DE3402927C2 - - Google Patents
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zellkulturmikroträger
mit positiv geladenen chemischen Anteilen
aus vernetzten Polysacchariden und damit verknüpften
basischen Gruppen, Verfahren zu ihrer Herstellung und
ihre Verwendung zur Züchtung verankerungsabhängiger
Zellen in einer Mikroträgerkultur.
Die Grundlagen der Halterung und Vermehrung menschlicher
und tierischer Zellen in Zellkulturen wurden während
der letzten 20 Jahre systematisch entwickelt. Zellkulturverfahren
sind heute in vielen Laboratorien zur Produktion
von Impfstoffen, Antikörpern, Interferon, Enzymen
und Hormonen fest etabliert.
Primärzellen und diploide Zellen benötigen für ihr
Wachstum eine feste Unterlage mit einer ausgeprägten
Oberflächenladung. Diese Zellen werden als verankerungsabhängige
Zellen bezeichnet, da sie nur dann
wachsen können, wenn sie sich an einem Träger verankern
können.
Als Träger ist ursprünglich vor allem Glas in Form von
Petrischalen, Kulturflaschen und Rollkulturflaschen
verwendet worden. Auf der Oberfläche der Geräte kann
sich jedoch nur eine Monoschicht der Zellen ausbilden,
so daß die pro Gerät zur Verfügung stehende Oberfläche
begrenzt bleibt. Im industriellen Maßstab müssen daher
für derartige Zellvermehrungskulturen Tausende von
Rollkulturflaschen gespült, sterilisiert, mit Nährmedium
gefüllt, mit Zellen beimpft und nach beendeter
Zellvermehrung abgeerntet werden. Da diese Schritte
alle unter sterilen Bedingungen ausgeführt werden müssen,
sind sie sehr arbeits- und kostenintensiv.
Mit der Einführung der Zellkulturvermehrung auf Mikroträgern
durch A. L. von Wezel, Nature 216 (1967) S. 64
wurde eine verbesserte Technologie entwickelt, welche
die geschilderten Probleme beseitigen könnte. Bei dieser
Technik werden Mikroträger mit einer durchschnittlichen
Größe im Bereich von 100 bis 300 µm in einem
Nährmedium suspendiert. Sofern die Mikroträger eine
geeignete Oberflächenladung aufweisen, heften sich die
verankerungsabhängigen Zellen an die Mikroträger an und
wachsen auf ihnen. 2 bis 5 g/l (Trockengewicht) Mikroträger
stellen im Nährmedium eine Oberfläche von 0,76
bis 1,9 m²/l Kulturvolumen zur Verfügung. Die größten
Rollerflaschen bieten hingegen nur eine Oberfläche von
etwa 0,16 m² an. 1 l Kultur mit Mikroträgern ist daher
in der Lage 5 bis 12 große Rollerflaschen zu ersetzen.
Mikroträger haben jedoch im industriellen Maßstab bisher
noch nicht die Bedeutung erlangt, die man zunächst
erwartet hatte, da bisher entwickelte Mikroträger noch
eine Reihe von Nachteilen aufweisen.
A. L. van Wezel verwendete ursprünglich unlösliche Dextranperlen,
die mit Diethylaminoethylgruppen substituiert
sind und als DEAE-Sephadex® A-50 im Handel erhältlich
sind. Bei ihrer Verwendung zeigten sich jedoch cytotoxische
und Nährmitteladsorptionseffekte, die sich in einem anfänglichen
Absterben von Zellen sowie durch ein unbefriedigendes
Zellenwachstum äußerten; vgl. C.-B. Horng, W. Melimaus
(Biotechnology and Bioengineering Vol. 17 (1975) S.
713-732). Es wurden in der Zwischenzeit verschiedene
Verbesserungen für Mikroträger entwickelt, die in der
Lage sind einige der ursprünglichen Nachteile zu beseitigen.
So wird in der DE-OS 29 09 340 ein Verfahren zur
Vorbehandlung von Mikroträgern für Zellkulturen beschrieben,
bei welchem die Perlen mit fötalem Kälberserum
getränkt und etwa 10 min in dem Serum auf 75 bis
90°C erwärmt werden.
Es werden auch wasserlösliche unvernetzte Amine eingesetzt.
So geht aus der US-PS 39 10 819 hervor, daß Zellkulturen
auf Festkörpern besser haften und danach dort besser
wachsen, wenn man die Festkörper zuvor mit verdünnten Lösungen
einen "Ionens" behandelt, d. h. eines polyquaternären,
polymeren Amins. Bei den Ionen handelt es sich um
wasserlösliche lineare Polymere, die weder verzweigt noch
quervernetzt sind. Diese Ionen sollen in verdünnter wäßriger
Lösung auf die Oberflächen von festen Trägern, wie Glas
oder Kunststoffen, aufgebracht werden. Die Ionene weisen
mindestens drei Kohlenwasserstoffatome zwischen den Stickstoffatomen
auf. Dabei sind Ionene mit einem größeren Abstand
der quaternären Stickstoffatome bevorzugt gegenüber
denen mit einem Abstand von nur drei Kohlenstoffatomen. Die
Ionene sind toxisch, da bereits eine Konzentration von 8 µg
pro ml für die Zellen tödlich ist.
Levine, Wong, Wang und Thilly experimentierten mit Mikroträgern
verschiedener Ladungsdichte und kamen zu dem
Ergebnis, daß DEAE-Dextranperlen mit einem Durchmesser von
150 µm und einer Ladungsdichte von 2 meq/g der trockenen
Dextranmatrix für das Verankern von Zellen und ihr Wachstum
optimal sind; vgl. D. W. Levine et al in Somatic Cell
Genetics Vol. 3 (1977) S. 149-155, US-PS 41 89 534 sowie
DE-OS 27 49 989.
Derartige Mikroträger, die anstelle von 5,4 meq/g nur noch
1,5 bis 2,0 meq/g Ladungsdichte aufweisen, wurden inzwischen
unter der Bezeichnung "Cytodex-1®" sowie
"Superbeads®" in den Handel gebracht. Einen Überblick über
die Eigenschaften und Anwendungsmöglichkeiten von diesen
Produkten sowie eine Einführung in die Entwicklung der
Mikroträgertechnologie gibt die Monographie "Microcarrier
cell culture, Principles+methods" Auflage 1981, der Firma
Pharmacia AB, Uppsala, Schweden.
Leider hat sich gezeigt, daß auch diese verbesserten Mikroträger
mit einer deutlich verminderten Ladungskapazität in
der Praxis vor allem bei empfindlichen Zellen noch immer
cytotoxische Effekte aufweisen.
Die EP-OS 66 726 geht davon aus, daß diese cytotoxischen
Eigenschaften der Mikroträger auf DEAE-Dextranbasis in der
chemischen Struktur der Mikroträger selbst liegen sollen.
So ist es bekannt, daß DEAE-Mikroträger neben dem DEAE-Substituenten
mit tertiär gebundenem Stickstoff auch
Gruppen mit quarternär gebundenem Stickstoff enthalten, die
sich bei der Synthese der Mikroträger durch eine nie ganz
zu vermeidende erneute Umsetzung mit weiteren Chlorethyldiethyl-amin
bilden. Von diesen sogenannten "Tandem"-Gruppen
wird vermutet, daß sie alkylierend wirken und
toxisch sind; vgl. L. Ahrgren et al in "Polymeric Amines
and Ammonium Salts" E. J. Goethals, Pergamin Press S. 293-294.
Auch in der Firmenschrift "Microcarrier cell cultur",
Pharmacia AB, S. 27 wird darauf hingewiesen, daß mit den
bekannten Herstellungsverfahren für DEAE-Dextran-Mikroträger
bis 35% Tandemgruppen gebildet werden. In dem Produkt
Cytodex-1® sei der Tandemgruppengehalt auf etwa 15%
vermindert.
Um diesen vermuteten cytotoxischen Effekt ganz auszuschließen,
werden in der EP-OS 66 726 Mikroträger geschrieben,
die nur quarternäre Aminogruppen enthalten. Derartige
Mikroträger sind unter der Bezeichnung Cytodex-2® in den
Handel gebracht worden. Sie weisen eine Ladungskapazität
von 0,5 bis 0,8 meq/g auf.
Trotz dieser noch weiter verminderten Ladungskapazität
haben auch diese Mikroträger in der Praxis noch nachteilige
Effekte gezeigt, die auf ein Absorbieren von Kulturmediumbestandteilen
an den Träger zurückgeführt werden. In der
DE-OS 30 33 885 werden daher ladungsfreie Mikroträger beschrieben,
die mit Polypeptiden wie Kollagen oder Gelatine
beschichtet sind. Auf diesen Mikroträgern können sich jedoch
nur Zellen verankern, die auf ihrer Oberfläche
Strukturelemente enthalten, die eine ausreichende Bindungsaffinität
zur Polypeptidschicht auf dem Mikroträger aufweisen.
Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, Zellkulturmikroträger
mit positiv geladenen chemischen Anteilen aus
vernetzten Polysacchariden und damit verknüpften basischen
Gruppen zu entwickeln, die alle zuvor genannten Nachteile
nicht aufweisen. Insbesondere hat sich die Erfindung die
Aufgabe gestellt, Mikroträger zu entwickeln, die auch im
industriellen Maßstab auch zur Züchtung empfindlicher
Zellen genutzt werden können und somit praktisch keine
Toxizität aufweisen.
Diese Aufgabe kann überraschenderweise dadurch gelöst werden,
daß die positiv geladenen basischen Gruppen mit einem
pKs-Wert von 5 bis 8 die allgemeine Formel (I)
aufweisen, in welcher Z eine Kohlenwasserstoffkette aus 2
bis 4 Kohlenstoffatomen ist, R₁ und R₂ gleich oder verschieden
sind und Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-,
Butyl-, Phenyl-, Tolyl- oder Benzylgruppen darstellen
und n 1, 2 oder 3 ist.
Zellkulturmikroträger mit derartigen positiv geladenen
basischen Gruppen haben sich überraschenderweise als nicht
toxisch erwiesen, obwohl die Fachwelt davon ausging, daß
gerade diese Gruppen besonders toxisch seien und deshalb
nach Möglichkeit nicht oder nur in geringer Zahl an den
Zellkulturmikroträgern vorhanden sein sollten. Überraschenderweise
dürfen diese positiv geladenen basischen Gruppen
auch in hoher Zahl vorhanden sein, so daß es nicht nötig
ist, die Anzahl der 5 meq/g trockenen, vernetzten Polysacchariden
zu beschränken. Ein Grund für diese überraschend
guten Eigenschaften der erfindungsgemäßen Zellkulturmikroträger
scheint darin zu liegen, daß es nicht auf
die Ladungsdichte ankommt, sondern auf den pKs-Wert der
positiv geladenen basischen Gruppen. Während die basischen
Gruppen von DEAE-Sephadex® bei 9,2 liegen, liegen die pKs-Werte
der erfindungsgemäßen Zellkulturmikroträger im Bereich
von 5 bis 8. Bei einem erfindungsgemäß bevorzugten
und leicht herzustellendem Zellkulturmikroträger, bei welchem
Z eine Ethylengruppe und R₁ und R₂ eine Ethylgruppe
darstellen und n gleich 1 ist, beträgt der pKs-Wert 6,2.
Ein derartiger Zellkulturmikroträger ist somit praktisch
nur mit "Tandem"-Gruppen substituiert.
Außer dem erwähnten einfachsten Fall von "Tandem"-Gruppen,
können erfindungsgemäß auch solche Gruppen zur Anwendung
kommen, in denen Z 3 oder 4 Kohlenstoffatome aufweist und
in denen R₁ und R₂ neben der Ethylgruppe auch Methylgruppen,
Propylgruppen, Isopropylgruppen und Butylgruppen
darstellen. Da die pKs-Werte immer noch in dem Bereich von
etwa 5 bis 8 liegen, können R₁ und R₂ auch Phenyl- und Toluolgruppen
sowie insbesondere Benzylgruppen sein. Da die
pKs-Werte in dem Bereich von 5 bis 8 liegen, kann n auch
größer als 1 sein, so daß auch basische Gruppen aus 3 oder
4 Aminogruppen zur Anwendung kommen können.
Als negative Gegenionen zu den positiv geladenen Stickstoffatomen
können prinzipiell alle physiologisch verträglichen
anorganischen oder organischen Anionen verwendet
werden. Geeignet sind insbesondere Chlorid-, Phosphat-,
Sulfat- und Acetat-Ionen.
Die pKs-Werte der basischen Substituenten der vernetzten
Polysaccharide können in einfacher Weise durch Titration
ermittelt werden. Die Titrationskurven weisen am pKs-Wert
den bekannten Wendepunkt auf.
Die Erfindung betrifft weiterhin das Verfahren zur Herstellung
der neuen Zellkulturmikroträger. Die Herstellung
erfolgt durch an sich bekannte Umsetzung der vernetzten
Polysaccharide mit Substanzen der allgemeinen Formel II
in der Z eine Kohlenwasserstoffkette aus 2 bis 4 Kohlenstoffatomen
ist, R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und
Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Phenyl-,
Tolyl- oder Benzylgruppen darstellen und Y eine reaktive
Gruppe ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in
Gegenwart von starken Basen in mindenstens zwei Stufen und
mindestens mit 2fach molarem Überschuß der Substanz II
erfolgt. Als reaktive Gruppen kommen insbesondere Chlorid,
Bromid aber auch Sulfonsäuregruppen etc. in Frage, die in
der Lage sind eine O-Alkylierung des vernetzten Polysaccharids
durchzuführen.
Die Umsetzung erfolgt erfindungsgemäß in Gegenwart von
starken Basen in mindestens 2 Stufen und mindestens mit
2fach molarem Überschuß der Substanz II. Vorzugsweise wird
dabei die wäßrige alkalische Suspension von vernetztem
Polysaccharid in warmes Toluol gegossen und unter Rühren
mit der Substanz II umgesetzt. Anschließend werden vorzugsweise
die positiv geladenen basischen Gruppen durch physiologisch
verträgliche Anionen neutralisiert.
Als vernetzte Polysaccharide kommen vorzugsweise die bekannten
vernetzten Polydextrane in Frage. Prinzipiell
können aber auch andere quellbare und vernetzte Polysaccharide
als Träger der positiven basischen Gruppen eingesetzt
werden.
In den nachfolgenden Beispielen sind die neuen Zellkulturmikroträger,
Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
näher erläutert.
13 g trockene, vernetzte Dextranperlen (Polydex® PL-50 oder
Sephadex® G 50) mit einer Wasseraufnahme von etwa 5 g/g
und einer Korngröße von 80 bis 100 µm werden in destilliertem
Wasser über Nacht gequollen. Nach Absaugen des überschüssigen
Wassers werden die gequollenen Perlen mit 5,2 g
einer 43gewichtsprozentigen Natronlauge vermischt. Die so
hergestellte alkalische Suspension von Dextrankügelchen
wird in 120 g auf 50°C vorgewärmtes Toluol gegossen. Unter
kräftigem Rühren werden zu dieser Reaktionsmischung 8 ml
Chlorethyl-diethyl-amin zugegeben. Nach 3 Stunden Reaktionszeit
bei 50°C werden weitere 10 ml Chlorethyldiethylamin
zugetropft.
Nach weiteren 3 Stunden Rühren bei 50°C ist die Reaktion
beendet. Die umgesetzten Dextranperlen werden durch Filtration
aus der Reaktionsmischung abgetrennt. Durch mehrmaliges
Waschen mit Alkohol und destilliertem Wasser sowie
durch Einstellen des pH-Wertes mit verdünnter Salzsäure auf
5,0 werden die Mikroträger gereinigt. Die Entquellung erfolgt
abschließend durch wiederholtes Behandeln der Perlen
mit Waschlösungen steigender Alkoholkonzentration. Die entquollenen
Perlen werden über Nacht bei 80°C getrocknet.
Nach dieser Methode hergestellte Mikroträger enthalten ungefähr
4,0% Stickstoff und eine Ladungskapazität von 2,86 meq/g
Mikroträger bzw. 4,66 meq/g des trockenen, nicht behandelten
Dextrans.
Die Austauscherkapazität der so hergestellten Mikroträger
beträgt 2,4 meq/g Mikroträger bzw. 3,91 meq/g trockenen,
nicht behandelten vernetzten Dextrans.
Zur Bestimmung der Austauscherkapazität werden 1,0 g getrocknetem
Mikroträger in destilliertem Wasser gequollen,
in eine kleine Säule überführt und mit 0,1 n Salzsäure
mehrfach gewaschen. Das Entfernen der nicht gebundenen
Chloridionen erfolgt durch Spülen der Perlen mit 10-4 n Salzsäure.
Durch Zugabe einer ausreichenden Menge von 10%iger
Natriumsulfatlösung werden die gebundenen Chloridionen verdrängt
und durch Titration des Eluates mit 0,1 n Silbernitratlösung
und Kaliumchromat als Indikator bestimmt.
Als Resultat erhält man dann meq Cl- pro Gramm Mikroträger.
Die Umrechnung auf meq Cl- pro Gramm nicht behandelte
Dextranperlen erfolgt nach folgender Formel:
Die Bestimmung der Struktur der so gebundenen Stickstoffverbindungen
erfolgt durch Titration von 1 g der trockenen
Mikroträger in 20 ml einer 1 m Kaliumchloridlösung nach dem
Einstellen des Ausgangs-pH-Wertes auf 12 mit 1,0 Salzsäure.
Die Titrationskurve zeigt durch Abwesenheit einer Stufe im
pH-Bereich von 10 bis 8,5, daß keine tertiären Aminogruppen
mehr vorhanden sind. Der pKs-Wert der Aminoverbindung liegt
zwischen 5 bis 7.
Durch Variation der Menge an eingesetzter Natronlauge und
Chlorethyl-diethyl-amin werden die Mikroträger Nr. 434,
416, 432 und 435 hergestellt.
5 mg/ml Mikroträger, hergestellt gemäß Beispiel 1 bzw.
2 werden in bakteriologischen Petrischalen, 0,6 cm,
1 Stunde bei 37°C mit 5 ml Medium MEM (Minimum Essential
Medium)+8% FBS (Fetal bovine serum) inkubiert.
Nach Zugabe von frischen, in Trypsin/Versen abgelösten
GMK-Zellen, so daß sich eine Konzentration von
2,6×10⁵ Zellen/ml Medium einstellte, erfolgt alle
15 Minuten eine Probenentnahme. Durch Auszählen der
nichtgebundenen Zellen kann die Anwachsrate bestimmt
werden.
Im Vergleich zu dem erfindungsgemäßen Zellträgermaterial
wurde gleichzeitig die Anwachskinetik auch mit den auf dem
Markt käuflich zu erwerbenden Mikrocarriern auf Dextranbasis
(Cytodex®) mit einer Ladungsdichte von 2,0 meq/g
neutrale Dextranmatrix und mit dem Anionenaustauscher
Sephadex A-50® durchgeführt.
Die Resultate sind in Fig. 1 dargestellt und zeigen, daß
die neuen Mikroträger auch bei hoher Ladungskapazität nicht
toxisch sind, während sich mit Sephadex A-50® die bekannten
toxischen Effekte nach etwa 75 Minuten zeigen.
Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen am Beispiel von
GMK-Zellen auf den Mikroträgern 416 und 421 mit unterschiedlicher
Ladungsdichte.
Je 0,3 g der trockenen Mikroträger werden in 20 ml PBS gequollen
und anschließend bei 115°C und 103,425 bar (15 psi) 15 Minuten sterilisiert.
Das PBS wird abgegossen und ersetzt durch warmes Kulturmedium.
Als Kulturmedium dient z. B. MEM (Minimum Essential
Medium) mit einem Zusatz von 8% fetal bovine serum (fötalem
Kälberserum oder Kälberfötusserum). Die Perlsuspension
wurde in einem Kulturgefäß, vorzugsweise eine Spezial-Spinnerflasche,
überführt. Das Volumen wurde mit dem
Kulturmedium+8% FBS auf 100 ml aufgefüllt, begast und
temperiert. Das Beimpfen erfolgte mit einem Zellinoculum
von 1,3×10⁷ GMK-Zellen (=Green Monkey Kidney=Grüne
Affennierenzellen), die aus Passage Nr. 127 des Institutes
für Virologie der Universität Köln stammten und 5 Tage lang
in Plastikflaschen mit Kulturmedium vorgezogen wurden.
Nach einer anfänglichen statischen Verankerungsphase wurde
eine Rührgeschwindigkeit von 0,5 s-1 eingestellt. Mediumwechsel
erfolgte alle 48 Stunden. Das Zellwachstum wurde
über einen Zeitraum von 170 Stunden hinweg überwacht, indem
man die Zellen durch Trypsinieren von den Carriern ablöste
und nach einer modifizierten Sanfortet al-Methode (J. Natl.
Cancer Inst. II, 737 (1951)) zählte. Als Vergleich wurde
gleichzeitig das Wachstum auf den bekannten Cytodex®-1-Mikroträgern
bestimmt. Das Ergebnis geht aus Fig. 2 hervor
und zeigt, daß das Wachstum auf den neuen Mikroträgern auch
bei hoher Ladungskapazität gut ist.
10 g trockene, mittels Epichlorhydrin vernetzte Stärkeperlen (eigene
Herstellung) mit einer Wasseraufnahmekapazität von 8 g/g und einer
Korngröße von 80 bis 100 µm wurden in destilliertem Wasser über
Nacht gequollen. Nach Absaugen des überschüssigen Wassers wurden die
gequollenen Stärkeperlen mit 1,7 g einer 40gewichtsprozentigen
Natronlauge vermischt. Die so hergestellte alkalische Suspension
von Stärkekügelchen wurde in 125 g auf 50°C vorgewärmtes Toluol
gegeben. Unter kräftigem Rühren wurden zu dieser Reaktionsmischung
zunächst 2,5 ml und 3 Stunden später weitere 3,2 ml Chlorethyldiethylamin
zugetropft. Nach weiteren 3 Std. wurde die Reaktion beendet,
indem die umgesetzten Stärkeperlen aus dem Toluol abgetrennt,
mit Wasser gewaschen und anschließend bei 105°C getrocknet wurden.
Die hergestellten Stärke-Mikroträger enthielten 2,7% Stickstoff
und eine Ladungskapazität von 1,93 meq/g Mikroträger bzw. 3,15 meq/g
trockene unbehandelte Stärkeperlen.
Je 50 mg der oben hergestellten Stärkemikroträger wurden in je 50 ml PBS (phosphatgepufferte
Kochsalzlösung) 15 min lang bei 1,1 bar autoklaviert. Der
Überstand wurde verworfen und die Mikroträger mit je 10 ml MEM
(Minimum Essential Medium)+8% FBS (Fetal bovine serum) 1 Stunde
bei 37°C inkubiert. Der Überstand wurde erneut verworfen. Die so
vorbehandelten Mikroträger wurden mit je 10 ml Medium, die je 6 · 10⁵
Vero-Zellen enthielten, in bakteriologische Petrischalen mit einem
Durchmesser von 9 cm überführt. In Abständen von jeweils 15 Minuten
wurden Proben entnommen und durch Auszählen der nicht von den Mikroträgern
gebundenen Zellen die Anwachsrate bestimmt.
Das Ergebnis ist in der nachfolgenden Tabelle und in der Fig. 1
dargestellt und zeigt, daß Stärkemikroträger mit dimeren DEAE-Substituenten
ebenso wie die analogen Dextranmiktroträger keinen
toxischen Effekt für das Wachstum von Zellen zeigen.
Claims (4)
1. Zellkulturmikroträger mit positiv geladenen chemischen
Anteilen aus vernetzten Polysacchariden und damit verknüpften
basischen Gruppen, dadurch gekennzeichnet, daß
die positiv geladenen basischen Gruppen mit einem pKs-Wert
von 5 bis 8 die allgemeine Formel (I)
aufweisen, in welcher Z eine Kohlenwasserstoffkette aus
2 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, R₁ und R₂ gleich oder
verschieden sind und Methyl-, Ethyl-, Proply-, Isopropyl-,
Butyl-, Phenyl-, Tolyl- oder Benzylgruppen darstellen
und n 1, 2 oder 3 ist.
2. Zellkulturmikroträger gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die positiv geladenen basischen Gruppen
durch physiologisch verträgliche Anionen neutralisiert
sind.
3. Verfahren zur Herstellung von Zellkulturmikroträgern
mit positiv geladenen chemischen Anteilen aus vernetzten
Polysacchariden und damit verknüpften basischen
Gruppen durch Umsetzung des vernetzten Polysaccharids
mit Substanzen der allgemeinen Formel (II)
in der Z eine Kohlenwasserstoffkette aus 2 bis 4
Kohlenstoffatomen ist, R₁ und R₂ gleich oder verschieden
sind und Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-,
Butyl-, Phenyl-, Tolyl- oder Benzylgruppen darstellen
und Y eine reaktive Gruppe ist, dadurch gekennzeichnet,
daß die Umsetzung in Gegenwart von starken Basen in
mindestens zwei Stufen und mindestens mit 2fach
molarem Überschuß der Substanz II erfolgt.
4. Verwendung der Zellkulturmikroträger gemäß einem der
Ansprüche 1 oder 2 zur Züchtung von verankerungsabhängigen
Zellen in einer Mikroträgerkultur.
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