogenase, Aldehydoxigenase, Diaphorase, Cholesterlnoxidase, Olutarthioreduktase, HydroxysteroirMehydrogenase, Xanthlnoxida.se, Popamin-

gg hydroxylase, Cytochromoxidase, Monoaminooxldase, Dlacetylreduktase, Superoxiddlsmutase, Liinonatdehydrogenase -; Transferasen - wie Polynucleotidphosphorylase, Dextransucrase, Phosphorylase, Carbamatkinase, Äminotransferase, Transaldolase, Methyltransferase, Pyruvatkinase, Carbarnoyl-

3Q transferase, Phosphofructokinase, Dextransynthetase -; Hydrolasen - wie Lipase, Esterase, Lactase, Lycozym, Cellulase, Urease, Trypsin, Chymotrypsin, Glutaminase, Asparaginase, Papain, Ficin, Pepsin, Leucinaminopeptidas^f.·, Carboxypeptidase A+?₃ Maringinase, Brornelain, Subtilisin, Phospholiphase, Isoamylase, Cephalosporinamidase,

BASF Aktiengesellschaft _ * . O. Z. 0050/035449

^rAdenosindeaminase, Penicilllnase, Maltase, Dextranase, Desoxyrlbonuclease, Sulfatase, Pullulanase, Phosphatase, alpha-Qalactosidase, Dextranase, beta-Glucanase -; Lyasen - wie Tryptophanase, Tyrosindecarboxylase, Oxinltrilase, Phenylalanindecarboxylase, Phenylalaninammoniumlase,

Aminosäuredecarboxylase, Pyruvatdecarboxylase, Pumarase, Enolase, Aspartase, Aminolaevulindehydratase, Carboanhydratase -; Isomerasen - wie Aminosäureracemase, Triosephosphatisomerase -; Ligasen - wie Glutathion-'0 synthetase.

Die erfindungsgemäßen Präparate weisen einen besonders hohen Proteingehalt auf und zeigen gute hydrodynamische Eigenschaften und eine gute mechanische Stabilität. Weiter IS sind sie einfach herzustellen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung des Proteinmaterials :

Beispiel 1

100 mg eines nach Beispiel A hergestellten Polymerisates (Teilchengröße 250 bis 500.um) werden in 100 ml einer 0,01 %igen Hämoglobinlösung gerührt und die Abnahme des Hämoglobins in der Lösung photometrisch verfolgt* Nach 20 min sind 15 %, nach 60 min 47 ? des Proteins am Polymeren adsorbiert.

Beispiel 2

. 200 mg eines nach Beispiel B hergestellten Polymeren (Teilchengröße 250 bis 50O₇Um) werden 64 h bei 4⁰C in 20 ml Lösung von 100 mg alpha-Amylase (130 Unit s/mg) in 0,005 M Natriumacetatpuffer vom pH 6,0 geschüttelt. Dann wird der Träger jeweils bei Raumtemperatur zweimal 5 min und zwei-

4f'

BASF AMhnsnilK»·» - /- 0.Z. 0050/035^9

^rmal 1 h in je 50 ml 0,05 M Natriumacetatpuffer von pH 6,0 gewaschen. Zur Ermittlung der immobilisierten enzymatischen Aktivität wird der Träger bei 3O⁰C 30 min in 50 ml Lösung von 5 g Stärke nach ■ Zulkowsky (Merck) in 0,016 M Natriumacetatpuffer (pH 6,0) geschüttelt. Die entstehenden Oligosaccharide werden mit 3,5-Dlnitrosallcylsäure nach P, Berenfeld (Methods in Enzymology, Vol. I, 149, Academic. Press, 1955), bestimmt. Aktivität des Trägers: 3,0 g hydrolysierte Stärke pro g und pro h.

' '

3elspiel 3

200 mg eines nach Beispiel C hergestellten Polymeren (Teilchengröße 250 bis 500,um) werden 64 h bei 4⁰C in 20 ml Lösung von 100 mg beta-Amylase (28 Units/mg) in 0,05 M Natriumacetatpuffer (pH 4,8) geschüttelt. Dann wird der Träger jeweils bei Raumtemperatur zweimal 5 min und zweimal 1 h in je 50 ml 0,05 M Natriumacetatpuffer von pH 4,8 gewaschen. Zur Ermittlung der immobilisierten enzymatischen Aktivität

2Q wird der Träger bei 3O⁰C 30 min in 50 ml Lösung von 5. g Stänke nach Zulkowsky (Merck) in 0,016 M Natriumacetatpuffer (pH 4,8) geschüttelt. Die gebildete Maltose wird mit 3,5-Dinitrosalicylsäure nach P. Berenfeld (loc. clt.) bestimmt. Aktivität des Trägers: 2,3 g gebildete Maltose pro g und pro h. .

Beispiel 4

An 200 mg eines nach Beispiel B hergestellten Polymeren 3Q (Teilchengröße 250 bis 500,Um) werden analog zu dem in Beispiel 2 angegebenen Verfahren Amyloglucosldase gebunden. Die Aktivität des Trägers beträgt 15,3 g gebildete Glucose pr.-> ^ und h.

it

BASF Aktiengesellschaft -KJ- O.Z. OO5O/O35449

^r Belspiel 5

25 mg eines nach Beispiel D hergestellten Polymeren v/erden 64 h bei 4⁰C mit einer Lösung von 250 mg Invertase (150 Units/mg) geschüttelt. Danach wird das Polymerisat bei Raumtemperatur zweimal 5 min und einmal 1 h in je 100 ml 0,0025 M Natriumacetatpuffer (pH 5,3) gewaschen. Das Polymere wird 10 min in 50 ml einer Lösung von 17,5 g Sucrose in 0,001 M Natriumacetatpuffer (pH 5,3) geschüttelt und der ^q Hydrolysegrad polarimetrisch bestimmt. Aktivität des Trägers 275 g Sucrose pro g und h. Gebundene Enzymmenge: 2,4 mg pro mg Polymeres.

Beispiel 6

Analog Beispiel G werden 25 mg eines nach Beispiel E hergestellten Polymeren mit Invertase beladen. Aktivität: 300 g Sucrose pro g Polymerisat und h. Gebundene Enzymmenge: 1,3 mg pro mg Polymerisat.

Beispiel 7

Analog Beispiel 5 werden 25 mg eines nach Beispiel P hergestellten Polymerisates mit Invertase beladen. Aktivität: 194 S Sucrose pro g Polymerisat und h. Gebundene Enzymmenge: 1,5 mg pro mg Polymerisat.

Beispiel 8

■^ Analog Eeispiel 5 werden 25 mg eines nach Beispiel G erhaltenen Polymeren mit Invertase beladen. Aktivität: 150 g-Sucrose pro g und h.

BASF Aktiengesellschaft - χι - O. Z. ΟΟ5Ο/Ο35Α49

'"Beispiel 9

Analog Beispiel 5 werden 25 mg eines naeh Beispiel H erhaltenen Polymeren mit Invertase beladen. Aktivität: 6 g Sucrose pro g und h.

Beispiel 10

Ig eines nach Beispiel C hergestellten Polymeren wird ana- ]q log zu Beispiel 5 mit Invertase beladen. Danach wird das

Polymerisat in eine Säule gefüllt und auf 3O⁰C thermostatisiert. Durch die Säule wird mit.einer Flußgeschwlndigkeit von 100 ml/h eine Lösung von 640 g Sue rose/1 (auf pH 5,3 eingestellt) gepumpt. Die Hydrolyse der Sucrose wird polari-J5 metrisch, verfolgt. Nach 1 Tag beträgt der Hydrolysegrad .92 %^P, nach 20 Tagen 38 %.

Beispiel 11

Der analog Beispiel 10 beladene Träger wird vor der Verwendung mit 20 ml einer 0,1 % igen Lösung von Glutardialdehyd in Wasser behandelt. Damit beträgt der Hydrolysegrad nach 1 Tag 95 %, nach 20 Tagen 85 %.

Claims

BASF Aktiengesellschaft 0. Z. 0050/035^9 Pa ten, tanSprüche

1. Wasserunlösliches poröses Proteinmaterial bestehend aus einem biologisch aktiven Protein auf einem wasserunlöslichen Träger, dadurch S.QJt_ejnnge_lj3hng_t, daß eg das Protein gebunden an ein wasserunlösliches, poröses und/oder quellbares Copolymerlsat auf der Basis eines Copolymeren von N-Vlnylimldazol und/oder substituierter N-Vlnyilmlazole und mit diesen copolymerleierbaren Monomeren enthält.

2. Proteinmaterial gemäß Anspruch 1, dadurch

3. Proteinmaterial gemäß Anspruch 1 oder 2, .d_adurgh_£gkennzelchnet, daß es als copolymerlsierbares Monomeren eine mehrfach ungesättigte Komponente enthält.

4· Protelnmatsrial gemäß Anspruch 3, d ad u rc hg g k f nn_z e lohnet , daß die mehrfach ungesättigte Komponente ein, zwei oder mehr Vinylgruppen enthaltendes Benzolderivat, ein mehrfunktloneller Ester der Acryl- oder Mit» acrylsäure, ein mehrfach ungesättigtes Harnstoffderlvat oder ein mehrfach ungesättigtes Säureamid ist.

5. Proteinmaterial gemäß Ansprüchen 1 bis U, l^JHEgjLS.g" kennzeichnet, daß es ein weiteres Comonomeres enthält.

6. Proteinmaterial gemäß Anspruch 5? dadurch g^enng^lehnet , daß es als weiteres Comonomeres Styrol, ei'n (C₁__>i(-Alkyl)-styrol, Acryl- oder Methacrylsäure sowie

516/81 WK/Ws 23.09.81
v.

BASF Aktiengesellschaft -2-] 0. Z. 0050/035449 ^!

** einen Alkyl- oder Aminoalkylester derselben oder ein Vinylheterocyclus enthält►

7. Verfahren zur Herstellung des Proteinmaterials gemäß 5 Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man das Protein an das Copolymerisat bindet.

8. Verwendung des Proteinmaterials gemäß Ansprüchen bis 6, zur Durchführung enzymatischer Reaktionen.