DE3321238C2

DE3321238C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Fusion von Zellen

Info

Publication number: DE3321238C2
Application number: DE3321238A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Prof. 8700 Würzburg Zimmermann
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich GmbH
Current assignee: Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Priority date: 1983-06-11
Filing date: 1983-06-11
Publication date: 1985-05-02
Also published as: IL72055A0; EP0128565A3; JPH0256074B2; EP0128565B1; DK285784A; EP0128565A2; US4784954A; DE3321238A1; JPS609491A; US4971910A; DK285784D0; ATE37563T1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Fusion von Zellen, bei dem die in einer Zellsuspension im Fusionsraum befindlichen Zellen zunächst durch äußere Kräfte auf einen geringen Abstand zueinander gebracht werden. Zur Verschmelzung der Zellen werden alternativ ein elektrisches Feld, Chemikalien oder inaktivierte Viren eingesetzt. Es soll dabei eine Möglichkeit zur Annäherung der Zellen geschaffen werden, die auch für den Fall, daß die Zellen sich in einer höher leitenden Lösung befinden, zur Anwendung kommen kann. Gemäß der Erfindung werden die Zellen mit magnetischen Teilchen dotiert und einem den Fusionsraum durchdringenden, inhomogenen, magnetischen Feld ausgesetzt. Die dotierten Zellen sammeln sich so in geringem Abstand zueinander, worauf die Mittel zur Fusionierung eingesetzt werden. Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine Vorrichtung mit einer Kammer zur Aufnahme der die Zellen enthaltenden Lösung und einem an der Kammer derart angeordneten Magneten, daß das den Raum der Kammer durchdringende, inhomogene magnetische Feld mit seiner höchsten Dichte einem in den Raum hineinragenden Teil des Magneten entspringend ist.

Description

dadurch gekennzeichnet, daß der Magnet derart an der Kammer angeordnet ist, daß das den Raum (1) durchdringende magnetische Feld mit seiner höchsten Dichte einem in den Raum der Kammer hineinragenden Teil des Magneten entspringend ist.

9. Vorrichtung und Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der in den Raum hineinragende Teil des Magneten ein eine Spitze oder Kante aufweisender Polschuh (3) ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Polschuh (3) zugleich Elektrode ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Magnet aus einer Kombination aus einem Permanentmagneten und einem Elektromagneten besteht.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Fusion von Zellen, bei dem die in einer Zellsuspension im Fusionsraum befindlichen Zellen durch äußere Kräfte auf einen geringen Abstand zueinander gebracht werden und in der Membranstruktur benachbarter Zellen durcn Aussetzen der benachbarten Zellen entweder dem Puls eines elektrischen Feldes von mindestens der Höhe der Durchbruchspannung oder Störungen in der Membranstruktur verursachenden Chemikalien oder Störungen in der Membranstruktur verursachenden inaktivierten Viren Störungen verursacht werden, die zur Bildung von Membranbrücken zwischen den benachbarten Zellen und zur Verschmelzung der Zellen führen. Zwei Zellen in einer Suspension sollten, wenn sie sich berühren und ein eng^r Kontakt zwischen den Membranen beider Zellen entsteht, miteinander verschmelzen, da die Bausteine in der Membran beweglich sind. Eine derartige spontane Verschmelzung (Fusion) von Zellen wird unter natürlichen Bedingungen nicht oder nur nußerst selten beobachtet. F.inc bekannte Ausnahme stell! die Befruchtung einer Eizelle durch eine Samenzelle bei der sexuellen Fortpflanzung dar. Die spontane Fusion wird durch die negative Ladung der Phospholipidc und

anderer Membrankomponenten behindert Sie führt zur Abstoßung der Zellen, wenn sie sich auf einen geringen Abstand genähert haben. Zellverschmelzung erfordert aber, daß die beiden Membranen sich bis auf einen Abstand von weniger als 10~⁷ cm nähern.

Die mit technischen Mitteln durchgeführte Fusion von Zellen ist in einem weiten Anwendungsbereich einsetzbar. So ist es für die biologisch-medizinische Forschung von großem Interesse, eine große Zahl von Zellen miteinander zu verschmelzen. Bei geeigneter Größe der durch Fusion mehrerer oder gegebenenfalls vieler Zellen — beispielsweise 1000 bis 10 000 Blutkörperchen

— entstandenen großen Zeilen lassen sich dann Mikroelektroden, Mikrodruckmeßsonden und andere Sensoren ohne irreversible Zerstörung der Membran in die große Zelle einführen. Die Technik, über die Sensoren direkt eine Reihe von Zellen und Membranfunktionen zu erfassen, ist dabei für die klinische Diagnostik, z. B. bei der Früherkennung von Erkrankungen sowie gener-*»ll fiir/ίΐί» f^runHI^fTAnf/M-cphiino υηπ Rf>i-1f»lltlinfT

Die Technik der Fusion von Zellen kann außerdem eingesetzt werden für die Bildung von Hybridzellen durch Verschmelzung von zwei Zellen unterschiedlicher Herkunft. Dabei können Zellhybride aus Pflanzenzellen, aus denen wieder ganze Pflanzen gezüchtet werden können oder Zellhydride aus tierischen Zellen, über die monoklonal Antikörper, z. B. gegen Tumore und Leukämie, gewonnen werden können, gebildet v/erden. Als Beispiel sei genannt die Verschmelzung einer Lymphozytenzelle mit einer Myelomzelie, die besonders aus medizinischer und pharmazeutischer Sicht von großem Interesse ist. Bestimmte Lymphozyten bilden gegen Fremdstoffe im Organismus Antikörper, z. B. gegen ein Fremdeiweiß, das in die Blutbahn injiziert worden ist. Isoliert man die Lymphozyten und fusioniert sie mit einer Tumorzelle, wie der Myelomzelie, so besteht die Chance, daß sich eine sogenannte Hybridomzelle bildet, die die Eigenschaften beider Elternzellen besitzt. Diese Zelle produziert Antikörper, und zwar spezifisch nur gegen den betreffenden Frernstoff (sogenannte monoklonale Antikörper). Sie ist unsterblich und läßt sich im Gegensatz zu einer normalen ausdifferenzierten Zelle, wie dem Lymphozyten, permanent in Nährmedium vermehren.

Ein Verfahren zur Fusion von Zelk-n der eingangs bezeichneten Art ist aus Biochimica et Biophysica Acta, 694 (1982), 227-277 (Electric Field-Mediated Fufion And Related Electrical Phenomena, U. Zimmermann) bekannt. Bei diesem bekannten Verfahren — dessen Ablauf unter dem Mikroskop beobachtet werden kann

— wird der Niembrankontakt zwischen wenigstens zwei Zellen durch Anlegen eines alternierenden, schwach inhomogenen Feldes erzeugt. Durch das elektrische Feld werden, bedingt durch Polarisationsprozesse in der Zelle, Dipole erzeugt, die sich gegenseitig anziehen, wenn die Zellen während ihrer Wanderung im elektrischen Feld sich einander nähern (sogenannte Dielektrophorese). Nach der Bildung der Zellenreihe werden die Störungen in der Membranstruktur zwischen benachbarten Zellen durch einen elektrischen Durchbruchimpuls ausgelöst (J. Membrane Biol. 67, 165-182 (1982), Electric Field-Induced Cell-to-Cell Fusion, U.Zimmermann and J. Vicnken). Dabei werden — nach den bisherigen Modcllvorstellungen — Löcher in der Membrankontaktzone benachbarter Zellen erzeugt, die zu einem zytoplasmatischen Kontinuum zwischen den beiden Zellen und zur Brückenbildung von Lipiden zwischen den Membranen der benachbarten 7ellen führen. Die Lipidmoleküle ordnen sich nicht mehr in ihre ursprüngliche Membran ein. Sobald sich eine Brücke gebildet hat, kommt es aus energetischen Gründen zur Abrundung des entstandenen Gebildes, das aus den über die Lipidbrücken miteinander verbundenen Zellen besteht.

Bei der Durchführung der bekannten Verfahrensweise der Sammlung der Zellen durch Dielektrophorese ist es jedoch erforderlich, daß die Lösung, in der sich die Zellen während der Durchführung des Verfahrens befinden, möglichst wenig leitend ist, da sonst die Wärmeentwicklung zu hoch ist, was zu Turbulenzen und zur Zerstörung des engen Membrankontaktes zwischen einander benachbarten Zellen führen kann. Das ist insofern von Nachteil, als eine nur wenig leitfähige Lösung nicht oder wenig zellverträglich ist und die Zellen daher in einem wenig leitenden Medium Schädigungen erleiden können, was u. a. ihre Lebensdauer beeinträchtigt

Es ist ferner bekannt, die elektrischen Abstoßungskräfte, die bei geringem Abstand zwi-rhen den Mem-

"⁵O brEnsn zweier Zellen auftreten durch £,'.nsHtz bestimmter Chemikalien, wie Polyethylenglykol (PEG) oder inaktivierte Viren, auszuschalten. Sowohl Viren als auch PEG vernetzen die beiden Zellmembranen, so dall ein enger Membrankontakt entsteht. Gleichzeitig werden durch die Viren und das PEG Störungen in der Membranstruktur erzeugt, die durch Einstellen unpbysiologischer Bedingungen, wie z. B. Zugabe hoher Konzentrationen von Calciumionen und Wahl tines sehr hohen oder niedrigen pH-Wertes, noch verstärkt werden. Diese Störungen bewirken, daß sich in der Membrankontaktzone Löcher bilden und es damit zur Ausbildung von Phospholipidbrücken zwischen den benachbarten Zellmembranen kommt. Dies führt zur Verschmelzung der beiden Zellen unter Ausbildung einer neuen Einheit.

Bei der Durchführung der zuletzt genannten bekannten Verfahren kann jedoch die Zahl der miteinander zu verschmelzenden Zellen nicht gesteuert werden. Einerseits führt eine zu geringe Zelldichte in der die Zellen enthaltenden Lösung praktisch zu keinen Fusionsprodukte-i, da die Zellen nicht in Kontakt zueinander kommen. Andererseits führt eine für eine Fusion hinreichende Zelldichte — die auch durch Zentrifugieren der die Zellen enthaltenden Lösung erreicht werden kann — in unkontrollierter Weise zu Produkten, die aus dem Zwei-, Drei-, Vier- oder Vielfachen von individuellen Zellen bestehen.

Insbesondere im Hinblick auf die Bildung von Hybridzellen durch Verschmelzung von nur zwei Zellen unterschiedlicher Herkunft sind die zuletzt genannten bekannten Verfahren sehr unzufriedensteliend. Denn Zellhybride, die eine neuartige Kombination von Eigenschafte" aufweisen, müssen nach der Durchführung der bekannten Verfahren erst durch die Anwendung sehr zeitraubender Selektonsmethoden isoliert werden. Die Gewinnung von Zellhydriden aus Pflanzenzellen, aus denen wieder ganze Pflanzen gezüchtet werden können oder von Zelihybriden aus tierischen Zellen, über die monoklonale Antikörper, z. B. gegen Tumore und Leukämie, gewonnen werden können, erfordert eine Fusionstechnik, hei der jeweils nur zwei Zellen miteinander fusionieren.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Fusion von Zellen der eingangs genannten Art zu schaffen, bei dessen Durchführung sich die Zellen auch in einer höher leitenden Lösung befinden können, die Zellen aber dennoch vor dem eigentlichen Verfahrensschritt der Fusion zunächst auf geringen Abstand zueinander gebracht werden.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß die Zellen mit magnetischen Teilchen dotiert und einem den Fusionsraum durchdringenden inhomogenen magnetischen Feld derart ausgesetzt werden, daß sich die dotierten Zellen in geringem Abstand zueinander ansammeln, worauf die Störungen in der Membranstruktur der benachbarten Zellen verursacht werden.

Der Verfahrensschritt des Sammelns der Zellen läuft, di? er allein unter Einwirkung magnetischer Kräfte und ohne elektrischen Stromabfluß erfolgt, ohne jegliche Wärmeentwicklung ab.

Dabei können die Zellen auch in einer Lösung mit höherer Leitfähigkeit suspendiert sein, beispielsweise in dem für die Zellen vorgesehenen Nährmedium oder in einem Medium, dessen Kalium-Konrzntration gleich der lonenkonzentration in der Zelle ist. Für den Fall, daß die Fusion der Zellen durch elektrischen Durchbruch erfolgen soil, genügt dann — infolge der höheren Leitfähigkeit der Zellsuspension — eine Pulslänge im Bereich von Nano-Sekunden.

Durch die Verfahrensweise gemäß der Erfindung ist eine kontrollierte Fusion zweier oder einer vorbestimmten Anzahl von Zellen auch dann möglich, wenn Polyethylenglycol oder Sendai-Viren zur Störung der Membranstruktur eingesetzt werden. Die miteinander zu verschmelzende Zahl der Zellen kann dabei auch durch die vorgegebene Zelldichte in der Zellsuspension gesteuert werden. Darüber hinaus ist durch das Verfahren gemäß der Erfindung auch die Möglichkeit geschaffen worden, diese »nichtelektrischen« Fusionsverfahren im Hinblick auf die Dosierung der die Störungen bewirkenden Mittel genauer zu untersuchen bzw. zu optimieren. Das insbesondere auch deshalb, weil die Sammlung der Zellen am Ort der höchsten Felddichte bei Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung unter dem mikroskop ucöuäCiuci Wcfucn ΚΰΓιΓι.

Zweckmäßig ist, daß die magnetischen Teilchen auf die Oberfläche der Zellen aufgebracht werden. Um die magnetischen Teilchen in möglichst feiner Verteilung auf die Oberfläche der Zellen aufzubringen und um außerdem zu vermeiden, daß sich in der Zellsuspension einzelne, nicht an der Oberfläche de- Zellen adsorbierte magnetische Teilchen befinden, werden die Zellen zweckmäßigerweise zur Aufnahme der magnetischen Teilchen auf ihre Oberfläche in eine Lösung gegeben, die die magnetischen Teilchen kolloidal gelöst enthält. Nach einer gewissen Zeit, nach der der Adsorptionsvorgang weitgehend beendet ist, können die in der kolloidalen Lösung vorhandenen überschüssigen magnetischen Teilchen durch Abzentrifugieren der Zellen von diesen getrennt werden.

Es kann ferner zweckmäßig sein, daß die magnetischen Teilchen nicht an der Oberfläche der Zellen adsorbiert, sondern in diese eingebracht werden sollen. Dazu wird die Durchlässigkeit der Membran der Zellen, die sich in einer die magnetischen Teilchen in kolloidaler Form enthaltenden Lösung befinden, durch Anwendung eines elektrischen Feldpulses erhöht, so daß die magnetischen Teilchen in das Zellinnere gelangen. So werden beispielsweise durch eine Zellsuspension, die Erythrozyten und Fe3O4-Partikeln enthält, ein Feldpuls von etwa 15kV/cm und 50 ns Dauer appliziert und damit eine hinreichende Permeabilitätserhöhung der Zellmembranen erzieh, um die Fe3O4-Teiichen in die Erythrozyten gelangen zu lassen. Nach Ausheilen der Permeabiiitätserhöhung können die zusätzlich an der Oberfläche adsorbierten Magnetteilchen durch mehrmaliges Waschen der Zellen mit einer isotonen Lösung entfernt werden.

Zweckmäßigerweise werden als magnetische Teilchen ferromagnetische Teilchen, insbesondere FcjO.;-Partikeln, eingesetzt.

Für den Fall, daß eine besondere Ausrichtung der Zellen, insbesondere eine Aufreihung der Zellen in Form einer Perlenkette, gewünscht ist, werden die Zellen nach der Sammlung im Bereich der höchsen Felddichte des magnetischen Feldes einem äußeren, inhomogenen elektrischen Feld einer Frequenz im Bereich von

ίο 5 kHz bis 2 MH/ und einer Stärke im Bereich von 10 V/cm bis 2000 V/cm je nach Giöße der Zellen für kurze Zeit — im allgemeinen einige Sekunden — derart ausgesetzt, daß sich die Zellen in der vorbestimmten Ausrichtung aneinanderreihen. Da die Zellen vor Anwcndung des elektrischen Wechsclfeldcs bereits durch die Einwirkung des magnetischen Feldes gesammelt worden waren, bedarf es nur einer kurzen Einwirkung des elektrischen Feldes, um die gewünschte Auireihung der Zellen zu erreichen. Eine Erwärmung der Zellsuspen-

2(i sion und damit der Zellen ist damit — bei gleich/eiligem Erzielen einer Zellenreihe — weitgehend vermieden.

Für den Fall, daß die Störungen in der Membranstruktur durch Verwendung von Polyethylenglycol oder Sendai-Viren bewirkt werden, wird zweckmäßigerweise zunächst das Mittel der die Zellen enthaltenden Suspension zugegeben, danach die Zellen gesammelt oder gesammelt und anschließend in Reihen ausgerichtet und sodann Calciumionen zur Bewirkung der Störungen in der Membran der Zellen zugegeben. Bei Verwendung von Sendai-Viren wird außerdem die Temperatur auf 37⁰C erhöht. Bei dieser Verfahrensweise setz! die Wirkung der Mittel erst nach Ausrichtung der Zellen ein.

Für die Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung

branstruktur bewirkenden Chemikalien oder Viren, bei der eine Kammer mit einem aus elektrisch nicht leitenden Wänden gebildeter Raum zur Aufnahme einer Zellsuspension vorgesehen ist und einen derart an die Kammer angeordneten Magneten aufweist, daß der Raum der Kammer von einem inhomogenen magnetischen Feld durchdrungen ist oder b) unter Verwendung von die Störungen in der Meinbranstruktur bewirkendem elektrischen Durchbruch, bei der eine Kammer mit einem aus elektrisch nicht leitenden Wänden gebildeter Raum zur Aufnahme einer Zellsuspension vorgesehen ist. in den wenigstens zwei Elektroden derart hine^;-iragend gestaltet sind, daß ein zwischen den Elektroden begrenzter Bereich gebildet ist, in welchem die Zellen einem zwischen den Elektroden ausgebildeten elektrischen Feld ausgesetzt sind und einen derart an der Kammer angeordneten Magneten aufweist und daß der Raum der Kammer von einem inhomogenen magnetischen Feld durchdrungen ist, besteht eine besondere Ausführungsform der Vorrichtung darin, daß der Magnet derart an der Kammer angeordnet ist, daß das den Raum durchdringende magnetische Feld mit seiner höchsten Dichte einem in den Raum der Kammer hineinragenden Teil des Magneten entspringend ist.

Das in den Raum hineinragende Teil des Magneten ist dabei zweckmäßigerweise ein eine Spitze oder Kante aufweisender Polschuh. Der Polschuh kann dabei zugleich eine der Elektroden sein.
Ausführungsvarianten der Vorrichtung gemäß der

So 2

Erfindung sind in der Zeichnung schematisch dargestellt und werden im folgenden näher erläutert:

Hs zeigt

!' i g. I den Kammerraum zur Aufnahme der Zellsuspension mit beidseitig des Raumes angeordneten Magnetpolen.

F i g. 7 den Kammerraum mit nur auf einer Seite des Raumes »/!geordnetem Magneten.

F i g. 3 Anordnung des Magneten gemäß F i g. 1 mit in den Kammerraum hineinragenden Elektroden,

F i g. 4 Anordnung des Magneten gemäß F i g. 1 mit in den Kammerraum hineinragendem und zugleich als Elektrode ausgebildetem Teil des Magneten,

F i g. 5 Anordnung des Magneten gemäß Fig. 1, bei der beide Magnetpole in den Kammerraum hineinragen und als Elektroden ausgebildet sind,

F i g. 6a Draufsicht auf eine Kammer zur Behandlung

hineinragendem Polschuh des Magneten,

F i g. 6b Längsschnitt durch die Kammer gemäß F i g. ba entlang der Linie A -B.

Die in F i g. 1 und F i g. 2 gezeigten Anordnungen dienen der Durchführung derjenigen Verfahrensvarianten, bei denen der Durchbruch der Zellen durch chemische Mittel oder durch inaktivierte Viren bewirkt wird. Der Kammerraum I ist dabei entweder oben offen oder geschlossen, wobei im letzteren Fall eine Möglichkeit zum Füllen des Kammerraumes mit Zellsuspension, beispielsweise eine Zu- und Ableitung, vorgesehen ist.

Bei c .τ in Fig. 3 dargestellten Anordnung ragen in den Kammerraum zwei Elektroden 2 und 3 hinein, deren Abstand je nach Art und Größe der zu behandelnder Zellen im allgemeinen zwischen 5 μίτι und 1000 μπι liegt. Die dem Nordpol des Magneten, dem das magnetische Feld mit hoher Felddichte entspringt, zugewandte Elektrode 3 liegt direkt an der dem Nordpol zugewandten Kammerwand an oder ist als diese ausgebildet. Zu dieser Elektrode 3 gelangen die Zellen, die sich, auf den Ort höchster magnetischer Felddichte zu bewegen. Die Zellen sammeln sich dabei in dichter Packung und können durch einen über die Elektroden geleiteten elektrischen Puls in der Höhe der Durchbruchspannung fusioniert werden. Die Elektroden sind dabei im allgemeinen an eine — in der Zeichnung nicht dargestellte — Einrichtung zur Erzeugung eines Rechteckimpulses (für den elektrischen Durchbruch) bis 300 V angeschlossen.

Sollen die Zellen nach der Sammlung im magnetischen Feld und vor der Fusionierung in Form einer Perlenkette aneinandergereiht werden, so ist an die Elektrode im allgemeinen eine Einrichtung zur Erzeugung eines elektrischen Wechselfeldes mit einer Ausgangsspannung von 50 V angeschlossen.

Bei der in Fig.4 dargestellten Anordnung ragt ein Teil des Magneten — ein eine Spitze aufweisender Polschuh — in den Kammerraum i hinein und ist zugleich als Elektrode 3 ausgebildet Bei dieser Ausführungsform werden die Zellen direkt an der Spitze der Elektrode 3 gesammelt.

Eine Ausführungsform der Vorrichtung, bei der sowohl Nord- als auch Südpol des Magneten in den Kammerraum 1 hineinragen und zugleich als Elektroden 2 und 3 ausgebildet sind, zeigt F i g. 5.

In Fig.6a und 6b ist eine besondere Ausführungsform einer Kammer zur elektrischen Behandlung von Zellen dargestellt. Der Kammerraum 1 wird begrenzt durch eine Grundplatte 4 und ein die seitlichen Wände des Raumes bildendes Seitenteil 5. Zur oberen Begrenzung des Raumes kann eine Deckplatte oder eine Folie

vorgesehen sein.

in den Kammerraum 1 ragen zwei Elektroden 2 und 3 hinein, von denen die Elektrode 3 plattenförmig und aus einem Material mit relativ großer magnetischer Permeabilität (Weicheisen) ausgebildet ist. Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung wird durch die Elektrode 3 — beispielsweise durch Kontakt mit einem Stabrr.agneten — der magnetische Kraftfluß geleitet, um so den gewünschten Verlauf der den Kammerraum 1 durchdringenden magnetischen Kraftlinien zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 1

An der Oberfläche von erythroleukämischen Zellen (Friend-Zellen) wurden Fe3O4-Partikeln (Magnetit) adsorbiert. Hierzu wurde 1 ml der Zellsuspension mit einer kolloidalen isüiuncii FC3O4-Lösung ver-

setzt. Zur Erhöhung der Adsorption der

kein wurde zusätzlich noch 1 mg Pronase (oder Dispase) zugegeben (die kolloidale FeßO.)-Lösung war durch Filtration einer Fe3O4-Aufschlämmung durch ein Membranfilter mit 0,45 μίτΐ Porendurchmesser hergestellt worden). Nach einer Inkubationszeit von etwa einer Stunde, nach der der Adsorptionsvorgang weitgehend abgeschlossen war, wurden die Zellen durch Abzentrifugieren aus der Lösung von den überschüssigen Fe3O4-Partikeln abgetrennt, da die FejO.)-Partikeln in der kolloidalen Lösung nicht abzentrifugierbarsind. Die Zellen wurden anschließend in einer isotonen Lösung gewaschen.

Die mit den magnetischen Teilchen dotierten Zellen wurden in einer isotonen 0,3molaren Mannitlösung inkubiert, der 41,5% Polyethylengiycol (PEG; MW 6000) sowie 15% Dimethylsulfoxid (DMSO) zugegeben werden.

Die Zellen wurden in eine Fusionskammer der in F i g. 1 dargestellten Art gegeben. Die Magnetfeldstärke des verwendeten Magneten betrug an dessen Oberfläehe ca. 1 kG. (Wie sich gezeigt hat, konnte der Sammlungsvorgang jedoch bereits bei Verwendung eines Stückes magnetisierten Stahlbleches bei Erythrozyten, die mit Fe3C>4-Partikeln dotiert worden waren, festgestellt werden.)

Nach Sammlung der Zellen am Ort der größten Felddichte wurde in den Kammerraum vorsichtig eine Lösung zugegeben, die 1OmM CaCb in 0,3molarer Mannitlösung enthielt. Durch die Zugabe der Calciumionen wurde die Fusion der aneinanderliegenden Zellen durch

so PEG ausgelöst.

Ausführungsbeispiel 2

Entsprechend Ausführungsbeispiel 1 wurden Avena-Sativa-Protoplasten mit Magnetteilchen dotiert und mit PEG fusioniert.

Ausführungsbeispiel 3

Wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, wurden erythroleukämische Zellen ir.it Magnetitteilchen dotiert und im magnetischen Feld gesammelt. In der die Zellen enthaltenden Lösung war jedoch kein PEG, sondern inaktivierte Sendai-Viren einer Konzentration von etwa 2XlO³HAUZmI (haemagglutinierende Einheiten) enthalten. Nach Sammlung der Zellen im magnetischen Feld wurde die doppelte Menge einer Lösung zugegeben, die etwa 4 mM/1 CaCb in phosphatgepufferter iso-

toner NaCI-Lösung enthielt. Darauf folgende Temperaturerhöhung auf 37° C löste Fusion aus.

Ausführungsbeispiel 4

Wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, wurden Avena-Sativa-Protoplasten mit Magnetitteilchen dotiert und im magnetischen Feld gesammelt. Die Suspensionslösung enthielt 5 mM CaCh und 1 mg Pronase/ml, was einer elektrischen Leitfähigkeit von 1 χ 10~^jn-' χ cm¹ entspricht. Nach Sammlung der Zellen wurde ein Feldpuls von 2400 V/cm und 500 ns Dauer appliziert und auf diese Weise die Zellen fusioniert.

Ausführungsbeispiel 5

Wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, wurden

[viagut.tiiit-itt.iif*!! tjw-

tiert und im magnetischen Feld gesammelt. Die Suspensionslösung hatte die in Ausführungsbeispiel 4 angegebene Zusammensetzung. Zur Ausbildung von Zellenreihen wurde ein elektrisches Wechselfeld einer Frequenz von 1500 kHz und einer Stärke von 200 V/cm für 5 Sekunden angelegt. Hiernach wurde, wie in Ausführungsbeispiel 4 beschrieben, mittels eines elektrischen Feld- pulses fusioniert.

Alle vorgenannten Ausführungsbeispiele wurden mittels einer Kammer der in Fig.61/6b dargestellten Art durchgeführt, wobei allerdings bei den Ausführungsbeispielen 1 bis 3 eine elektrische Spannung nicht angelegt wurde.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

35

40

45

50

55

60

65

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Fusion, von Zellen, bei dem die in einer Zellsuspension im Fusionsraum befindlichen Zellen durch äußere Kräfte auf einen geringen Abstand zueinander gebracht werden und in der Membranstruktur benachbarter Zellen durch Aussetzen der benachbarten Zellen entweder dem Puls eines elektrischen Feldes von mindestens der Höhe der Durchbruchspannung oder Störungen in der Membranstruktur verursachenden Chemikalien oder Störungen in der Membranstruktur verursachenden inaktivierten Viren Störungen verursacht werden, die zur Bildung von Membranbrücken zwischen den benachbarten Zellen und zur Verschmelzung der Zellen führen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit magnetischen Teilchen dotiert und einem den Rsisionsraum durchdringenden inhomogenen magnetischen Feld derart ausgesetzt werden, daß sich die dotierten Zellen in geringem Abstand zueinander ansammeln, worauf die Störungen in der Membranstruktur der benachbarten Zellen verursacht werden.

2. Verfahren nach Anspruch ;'. dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen zur Aufnahme der magnetischen Teilchen in eine kolloidale, die magnetischen Teilchen enthaltende Lösung gegeben werden.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurv.ii gekennzeichnet, daß man als magnetische Teilchen ferromagnecr/Che Teilchen einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 3. !adurch gekennzeichnet, daß man als ferromagnetische Teilchen FejCVPartikeln einsetzt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach Sammlung der Zellen im Bereich der höchsten Felddichte des magnetischen Feldes die Zellen einem äußeren inhomogenen elektrischen Feld einer Frequenz im Bereich von 5 kHz bis 2 MHz und einer Stärke im Bereich von 10 V/cm bis 2000 V/cm je nach Größe der Zellen für kurze Zeit derart ausgesetzt werden, daß sich die Zellen in vorbestimmter Ausrichtung aneinanderreihen.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß für den Fall, daß die Störungen in der Membranstruktur durch Verwendung von Polyethylenglycol bewirkt werden, zunächst Polyethylenglykol der die Zellen enthaltenden Suspension zugegeben wird, danach die Zellen im magnetischen Feld gesammelt oder gesammelt und aneinandergereiht werden und sodann Calciumioncn zur Bewirkung der Störungen in der Membran der Zellen zugegeben werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 —5, dadurch gekennzeichnet, daß für den Fall, daß die Störungen in der Membranstruktur durch Verwendung von inaktivierten Sendai-Viren bewirkt werden, zunächst die Viren der die Zellen enthaltenden Suspension zugegeben werden, danach die Zellen im magnetischen Feld gesammelt oder gesammelt und aneinandergereiht werden und sodann Calciumionen zur Bewirkung der Störungen in der Membran der Zellen zugegeben werden.

8. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 — 7,

a) unter Verwendung von die Störungen in der Membranstruktur bewirkenden Chemikalien oder Viren gernäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der eine Kammer mit einem aus elektrisch nicht leitenden Wänden gebildeter Raum zur Aufnahme einer Zellsuspension vorgesehen ist und einen derart an der Kammer angeordneten Magneten aufweist, daß der Raum der Kammer von einem inhomogenen magnetischen Feld durchdrungen ist oder

b) unter Verwendung von die Störungen in der Membranstruktur bewirkendem elektrischen Durchbruch, bei der eine Kammer mit einem aus elektrisch nicht leitenden Wänden gebildeter Raum zur Aufnahme einer Zellsuspension vorgesehen ist, in den wenigstens zwei Elektroden derart hineinragend gestaltet sind, daß ein zwischen den Elektroden begrenzter Bereich gebildet ist, in welchem die Zellen einem zwischen den Elektroden ausgebildeten elektrischen Feld ausgesetzt sind und einen derart an der Kammer angeordneten Magneten aufweist, daß der Raum der Kammer von einem inhomogenen magnetischen Feld durchdrungen ist,