DE3211167A1 - Testsystem und verfahren zur bestimmung von substanzen in fluessigkeiten - Google Patents
Testsystem und verfahren zur bestimmung von substanzen in fluessigkeitenInfo
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Description
Merck Patent Gesellschaft 25. März 1982
mit beschränkter Haftung
6100 Darmstadt
6100 Darmstadt
Testsystem und Verfahren zur Bestimmung von Substanzen in Flüssigkeiten
Merck Patent Gesellschaft
mit beschränkter Haftung
Darmstadt
mit beschränkter Haftung
Darmstadt
Testsystem und Verfahren zur Bestimmung von Substanzen
in Flüssigkeiten
Die Erfindung betrifft ein Testsystem und ein Verfahren mit erweitertem Meßbereich zur Bestimmung
von Substanzen in Flüssigkeiten, insbesondere in Körperflüssigkeiten.
Die Bestimmung von Substanzen in Körperflüssigkeiten ist für die medizinische Diagnose von großer Bedeutung.
Dies gilt sowohl für quantitative Bestimmungen ■10 als auch für semiquantitative oder qualitative Verfahren,
die eine Selbstüberwachung des einzelnen Patienten oder ein einfaches Screening erlauben. Entsprechend
der Bedeutung dieser Tests sind eine Vielzahl von Verfahren bekannt geworden. Die gebrauchlichsten
Verfahren sind enzymatische Bestimmungsmethoden, die ein hohes Maß an Spezifität erlauben.
Hier wird die Zu- oder Abnahme eines bei der Bestimmungsreaktion beteiligten Reaktanten mittelbar
oder unmittelbar visuell, photometrisch oder mit anderen optischen oder physikalisch-chemischen Verfahren
bestimmt. Allen diesen Systemen ist gemeinsam, daß immer nur ein Enzym oder Enzymsystem mit der zu
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-jf- 5
bestimmenden Substanz reagiert, wobei im gleichen oder proportionalen Molverhältnis ein Umsetzungsprodukt
gebildet oder ein Mitreaktant verbraucht wird.
Infolgedessen ergibt sich für alle Verfahren ein in etwa gleich großer Meßbereich, der je nach Empfindlichkeit
des Meßsignals und der Probenverdünnung verschoben sein kann.
Für die medizinische Diagnose sind Tests erforderlich, die in der Lage sind, sowohl nur wenig differierende
Werte im Grenzbereich Normalbereich/pathologischer Bereich sicher zu erfassen, als auch gleichzeitig im
pathologischen Bereich einen möglichst großen Bereich abzudecken. Dies gilt insbesondere auch für Screening-Methoden,
z.B. mit Teststäbchensystemen. Der für die üblichen Tests erhaltene Meßbereich ist für einen
Teil der anfallenden Aufgaben nicht ausreichend; dies trifft vor allem für die Bestimmung von Glucose zu.
Es ist zwar schon versucht worden, dieses Problem durch Testzusätze zu lösen, die die Testempfindlichkeit
verändern; ein größerer Meßbereich wird aber nur dann erhalten, wenn mehrere Tests mit entsprechend
verschieden eingestellten Meßbereichen in den Gesamttest einbezogen werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Testsysteme und Verfahren zu entwickeln, die gegenüber den üblichen
Systemen und Verfahren einen vielfach größeren Meßbereich bei mindestens gleicher Meßgenauigkeit
haben. Gelöst wurde diese Aufgabe dadurch, daß man mehrere verschiedene Enzyme oder Enzymsysteme, die
das gleiche Substrat als Ausgangsreaktant unabhängig voneinander umsetzten, aber verschiedene unterscheidbare
Endprodukte ergeben, miteinander koppelt.
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-Ei -to
Gegenstand der Erfindung ist ein Testsystem mit erweitertem
Meßbereich zur Bestimmung von Substanzen in Flüssigkeiten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
es gleichzeitig mehrere, unabhängig voneinander mit der zu bestimmenden Substanz direkt oder, indirekt
reagierende Enzyme oder Enzymsysteme enthält.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Bestimmung von Substanzen in Flüssigkeiten, die
dadurch gekennzeichnet sind, daß die Probelösung
._ gleichzeitig mit mehreren, unabhängig voneinander mit
der zu bestimmenden Substanz direkt oder indirekt reagierenden Enzymen oder Enzymsystemen behandelt
wird, wobei verschiedene analytisch unterscheidbare Endprodukte entstehen, die meßtechnisch oder visuell
ausgewertet werden.
Eine sequenzielle Koppelung von verschiedenen enzymatischen Reaktionen ist in einer Vielzahl von Beispielen
bekannt, wie die Hexokinase/Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Reaktion
zur Glucosebestimmung oder die Urease/Glutamatdehydrogenase-Reaktion zur
Harnstoffbestimmung. Diesen Enzymsystemen ist gemeinsam, daß sie hintereinandergeschaltet sind, d.h.
das Reaktionsprodukt der ersten Reaktion ist Ausgangssubstrat der zweiten Reaktion.
Eine parallele Koppelung von verschiedenen enzymatischen Reaktionen, d.h. das gleichzeitige Vorliegen
mehrerer, das gleiche Substrat umsetzender Enzymsysteme müßte zu einer Konkurrenz der beiden Reaktionen führen
und damit zu einer gegenseitigen Abhängigkeit der Reaktionen. So erhält man etwa bei der Koppelung der
Glucoseoxidase- mit der NAD -abhängigen Glucosedehydrogenase-Reaktion einen gleichzeitigem Ablauf beider
GSPHA7 K-ih
- λΤ-
Reaktionen; das Verhältnis der dabei jeweils gebildeten
Endprodukte ist von der jeweiligen Konzentration der beiden Enzyme abhängig. Erhöht man z.B. die Konzentration
an Glucoseoxidase, so wird unter sonst gleichen Bedingungen bei gleicher Glucosekonzentration
weniger NAD+ reduziert. Insgesamt ergibt sich auf diese Weise zwar eine Vergrößerung des Meßbereiches,
dies aber auf Kosten der Meßgenauigkeit. Darüberhinaus beschreiben beide Reaktionen einen gemeinsamen Meßbereich.
Umso überraschender ist es, daß eine Koppelung mehrerer, das gleiche Substrat unabhängig voneinander direkt oder
indirekt zu verschiedenen Produkten umsetzender Enzymsysteme möglich ist, wobei mindestens zwei verschiedene
Meßsignale in einem Reaktionsansatz erhalten werden, die jeweils zwei verschiedene Konzentrationsbereiche
der zu bestimmenden Substanz beschreiben. Unabhängig voneinander bedeutet dabei, daß bei gleichzeitigem
Vorliegen der die Substanz umsetzenden erfindungsgemäßen Systeme die Umsetzung durch das zweite System
erst nach weitgehendem Verbrauch des Coenzyms des ersten Systems erfolgt. Man erhält dadurch zwei definierte
Meßbereiche in einem Gesamtmeßbereich.
Die erfindungsgemäßen Enzyme oder Enzymsysteme sind
Dehydrogenasen mit voneinander unabhängigen Elektronenakzeptoren
bzw. -donatoren. Das Testsystem enthält demnach folgende Komponenten:
a) Ein Enzym oder Enzymsystem, das reduziertes
oder oxidiertes Nicotinamidadenin-dinucleotid (NADH, NAD+) bzw. Nicotinsäureamidadenin-dinucleotidphosphat
(NADPH, NADP+) umsetzt.
GSPHA7 K-ih
b) Ein Enzym oder Enzymsystem, das die unter a) genannten Coenzyme nicht umsetzt, sondern einen
Elektronenakzeptor bzw. -donator, der ein von diesen Coenzymen unterscheidbares Meßsignal
liefert. Solche Substanzen sind z.B. bekannt als Coenzyme aus der Klasse der Cytochrome,
Quinone oder Pyrroloquinolin-quinone; in Frage kommen auch Flavinnucleotide, Hexaeyanoferrat,
Methylenblau, Phenazinmethosulfat, Phenazinethosulfat,
Benzochinon, Dichlorphenolindophenol, Dichlorindophenol, Trichlorindophenol und andere.
Entsprechende, diese Coenzyme umsetzende Enzyme sind aus der Literatur bekannt.
c) Alle für die Durchführung eines diagnostischen Tests mit Hilfe des erfindungsgemäßen Enzymsystems
notwendigen Coenzyme und Hilfsubstanzen
wie Puffer, Stabilisierungsmittel, Chromogene usw.
Durch Koppelung von jeweils einem der unter a) und b) genannten Enzyme bzw. Enzymsysteme erhält man
ein erfindungsgemäßes Testsystem mit zwei definierten Meßbereichen, die sich zu einem erweiterten Gesamtmeßbereich
ergänzen. In der nachstehenden Tabelle ist beispielhaft eine Auswahl von mit Hilfe des
Testsystems bestimmbarer Substanzen aufgeführt, die beliebig erweitert werden kann. Die für die
NAD-abhängigen und nicht-NAD-abhängigen Enzyme angegebenen
Nummern entsprechen der Enzymnomenklatur des Nomenklatur Committee of the International Union
of Biochemistry:
GSPHA7 K-ih
-B-
zu bestimmende Substanz NAD-abhängiges nicht-NAD-
Alkohol Glucose Glycerin-3-phosphat Glycin
Laktat Mal at Mannitol
Enzym
1.1.1.1
1.1.1.47
1.1.1.8
1.4.1.10
1.1.1.27
1.1.1.37
■1.1.1.67
abhängiges
Enzym
1.1.99.8 1.1.99.-1.1.99.5 1.4.2.1
1.1.2.3
1.1.99.16 1.1.2.2
Im Falle der Bestimmung von Glucose ist das NAD-abhängige
Enzym Glucosedehydrogenase 1.1.1.47, vorzugsweise aus Bacillus megaterium, und das
nicht-NAD-abhängige Enzym Glucosedehydrogenase 1.1.99., vorzugsweise aus Acinetobacter calcoaceticus.
Für Glucosebestimmungen mit Systemen, die jeweils nur eine (NAD-abhängige bzw. nicht-NAD-abhängige)
Glucosedehydrogenase enthalten, ergibt sich bei gleicher Probenverdünnung eine verschiedene Lage,
aber in etwa gleicher Umfang des Meßbereichs. Das aus beiden Enzymsystemen gekoppelte System ermöglicht
dagegen einen bedeutend größeren Meßbereich. Eine Koppelung von Glucosedehydrogenase und Glucoseoxidase
führt zwar ebenfalls zu einer Erweiterung des Meßbereiches; dabei ergibt sich aber aus der gegenseitigen
Konkurrenz die erwartete Verringerung der Meßgenauigkeit.
Das NAD-umsetzende Enzymsystem kann zusätzlich ein Tetrazoliumsalz und ein darauf elektronenübertragendes
System, z.B. Diaphorase, enthalten.
GSPHA7 K-ih
-ζί-
Die beschriebenen Enzyme setzen in der Regel die zu bestimmende Substanz direkt um. Es ist aber auch
möglich, das erfindungsgemäße, gekoppelte Enzymsystem mit einer oder mehreren vorangegangenen Enzymreaktionen
zu koppeln. Als Beispiel sei folgendes Reaktionssystem aufgeführt:
Triglyceride Lipase^ Glycerin
Glycerin Glycerokinase ^ Glycerin-3-phosphat
Glycerin-3-phosphat +
NADH + D.ihyc"roxy- acetonphosphat
red. Akzeptor + Dihydroxy- acetonphosphat
Damit ist es möglich, Testverfahren mit erweitertem Meßbereich für eine Vielzahl von Bestimmungen durchzuführen.
Ebenso ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems
möglich, ein Substrat umzusetzen, das durch Umsetzung eines zu bestimmenden Enzyms in einer Reaktion
gebildet wird. Hierbei lassen sich insbesondere auf einfache Weise Störeinflüsse, wie additive
Blindwerte, elimineren. So kann etwa bei der Amylasebestimmung die endogene Glucose in einer ersten Reaktion
beseitigt werden, während der durch die zweite Reaktion bedingte Meßbereich voll zur Bestimmung der
gebildeten Glucose erhalten bleibt.
GSPHA7 K-ih
/ i 1 I b 7
λλ
Das erfindungsgemäße Testsystem bietet auch die Möglichkeit, einen Meßbereich zu verändern, während der
zweite unverändert bleibt. Damit kann man das erfindungsgemäße Testsystem derart beeinflussen, daß
für den beschriebenen Grenzbereich zwischen Normalbereich und pathologischem Bereich ein den üblichen
Methoden entsprechender Meßbereich existiert, während für den pathologischen Bereich ein variabler, an die
Anforderungen der medizinischen Diagnose anpaßbarer Meßbereich gestaltet werden kann. Im Falle einer
Glucosebestimmung wird dies durch Zusatz von GIucoseoxidase und Peroxidase erreicht.
Die Durchführung der erizymatischen Bestimmung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems erfolgt in
der für enzymatische Methoden üblichen Weise, wobei jedoch beide Enzymsysteme gleichzeitig zur Probelösung
gegeben werden. Die Auswertung kann visuell, photometrisch oder mit anderen optischen wie auch
physikalisch-chemischen Methoden erfolgen. Bei
photometrischer Bestimmung kann die Auswertung nach dem Endpunktverfahren bei zwei definierten Wellenlängen
erfolgen (z.B. bei 334 und 600 mn oder bei 460 und 650 nm). Ebenso ist es möglich, kinetisch
bei einer oder zwei Wellenlängen den Reaktionsverlauf zu registrieren und auszuwerten. Der erweiterte
Meßbereich ermöglicht dabei vornehmlich eine einfachere Bestimmung auch erhöhter pathologischer
Werte für eine Substanz; eine zusätzliche Verdünnung ist nicht nötig.
3Q Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele
näher erläutert:
GSPHA7 K-ih
-M-
Bestimmung von Glucose mit einem gekoppelten System aus Glucosedehydrogenase mit NAD als Coenzym und
Glucosedehydrogenase mit Dichlorphenolindophenol als Coenzym.
Es werden je 1 ml der folgenden Reaktionsgemische, enthaltend
a) 0,12 mol/1 Phosphatpuffer, pH 6,5,
1,0 mmol/1 NAD+,
1,0 mmol/1 NAD+,
5,0 kU/1 Glucosedehydrogenase aus Bacillus
megaterium
megaterium
b) 0,12 mol/1 Phosphatpuffer, pH 6,5,
0,12 mmol/1 Dichlorphenolindophenol,
0,12 mmol/1 Dichlorphenolindophenol,
250 U/l Glucosedehydrogenase aus Acinetobacter calcoaceticus
miteinander gemischt und mit 40 μ1 Serum (1+1
enteiweißt mit 0,3 mol/1 Trichloressigsäure) mit unterschiedlichem definiertem Glucosegehalt versetzt. Nach jeweils 15 Minuten wird die Extinktion bei 334 und 600 nm gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt.
enteiweißt mit 0,3 mol/1 Trichloressigsäure) mit unterschiedlichem definiertem Glucosegehalt versetzt. Nach jeweils 15 Minuten wird die Extinktion bei 334 und 600 nm gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt.
Während mit den beiden Einzelreaktionen im einem Fall Glucosebestimmungen von 0,5 - 12 mmol/1 und
im anderen Fall von etwa 2-60 mmol/1 durchgeführt werden können, zeigt die Abbildung 1, daß mit dem erfindungsgemäßen
gekoppelten System Glucose von 0,5 bis über 160 mmol/1 sicher bestimmt werden kann.
1 mmol/1 entspricht 18 mg-% Glucose.
GSPHA7 K-ih
Bestimmung von Glucose mit Glucosedehydrogenase/NAD in Gegenwart von Glucoseoxidase und Peroxidase.
Es werden die Bedingungen von Beispiel 1 und der Ansatz nach la) verwendet. Das Reaktionsgemisch enthält
zusätzlich 1 kU/1 Glucoseoxidase und 400 U/l Peroxidase. Die erhaltene Meßkurve ist in Abbildung 2
dargestellt.
Die Abbildung zeigt, daß die Koppelung von Glucosedehydrogenase-
und Glucoseoxidasereaktion ebenfalls zu einer Erweiterung des Meßbereichs führt, wobei
jedoch aufgrund des flachen Kurvenverlaufε die Meßgenauigkeit verringert ist.
Visuelle Bestimmung von Glucose mit einem gekoppelten System aus Glucosedehydrogenase/NAD/Diaphorase/Tetrazoliumsalz
und Glucosedehydrogenase/Dichlorphenolindophenol; Variation des Meßbereichs
Es werden je 2 ml eines Reaktionsgemisches vier verschiedener
Ansätze verwendet, die alle 0,12 mol/1 Phosphatpuffer, pH 6,5, und 10 Gew.-% Fluoreszein-Natrium
enthalten. Darüberhinaus enthält
Ansatz A: 1 mmol/1 NAD+,
0,67 mmol/1 3-(4-Jodphenyl)-2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchloid
(INT),
5 kU/1 Glucosedehydrogenase aus B. megaterium und
250 U/l Diaphorase.
250 U/l Diaphorase.
GSPHA7 K-ih
10
20
Ansatz B 1:
Ansatz B 2:
Ansatz B 3:
- 13 -
1 mmol/1 NAD+, 0,25 mmol/1 Dichlorphenolindophenol,
0,67 mmol/1 INT, 2,5 kU/1 Glucoesedehydrogenase aus B.
megaterium,
250 U/l Glucosedehydrogenase aus A. calco·
aceticus und
250 U/l Diaphorase.
die im Ansatz B 1 aufgeführten Reagenzien in der gleichen Konzentration
zuzüglich 500 U/l Glucoseoxidase und 200 U/l Peroxidase
die im Ansatz B 1 aufgeführten Reagenzien in den gleichen Konzentrationen
zuzüglich 1 kU/1 Glucoseoxidase und 400 U/l Peroxidase.
Zu dem Reaktionsgemisch werden jeweils 60 μ1 Serum
(1+1 enteiweißt mit 0,3 mol/1 Trichioressigsäure)
mit unterschiedlichem definiertem Glucosegehalt pipettiert. Nach 20 Minuten wird visuell der Farbeindruck
der Gesamtlösung beurteilt; die visuell untersciieidbaren
Glucosekonsentrationen ergeben dabei den
Gesämtmeßbereich. In Abbildung 3 ist das Ergebnis graphisch dargestellt. Man erkennt deutlich den
größeren Meßbereich des gekoppelten Systems sowie die mögliche breite Varianz.
Beispiel 4: Bestimmung von Laktat mit einem gekoppelten
System aus Laktatdehydrogenase/NAB/Diaphorase und
Laktatdehydrοgenas e/Di chiorpheno1indopheno1.
GSPHA7 K-in
Es werden 2 ml eines Reaktionsgemisches verwendet,
das
0,25 mol/1 Phosphatpuffer, pH 7,0, 1 mmol/1 NAD+,
0,12 mmol/1 Dichlorphenolindophehol, 0,67 mmol/1 INT,
5 kU/1 Laktatdehydrogenase aus Schweineherz,
250 U/l Diaphorase und
200 U/l Laktatdehydrogenase aus Hefe
200 U/l Laktatdehydrogenase aus Hefe
,_ enthält. Dazu werden 100 μΐ Serum (1+1 enteiweißt
mit 0,3 mol/1 Trichloressigsäure) pipettiert. Nach jeweils 30 Minuten wird die Extinktion bei 460
und 650 nm gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt.
. 5 Während mit den beiden Einzelreaktionen in einem
Fall Laktatbestimmungen von 0,2-6 mmol/1 und im anderen Fall von etwa 0,8 - 24 mmol/1 durchgeführt
weden können, zeigt die Abbildung, daß mit dem erfindungsgemäßen gekoppelten System Laktat von 0,2
2Ö bis über 60 mmol/1 bestimmt werden kann.
Bestimmung von Alkohol mit einem gekoppelten System aus Alkoholdehydrogenase/NAD/Diaphorase und Alkoholdehydrogenase/Dichlorphenolindophenol.
Es werden 2 ml eines Reaktionsgemisches verwendet, das 0,3 mol/1 Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer, pH 8,0,
1 mmol/1 NAD+,
0,12 mmol/1 Dichlorphenolindophenol,
0,67 mmol/1 INT,
-30 2 kU/1 ADH aus Hefe,
-30 2 kU/1 ADH aus Hefe,
GSPHA7 K-ih
Wo '
- 15 -
250 U/l Diaphorase und
250 U/l ADH aus Pseudomonas sp. M 27 enthält. Dazu werden 50 μ1 Serum (1+1 enteiweißt mit 0,3 mol/1 Trichloressigsäure) pipettiert. Nach jeweils 30 Minuten wird die Extinktion bei 460
250 U/l ADH aus Pseudomonas sp. M 27 enthält. Dazu werden 50 μ1 Serum (1+1 enteiweißt mit 0,3 mol/1 Trichloressigsäure) pipettiert. Nach jeweils 30 Minuten wird die Extinktion bei 460
und 650 nm gemessen. Es ergibt sich ein Meßbereich von 0,02 bis über 3 g/l Alkohol, während mit den
beiden Einzelreaktionen lediglich Meßbereiche von 0,02 bis 0,5 bzw. von 0,08 bis 2,2 g/l Akohol
jo erhältlich sind.
Bestimmung von Glucose im Urin mit Hilfe von Teststreifen
Ein saugfähiges Material wird mit Lösungen analog Bei·
spiel 3, jedoch 20-fach höherer Enzymkonzentration getränkt, vorsichtig getrocknet und auf einem geeigneten
Trägermaterial fixiert. Nach Eintauchen in die Probelösung erhält man je nach dem Glucosegehalt
Farbumschläge von Blau über Blaugrün, Grün, HeIlgrün, Beige, Orange, Rot bis Dunkelrot. Die Auswertung
kann durch Vergleich mit einer geeigneten Standardfarbskala erfolgen.
GSPHA7 K-ih
Leerseite
Claims (7)
1. Testsystem mit erweitertem Meßbereich zur Bestimmung von Substanzen in Flüssigkeiten, dadurch
gekennzeichnet,-daß es gleichzeitig mehrere, unabhängig voneinander mit der zu bestimmenden
Substanz direkt oder indirekt reagierende Enzyme oder Enzymsysteme enthält.
2. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Enzyme oder Enzymsysteme Dehydrogenasen mit voneinander unabhängigen Elektronenakzeptoren
bzw. -donatoren sind.
3. Testsystem nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß eines der Enzymsysteme eine
reduzierte oder oxidierte Nicotinamidadenindinuclotid bzw. -dinucleotidphosphat umsetzende
Dehydrogenase und das andere eine diese Coenzyme nicht umsetzende Dehydrogenase mit einem
anderen Elektronenakzeptor bzw. -donator enthält.
GSPHA7 K-ih
4. Testsystem zur Bestimmung von Glucose nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß das NAD umsetzende Enzymsystem Glucosedehydrogenase aus Bacillus megateriurn und das nicht
NAD umsetzende Enzymsystem Glucosedehydrogenase aus Acinetobacter calcoaceticus enthält.
5. Testsystem nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das NAD umsetzende Enzymsystem zusätzlich ein Tetrazoliumsalz und ein darauf
elektronenübertragendes System enthält.
6. Testsytem nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich Glucoseoxidase
und Peroxidase enthält.
7. Verfahren zur Bestimmung von Substanzen in X5 Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß
die Probelösung gleichzeitig mit mehreren, unabhängig voneinander mit der zu bestimmenden Substanz
direkt oder indirekt reagierenden Enzymen oder Enzymsystemen behandelt wird, wobei verschiedene
analytisch unterscheidbare Endprodukte entstehen, die meßtechnisch oder visuell ausgewertet werden.
GSPHA7 K-ih
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