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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues Adsorptionsmittel und ein
Verfahren zu dessen Herstellung, ganz besonders ein Adsorptionsmittel
zur Entfernung von Lipoproteinen niedriger und/oder sehr niedriger Dichte
(VLDL) aus Blut oder Plasma, in einer extrakorporalen Zirkulationsbehandlung.
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Es
war ein Mittel zur selektiven Entfernung schädlicher Substanzen, die in
der Körperflüssigkeit
auftreten und in enger Beziehung zu den Ursachen oder dem Fortschreiten
einer Krankheit stehen, erforderlich. Es ist zum Beispiel bekannt,
daß Plasmalipoproteine,
insbesondere Lipoproteine mit sehr niedriger Dichte (im folgenden
als "VLDL" bezeichnet) und/oder
Lipoproteine mit niedriger Dichte (im folgenden als "LDL" bezeichnet), eine
große
Menge Cholesterin enthalten und Arteriosklerose verursachen. Bei
Hyperlipämien
wie der familiären
Hyperlipämie
und der familiären
Hypercholesterinämie
zeigen VLDL und/oder LDL um ein Vielfaches höhere Werte wie unter normalen
Bedingungen und verursachen häufig
Arteriosklerose wie Coronararteriosklerose. Obgleich verschiedene
Behandlungsarten wie Diäten
und medizinische Behandlungen angewendet wurden, sind deren Wirkungen
beschränkt,
und es besteht die Gefahr von ungünstigen Nebenwirkungen. Besonders
bei der familiären
Hypercholesterinämie
ist eine Plasmaaustauschtherapie, die sich aus der Plasmaentfernung
und der kompensatorischen Ergänzung
exogener menschlicher Plasmaproteinlösungen zusammensetzt, heutzutage
wohl die einzige Behandlungsmethode, die wirksam ist. Jedoch weist
die Plasmaaustauschtherapie verschiedene Mängel auf, wie (1) eine Notwendigkeit
für die
Verwendung von teurem, frischem Plasma oder Plasmafraktionen, (2)
die Gefahr von Infektionen durch Hepatitisviren und dergleichen
und (3) den Verlust aller Plasmakomponenten, die nicht nur schädliche Komponenten
sondern auch nützliche
enthalten, d.h. im Fall von Lipoproteinen gehen nicht nur VLDL und/oder
LDL sondern auch Lipoprotein mit hoher Dichte (im folgenden als "HDL" bezeichnet) verloren.
Um die obigen Mängel
zu beheben, wurde eine selektive Entfernung von schädlichen
Komponenten durch eine Membran oder dergleichen eingesetzt. Jedoch
sind diese Verfahren in der Selektivität unzulänglich und verursachen einen
großen
Verlust von nütz lichen
Komponenten aus der Körperflüssigkeit.
Es wurde auch ein selektives Entfernen von schädlichen Komponenten durch Adsorption
versucht. Zum Beispiel wurde ein synthetisches Adsorptionsmittel
wie Aktivkohle oder Amberlite XAD (ein eingetragenes Warenzeichen,
kommerziell erhältlich
von Rohm + Haas Co.) bei Leberkrankheiten verwendet. Solche Adsorptionsmittel
weisen jedoch viele Nachteile auf, wie eine geringe Selektivität und die Unfähigkeit
zur Entfernung hochmolekularer Verbindungen. Weiterhin wurde mit
dem Ziel, die Selektivität
zu erhöhen,
ein Adsorptionsmittel basierend auf dem Prinzip der Affinitätschromatographie
verwendet, das sich aus einem Träger,
auf dem ein Material mit einer Affinität für eine spezifisch zu entfernende
Substanz (solch ein Material wird im folgenden als "Ligand" bezeichnet) immobilisiert
ist, zusammensetzt. In diesem Fall ist es jedoch schwierig, eine
ausreichende Fließgeschwindigkeit
für eine
extrakorporale Behandlung zu erhalten, weil der Träger ein
weiches Gel wie Agarose ist. Dementsprechend ist eine bestimmte
Veränderung
der Kolonnenform erforderlich, um eine große Fließgeschwindigkeit zu erhalten,
und das Risiko einer gelegentlichen Verstopfung bleibt noch bestehen.
Deshalb kann ein stabiler, extrakorporaler Kreislauf durch das obige
Verfahren nicht erreicht werden.
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Ein
Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung wird zum selektiven
Entfernen von VLDL und/oder LDL aus Blut oder Plasma verwendet.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Adsorptionsmittel
zum selektiven Entfernen von VLDL und LDL aus Blut oder Plasma in
der extrakorporalen Zirkulationsbehandlung zur Verfügung zu
stellen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
zur Herstellung des Adsorptionsmittels zur Verfügung zu stellen.
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Diese
und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden
Beschreibung ersichtlich.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Adsorptionsmittel gemäß Anspruch 1 bereitgestellt.
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1 und 2 sind
jeweils Abbildungen, die die Beziehung zwischen der Fließgeschwindigkeit
und dem Druckabfall erhalten in den Referenzbeispielen 1 und 2 zeigen,
und 2 ist ein Diagramm der Polyacrylamid-Disk-Gel-Elektrophorese erhalten
in Referenzbeispiel 39.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Träger haben die folgenden Eigenschaften:
- (1) eine relativ hohe mechanische Festigkeit,
- (2) einen niedrigen Druckabfall und keine Säulenverstopfung im Falle der
Durchleitung von Blut oder Plasma durch eine mit einem Träger gepackte
Säule,
- (3) eine große
Zahl von Mikroporen, in die eine zu entfernende Substanz im wesentlichen
eindringt und
- (4) geringe, durch ein Sterilisierungsverfahren wie das Dampfsterilisieren
im Autoklaven hervorgerufene Veränderungen.
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Deshalb
ist in der vorliegenden Erfindung der verwendete Träger ein
wasserunlösliches
poröses
vernetztes Polyacrylat.
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Das
in der vorliegenden Erfindung verwendete poröse Hartgel quillt mit einem
Lösungsmittel
weniger und wird durch Druck weniger deformiert als ein weiches
Gel wie Dextran, Agarose oder Acrylamid.
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Der
Ausdruck "hartes
Gel" und "weiches Gel" in der vorliegenden
Erfindung wird wie folgt erläutert:
Ein
hartes Gel wird von einem weichen Gel durch das folgende, in den
Referenzbeispielen 1 und 2 beschriebene Verfahren unterschieden.
Das bedeutet, wenn eine Beziehung zwischen der Fließgeschwindigkeit
und dem Druckabfall durch Durchleiten von Wasser durch eine gleichförmig mit
einem Gel gepackte Säule
bestimmt wird, zeigt ein hartes Gel eine lineare Beziehung während ein
weiches Gel eine nichtlineare Beziehung zeigt. Im Falle eines weichen
Gels wird das Gel deformiert und verfestigt sich bei einem bestimmten
Druck, so daß die
Fließgeschwindigkeit
nicht weiter ansteigt. In der vorliegenden Erfindung wird ein Gel
mit der obigen linearen Beziehung bei mindestens 0,3 kg/cm als "hartes Gel" bezeichnet.
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Eine
Porengröße des porösen Cellulosegels
wird ausgewählt
abhängig
vom Molekulargewicht, Form oder Größe einer zu entfernenden Substanz,
und die am meisten geeignete Porengröße kann in jeweiligen Fall ausgewählt werden.
Zum Messen der Porengröße gibt
es verschiedene Arten von Methoden, wie die Quecksilberporosimetrie
und die Beobachtung durch ein Elektronenmikroskop als Direktmeßverfahren.
Im Hinblick auf wasserhaltige Teilchen können die obigen Verfahren manchmal
jedoch nicht angewendet werden. In einem solchen Fall kann eine
Ausschlußgrenze
als ein Maß der
Porengröße angenommen
werden. Der Ausdruck "Ausschlußgrenze" (exclusion limit)
in der vorliegenden Erfindung bedeutet das kleinste Molekulargewicht
eines Moleküls,
das nicht in eine Pore in einer Gelpermeationschromatographie (vgl.
Hiroyuki Hatano und Toshihiko Hanai: Zikken Kosoku Ekitai Chromatography
(Experimental High-Pressure Liquid Chromatography), veröffentlicht
von Kabushiki Kaisha Kagaku Dojin) eindringen kann. Außergewöhnlich wird
ein Molekül
mit einem Molekulargewicht größer als
die Ausschlußgrenze
nahe dem Porenvolumen eluiert. Deshalb kann die Ausschlußgrenze
durch Untersuchung der Beziehungen zwischen Molekulargewichten und
Elutionsvolumina unter Verwendung von Substanzen mit verschiedenen
Molekulargewichten durch Gelpermeationschromatographie untersucht
werden. Eine Ausschlußgrenze
variiert mit der Art der auszuschließenden Substanzen. In der vorliegenden
Erfindung wird eine Ausschlußgrenze
des porösen
Cellulosegels unter Verwendung von globulären Proteinen und/oder Viren
gemessen, und die bevorzugte Ausschlußgrenze beträgt 5 × 103 bis 1 × 109. Wenn die Ausschlußgrenze größer als 1 × 109 ist,
sinkt die adsorbierte Menge einer zu entfernenden Substanz mit der
Abnahme der Menge des immobilisierten Liganden, und außerdem wird
die mechanische Festigkeit des Gels reduziert.
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VLDL
und/oder LDL sind riesige Moleküle
mit einem Molekulargewicht von größer als 1 × 106.
Die Ausschlußgrenze
zum Entfernen von VLDL und/oder LDL ist 1 × 106 bis
1 × 109, besonders bevorzugt 1 × 106 bis 1 × 108.
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Im
Hinblick auf die poröse
Struktur des in der vorliegenden Erfindung verwendeten porösen Cellulosegels
ist eine Struktur, die in jedem Teil des Gels gleichförmig Poren
aufweist (im folgenden als "gleichförmige Struktur" bezeichnet) bevorzugter
als eine Struktur, die nur an der Oberfläche des Gels Poren aufweist.
Es ist bevorzugt, daß die
Porosität
des Gels nicht kleiner als 20% ist. Die Form des Trägers wird
abhängig
von der Art der zu entfernenden Substanz ausgewählt. Der Träger kann aus geeigneten Formen
wie Partikeln, Fasern, Folien und Hohlfasern ausgewählt werden.
Im Falle der Verwendung eines Trägers
in Form von Partikeln steigt der Druckabfall mit einer extrem kleinen
Größe an, obwohl
Partikel mit einer kleineren Größe im allgemeinen eine
exzellente Adsorptionskapazität
zeigen. Deshalb sind Partikel mit einer Größe von 1 μm bis 5.000 μm bevorzugt. Weiterhin ist es
bevorzugt, daß ein
Träger
funktionale Gruppen, die zur Immobilisierung der Liganden verwendet
werden, oder Gruppen, die leicht zu aktiveren sind, aufweist. Beispiele
dieser Gruppen sind zum Beispiel Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Thiol-,
Säureanhydrid-,
Succinylimid-, Chlor-, Aldehyd-, Amido-, Epoxygruppen und dergleichen.
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Das
wasserlösliche
poröse
Polymer-Hartgel, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird,
ist ein vernetztes Polyacrylat.
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Der
Ligand, der eine spezifische Affinität aufweist, ist eine Polyanionverbindung
zum Entfernen eines Lipoproteins wie VLDL oder LDL.
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Die
zu entfernenden Substanzen sind VLDL und/oder LDL, die eine große Menge
Cholesterin enthalten und Arteriosklerose hervorrufen. Beispiele
der Polyanionverbindungen sind zum Beispiel sulfatisierte Polysaccharide
wie Heparin, Chondroitinsulfat, Chondroitinpolysulfat, Heparansulfat,
Keratansulfat, Heparinsulfat, Xylansulfat, Caroninsulfat, Cellulosesulfat,
Chitinsulfat, Chitosansulfat, Pectinsulfat, Inulinsulfat, Argininsulfat,
Glycogensulfat, Polylactosesulfat, Carrageenansulfat, Stärkesulfat,
Polyglucosesulfat, Laminarinsulfat, Galactansulfat, Levansulfat
und Mepesulfat, Phosphorwolframsäure,
polysulfatisiertes Anethol, Polyvinylalkoholsulfat, Polyphosphorsäure und/oder
Salze davon und dergleichen. Bevorzugte Beispiele der obigen Polyanionverbindungen
sind zum Beispiel Heparin, Chondroitinpolysulfat und/oder Salze
davon. Beispiele des Salzes der obigen Polyanionverbindung sind
zum Beispiel ein wasserlösliches
Salz wie ein Natriumsalz oder Kaliumsalz und dergleichen.
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Zum
Kuppeln eines Liganden mit einem Träger werden kovalente Kupplungsverfahren
verwendet. Um das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung zur
extrakorporalen Zirkulationsbehandlung zu verwenden, ist es wichtig,
daß sich
der Ligand nicht löst.
Falls notwendig, kann ein Abstandsstück (Spacer) zwischen Ligand
und Träger
eingeführt
werden.
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Es
ist bevorzugt, daß ein
Gel aktiviert wird durch ein Reagenz wie ein Cyanhalogenid, Epichlorhydrin, eine
Polyoxyranverbindung wie Bisepoxid oder Triazinhalogenid, und dann
mit einem Liganden umgesetzt wird unter Bildung des gewünschten
Adsorptionsmittels. In diesem Falle ist es bevorzugt, daß ein Gel
mit einer zu aktivierenden Gruppe wie einer Hydroxylgruppe als ein
Träger
verwendet wird. Von den obigen Reagenzien sind Epichlorhydrin oder
eine Polyoxyranverbindung wie Bisepoxid besonders bevorzugt, weil
ein Ligand auf einem unter Verwendung eines solchen Reagenzes aktivierten
Träger
stark immobilisiert und die Ablösung
des Liganden vermindert ist.
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Die
Menge des immobilisierten Liganden variiert in Abhängigkeit
von den Eigenschaften des verwendeten Liganden wie seiner Form und
seiner Aktivität.
Zur ausreichenden Entfernung von VLDL und/oder LDL unter Verwendung
einer Polyanionverbindung zum Beispiel, ist es bevorzugt, daß die Polyanionverbindung
immobilisiert wird in einer Menge von nicht weniger als 0,02 mg/ml
eines offensichtlichen Säulenvolumens,
das durch ein Adsorptionsmittel eingenommen wird (im folgenden auch
als "Schüttvolumen" (bed volume) bezeichnet),
unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten 100 mg oder weniger. Der
bevorzugte Bereich beträgt
0,5 bis 20 mg/ml des Schüttvolumens.
Nach der Kupplungsreaktion kann die nicht umgesetzte Polyanionverbindung
zur Wiederverwendung durch Reinigung etc. wiedergewonnen werden.
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Es
ist bevorzugt, daß die
verbleibenden, nicht umgesetzten aktiven Gruppen mit Ethanolamin
und dergleichen blockiert werden.
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Das
Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung kann für die extrakorporale
Zirkulationsbehandlung, durchgeführt
durch Füllen
einer Säule
in einem extrakorporalen Zirkulationskreislauf und Durchleiten von
Körperflüssigkeit
wie Blut oder Plasma durch die Säule,
wobei die Säule
mit dem Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung gepackt ist,
verwendet werden. Die Verwendung des Adsorptionsmittels ist nicht
notwendigerweise auf das obige Beispiel beschränkt.
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So
lange der Ligand nicht stark degeneriert wird, kann das Adsorptionsmittel
der vorliegenden Erfindung der Dampfsterilisation durch Autoklaven
unterzogen werden, und dieses Sterilisationsverfahren beeinflußt die Mikroporenstruktur,
die Teilchenform und das Gelvolumen des Adsorptionsmittels nicht.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Referenzbeispiele
und Beispiele genauer beschrieben und erläutert.
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Referenzbeispiel 1
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Biogel
A5m (ein kommerziell erhältliches
Agarosegel, hergestellt von Biorad Co., Teilchengröße: 50 bis
100 mesh) als weiches Gel und Toyopearl HW65 (ein kommerziell erhältliches
vernetztes Polyacrylatgel, hergestellt von Toyo Soda Manufacturing
Co., Ltd., Partikelgröße: 50 bis
100 μm)
und Cellulofine GC-700 (ein kommerziell erhältliches poröses Cellulosegel,
hergestellt von Chisso Corporation, Partikelgröße: 45 bis 105 μm) als Hartgel
wurden gleichförmig
in eine Glassäule
(Innendurchmesser: 9 mm, Höhe:
150 mm) gepackt, die sowohl an der Spitze als auch am Boden der
Säule Filter
(Porengröße: 15 μm) aufwies.
Wasser wurde durch die so erhaltene Säule durchgeleitet, und die
Beziehung zwischen der Fließgeschwindigkeit
und dem Druckabfall wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Wie in 1 gezeigt, steigt die Fließgeschwindigkeit nahezu proportional
mit dem Anstieg des Druckabfalls im porösen Polymer-Hartgel an. Auf
der anderen Seite verfestigte sich das Agarosegel. Als Ergebnis
verursacht ein ansteigender Druck kein Ansteigen der Fließgeschwindigkeit.
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Referenzbeispiel 2
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Die
Verfahren von Referenzbeispiel 1 wurden wiederholt, ausgenommen
daß FPG
(ein kommerziell erhältliches
poröses
Glas, hergestellt durch Wako Pure Chemical Industry Ltd., Partikelgröße: 80 bis
120 mesh) anstelle der porösen
Polymer-Hartgele als poröses
anorganisches Hartgel verwendet wurde. Die Ergebnisse sind 2 gezeigt.
Wie in 2 gezeigt, stieg die Fließ geschwindigkeit nahezu proportional
mit dem Anstieg des Druckabfalls im porösen Glas an, was beim Agarosegel
nicht der Fall war.
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Referenzbeispiel 3
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Toyopearl
HW55 (ein kommerziell erhältliches
vernetztes Polyacrylatgel, hergestellt durch Toyo Soda Manufacturing
Co., Ltd., Ausschlußgrenze:
7 × 105, Partikelgröße: 50 bis 100 μm) mit einer
gleichförmigen Struktur
wurde als Träger
verwendet.
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Zu
10 ml des Gels wurden 6 ml gesättigte
wäßrige NaOH-Lösung und
15 ml Epichlorhydrin gegeben, und die Reaktionsmischung wurde unter
Rühren
bei 50°C
für 2 Stunden
umgesetzt. Das Gel wurde nacheinander mit Alkohol und Wasser gewaschen,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen. Zu dem resultierenden epoxyaktivierten
Gel wurden 20 ml konzentriertes wäßriges Ammoniak gegeben, und
die Reaktionsmischung wurde unter Rühren bei 50°C für 2 Stunden umgesetzt, um Aminogruppen
in das Gel einzuführen.
3 ml des so erhaltenen aktivierten Gels, das Aminogruppen enthielt,
wurden zu 10 ml einer wäßrigen Lösung (pH
4,5), die 200 mg Heparin enthielt, gegeben. Zur resultierenden Reaktionsmischung
wurden 200 mg 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid gegeben, während die
Reaktionsmischung bei pH 4,5 gehalten wurde, und die Reaktionsmischung
wurde bei 4°C
für 24
Stunden geschüttelt.
Nach Abschluß der
Reaktion wurde die resultierende Reaktionsmischung nacheinander
mit einer wäßrigen 2
M NaCl-Lösung,
einer wäßrigen 0,5
M NaCl-Lösung und
Wasser gewaschen, um das gewünschte
Gel zu ergeben, auf dem Heparin immobilisiert war (im folgenden
als "Heparingel" bezeichnet). Die
Menge des immobilisierten Heparins betrug 2,2 mg/ml des Schüttvolumens.
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Beispiele 1 bis 3
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Das
Verfahren von Referenzbeispiel 3 wurde wiederholt, ausgenommen daß Toyopearl
HW60 (Ausschlußgrenze:
1 × 106, Partikelgröße: 50 bis 100 μm), Toyopearl
HW65 (Ausschlußgrenze:
5 × 106, Partikelgröße: 50 bis 100 μm) und Toyopearl
HW75 (Ausschlußgrenze:
5 × 107, Partikelgröße: 50 bis 100 μm) anstelle von
Toyopearl HW55 verwendet wurden, um jeweils ein Heparingel zu ergeben.
Toyopearl HW60, Toyopearl HW65 und Toyopearl HW75 sind alle kommerziell
erhältliche
vernetzte Polyacrylatgele mit einer gleichförmigen Struktur, hergestellt
durch Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. Die Mengen des immobilisierten
Heparins betrugen 1,8 mg, 1,4 mg bzw. 0,8 mg/ml des Schüttvolumens.
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Referenzbeispiel 4
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Cellulofine
GC 700 (ein kommerziell erhältliches
poröses
Cellulosegel, hergestellt von Chisso Corporation, Ausschlußgrenze:
4 × 105, Partikel größe: 45 bis 105 μm) mit einer
gleichförmigen
Struktur wurde als ein Träger
verwendet.
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Das
Gel wurde durch einen Filter abgesaugt und 4 g 20%ige NaOH und 12
g Heptan wurden zu 10 g des abgesaugten Gels hinzugefügt. Ein
Tropfen Tween 20 (nichtionisches oberflächenaktives Mittel) wurde weiter
zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt,
das zum Dispergieren des Gels gerührt wurde. Nach 2-stündigem Rühren bei
40°C wurden
5 g Epichlorhydrin zum Reaktionsgemisch hinzugefügt, das weiter bei 40°C 2 Stunden
gerührt
wurde. Danach ließ man
das Reaktionsgemisch stehen, der resultierende Überstand wurde abdekantiert,
und das Gel wurde mit Wasser gewaschen, um Epoxygruppen in das Gel
einzuführen.
Zum resultierenden epoxyaktivierten Gel wurden 15 ml konzentriertes
wäßriges Ammoniak
hinzugefügt,
und das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden bei 40°C gerührt, durch
einen Filter abgesaugt und mit Wasser gewaschen, um Aminogruppen
in das Gel einzuführen.
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Eine
3 ml-Portion des so erhaltenen aktivierten Gels, enthaltend Aminogruppen,
wurde zu 10 ml einer wäßrigen Lösung (pH
4,5), enthaltend 200 mg Heparin, hinzugefügt. Zum resultierenden Reaktionsgemisch wurden
200 mg 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid hinzugefügt, während das
Reaktionsgemisch bei pH 4,5 gehalten wurde, und anschließend wurde
das Reaktionsgemisch 24 Stunden bei 4°C geschüttelt. Nach Vervollständigung
der Reaktion wurde das resultierende Reaktionsgemisch nacheinander
mit 2 M wäßriger NaCl-Lösung, 0,5
M wäßriger NaCl-Lösung und
Wasser gewaschen, unter Bildung des gewünschten Heparin-Cellulofine
A-3. Die Menge des immobilisierten Heparins betrug 2,5 mg/ml Schüttvolumen.
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Referenzbeispiele 5 bis
6
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Die
Verfahren von Referenzbeispiel 4 wurden wiederholt, außer daß Cellulofine
A-2 (Ausschlußgrenze:
7 × 105, Teilchengröße: 45 bis 105 μm) bzw. Cellulofine
A-3 (Ausschlußgrenze:
5 × 10,
Teilchengröße: 45 bis
105 μm)
anstelle von Cellulofine GC 700 verwendet wurden, um jeweils ein
Heparingel zu ergeben. Sowohl Cellulofine A-2 als auch Cellulofine
A-3 sind kommerziell erhältliche
poröse
Cellulosegele mit einer einheitlichen Struktur, hergestellt von
Chisso Corporation. Die Mengen des immobilisierten Heparins betrugen
2,2 mg bzw. 1,8 mg/ml des Schüttvolumens.
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Referenzbeispiel 7
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Die
Verfahren von Referenzbeispiel 4 wurden wiederholt, außer daß Cellulofine
A-3 mit einer Teilchengröße von 150
bis 200 μm
anstelle von 45 bis 105 μm
verwendet wurde. Die Menge des immobilisierten Heparins betrug 1,5
mg/ml Schüttvolumen.
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Beispiel 4
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Die
Verfahren von Referenzbeispiel 3 wurden wiederholt, außer daß Toyopearl
HW65 anstelle von Toyopearl HW55 und Chondroitinpolysulfat anstelle
von Heparin verwendet wurden, um das gewünschte Chondroitinpolysulfat-Toyopearl
HW65 zu erhalten. Die Menge des immobilisierten Chondroitinpolysulfats
betrug 1,2 mg/ml Schüttvolumen.
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Referenzbeispiel 8
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Zu
4 ml Cellulofine A-3 wurde Wasser zum Auffüllen des Volumens auf 10 ml
hinzugefügt,
und dann wurden 0,5 Mol NaIO4 hinzugefügt. Nach
1-stündigem
Rühren
bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mittels Filtration
mit Wasser gewaschen, um Aldehydgruppen in das Gel einzuführen. Das
so erhaltene Gel wurde in 10 ml Phosphatpuffer von pH 8 suspendiert
und nach Zugabe von 50 mg Ethylendiamin 20 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Gel wurde abfiltriert und anschließend in 10 ml 1%iger NaBH4-Lösung suspendiert.
Nach 15-minütiger
Reduktionsreaktion wurde das Reaktionsgemisch abfiltriert und mit
Wasser gewaschen, um Aminogruppen in das Gel einzuführen.
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In
10 ml 0,25 M NaIO4-Lösung wurden 300 mg Natriumsalz
der Dextranschwefelsäure
gelöst.
Nach 4-stündigem
Rühren
bei Raumtemperatur wurden 200 mg Ethylenglykol zur resultierenden
Lösung
hinzugefügt
und eine Stunde gerührt.
Die resultierende Lösung
wurde auf pH 8 eingestellt und dann wurde das obige Gel, enthaltend
Aminogruppen, in der Lösung
suspendiert und 24 Stunden gerührt.
Nach Vervollständigung der
Reaktion wurde das Gel filtriert, mit Wasser gewaschen und dann
in 10 ml 1%iger NaBH4-Lösung suspendiert. Die resultierende
Suspension wurde 15 Minuten der Reduktionsreaktion unterzogen und
durch Filtration mit Wasser gewaschen, um das gewünschte Natriumsalz
des Dextransulfat-Cellulofins A-3 zu geben. Die Menge des immobilisierten
Natriumsalzes des Dextransulfats betrug 0,5 mg/ml des Schüttvolumens.
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Referenzbeispiel 9
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Cellulofine
A-3 wurde auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 4 behandelt,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen.
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2
ml des so erhaltenen epoxyaktivierten Gels wurden zu 2 ml einer
wäßrigen Lösung, enthaltend
0,5 g Natriumsalz von Dextransulfat (innere Viskosität 0,055
dl/g, mittlerer Polymerisationsgrad: 40, Schwefelgehalt: 19 Gew.-%),
hinzugefügt,
und das Reaktionsgemisch wurde auf pH 12 eingestellt. Die Konzentration
des Natriumsalzes von Dextransulfat betrug ungefähr 10 Gew.-%. Das resultierende
Reaktionsgemisch wurde abfiltriert und nacheinan der mit 2 M wäßriger NaCl-Lösung, 0,5
M wäßriger NaCl-Lösung und
Wasser gewaschen, um das gewünschte
Natriumsalz des Dextransulfat-Cellulofins A-3 zu ergeben. Die zurückbleibenden unumgesetzten
Epoxygruppen wurden mit Monoethanolamin blockiert. Die Menge des
immobilisierten Natriumsalzes von Dextransulfat betrug 1,5 mg/ml
des Schüttvolumens.
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Referenzbeispiel 10
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Zu
5 g durch einen Filter abgesaugtem Cellulofine A-3 wurden 2,5 ml
1,4-Butandioldiglycidylether und 7,5 ml 0,1 N wäßrige NaOH-Lösung hinzugefügt, und
das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um
Epoxygruppen in das Gel einzuführen.
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Das
so erhaltene epoxyaktivierte Gel wurde mit Natriumsalz von Dextransulfat
auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 9 umgesetzt, um das
gewünschte
Natriumsalz von Dextranschwefelsäure
(bzw. sulfat)-Cellulofine A-3 zu geben. Die Menge des immobilisierten
Natriumsalzes von Dextransulfat betrug 1,8 mg/ml Schüttvolumen.
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Referenzbeispiel 11
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Die
Verfahren von Referenzbeispiel 9 wurden wiederholt, außer daß Cellulofine
A-6 (ein kommerziell erhältliches
poröses
Cellulosegel, hergestellt von Chisso Corporation, Ausschlußgrenze:
1 × 108, Teilchengröße: 45 bis 105 μm) mit einer
einheitlichen Struktur anstelle von Cellulofine A-3 verwendet wurde,
um das gewünschte
Natriumsalz von Dextransulfat-Cellulofine A-6 zu ergeben. Die Menge
des immobilisierten Natriumsalzes von Dextransulfat betrug 1,2 mg/ml
des Schüttvolumens.
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Referenzbeispiel 12
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Toyopearl
HW65 wurde in der gleichen Weise wie in Referenzbeispiel 3 behandelt,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen.
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2
ml des so erhaltenen epoxyaktivierten Gels wurden in der gleichen
Weise behandelt wie in Referenzbeispiel 9, um das gewünschte Natriumsalz
von Dextransulfat-Toyopearl HW65 zu geben. Die Menge des immobilisierten
Natriumsalzes von Dextransulfat betrug 0,4 mg/ml des Schüttvolumens.
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Referenzbeispiel 13
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Cellulofine
A-3 wurde auf die gleiche Weise behandelt wie in Referenzbeispiel
4, um Epoxygruppen in das Gel einzuführen.
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Zu
10 ml des so erhaltenen epoxyaktivierten Gels wurden 50 mg Protein
A hinzugefügt.
Das Reaktionsgemisch wurde auf pH 9,5 eingestellt und 24 Stunden
der Reaktion bei Raumtemperatur unterzogen. Das resultierende Reaktionsgemisch
wurde nacheinander mit 2 M wäßriger NaCl-Lösung, 0,5
M wäßriger NaCl-Lösung und
Wasser gewaschen. Die verbleibenden unumgesetzten Epoxygruppen wurden
durch 16-stündige Reaktion
mit Ethanolamin blockiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Wasser
gewaschen, um das gewünschte
Protein-A-Cellulofine A-3 zu ergeben.
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Referenzbeispiel 14
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Die
Verfahren von Referenzbeispiel 13 wurde wiederholt, außer daß Cellulofine
A-7 (ein kommerziell erhältliches
poröses
Cellulosegel, hergestellt von Chisso Corporation, Ausschlußgrenze:
5 × 106, Teilchengröße: 45 bis 105 μm) mit einer
einheitlichen Struktur anstelle von Cellulofine A-3 verwendet wurde,
und die Kupplungsreaktion wurde bei pH 8,5 durchgeführt, um
das gewünschte
Protein-A-Cellulofine A-7 zu ergeben.
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Referenzbeispiel 15
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Toyopearl
HW65 wurde in der gleichen Weise wie in Referenzbeispiel 3 behandelt,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen.
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Das
so erhaltene aktivierte Gel wurde mit Protein A in der gleichen
Weise behandelt wie in Referenzbeispiel 13, um das gewünschte Protein
A-Toyopearl HW65
zu geben.
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Referenzbeispiel 16
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20
ml Cellulofine A-3 wurden in Wasser dispergiert. Dazu wurden 6 g
Cyanbromid langsam hinzugefügt,
während
das Reaktionsgemisch bei pH 11 bis 12 gehalten wurde. Nach 10-minütigem Rühren wurde
das Gel abfiltriert und mit kaltem Wasser und 0,1 M wäßriger NaHCO3-Lösung
gewaschen, unter Bildung eines aktivierten Gels. Das so erhaltene
aktivierte Gel wurde zu 20 ml 0,1 M wäßriger NaHCO3-Lösung, enthaltend
1,5 g Polymyxin B-Sulfat, gegeben und 24 Stunden bei 4°C geschüttelt. Die
verbleibenden nichtumgesetzten aktiven Gruppen wurden mit Monoethanolaminlösung blockiert,
und dann wurde das gewünschte
Polymyxin-B-Cellulofine A-3 erhalten.
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Referenzbeispiel 17
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Cellulofine
A-3 wurde auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 4 behandelt,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen. Das so erhaltene epoxyaktivierte
Gel wurde mit Polymyxin B-sulfat auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel
16 unter Bildung des gewünschten
Polymyxin-B-Cellulofine A-3 umgesetzt.
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Referenzbeispiel 18
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Cellulofine
A-2 wurde auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 4 behandelt,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen. Zu 1 ml des so erhaltenen
epoxyaktivierten Gels wurden 10 mg IgG hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch
wurde auf pH 9 eingestellt und der Reaktion 24 Stunden bei Raumtemperatur
unterzogen. Das Gel wurde abfiltriert und nacheinander mit 2 M wäßriger NaCl-Lösung, 0,5
M wäßriger NaCl-Lösung und Wasser
gewaschen. Nachdem die verbleibenden nichtumgesetzten Epoxygruppen
mit Monoethanolaminlösung
blockiert waren, wurde das gewünschte
IgG-Cellulofine A-3 erhalten.
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Referenzbeispiel 19
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Cellulofine
A-3 wurde auf die gleiche weise wie in Referenzbeispiel 4 behandelt,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen. 1 ml des so erhaltenen
epoxyaktivierten Gels wurde mit 10 mg hitzedenaturiertem IgG auf
die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 18 bei pH 8,5 umgesetzt,
unter Bildung des gewünschten
hitzedenaturierten IgG-Cellulofine A-3.
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Referenzbeispiel 20
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Cellulofine
A-7 wurde auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 4 behandelt,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen. 1 ml des so erhaltenen
epoxyaktivierten Gels wurde mit 100 mg Hämoglobin auf die gleiche Weise
wie in Referenzbeispiel 18 bei pH 8,5 umgesetzt, unter Bildung des
gewünschten
Hämoglobin-Cellulofine
A-7.
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Referenzbeispiel 21
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Toyopearl
HW55 wurde in der gleichen Weise wie in Referenzbeispiel 3 behandelt,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen.
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Das
so erhaltene aktivierte Gel wurde mit Hämoglobin in der gleichen Weise
behandelt wie in Referenzbeispiel 20, um das gewünschte Hämoglobin-Toyopearl HW55 zu geben.
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Referenzbeispiel 22
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Cellulofine
A-7 wurde auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 4 behandelt,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen. Das so erhaltene epoxyaktivierte
Gel wurde mit DNA auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel
18 umgesetzt, unter Bildung des gewünschten DNA-Cellulofine A-7.
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Referenzbeispiel 23
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Cellulofine
A-3 wurde auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 4 behandelt,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen. Das so erhaltene epoxy-aktivierte Gel wurde
mit Anti-DNA-Kaninchen-Antikörper
auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 18 bei pH 8,5 umgesetzt,
unter Bildung des gewünschten
Anti-DNA-Kaninchen-Antikörper-Cellulofine
A-3.
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Referenzbeispiel 24
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Cellulofine
A-3 wurde auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 4 behandelt,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen. Das so erhaltene epoxyaktivierte
Gel wurde mit einer Acetylcholinrezeptorfraktion auf die gleiche
Weise wie in Referenzbeispiel 18 umgesetzt, unter Bildung des gewünschten Acetylcholinrezeptorfraktion-Cellulofine
A-3.
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Referenzbeispiel 25
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FPG
2000 (Ausschlußgrenze:
1 × 109, Partikelgröße: 80 bis 120 mesh, durchschnittliche
Porengröße: 1950 Å) wurde
in verdünnter
Salpetersäure
für 3 Stunden
erhitzt. Nach Waschen und Trocknen wurde das Gel bei 500°C für 3 Stunden
erhitzt und dann in einer 10%igen γ-Aminopropyltriethoxysilan-Lösung in Toluol für 3 Stunden
erhitzt. Nach Waschen mit Methanol wurde ein γ-Aminopropyltriethoxysilan-aktiviertes
Glas erhalten. 2 g des so erhaltenen Glases wurden zu 10 ml einer
wäßrigen Lösung (pH
4,5) gegeben, die 200 mg Heparin enthielt. Die Reaktionsmischung
wurde in der gleichen Weise wie in Referenzbeispiel 3 behandelt,
um das gewünschte
Heparin-FPG 2000 zu ergeben. Die Menge des immobilisierten Heparins
betrug 1,2 mg/ml des Schüttvolumens.
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Referenzbeispiele 26 bis
28
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Die
Verfahren von Referenzbeispiel 25 wurden wiederholt, ausgenommen
daß FPG
700 (ein kommerziell erhältliches
poröses
Glas, hergestellt von Wako Pure Chemical Industry Ltd., Ausschlußgrenze:
5 × 107, Partikelgröße: 80 bis 120 mesh, durchschnittliche
Porengröße: 70 Å), FPG
1000 (ein kommerziell erhältliches poröses Glas,
hergestellt von Wako Pure Chemical Industry Ltd., Ausschlußgrenze:
1 × 109, Partikelgröße: 80 bis 120 mesh, durchschnittliche
Porengröße: 1091 Å) und Lichrospher
Si4000 (ein kommerziell erhältliches
poröses
Silicagel von Wako Pure Chemical Industry Ltd., Ausschlußgrenze:
1 × 109, Partikelgröße: 10 μm, durchschnittliche Porengröße: 4000 Å) anstelle
von FPG 2000 verwendet wurden. Die Mengen des immobilisierten Heparins
waren 3,2 mg, 2,2 mg bzw. 0,5 mg/ml des Schüttvolumens.
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Referenzbeispiel 29
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Die
Verfahren von Referenzbeispiel 25 wurden wiederholt, ausgenommen
daß Chondroitinpolysulfat anstelle
von Heparin verwendet wurde, um das gewünschte Chondroitinpolysulfat-FPG
2000 zu erhalten. Die Menge des immobilisierten Chondroitinpolysulfats
betrug 1,0 mg/ml des Schüttvolumens.
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Referenzbeispiel 30
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FPG
2000 wurde in der gleichen weise behandelt wie in Referenzbeispiel
25, um die γ-Aminopropylgruppen
in das Gel einzuführen.
Das so erhaltene aktivierte Gel wurde mit dem Natriumsalz des Dextransulfats in
der gleichen Weise wie in Referenzbeispiel 8 umgesetzt, um das gewünschte Natriumsalz
des Dextransulfats-FPG 2000 zu erhalten. Die Menge des immobilisierten
Natriumsalzes des Dextransulfats betrug 0,5 mg/ml des Schüttvolumens.
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Referenzbeispiel 31
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FPG
2000 wurde unter Rückfluß in einer
1%igen Lösung
von γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan
für 3 Stunden
erhitzt und dann mit Methanol gewaschen. Das so erhaltene aktivierte
Gel wurde mit dem Natriumsalz von Dextransulfat in der gleichen
Weise wie in Referenzbeispiel 9 umgesetzt, ausgenommen daß die Reaktion bei
pH 8,5 bis 9 und bei 45°C
durchgeführt
wurde, um das gewünschte
Natriumsalz von Dextransulfat-FPG 2000 zu ergeben.
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Referenzbeispiel 32
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FPG
1000 wurde in der gleichen Weise wie in Referenzbeispiel 25 aktiviert.
Das so erhaltene aktivierte Gel wurde mit Protein A in der gleichen
Weise wie in Referenzbeispiel 13 umgesetzt, um das gewünschte Protein
A-FPG 1000 zu erhalten.
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Referenzbeispiel 33
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FPG
2000 wurde in der gleichen Weise wie in Referenzbeispiel 31 aktiviert.
Das so erhaltene aktivierte Gel wurde mit Polymyxin B in der gleichen
Weise wie in Referenzbeispiel 16 umgesetzt, um das gewünschte Polymyxin
B-FPG 2000 zu erhalten.
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Referenzbeispiel 34
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FPG
1000 wurde in der gleichen Weise wie in Referenzbeispiel 25 aktiviert.
Das so erhaltene aktivierte Gel wurde mit hitzedenaturiertem IgG
in der gleichen Weise wie in Referenzbeispiel 18 umgesetzt, um das
gewünschte
hitzedenaturierte IgG-FPG 1000 zu erhalten.
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Referenzbeispiel 35
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FPG
700 wurde in der gleichen Weise wie in Referenzbeispiel 31 aktiviert.
Das so erhaltene aktivierte Gel wurde mit DNA in der gleichen Weise
wie in Referenzbeispiel 18 umgesetzt, um das DNA-FPG 700 zu erhalten.
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Testbeispiel 1
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Jedes
Adsorptionsmittel, wie oben erhalten, wurde gleichförmig in
eine Säule
gepackt (inneres Volumen: ungefähr
3 ml, innerer Durchmesser: 9 mm, Höhe: 47 mm) und 18 ml Plasma,
enthaltend 200 U Heparin, wurden durch die Säule bei einer Fließgeschwindigkeit
von 0,3 ml/min. durchgeleitet, mit variieren der Herkunft des Plasmas
je nach Art der gewünschten
zu entfernenden Substanz. Das heißt, menschliches Plasma erhalten
aus familiärer
Hypercholesterinämie,
normales menschliches Plasma wie auch normales menschliches Plasma,
enthaltend ungefähr
100 μg/ml
eines kommerziell erhältlichen
Endotoxins, menschliches Plasma stammend von Rheumatismus, menschliches
Plasma stammend von systemischem Lupus erythematodes bzw. menschliches
Plasma stammend von Myasthenia gravis wurden für die Tests zum Entfernen von
VLDL und/oder LDL; IgG, C1g oder Haptoglobin;
Endotoxin; rheumatischer Faktor; Anti-DNA-Antikörper oder DNA und Anti-Acetylcholinrezeptor-Antikörper verwendet.
Der Druckabfall in der Säule
betrug 0,02 bar (15 mmHg) oder weniger während der Testphase und kein
Zusammenklumpen wurde beobachtet. In jedem Adsorptionsmittel wurde
eine zu entfernende Substanz im Plasma, die durch die Säule geleitet
wurde, bestimmt, um eine Entfernungseffizienz zu erhalten. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
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Im
Hinblick auf das Kupplungsverfahren in Tabelle 1 werden das Epichlorhydrin-Verfahren,
das Epichlorhydrin-Ammoniak-Verfahren, NaIO4-Diamin, Bisepoxid-Verfahren
bzw. CNBr-Verfahren auf die gleichen Weisen wie in Referenzbeispielen
3 und 4, 8, 10, 16, 26 und 32 durchgeführt.
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Beispiel 36
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[Wirkung der inneren Viskosität und Schwefelgehalt
des Dextransulfats und/oder des Salzes davon]
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Cellulofine
A-3 wurde auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 4 behandelt,
um Epoxygruppen in das Gel einzuführen. Das so erhaltene epoxyaktivierte
Gel wurde jeweils mit dem Natriumsalz von Dextransulfat mit der
inneren Viskosität
und dem Schwefelgehalt, die in der folgenden Tabelle 2 gezeigt sind
(Präparate-Nrn.
(1) bis (7)), auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 9 umgesetzt.
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Eine
1 ml-Portion des jeweils erhaltenen Adsorptionsmittels wurde in
eine Säule
gepackt und dann wurden 6 ml menschliches Plasma, enthaltend 300
mg/dl Gesamtcholesterin, erhalten von einem Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie, durch
die Säule
geleitet mit einer Fließgeschwindigkeit
von 0,3 ml/min. Die Entfernungseffizienz für LDL wurde aus der Menge des
adsorbierten LDL, gemessen unter Verwendung der Gesamtmenge des
Cholesterins, als Kennzeichen bestimmt. Das heißt, die Menge des Cholesterins
im verwendeten menschlichen Plasma war größtenteils aus LDL erhalten.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
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Referenzbeispiel 37 [Wirkung
der Menge der eingeführten
Epoxygruppen]
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Toyopearl
65 wurde in der gleichen Weise behandelt wie in Referenzbeispiel
3, um Epoxygruppen in das Gel einzuführen, und CSKA-3 (ein kommerziell
erhältliches
poröses
Cellulosegel, hergestellt von Chisso Corporation, Ausschlußgrenze:
5 × 107, Teilchengröße: 45 bis 105 μm) mit einer
einheitlichen Struktur wurde auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel
4 behandelt, um Epoxygruppen in das Gel einzuführen. Die Mengen der eingeführten Epoxygruppen
betrugen 250 μmol
bzw. 30 μmol/ml
des Schüttvolumens.
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Jedes
Gel wurde mit dem Natriumsalz von Dextransulfat (intrinsische Viskosität: 0,027
dl/g; Schwefelgehalt: 17,7 Gew.-%) auf die gleiche Weise wie in
Referenzbeispiel 9 umgesetzt, außer daß die Konzentration des Natriumsalzes
des Dextransulfats bezogen auf das Gewicht des gesamten Reaktionssystems
mit Ausnahme des Trockengewichts des Gels aufgezogen wurde.
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Das
so erhaltene Adsorptionsmittel wurde der Bestimmung der Entfernungseffizienz
für LDL
auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 36 unterzogen. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
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Referenzbeispiel 38
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Eine
1 ml-Portion des Adsorptionsmittels erhalten in Referenzbeispiel
36 Präparat-Nr.
(3) wurde gleichförmig
in eine Säule
mit einem Innenvolumen von 1 ml gepackt, und 6 ml normales menschliches
Plasma, enthaltend LDL und HDL-Cholesterin in dem Verhältnis von
ungefähr
1:1, wurden durch die Säule
geleitet. LDL im durch die Säule
geleiteten Plasma wurde größtenteils
reduziert, während
HDL mäßig reduziert
wurde.
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Referenzbeispiel 39
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Eine
1 ml-Portion des Adsorptionsmittels erhalten in Referenzbeispiel
36 Präparat-Nr.
(3) wurde gleichförmig
in eine Säule
mit einem Innenvolumen von 1 ml gepackt, und 6 ml normales Kaninchenplasma, enthaltend
Lipoproteine von VLDL, LDL und HDL, wurden durch die Säule geleitet.
Das Plasma, das vor bzw. nach der Säulenbehandlung erhalten wurde,
wurde durch Polyacrylamid-Disk-Gel-Elektrophorese bestimmt. Die
Ergebnisse sind in 3 gezeigt. In 3 zeigen
die Kurven A bzw. B die Ergebnisse erhalten vor und nach der Säulenbehandlung.
Die Ordinatenachse bedeutet die Extinktion bei 570 nm und die Abszisse
bedeutet die Wanderungspositionen, bei welchen die Banden von VLDL,
LDL bzw. HDL erscheinen.
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Wie
in 2 gezeigt, werden VLDL und LDL erheblich adsorbiert,
während
HDL nicht adsorbiert wird.
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Referenzbeispiel 40
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Die
Adsorptionsmittel erhalten in den Referenzbeispielen 3, 4, 5 und
6 und 9 bis 12 und Beispielen 1 bis 3 wurden 15 Minuten bei 120°C in einem
Autoklaven sterilisiert. Jede der erhaltenen sterilisierten Adsorptionsmittel
wurde der Bestimmung der Entfernungseffizienz für LDL auf die gleiche Weise
wie in Testbeispiel 1 unterzogen. Als Ergebnis liegen die Entfernungseffizienzen
nicht unter denen, die ohne Sterilisation im Autoklaven erhalten
wurden. Zusätzlich änderte sich
der Druckabfall nicht.