DE3305047A1

DE3305047A1 - Polysaccharide, ihre herstellung und diese enthaltende therapeutische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE3305047A1
Application number: DE19833305047
Authority: DE
Inventors: Takeo Hino Tokyo Nomura; Masaki Nakano Tokyo Shimizu
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1982-02-19
Filing date: 1983-02-14
Publication date: 1983-09-22
Also published as: US4536496A; GB2120265B; GB8304461D0; FR2522001A1; FR2522001B1; CH653349A5; GB2120265A

Description

Henkel, Pfenning, Feiler, Hänzel & Meinig _ /jA _% Patentanwälte

Terumo Kabushiki Kaisha trading as Terumo Corporation , Tokio, Japan

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NP-8107-3/Dr.S/F/to

Polysaccharid, ihre Herstellung und diese enthaltende therapeuti sehe Zusammensetzungen

SMCT

Polysaccharide, ihre Herstellung und diese enthaltende therapeutische Zusammensetzungen

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polysaccharide, ihre Herstellung und diese enthaltende therapeutische Zusammensetzungen.

Insbesondere betrifft die Erfindung Polysaccharide, die durch Reinigung der Heißwasserextrakte der Rinde von Melia azadirachta L. erhalten werden, ihre Herstellung und sie enthaltende therapeutische Zusammensetzungen. Die erfindungsgemäßen Polysaccharide sind zur Therapie verschiedener Krebsarten nützlich.

Es ist bekannt, daß Extrakte von Melia azadirachta L. verschiedene pharmakologische Wirkungen zeigen. So sind ein Verfahren zur Herstellung von Kosmetika für die

15 Haut aus der Rinde, den Blättern, den Blüten, den

Früchten, der Wurzelhaut (Epidermis) oder dem Harz von Melia azadirachta L. durch Extraktion derselben mit Wasser oder einem hydrophilen Lösungsmittel oder durch feines Pulverisieren derselben bekannt (Japanische Pa-

20 tentveröffentlichungen Nr. 28853/77, 28854/77 und

10125/78); ein Verfahren zur Herstellung von Bestandteilen aus solchen Rohmaterialien von MeIia azadirachta L,, die antimikrobische Wirkungen oder die gastrointestinale oder leberfunktionverbessernde Wirkungen besitzen, durch Extraktion derselben mit heißem Wasser (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 10124/78); und ein Verfahren zur Herstellung von Bestandteilen aus solchen Rohmaterialien von MeIia azadirachta L., die für die Therapie dermatologischer und rheumatischer Erkrankungen nutzbar sind, durch Extraktion derselben mit einem hydrophoben Lösungsmittel (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 13689/78).

Nach ausführlichen Studien der pharmakologisch wirksamen Bestandteile der Rinde von Melia azadirachta L. wurden nun aus den Heißwasserextrakten der Rinde Polysaccharide mit Anti-Tumor-Wirkungen isoliert. Aus dem Stand der Technik war es nicht bekannt, daß die Rinde von Melia azadirachta L. Polysaccharide enthält. 20

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung von Polysacchariden, die als Antikrebsmittel brauchbar sind. Eine andere Aufgabe betrifft die Bereitstellung therapeutischer Zusammensetzungen, die diese Polysaccharide enthalten. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Herstellung dieser Polysaccharide anzugeben.

Wie nachfolgend beschrieben wird, besitzen die erfin-30 dungsgemäßen Polysaccharide, die neue Substanzen sind, starke inhibierende Wirkungen gegen Ascites Sarkom 180 (Sarcoma 180 ascites) und' feste transplantierte Tumore in Mäusen und Meth A feste transplantierte Tumore in Mäusen. Sie sind insbesondere bei fixierten festen Tu-35 moren wirksam.

Erfindungsgemäß wird Polysaccharid N9GI bereitgestellt, das aus der Rinde von Melia azadirachta L. erhalten wurde und die folgenden physikalischen und chemischen Charakteristik^ aufweist:
5

(1) Farbe und Aussehen

Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weißes oder blaßgelblich bis braunes Pulver.

10 (2) Infrarotabsorptionsspektrum

Wie in Fig. 1 gezeigt. KBr _₁

IRV cm : 3400, 1630, 1030·. max

(3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum

In wäßriger Lösung kein Absorptionsmaximum, 15 nur Endabsorption beobachtet.

(4) Löslichkeit

Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergleichen.

(5) Farbreaktion

Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion sind positiv. Bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.

Erfindungsgemäß wird zweitens ein Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid N9GI, das die oben beschriebenen physikalischen und chemischen Charakteristika aufweist, bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Rinde von Melia azadirachta L. mit heißem Wasser extrahiert, den Extrakt mittels Fällung mit Alkohol oder einer permeablen Membran reinigt, das so erhaltene ge-

- JT-

reinigte Produkt in Wasser löst, die wäßrige Lösung mit einem Molekularsieb-Agens behandelt, das einen Molekulargewicht-Fraktionierungsbereich von ca. 1 χ 10 1x10 bis 1 χ 10 - 1,5 χ 10 besitzt, und die erste Fraktion der drei getrennten Polysaccharidfraktionen isoliert.

Erfindungsgemäß wird drittens ein aus der Rinde von MeIia azädirachta L. erhaltenes Polysaccharid N9GIa bereitge-10 stellt, das die folgende Struktur und Eigenschaften aufweist:

(1) Struktur

Neutrales Polysaccharid/ das als Hauptkette ot— (T-* 4)-Glucan enthält, das über eine OL-(1 —» 6)-Bindung mit Arabinose verknüpft ist und aus Glukose und Arabinose im Verhältnis ca. 5 : 1 zusammengesetzt ist.

(2) Farbe und Aussehen

Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weißes Pulver.

(3) Löslichkeit

(4) Farbreaktion

(5) Molekulargewicht

Säulen-Gelchromatographie unter Verwendung von

Dextrangel mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von 1x10 -2x10 ergibt einen einzelnen Peak mit einem Molekulargewicht von ca. 94 000.

(6) Spezifische Drehung

LpU ²d^: "³⁵° ^{(c =} °'⁴' ^H2⁰⁾

(7) Infrarot-Absorptionsspektrum
wie in Fig. 2 gezeigt.

IRV ""■"" cm"¹: 3400, 2930, 1620. max.

(8) Ultraviolett-Absorptionsspektrum

In wäßriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur Endabsorption beobachtet.

(9) C Kernmagnetisches Resonanzspektrum

1 3

100 MHz C kernmagnetisches Resonanzspektrum, gemessen in Deuteriumoxid mit TMS (Tetramethylsilan) 20 als externer Standard zeigt Fig. 4.

Erfindungsgemäß wird viertens ein Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid N9GIa, das die oben angegebene Struktur und Eigenschaften besitzt, bereitgestellt, das 25 dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Heißwasserextrakt der Rinde von Melia azadirachta L. mit einem Molekularsieb behandelt, um eine Verbindung mit dem Molekulargewicht von ca. 94 000 zu isolieren.

30 Fünftens wird erfindungsgemäß ein Polysaccharid N9GIb bereitgestellt, das aus der Rinde von Melia azadirachta L. erhalten wird und die folgende Struktur und Eigenschaften besitzt:

- Sr -

(1) Struktur

Neutrales Polysaccharide das als Hauptkette OC-(1 -* 4)-Glucan enthält, das mit ß-(1 -> 3)-fucose durchsetzt und mit o£-(1 -f 6)-Arabinose verzweigt ist und aus Glucose, Arabinose und Fucose im Verhältnis ca. 5 : 2 : 1 zusammengesetzt ist.

(2) Farbe und Aussehen

Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weißes Pulver.

(3) Löslichkeit

Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen 15 Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergl.

(4) Farbreaktion

Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion 20 · sind positiv. Bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.

(5) Molekulargewicht
Säulen-Gelchromatographie unter Verwendung von

25 Dextrangel mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von 1x10 -2x10 ergibt einen einzelnen Peak mit einem Molekulargewicht von ca. 21 000.

(6) Spezifische Drehung

~7²h -46° (c = 0,28, H₉O).

(7) Infrarot-Absorptionsspektrum Wie in Fig. 4 gezeigt.

IRV ^KBr cm"¹: 3400, 2930, 1630. max

max.

(8) Ultraviolett-Absorptionsspektrum

In wäßriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur Endabsorption beobachtet.

5 (9) C Kernmagnetisches Resonanzspektrum

Ein 100 MHz C kernmagnetisches Resonanzspektrum, gemessen in Deuteriumoxid mit TMS (Tetramethylsilan) als externer Standard zeigt Fig. 5.

Erfindungsgemäß wird sechstens ein Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid N9GIb, das die oben beschriebene Strukturencharakteristika aufweist, bereitgestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Heißwasserextrakt der Rinde von Melia azadirachta L. einer Behandlung mit einem Molekularsieb unterwirft und dabei eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von ca. 21 000 isoliert.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Polysaccharid N9GI.

Die Fig. 2 bzw. 3 zeigen ein Infrarot-Absorptionsspek-

1 3

trum und ein C kernmagnetisches Resonanzspektrum von

25 Polysaccharid N9GIa.

Die Fig. 4 bzw. 5 zeigen ein Infrarot-Absorptionsspek-

1 3 trum und ein C ker Polysaccharid N9GIb.

1 3
trum und ein C kernmagnetisches Resonanzspektrum von

Das erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial verwendete Gewächs wird wissenschaftlich Melia azadirachta L. oder Azadirachta indica Juss bezeichnet, und ist ein großer Baum mit einer Höhe von 10m oder mehr, der in den Tropen beheimatet ist. In dem erfindungsgemäßen Verfah-

ren werden die Heißwasser-Extrakte der Rinde dieses Gewächses als Polysaccharidquelle verwendet. Die zu jeder Jahreszeit geerntete Rinde kann als Ausgangsmaterial verwendet werden. Die Heißwasserextraktion der Rinde von 5 Melia azadirachta L. wird nach üblichen Verfahren durchgeführt. Im wesentlichen wird sie durchgeführt durch Zugabe von heißem Wasser von ungefähr 80⁰C oder höher zu einer fein zerteilten Rinde oder durch Zugabe von Wasser zu der Rinde und Erhitzen der Mischung zum Kochen.

Das Erhitzen kann in einem kochenden-Wasser-Bad oder über Direkterhitzer durchgeführt werden. Obwohl die Zeit des Erhitzens von der Qualität des Ausgangsmaterials und
anderen Faktoren abhängt, beträgt sie im allgemeinen
1 bis 48 Stunden. Nach Vervollständigung der Extraktion wird die Extraktionsmischung einer Filtration unterworfen, um das Extrakt zu erhalten. Da das so erhaltene
Heißwasserextrakt der Rinde von Melia azadirachta L.
große Mengen von Verunreinigungen enthält, ist es wünschenswert, das Extrakt vor der erfindungsgemäßen Stufe des Molekularsiebens mittels einer Alkoholfällung oder
einer permeablen Membran zu reinigen. Wenn zum Beispiel die Reinigung mittels einer Alkoholfällung durchgeführt wird, wird Alkohol wie zum Beispiel Methanol oder Äthanol zu dem vorgenannten Extrakt gegeben, und die dabei

25 erhaltenen Niederschlage isoliert, zum Beispiel mittels einer Zentrifugentrennung, um das gewünschte Extrakt zu erhalten. Wenn zur Reinigung eine permeable Membran verwendet wird, wird das Extrakt auf eine permeable Membran gebracht, die dann zur Durchführung der Dialyse

30 in Wasser eingetaucht wird. Wenn erwünscht, wird das Dialysat bis zur Trockne konzentriert oder gefriergetrocknet, um das gewünschte Extrakt zu ergeben. Als permeable Membran wird regenerierte Zellulose mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von 50 000

oder weniger verwendet, zum Beispiel Spectra Por 1 - 6

(hergestellt von Spectrum Medical Industries Co.) oder Visking Tube (hergestellt von Union Carbide Co.). Das Heißwasserextrakt der Rinde von Melia azadiraehta L. wird nach der Reinigung mittels einer permeablen Membran 5 oder durch Alkoholfällung in Wasser gelöst. Daneben ist es auch wünschenswert, vor der Heißwasserextraktion der Rinde von Melia azadirachta L. nutzlose Bestandteile zu entfernen, indem man die Rinde einer Vorbehandlung mit einem organischen Lösungsmittel und/oder Wasser bei Raumtemperatur unterwirft. Als Lösungsmittel für die Vorbehandlung werden polare organische Lösungsmittel genannt, wie zum Beispiel Methanol, Äthanol, Propanol, Pyridin und Aceton und nicht-polare organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Benzol, Toluol, Xylol, n-Hexan,

15 Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid und A'thylacetat.

Die erfindungsgemäß zur Trennung der Polysaccharide erfolgende Behandlung mit einem Molekularsieb wird vorzugsweise durch Gelfiltration mittels eines Gelfiltrationsagens durchgeführt. Als Gelfiltrationsagens wird vorzugsweise Dextrangel, Polyacrylamidgel, Polyvinylpolymergel, poröse Glasperlen und dergl. verwendet.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid N9GI wird hergestellt durch Durchlaufenlassen des vorgenannten Heißwasserextrakts der Rinde von Melia azadirachta L. durch eine Säule, die mit einem Gelfiltrationsagens mit einem Molekulargewichts-Praktionierungsbereich von ca. 1 χ 10³ - 1 χ 10⁵ bis 1 χ 10³ - 1,5 χ 10⁵ bestückt ist, Eluieren der Säule mit destilliertem Wasser, Sammeln der ersten Fraktion der drei getrennten Polysaccharidfraktionen und Verdampfen zur Trockne oder Gefriertrocknung der gesammelten Fraktion. Bei der Durchführung der Elution wird die Elution des Polysaccharide gemäß üblieher Verfahren, wie zum Beispiel nach der Phenolsulfat-

JJO- -

Methode, bestimmt. Als Gelfiltrationsagens mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von ca. 1 χ TO³ - 1 χ 10⁵ bis .1 χ 10³ -.1,5 χ 10⁵ werden vorzugsweise verwendet Sephadex G-100 (hergestellt von Pharmacia Co., Schweden), welches ein Dextrangel ist, Biogel P-IOO (hergestellt von Biorad Co., USA), welches ein Polyacrylamidgel ist, Toyopal HW-55 (hergestellt von Toyo Soda Industries), welches ein Polyvinylpolymergel ist, CPG-1Q (hergestellt von Electro-Nucleonics, USA), welches poröse Perlen darstellt.

Die Polysaccharide N9GIa und N9GIb werden erhalten, indem man das Heißwasserextrakt der Rinde von Melia azadirachta L. einer Behandlung mit einem Molekularsieb unterwirft, um ein Polysaccharid mit dem Molekulargewicht von ca. 94 000 und ein Polysaccharid mit dem Molekulargewicht von ca. 21 000 zu isolieren.

Vorzugsweise wird eine das vorgenannte Polysaccharid N9GI enthaltende Fraktion oder eine wäßrige Lösung des Polysaccharids N9GI weiters durch eine Säule laufen gelassen, die mit einem Gelfiltrationsagens mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von ca. 1 χ 10³ - 2 χ 10⁵ bis 1 χ 10³ - 8 χ 1O⁵ beladen ist, die Säule mit destilliertem Wasser eluiert und Polysaccharid N9GIa aus der ersten Fraktion der zwei getrennten Polysaccharidfraktionen erhalten, und Polysaccharid N9GIb aus der zweiten Polysaccharidfraktion.

30 Als Gelfiltrationsagens mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von ca. 1x10 -2x10 bis 1x10 -8x10 wird vorzugsweise verwendet Sephadex G-200, Sephacril S-300 (hergestellt von Pharmacia Co., Schweden), welche Dextrangele sind, Biogel P-300 (her-

gestellt von Biorad Co., USA), welches ein Polyacrylamid

ist, Toyopal HW-60 (hergestellt von Toyo Soda Industries), welches ein Polyvinylpolymer ist, poröse Perlen CPG-10 und dergleichen.

Es wird angenommen, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid N9GI eine Mischung von Polysaccharid N9GIa und Polysaccharid N9GIb ist. Pharmakologische Untersuchungen haben ergeben, daß es ausgeprägte inhibierende Wirkungen gegen Ascites Sarkom 180 (Sarcoma 180 ascites) und feste

10 transplantierte Tumore in der Maus und Meth A feste transplantierte Tumore in der Maus besitzt. Es wurde auch nachgewiesen, daß die Polysaccharide N9GIa und N9GIb ähnliche pharmakologische Wirkungen aufweisen. Deshalb ist eine Trennung von Polysaccharid N9GI in

Polysaccharid N9GIa und Polysaccharid N9GIb für die Verwendung als Antikrebsmittel nicht notwendig. Praktisch ist es, die beiden in Mischung zu verwenden, das heißt als Polysaccharid N9GI.

Das folgende Bezugsbeispiel, die Beispiele und die pharmakologischen Tests veranschaulichen die Erfindung weiter, ohne sie darauf zu beschränken.

Bezugsbeispiel

25 Herstellung eines Heißwasserextraktes der Rinde von Melia azadirachta L.

(1) Vorbehandlung wurde durchgeführt durch Extraktion von 50 g trockener Rinde von Melia azadirachta L. mit Benzol (3 χ 500 ml) und Methanol (3 χ 500 ml) bei Raum-

30 temperatur während 24 Stunden. Der so erhaltene Extraktionsrückstand wurde mit 3 χ 200 ml heißem Wasser extrahiert.

Die vereinigten Extrakte wurden an einem Rotationsverdämpfer zur Trockne konzentriert und ergaben 1960,5 mg

Pulver.

(2) Zu einer Lösung von 1000 mg des nach (1) hergestellten Pulvers in 200 ml Wasser wurde langsam reines Äthanol unter Rühren bei Raumtemperatur bis zu einer Äthanolkonzentration der wäßrigen Lösung von 80 % zugegeben. Es bildeten sich Niederschläge, die durch Zentrifugentrennung abgetrennt wurden und es wurden 594,5 mg eines braunen Pulvers erhalten. 10

(3) .Eine Lösung von 500 mg des nach (1) erhaltenen Pulvers in 50 ml Wasser wurde in Spectra Por 6 (MoIekulargewichts-Fraktionierungsbereich 50 000) zur Dialyse gegen Wasser gegeben.. Das Dialysat wurde am Rotations-

15 verdampfer zur Trockne konzentriert und es wurden 310 mg eines braunen Pulvers erhalten.

Beispiel 1 Herstellung von Polysaccharid N9GI

20 Eine Lösung von 1020 mg des nach dem obigen Bezugsbeispiel unter (2) oder (3) erhaltenen Heißwasserextraktes der Rinde von MeIia azadirachta L. in 20 ml destilliertem Wasser wurde in eine Säule (7,0 cm Durchmesser und 35,0 cm Länge), die mit Sephadex G-100 gefüllt war,

25 gegossen und die Gelfiltration wurde unter Verwendung von destilliertem Wasser durchgeführt. Während der Gelfiltration wurde der Zuckergehalt des Eluats durch die Phenolsulfat-Methode bestimmt. Es wurden drei Polysaccharidfraktionen erhalten. Nach Abdestillieren des Lösungs-

mittels aus der ersten Eluatfraktion wurden 273 mg des gewünschten Polysaccharids N9GI erhalten.

Nach dem obigen Verfahren wurde ein ähnliches Ergebnis unter Verwendung von Biogel P-100 anstelle des GeI-filtrationsagens Sephadex G-100 erhalten.

Beispiel 2

Herstellung der Polysaccharide N9GIa und N9GIb Eine Lösung von 50 mg des nach Beispiel 1 hergestellten Polysaccharids N9GI in 5 ml destilliertem Wasser wurde . 5 in eine Säule (4,0 cm Durchmesser und 50,0 cm Länge), die mit Sephadex G-200 gefüllt war, gegossen und die Gelfiltration unter Verwendung von destilliertem Wasser ausgeführt. Der Zuckergehalt des Eluates wurde während der Gelfiltration durch die Phenolsulfat-Methode bestimmt, Es wurden zwei Polysaccharidfraktionen erhalten. Die erste Polysaccharidfraktion ergab 18 mg Polysaccharid N9GIa und die zweite 16 mg Polysaccharid N9GIb. Mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Elektrophorese wurde gefunden, daß diese Polysaccharide jeweils

15 eine einzige Verbindung darstellten.

Ein ähnliches Ergebnis wurde bei der obigen Gelfiltration unter Verwendung von Sephacril S-300 anstelle von Sephadex G-200 erhalten.

Die Strukturen und Eigenschaften der Polysaccharide N9GI, N9GIa und N9GIb sind wie oben angegeben, wobei das IR-Absorptionsspektrum mittels der KBr-Methode gemessen wurde unter Verwendung von "Hitachi Infrared Spectrophotometer Model 295" (Erzeugnis von Hitachi Ltd.), das UV-Absorptionsspektrum unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel und unter Verwendung von "Hitachi Doublebeam Spectrophotometer Model 200-20" (Erzeugnis

1 3 der Hitachi Ltd.) gemessen wurde und das C kernmagnetische Resonanzspektrum unter Verwendung von "JEOL FX-100" (Erzeugnis von Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.) gemessen wurde.

Die Ergebnisse der pharmakologischen Tests der erfindungsgemäßen Polysaccharide N9GI, N9GIa und N9GIb wer-

den nachfolgend beschrieben.

Testbeispiel 1

Wirkung auf Sarkom 180 Ascites-Tumor 5 (Herstellung des Testmaterials)

In einer Suspension von 0,5 % Carboxymethylcellulose (CMC) in Phosphatpuffer-Salzlösung (hergestellt von Gibco, enthaltend 9,5 mM Phosphat; PBS) wurde das Testmaterial in einer vorbestimmten Konzentration gelöst.

(Transplantation von Sarkom 180 Tumorzellen) Sarkom 180 Tumorzellen aus einer Tochterkultur der Bauchhöhle der Maus wurden entfernt und mit physiologi-

scher Salzlösung auf eine Zellzahl von 1,0 χ 10 /ml verdünnt. Die Zellsuspension wurde intraperitoneal in männliche, vier Wochen alte ICR-Mäuse in einer Menge von 0,5 ml pro Maus mittels einer Spritze transplantiert. Die Zahl der transplantierten Zellen pro Maus wurde als

20 1,0 χ 10⁷ berechnet.

(Applikation des Testmaterials)

Einen Tag nach der Transplantation der Sarkom 180 Tumorzellen wurde das wie oben hergestellte Testmaterial intraperitoneal mittels einer Spritze in einer Dosis von 0,1 ml/Maus appliziert und die Applikation einmal am Tag vier Tage lang durchgeführt. Für jede Konzentration eines jeden Testmaterials wurden sechs Mäuse verwendet. Als Kontrolle wurde die CMC-enthaltende PBS verwendet,

30 das Lösungsmittel für das Testmaterial, das auf die gleiche Weise appliziert wurde. Die Dosis wurde in mg pro kg Körpergewicht der Maus angegeben.

(Auswertungsmethode)
Am siebten Tage nach der Tumorzellentransplantation wur-

de das Körpergewicht jeder Maus bestimmt. Dann wurde die in der Bauchhöhle angehäufte Ascites sorgfältig entfernt und das Körpergewicht der Maus gemessen. Die Differenz ■ des Körpergewichts vor und nach der Entfernung der Ascites wird als Menge der Ascites angegeben. Die entfernte Ascites wurde in ein Blutzentrifugengefäß gegeben und dann an einer Blutzentrifuge bei einer niederen Temperatur zentrifugiert, um einen Asciteswert (Anteil der Tumorzellen in der Ascites) zu ergeben, der dem Blutzentrifugenwert (blood hematocrit value) entsprach. Dieser Wert multipliziert mit dem Volumen der Ascites gibt das Volumen der in der gesamten Ascites vorhandenen Zellen wieder. Dieses wird als Gesamtzellenvolumen (total packed cell volume; TPCV) bezeichnet. Im Falle

15 der Kontrollprobe war das Gesamtvolumen von Ascites 6 bis 10 ml und TPCV 1,6 - 2,5 ml.

Die Wirkung auf den Tumor wurde als schlecht (-) bezeichnet, wenn das TPCV-Verhältnis von Mäusen, denen das Testmaterial appliziert wurde, zu den Kontrollmäusen (T/C). 100 - 66 % war, mittel ( + ), wenn es 65 - 41 % betrug, gut (++), wenn es 40 - 11 % betrug und ausgezeichnet ( + + + ), wenn es 10 - 0 % betrug. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

Testbeispiel 2

Wirkung auf Sarkom 180 Festtumor (Transplantation von Sarkom 180 Tumorzellen) Die Zellsuspension mit einer Konzentration von 1,0 χ

10 Zellen/ml wurde auf die gleiche Weise wie im Testbeispiel 1 hergestellt. Die Zellen wurden subkutan in den Rücken männlicher, vier Wochen alter ICR-Mäuse mit einer Dosis von 0,1 ml pro Maus mittels einer Spritze transplantiert.

(Applikation des Testmaterials)

Arn 21 . Tag nach der Tumorzellentransplantation wurde gewachsenes Tumorgewebe ausgeschnitten und gewogen (Mittelwert für eine Gruppe von sechs Tieren). Die Wirkung 5 wurde auf der Basis des Verhältnisses durchschnittliches Gewicht der behandelten Tiere zu dem der Kontrolltiere

(T/C) ermittelt. Das Gewicht des Tumorgewebes der Kontrolltiere, war 3,0 - 4,5 g. Die Wirkung wurde als schlecht (-) bezeichnet, wenn das Verhältnis 100 - 71 % 10 war, mittel ( + ) , wenn das Verhältnis 70 - 51 % war, gut ( + + ) , wenn es 50 - 21 % betrug und hervorragend ( + + + ), wenn es 20 - 0 % betrug. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgezeigt.

15 Tabelle 1

Wirkung auf Tumoren von transplantiertem Sarkom 180

(Mäuse)

20	Testmaterial	Dosis	Ascites Tumor	Fester Tumor
		mg Ag	T/C(%) Bewertung	T/C(%) Bewertung
	Polysaccha- rid	75	60 +	43 ++
	N9GI	50	46 ++	26 ++
25		25	52 +	34 ++
		5	100	100
	Polysaccha- rid	75	21 ++	43 ++
	N9GIa	50	23 ++	61 +
30		25	25 ++	70 +
		5	17 ++	98
	Polysaccharid	75	22 ++	64 +
	N9GIb	50	24 ++	77
		25	30 ++	103
35		5	43 +	105

Testbeispiel 3 Wirkung auf Sarkom 180-Festtumor

Die Herstellung des Testmaterials, die Transplantation von Sarkom 180-Tumorzellen, die Applikation des Testmaterials und die Auswertung der Wirkung wurden auf die gleiche Weise wie im Testbeispiel 2 vorgenommen, mit der Ausnahme, daß die Applikation des Testmaterials auf drei Wegen durchgeführt wurde: Applikationen am ersten, dritten, fünften, siebten und neunten Tag der ZeIltransplantation einmal am Tag, darauffolgende Applikationen vom ersten Tag der Transplantation einmal am Tag 10 Tage lang und nachfolgende Applikationen vom ersten Tag der Transplantation einmal am Tag 20 Tage lang. Die Wirkung wurde am 35. Tag nach der Tumorzellentransplantation durch Ausschneiden des Tumorgewebes bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2 Wirkung auf Sarkom 180 Festtumor

(Mäuse)

Test	Dosis	Tag der Applikation	1,3,5	,7 + 9	7/9*	1 .	- 10.	T/C	1. - 20.
material	(mg/kg)		T/C(%)		5/9	T/C(%)	Bewertung		(%) Bewertung
	50		4	Bewertung	1/9	7	(4H-) 5/7
Polysaccharxd	25		11	(4H-)				CTi
N9GI	10		68	(4H)	24	(4f) 5/10	53	(4H) 7/11
	2		74	(+)			(4) 2/11
	(-)

* gibt den Anteil der Mäuse an, bei denen das Tumorgewebe vollständig
rückgebildet war.

co O cn O

- ye-

- 30 -

Testbeispiel 4 Wirkung auf fixierten Festtumor

Sarkom 180 Zellen wurden subkutan am Rücken männlicher ICR-Mäuse (10 Tiere) in einer Dosis von 1 χ 10 Zellen pro Tier transplantiert, und die Mäuse gezüchtet. Vom 10. Tage an, nachdem der feste Tumor vollständig fixiert und auf eine Größe von ca. 1 -2g gewachsen war, erfolgte Applikation einer vorbestimmten Dosis des Testmaterials 5 Tage lang einmal am Tag intraperitoneal. Am 21. Tag nach der Transplantation wurde der Tumor ausgeschnitten und das Gewicht mit dem der Kontrollgruppe verglichen. Die Wirkung wurde gemäß der Methode des Testbeispiels 2 bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Wirkung	Test - material	auf fixierten	Festtumor	Bewertung
Polysaccharid	Dosis (mg/kg) ι		4+4·
N9GI	100	6	4+4-
	50	15	44- - j
	25	33	44-
Polysaccharid	10	39	4+4-
N9GIa	100	5	4+4-
	50	7	44-
	25	22	44-
Polysaccharid	10	4 7	4+4-
N9GIb	100	18	44-
	50	25	44- i
	25	39	4-
10	54

Testbeispiel 5 Wirkung auf fixierten Festtumor

Die Wirkungen auf fixierten Festtumor wurden auf die gleiche Weise wie im Testbeispiel 4 bestimmt, mit der Ausnahme, daß die Applikationen des Testmaterials auf drei Wegen erfolgten: Nachfolgende Applikationen vom 6. Tag bis zum 10. Tag nach der Tumortransplantation einmal am Tag, vom 6. Tag bis zum 15. Tag einmal am Tag und vom 11. bis 20. Tag einmal am Tag. Die Wirkung wurde am 35. Tag nach der Tumorzellentransplantation bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Wirkung auf fixierten Festtumor
(Mäuse)

Test material	\Tac Dosis*" (mg/kg)	} der .Applikation	6. -	■ 10.	6. -	15.	11 .-	20.
Polysaccharid	50	"\	T/C(%)	Bewertung	T/C(%)	Bewertung	T/C(%)	Bewertung
N9GI	25		6	(+H-) 7/9*	3	(.+H-) 4/6	5	(+++) 5/7
	10		3	(4H-) 7/10	-	-	-	-
	57	(+) i/io	1	(+++) 8/9	7	(+4+) 8/10

Wie aus den obigen Tabellen 1 bis 4 klar ersichtlich ist, besitzen die erfindungsgemäßen Polysaccharide N9GI, N9GIa und N9GIb bei intraperitonealer Applikation starke inhibierende Wirkungen gegen Ascites Sarkom 180 und feste Tumore und fixierte feste Tuniore.

Testbeispiel 6

Wirkung auf Sarkom 180 Festtumor bei oraler Applikation

Die Wirkung der erfindungsgemäßen Polysaccharide bei

TO oraler Applikation auf Sarkom 180 Festtumor wurde unter den gleichen Bedingungen wie in den Testbeispielen 2 und 3 geprüft, mit der Ausnahme, daß die Dosis der transplantierten Zellen 2 χ 10 Zellen pro Maus war und die Auswertung auf der Basis des Gewichtes am 32. Tag erfolgte. Die Applikation des Testmaterials in einer vorbestimmten Konzentration erfolgte mittels einer Magensonde zwangsweise bei einer Dosis von 0,1 ml/Applikation/Maus. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 5.

Tabelle 5

Wirkung auf Sarkom 180 Festtumor bei oraler Applikation

(Mäuse)

Applikation 1. ,3.,5.,7.,9. 7 . , 9 . , 11 . , 13^ , 1 5 . 5 . ,7 . ,9 . ,19. ,21 .,23.

T/C_(_%]_ _Bewertung_ T./^%J_ Bewertu^ T/C(%) Bewertung

Polysaccharid 250 44 (*) 54 (₊) ₅₇

80 (-) 71 ₍-_{} 95}

OO CO CD

Aus Tabelle 5 folgt klar, daß die erfindungsgemäßen Polysaccharide in Dosen von 250 mg/kg Körpergewicht auch bei oraler Applikation eine Anti-Tumor-Wirkung besitzen.

Testbeispiel 7

Wirkung auf Meth A Fibroblastsarkom

Die in der Bauchhöhle einer Balb/C-Maus subkultivierten Zellen von Meth A Fibroblastsarkom wurden zusammen mit dem Ascites entfernt und mit physiologischer SaIz-

lösung zur Einstellung einer Zellzahl von 1,Ox 10

Zellen/ml verdünnt. Die Zellsuspension wurde subkutan auf den Rücken 5 Wochen alter männlicher Balb/C-Mäuse in einer Dosis von 0,1 ml pro Tier mittels einer
Spritze transplantiert. Die Zahl der transplantierten

15. Zellen pro Tier beträgt 1,0 χ 10 . Das Testmaterial wurde auf die gleiche Weise wie in den Testbeispielen 2 und 3 hergestellt und wurde an einem vorbestimmten Tag intraperitoneal appliziert. Die Auswertung erfolgte durch Ausschneiden des Sarkomgewebes am 21. Tag nach

der Sarkomzellentransplantation und Messung des Gewichtes. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle 6.

Tabelle 6

Wirkung auf Meth A Fibroblastsarkom
(Mäuse)

Testmaterial

Tag der

Dosis^^Appllkation (mg/kg) ^

Polysaccharid
N9GI

100

25

Gewicht des Inhibie- Gewicht des Inhibie- Gewicht des Inhibie-Sarkoms rungs- Sarkoms rungs- Sarkoms ¹^ ^inr"^z~ (g) grad(%) (g)

4.04 39(P<0.01) 3.31 4.74 29(P<0.02) 5.49 5.16 22 6.08

47	4	.56	28	(P<0	.05)
12	5	.08	19	(P<0	.02)
3	5	.07	20	(P<0	.05)

Kontrο11g ruppe

6.27

6.31

* Signifikanzzahl im t-Test.

Go CO O cn O

Wie in Tabelle 6 gezeigt, besitzen die erfindungsgemäßen Polysaccharide auch gegenüber Meth A Fibroblastsarkom, einem isogenen Tumor, bei 8- bis 10-maliger Applikation in einer Dosis von 100 mg/kg eine deutliehe wachstumshemmende Wirkung.

Testbeispiel 8

Akute Toxizität ·

Mit den Polysacchariden N9GI, N9GIa und N9GIb wurden

10 unter Verwendung männlicher ICR-Mäuse vom Gewicht

20 + .1 g Tests zur akuten Toxizität durchgeführt. Die LD₅_-Werte waren bei jedem der Polysaccharide bei intraperitonealer Applikation größer als 600 mg/kg, bei oraler Applikation größer als 1000 mg/kg.

Wie durch die obigen pharmakologischen Tests deutlich gezeigt wurde, kann von den erfindungsgemäßen Polysacchariden, die ausgeprägte Anti-Tumor-Wirkungen und eine sehr niedrige Toxizität besitzen, erwartet werden, daß sie hervorragende Antikrebsmittel sind. Aufgrund ihrer speziellen hohen Inhibitorwirkungen bei fixierten festen Tumoren kann auch erwartet werden, daß die erfindungsgemäßen Polysaccharide Anti-Tumor-Wirkungen vom Immuno-Aktivierungstyp besitzen.

Die erfindungsgemäßen Polysaccharide sind bei einer Vielzahl von Krebserkrankungen wirkungsvoll, insbesondere bei fixiertem festem Krebs, wie zum Beispiel Magen krebs, Dickdarmkrebs oder Mastdarmkrebs. Die Dosierung hängt von den Symptomen, dem Alter, Körpergewicht und anderen Bedingungen ab, und die tägliche Dosis beträgt bei Erwachsenen 100 bis 2500 mg und kann in 1 bis 4 Einzeldosen verabreicht werden.

35 Für die orale oder parenterale Applikation werden

die erfindungsgemäßen Polysaccharide gegebenenfalls mit pharmazeutischen Trägern oder Exzipienten formuliert.

Die Formulierungen für orale Applikation, wie zum Beispiel Tabletten, Pulver, Kapseln und Granulate, können übliche Träger enthalten, zum Beispiel Calciumcarbonat, Calciumphosphat, Maisstärke, Kartoffelstärke, Sucrose, Lactose, Talk, Magnesiumstearat, Gummi Arabicum und dergleichen. Die flüssigen Zubereitungen für orale Applikation können wäßrige oder ölige Suspensionen, Lösungen, Sirupe, Elixiere und dergleichen sein.

Die injizierbaren Zubereitungen liegen in Form einer Lösung oder Suspension vor und können Exzipienten, wie zum Beispiel Schwebemittel, Stabilisatoren oder Dispergiermittel enthalten. Sie können auch sterilisiertes destilliertes Wasser, gereinigtes öl wie zum Beispiel Erdnußöl oder Maiskeimöl enthalten, oder nicht-wäßrige Lösungsmittel wie zum Beispiel Polyäthylenglykol oder Polypropylenglykol.

Für die rektale Applikation ist die Form einer Zäpfchenzusammensetzung vorgesehen, die bekannte pharmazeutische Träger wie zum Beispiel Äthylenglykol, Lanolin und Kokosnußöl enthalten kann.

Eine bevorzugte Formulierung ist eine pharmazeutische Zubereitung in Form von Dosierungseinheiten, die pro Dosierungseinheit 10 bis 500 mg der erfindungsgemäßen Polysaccharide und ein pharmazeutisches Streckmittel enthalten.

Claims

Patentansprüche

' 1 . Polysaccharid N9GI aus der Rinde von Melia azadirachta L. mit den folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weißes oder blaßgelblich bis braunes Pulver.

(2) Infrarot-Absorptionsspektrum 10 Wie in Fig. 1 gezeigt.

IRlf^KBr cm"¹: 3400, 1630, 1030.

(3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum

In wäßriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur Endabsorption beobachtet.

(4) Löslichkeit

Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen

Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton,

Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergleichen.

(5) Farbreaktion

Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion sind positiv. Bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.
2. Therapeutische Zusammensetzung in Form einer Dosierungseinheit enthaltend pro Dosierungseinheit 10 bis 500 mg des Polysaccharids nach Anspruch 1 und ein pharmazeutisches Streckmittel.
3. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid N9GI mit den nachstehend beschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet , daß man die Rinde von Melia azadirachta L. mit heißem Wasser extrahiert, den Extrakt mittels Alkoholfällung oder einer permeablen Membran reinigt, das so erhaltene gereinigte Produkt in Wasser löst, die wäßrige Lösung mit einem Molekularsiebagens mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich

von 1 χ 10³ - 1 χ 10⁵ bis 1 χ 10³ - 1,5 χ 10⁵ behandelt und die erste Fraktion der drei getrennten PoIysaccharidfraktionen isoliert, wobei das erhaltene Polysaccharid N9GI die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist:

(1) Farbe und Aussehen

Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weißes oder blaßgelblich bis braunes Pulver.

20 (2) Infrarot-Absorptionsspektrum Wie in Fig. 1 gezeigt.

IRV cm ': 3400, 1630, 1030. max. '

(3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum

In wäßriger Lösung kein Absorptionsraaximum, nur Endabsorption beobachtet.

(4) Löslichkeit

Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergleichen.

(5) Farbreaktion

Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion

sind positiv. Bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.
4. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid N9GI

gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß die Molekularsiebbehandlung eine Gelfiltration ist und das Molekularsiebagens ein Gelfiltrationsagens ist.
5. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid N9GI

gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß-das Gelfiltrationsagens Dextrangel, Polyacrylamidgel, hydrophiles Polyvinylgel oder poröse Glasperlen bedeutet. \
6. Polysaccharid N9GIa aus der Rinde von MeIia azadirachta L., das die folgende Struktur und Eigenschaften besitzt:

(1.) Struktur

Neutrales Polysaccharid, das als Hauptkette Od-.(1 ·* 4)-Glucan enthält, das über eine Ot-(I ·> 6)-Bindung mit Arabinose verknüpft ist und aus Glukose und Arabinose im Verhältnis ca. 5 : 1 zusammengesetzt ist.

(2) Farbe und Aussehen

Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weißes Pulver.

30 (3) Löslichkeit

Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen ■ Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan

und dergleichen. 35

(4) Farbreaktion

Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion sind positiv. Bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.
5

(5) Molekulargewicht

Säulen-Gelchromatographie unter Verwendung von Dextrangel mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von 1 χ 10 - 2 χ 10 ergibt einen einzelnen Peak mit einem Molekulargewicht von ca. 94 000.

(6) Spezifische Drehung 15

/6C7 ί ' -35° (c = 0,4, H₀O).

(7) Infrarot-Absorptionsspektrum Wie in Fig. 2 gezeigt.

IRv; ^KBr cm"¹: 3400, 2930, 1620. max.

20 (8) Ultraviolett-Absorptionsspektrum

In wäßriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur Endabsorption beobachtet.

1 3

(9) C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum

Ein 100 MHz-kernmagnetisches Resonanzspektrum gemessen in Deuteriumoxid mit TMS (Tetramethylsilan) als externer Standard zeigt Fig. 4.
7. Therapeutische Zusammensetzung in Form einer Dosierungseinheit enthaltend pro Dosierungseinheit 10 bis 500 mg des Polysaccharids gemäß Anspruch 6 und ein pharmazeutisches Streckmittel.
8. Verfahren zar Herstellung von Polysaccharid

N9GIa mit der unten beschriebenen Struktur und Eigen-

schäften, dadurch gekennzeichnet, daß man das Heißwasserextrakt der Rinde von Melia azadirach-

. ta L. mit einem Molekularsieb behandelt, um eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von ca. 94 000 zu 5 isolieren, die die folgende Struktur und Eigenschaften besitzt:

(1) Struktur Neutrales Polysaccharid, das als Hauptkette Ot- (1 -* 4)-Glucan enthält, das über eine Ot--(1 -> 6)-Bindung mit Arabinose verknüpft ist und aus Glucose und Arabinose im Verhältnis ca. 5 : 1 zusammengesetzt ist.

(2) Farbe und Aussehen Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weißes Pulver.

(3) Löslichkeit

20 Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergleichen.

(4) Farbreaktion

Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion sind positiv. Bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.

(5) Molekulargewicht

Säulen-Gelchromatographie unter Verwendung von Dextrangel mit einem Molekulargewicht-Fraktionierungsbereich von 1x10 -2x10 ergibt einen einzelnen Peak mit einem Molekulargewicht von

ca. 94 000.

(6) Spezifische Drehung ²·' ~³⁵° <^c = °

(7) Infrarot-Absorptionsspektrum 5 Wie in Fig. 2 gezeigt.

TfRv — 1

IRu cm : 3400, 2930, 1620. max.

(8) Ultraviolett-Absorptionsspektrum

In wäßriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur Endabsorption beobachtet.

13

(9) C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum

1 3

Ein 100 MHz C-kernmagnetisches Resonanzspektrumgemessen in Deuteriumoxid mit TMS (Tetramethylsilan) als externer Standard zeigt Fig. 4.
9. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid N9GIa nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß die· MolekularSiebbehandlung anfänglich unter Ver-Wendung eines Molekularsiebagens mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von ca. T χ 10 1 χ 10⁵ bis 1 χ 10³ - 1,5 χ 10 durchgeführt wird, und für die erste Fraktion der drei getrennten PoIysaccharidfraktionen weiters unter Verwendung eines Molekularsiebagens mit einem Molekulargewicht-Fraktio-

3 5 3

nierungsbereich von ca. 1x10 -2x10 bis 1x10 - 8 χ 10 und die erste Polysaccharidfraktion der zwei getrennten Polysaccharidfraktionen isoliert wird.

30
10. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid

N9GIa nach Anspruch 9, dadurch gek'ennzeich net, daß die Molekularsiebbehandlung eine Gelfiltration ist und das Molekularsiebagens ein Gelfiltrationsagens .
11. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid N9GIa nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Gelfiltrationsagens Dextrangel, Polyacrylamidgel, hydrophiles Polyvinylgel oder poröse Glasperlen

bedeutet.
12. Polysaccharid N9GIb aus Rinde von Melia azadi-

rachta L., welches die folgende Struktur und Eigenschaften besitzt:
10

(1) Struktur

Neutrales Polysaccharid, das als Hauptkette Od.-{1 ^ 4)-Glucan enthält, das mit ß-(1 *3)-Fucose durchsetzt und mit et-(1 ■> 6)-Arabinose verzweigt ist und aus Glukose, Arabinose und Fucose im Verhältnis ca. 5 : 2 : 1 zusammengesetzt ist.

(2) Farbe und Aussehen

Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weißes Pulver.

(3) Löslichkeit

Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen 25 Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergleichen.

(4) Farbreaktion

30 Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion sind positiv. Bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.

(5) Molekulargewicht

Säulen-Gelchromatographie unter Verwendung von

Dextrangel mit einem Molekulargewicht-Fraktionierungsbereich von 1x10 -2x10 ergibt einen einzelnen Peak mit einem Molekulargewicht von
ca. 21 000.

(6) Spezifische Drehung

²: -46° (c = 0,28, H₀

(7) Infrarot-Absorptionsspektrum 10 Wie in Fig. 4 gezeigt.

IRV ^KBr cm"¹: 3400, 2930, 1630. max.

(8) Ultraviolett-Absorptionsspektrum

In wäßriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur Endabsorption beobachtet.

1 3

(9) C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum

Ein 100 MHz C-kernmagnetisches ResonanzSpektrum, gemessen in Deuteriumoxid mit TMS (Tetramethylsilan) als externer Standard zeigt Fig. 5.
13. Therapeutische Zusammensetzung in Form einer Dosierungseinheit enthaltend pro Dosierungseinheit 10 bis 500 mg des Polysaccharids nach Anspruch 11 und

25 ein pharmazeutisches Streckmittel.
14. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid
N9GIb mit der nachfolgend beschriebenen Struktur und Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Heißwasserextrakt der Rinde von Melia azadirachta L. einer Behandlung mit einem Molekularsieb unterwirft und dabei eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von ca. 21 000 isoliert, die die folgende Struktur und Eigenschaften besitzt:

(1) Struktur

Neutrales Polysaccharid, das als Hauptkette OL-(I -> 4)-Glucan enthält, das mit ß-(1 * 3)-Fucose durchsetzt und mit ot- (1 > 6)~Arabinose verzweigt ist und aus Glukose, Arabinose und

Fucose im Verhältnis ca. 5 : 2 : 1 zusammengesetzt ist.

(2) Farbe und Aussehen

Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weißes Pulver .

(3) Löslichkeit

Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergleichen.

(4) Farbreaktion

Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion sind positiv. Bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.

(5) Molekulargewicht

25 Säulen-Gelchromatographie unter Verwendung von

Dextrangel mit einem Molekulargewicht-Fraktionierungsbereich von 1x10 - 2 χ 10 ergibt einen einzelnen Peak mit einem Molekulargewicht von ca. 21 000.

(6) Spezifische Drehung

/et'7 n^2; ~⁴⁶° <^c = °'²⁸' ^Ho°)· — — υ £

(7) Infrarot-Absorptionsspektrum 35 Wie in Fig. 4 gezeigt.

IRV ^KBr cm"¹: 3400, 2930, 1630. max.

(8) Ultraviolett-Absorptionsspektrum

In wäßriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur 5 Endabsorption beobachtet.

1 3

(9) C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum

Ein 100 MHz C-kernmagnetisches Resonanzspektrum, gemessen in Deuteriumoxid mit TMS (Tetramethylsilan) als externer Standard zeigt Fig. 5.
15. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid N9GIb nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Molekularsiebbehandlung anfänglich unter Ver-Wendung eines Molekularsiebagens mit einem Molekulargewicht-Fraktionierungsbereich von ca. 1x10 1 χ 10⁵ bis 1 χ 10³ - 1,5 χ 10⁵ durchgeführt wird und für die erste. Fraktion der drei getrennten Polysaccharidfraktionen weiters unter Verwendung eines Molekularsiebagens mit einem Molekulargewicht-Fraktionierungsbereich von ca. 1 χ 10 - 2 χ 10 bis 1 χ 10 8 χ 10 und die zweite Polysaccharidfraktion der zwei getrennten Polysaccharidfraktionen isoliert wird.

25
16. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid

N9GIb nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Molekularsiebbehandlung eine Gelfiltration und das Molekularsiebagens ein Gelfiltrationsagens ist.

17. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids N9GIb mit Anti-Tumor-Wirkung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß das Gelfiltrationsagens Dextrangel, Polyacrylamidgel, hydrophiles

35 Polyvinylgel oder poröse Glasperlen bedeutet.