DE3422494A1 - Verfahren und vorrichtung zur spezifischen adsorption von heparin - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur spezifischen adsorption von heparin

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Gerhard Dipl.-Chem. Dr. 3501 Fuldabrück Roßkopf
Dietrich Prof. Dr. 3400 Göttingen Seidel
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Description

Das Glykosaminoglykan Heparin wird bei der postoperativen subkutanen Thromboembolieprophylaxe in geringen Dosierungen von 3 χ 5000 IE täglich, dagegen bei Behandlungen mit extrakorporalen Kreisläufen in vergleichsweise hohen Dosierungen zur Verhinderung der Blutgerinnung eingesetzt. Derartige Behandlungen sind z.B. die Blutoxygenation, Operationen unter Einsatz der Herz-Lungen-Maschine, Hämodialyse, Hämofiltration, Hämoperfusion und Plasmapherese. Auch im Rahmen der Heparintherapie nach thromboembolischen Erkrankungen, der Venenthrombose oder Lungenembolie, werden Heparinsalze intravenös, mit 30 000 bis 40 000 IE täglich verabreicht.
Nach Abschluß der extrakorporalen Behandlungen oder bei Blutungskomplikationen wird es oft notwendig, das noch in relativ hohen Konzentrationen im Kreislauf zirkulierende Heparin möglichst schnell zu neutralisieren, üblicherweise wird zur Heparin-Inaktivierung Protaminsulfat oder Protaminchlorid eingesetzt. Ein Nachteil dieser Behandlung besteht nach D. Benayahn et al, Thrombos. Res. 32, 109 (1983), darin, daß ein Rebound-Phänomen
Telefon: (0221) 131041 · Telex: 8882307 dopa d - Telegramm: Dompatent Köln
beobachtet wird, das - insbesondere bei hohen Heparindosen - einige Stunden nach der Neutralisation zur plötzlichen Wiederfreisetzung des Heparins führen kann.
in der DE-OS 31 35 814 wird ein extrakorporales Präzipitationsverfahren zur spezifischen Abtrennung von Low-Density-Lipoproteinen (LDL) beschrieben, in dem bei saurem pH-Wert (pH 5,05 bis 5,25) Heparin in sehr hoher Dosierung dem Plasma zugesetzt wird, um einen filtrierbaren LDL-Heparinkomplex auszufällen. Nach der Filtration des heparinisierten Plasmas über ein Separationsfilter, wird der pH-Wert des von LDL befreiten Plasmas nach Passage eines Hämodialysators wieder in den physiologischen Bereich gebracht und das Plasma den Patienten wieder zugeführt.
bei dieser extrakorporalen Behandlung werden zur quantitativen Ausfällung des LDL-Heparinkomplexes insgesamt etwa 100 000 Heparineinheiten benötigt. Die Heparinkonzentration in dem den Patienten wieder zugeführten Plasma kann dabei bei Werten von über 20 IE/ml liegen. Die Plasmaspiegel der Patienten erreichen dann Werte von 4-12 ΙΕ/ml Plasma, die eine erhöhte Blutungsgefahr mit sich bringen. Es besteht deshalb die Forderung, ein Verfahren zu finden, mit dem Heparin aus Plasma weitgehend und schnell abgetrennt werden kann. Die Abtrennung anderer Plasmabestandteile, wie z.B. Proteine, aus dem extrakorporalen Kreislauf ist bei
30 diesem Schritt jedoch unbedingt zu vermeiden.
Da eine Inaktivierung mit Protaminchlorid oder Protaminsulfat aus den erwähnten Gründen ausscheidet, stellte sich die Aufgabe, ein Verfahren zur Entfernung von Heparin und ebenfalls als Präzipitationsmittel in
Verfahren zur LDL-Fällung eingesetzten Heparin-Fraktionen und Heparin-Fragmenten zur Verfügung zu stellen, das eine effiziente Separation von Heparin und seinen Derivaten sowie Heparin-Fraktionen, Heparinoiden und Heparin-Fragmenten ermöglicht, ohne daß später Rebound-Phänomene beobachtet werden und/ oder eine Fremdadsorption von Proteinen zu befürchten ist.
Langer et al., (J. Biol. Chem. 257, 7310 (1982); Science 217, 261 (1982)) beschreiben ein Verfahren zur Entfernung von Heparin, in dem Plasma über einen Austauscher geleitet wird, an dessen Oberfläche Heparinase aus Flavobacterium heparinum immobilisiert ist. Das Heparin wird dabei enzymatisch in Bruchstücke gespalten, deren antikoagulatorische Wirkung im Vergleich zu Heparin sehr gering ist. Dieses Verfahren setzt allerdings bei einer breiten Anwendung voraus, daß das relativ instabile Enzym in großen Mengen und in hoher Reinheit und Enzymaktivität zu gewinnen ist und in eine stabile, sterile und lagerfähige Form ge-
20 bracht werden kann.
Dies erscheint angesichts der zu lösenden prinzipiellen Probleme der Enzymstabilisierung und Sterilisation nicht möglich. Auch eine direkte Injektion des gereinigten Enzyms zur Inaktivierung des Heparins scheidet derzeit aus den von M.D. Klein in J. Lab. Clin. Med. 102, 828 (1983) beschriebenen toxikologischen Gründen aus.
Die Bindung von Heparin an Ionenaustauscher ist seit längerer Zeit bekannt. So werden Ionenaustauscher zur Isolierung von Heparin aus wäßrigen Lösungen im Zuge der Heparin-Gewinnung aus biologischem Material sowie
zur Reinigung und Herstellung von Heparinfragmenten
35
und Heparinfraktionen seit vielen Jahren eingesetzt und beschrieben in:
J.P. Green, Nature JUJ6, 472 (1960); R.H. Yue et al, Thrombos. Haemostas. 42, 1452 ff. (1979); M.W.
Piepkorn et al, Thromb. Res. Γ3, 1077-1087 (1978) und
DE-AS 26 52 272; DE-OS 31 15 245.
Daneben sind in den zitierten Publikationen auch Bemühungen beschrieben, Heparin im physiologischen pH-Wert-Bereich spezifisch aus Blut oder Blutplasma zu adsorbieren. Aufgrund der basischen Eigenschaften der eingesetzten Ionenaustauscher-Materialien ist jedoch im physiologischen pH-Wert-Bereich stets auch mit unerwünschter, Unspezifischer Bindung von Plasma-Proteinen zu rechnen. Es zeigte sich außerdem (E. Schmitt et al, Biomaterials £, 309-314 (1983) und P. Ferruti et al, Biomaterials 4_, 218-221 (1983) ) , daß nach der Bindung von Heparin an basische Anionenaustauscher-Materialien, wie ζ^B. an Membranen aus Ν,Ν-Diethylaminoethylcellülose (DEAE) und Poly-(amidoamin)-Harzen sogar Desorptionsphänomene von Heparin im physiologischen pH-Bereich zu beobachten sind.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß sich Heparin aus Blutplasma bei pH-Werten zwischen 4 und 5,5 in einem extrakorporalen Kreislauf durch Adsorption entfernen läßt, ohne daß eine nennenswerte Fremdadsorption von Plasmaproteinen beobachtet wird, wenn man zur Adsorption basische Anionenaustauscher-Materialien geeigneter Zusammensetzung verwendet.
Wie sich weiterhin zeigte, können anstelle des He^arins auch polyanionische Heparin-Derivate, Heparin-Fragmente, Heparin-Fraktionen und wasserlösliche, polymere, polyanionische Heparinoide, sulfatierte Glykosaminglykane in gleicher Weise im pH-Bereich zwischen 4,0 und 5,5 aus Plasma entfernt werden.
Die Erfindung betrifft daher Verfahren zur spezifischen Adsorption von Heparin, Heparinfraktionen, Heparinderivaten, Heparinfragmenten und/oder Heparinoiden aus Vollblut, Plasma und/oder Vollblut oder Plasma enthaltenden Lösungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man ausgehend von Vollblut aus einem extrakorporalen Kreislauf oder aus Blutkonserven,
a) gegebenenfalls korpuskulare Blutbestandteile und Blutplasma nach an sich bekannten Methoden voneinander trennt, darauf folgend
b) Plasma oder Plasma enthaltende Lösungen, die Heparin, Heparinfraktionen, Heparinderivate, Heparin-Fragmente oder Heparinoide in Mengen von 1000 bis 200 000 IE/1 oder im Falle der Heparinoide, Heparinfraktionen, Heparin-Fragmente und Heparinderivate bis zu 2 g/l enthalten, durch Zugabe eines Puffers auf einen pH-Wert zwischen 4,0 und 5,5 einstellt,
c) die gepufferten Flüssigkeiten mit einer Durchflussgeschwindigkeit zwischen 60 ml/h und 25 l/h durch eine sterilisierte, zylinderförmige, einen Deckel und einen Boden mit zentralen Zulaufstutzen und Ablaufstutzen und kreisförmige Doppelsiebe von 50 bis 100 μΐη Maschenweite in Deckel und Boden aufweisende, ein Heparin, Heparinderivate, Heparinfraktionen, Heparin-Fragmente oder Heparinoide adsorbierendes, wasserfeuchtes Medium enthaltende Adsorberkapsel führt, wobei eine Heparinadsorption -von 80 bis 100 % des ursprünglich in den Flüssigkeiten vorhandenen Heparins bewirkt wird,
d) die von Heparin und/oder Heparinoiden befreiten Flüssigkeiten einer Bicarbonatdialyse zur Anhebung des pH-Wertes auf physiologische Bedingungen unterwirft ,
e) gegebenenfalls entheparinisiertes Plasma und korpuskulare Blutbestandteile wieder vereinigt und
" J& —
f) die von Heparin, Heparinfraktionen, Heparinderivaten, Heparinfragmenten oder Heparinoiden befreiten Flüssigkeiten re-infundiert oder einer üblichen
Blutkonserve wieder zuführt,
sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Im Laufe der Prüfung zahlreicher handelsüblicher Materialien auf ihre Eignung als Adsorbermaterxalien für Heparin zeigte sich, daß der Erfolg der Heparinadsorption und die Unterdrückung der Fremdadsorption von Proteinen davon abhängig ist, ob es die Struktur des Anionenaustauschers erlaubt, daß die Heparinmoleküle bei vorgegebenem pH-Wert von 4,0 bis 5,5 auch in die Poren des Austauschermaterials eindringen können. Besonders geeignet für die Adsorption sind makroporöse, hydrophile Anionenaustauscher hoher Porosität auf Acrylatbasis, die bevorzugt aus Gründen der chemischen Stabilität tertiäre Aminofunktionen als Ankergruppen -aufweisen.
Die physikalische Form der Austauscher ist dabei weitgehend veränderbar: die Austauschergruppen können auf Membranen, Platten, Gelen sowie körnigen Materialien aufgebracht sein.
Die Vorrichtung zur spezifischen Adsorption von Heparin und seinen Derivaten besteht erfindungsgemäß aus einer sterilisierten, zylinderförmigen Adsorberkapsel, deren Deckel und Boden zentrale Zulaufstutzen und Ablaufstutzen aufweisen und die gegebenenfalls kreisförmige Doppelsiebe von 50 bis 100 (im Maschenweite enthalten. Die Adsorberkapseln weisen eine Länge von 4 bis 30 cm und einen Durchmesser von 2 bis 10 cm auf. Sie sind über ihre Zulaufstutzen und Ablaufstutzen und
auswechselbare Zuleitungen und Ableitungen aus an sich bekannten Materialien mit Pumpen und Kontrolleinrichtungen verbunden, die den Zulauf des heparinisierten Vollblutes oder Plasmas und den Ablauf der gereinigten Flüssigkeiten kontrolliert ermöglichen.
Die sterilisierten, zylinderförmigen Adsorberkapseln bestehen aus an sich bekannten, physiologisch verträglichen Materialien. Sie sind mit einem Heparin, Heparinfraktionen, Heparinderivate und/oder Heparinoide adsorbierenden, als Anionenaustauscher wirkenden Medium gefüllt. Die Heparin adsorbierenden Materialien einer Adsorberkapsel weisen unter Anwendungsbedingungen mindestens eine Heparinkapazität von 5000 bis 300 000 IE Heparin, bevorzugt von 10 000 bis 100 000 IE Heparin, oder eine entsprechende Kapazität für Heparinoide, Heparinfraktionen, Heparinfragmente oder Heparinderivate bis zu 2 g auf. Dies bedeutet, daß die Kinetik der Adsorption nach Aufnahme der angegebenen Heparin-Menge so verlangsamt ist, daß bei Einhaltung von Durchflußgeschwindigkeiten von 60 ml . h~ bis 25 1 . h keine Adsorption von Heparin und seinen Derivaten mehr erfolgt.
Bei dem genannten Anionenaustauscher kann es sich um Anionenaustauscherharze in Kugelform handeln, wobei die Harzkugeln Korngrößen von 100 bis 2000 um, bevorzugt zwischen 300 und 1000 um aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann die Adsorberkapsel auch ein Heparin, Heparinfraktionen, Heparinfragmente, Heparinderivate und/oder Heparinoide adsorbierendes Gel enthalten. Das Auslaufen des Gels aus der Adsorberkapsel wird durch an sich übliche Vorrichtungen verhindert.
43
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthält die Adsorberkapsel eine Adsorptions-Filterpatrone, die aus einem massiven oder hohlen Kern und einem Stützgitter besteht, auf das eine als aktives Adsorbens wirkende Fasermatte auf Cellulosebasis gewickelt ist, die Anionenaustauscher-Eigenschaften aufweist.
Die das adsorbierende Anionenaustauscher-Material enthaltenden Adsorberkapseln sind nach an sich bekannten Methoden sterilisiert. Es können beispielsweise durch Gammabestrahlung, durch Behandlung mit Ethylenoxid oder anderem chemischen Sterilisationsmitteln, wie Natriumhypochlorit - oder H_O? - Lösung, oder durch Hitzebehandlung sterilisierte Adsorberkapseln verwen-
15 det werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur spezifischen Adsorption von Heparin, Heparinfraktiönen, Heparinderivaten, Heparin f ragmen tön tind/oder Heparinoiden wird die heparinisierte Lösung, heparinisiertes Vollblut oder heparinisiertes Blutplasma über ein Membranfilter geführt, um korpuskulare Bestandteile nach an sich bekannten Methoden abzutrennen. Die resultierenden Lösungen, die das gesamte abzutrennende Heparin enthalten, werden anschließend durch Zugabe eines Puffers auf einen pH-Wert zwischen 4,0 und 5,5, bevorzugt auf einen pH-Wert von 4,7 bis 5,2, eingestellt. Als Puffer wird normalerweise Natriumacetat verwendet, da es in diesem pH-Bereich eine optimale Pufferung bewirkt. Es sind jedoch auch andere physiologisch verträgliche, in diesem pH-Bereich wirksame Puffer-Systeme verwendbar.
Die gepufferten heparinhaltigen Flüssigkeiten werden mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 60 ml . h~ bis
25 1 . h 1, bevorzugt 1,5 bis 12 1 . h""1, mit Hilfe einer Pumpe über geeignete Zuleitungen durch die oben beschriebene sterilisierte, zylinderförmige Adsorberkapsel geführt, die das Heparin oder Heparin-Derivate adsorbierende Medium enthält. Dieses Medium kann, wie oben beschrieben, ein Harz, ein Gel oder eine das Adsorbens tragende Fasermatte sowie auch jedes andere Anionenaustauschergruppen tragende System sein, das für einen ausreichenden Kontakt zwischen dem Adsorber und den zu adsorbierenden Verbindungen führt.
10
Die die Adsorberkapsel verlassenden, von Heparin und/ oder Heparinoiden befreiten Flüssigkeiten werden anschließend einer Dialyse, bevorzugt einer Bicarbonat-Dialyse zur Anhebung des pH-Wertes auf physiologische Bedingungen, unterworfen, wonach gegebenenfalls das entheparinisierte Plasma und die korpuskularen Blutbestandteile wieder vereinigt werden und entweder einem Patienten re-infundiert oder einer üblichen Blutkonserve wieder zugeführt werden.
20
Die jeweilige Heparinkonzentration wurde vor Beginn des Adsorptionsvorganges sowie in dessen Verlauf und nach dessen Abschluß bestimmt. Parallel wurde ebenfalls die Konzentration an Proteinen nach der Biuret-Methode vor und nach dem Adsorptionsvorgang bestimmt. Wie sich dabei zeigt und durch die Beispiele im einzelnen belegt wird, wurden Heparin, seine Fraktionen,-Spaltprodukte und Derivate zu 80 bis 100 % aus dem Blut bzw. Blutplasma abgetrennt, während die Proteinkonzentration vor und nach der Adsorption weitgehend gleich war. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist also eine Adsorption von Heparin und seinen Derivaten ohne Fremdadsorption körpereigener Proteine möglich.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, daß der Einsatz basischer Ionenaustauscher es
■:-""" J V- **■ " 342249A
auch erlaubt, anstelle von Heparin, dessen Fraktionen, Spaltprodukten oder Derivaten auch andere polyanionische, eine mit Heparin vergleichbare Struktur aufweisende, Sulfatestergrüppen tragende Glykosaminoglykane, deren Derivate, Fraktionen und Spaltprodukte sowie auch polyanionische Sulfatgruppen enthaltende Arzneimittel, wie z.B. das anionische Sulfatester enthaltende Arzneimittel SP 54 , aus dem Humanplasma zu eliminieren, wenn man das Plasma, z.B. in einem extrakorporalen Kreislauf, auf einen pH-Wert von 4,0 bis 5,5 einstellt und über einen der genannten basischen Anionenaustauscher führt. Auch in diesem Fall gelingt eine fast quantitative Adsorption der Sulfatestertragenden Verbindungen an die Austauschermaterialien, wobei eine Fremdadsorption von Proteinen weitgehend
15 unterdrückt wird.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert.
20 Beispiel 1
Die Adsorptionswirkung der Adsorbermäterialien für Heparin wurde folgendermaßen getestet:
Humanplasma wurde mit dem gleichen Volumen eines 0,2 molaren Acetatpuffers (pH 4,88) sowie/50 000 IE Heparin/Liter Plasma vermischt und der Lipoprotein-Heparin-Komplex gemäß der DE-OS 31 35 814 durch Filtration über ein Filter (0,4 μπι) abgetrennt. Diese Heparin/-Plasma-Acetatmischung wujrde über die zu testenden Austauscher gepumpt. Die Proteinkonzentration wurde nach der Biuret-Methode und die Heparinkonzentration mit einem Testkit der Fa. Kabi nach Teien et al. Thromb. Res. 8_, 413 (1976) und Thromb. Res. Ki, 399 (1977),
35 gemessen.
05
über je 5 ml der in Tabelle 1 angegebenen Harzmaterialien wurde 100 ml Plasma-Acetatlösung mit einer Laufgeschwindigkeit von 50 ml/h gepumpt, Fraktionen aufgefangen und darin die Heparinkonzentratxon wie oben angegeben ermittelt. In dem Diagramm ist der prozentuale Anteil des nichtadsorbierenden Heparins gegen das Volumen des Säuleneluats aufgetragen.
10
Vor Beginn des Versuchs wurden die Austauscher stets mit einer Mischung (1 : 1) von 0,2 M Natriumacetatlösung, pH 5,12, und 0,9 % NaCl-LÖsung äquilibriert.
Tabelle 1;
Harze, die auf ihre Adsorptionsfähigkeit geprüft wurden:
15 Harz Charakter Bezugsquelle
R
DEAE-Sephacel Cellulose-An- Pharmacia Fine
ionenaustauscher Chemicals,
Uppsala
TEAE-Cellulose
Cellulose-Anionenaustauscher
Serva, Heidelberg
Lewatit CA-9249
AG-MP I
makroporöser Anionenaustauscher
makroporöser Anionenaustauscher
Bayer AG, Leverkusen
BIO-RAD, München
IRA-900
IRA-410
poröser, stark basischer Anionenaustauscher -CH2-N+(CH3J3
stark basischer Anionenaustauscher -CH2-N+(CH3)2 CH2-CH2-OH
Serva, Heidelberg
Serva, Heidelberg
Die Experimente zeigen, daß insbesondere mäkroporöse Austauscher sehr geeignet sind, Heparin bei pH 5,1 nahezu vollständig aus Plasma zu adsorbieren.
Mit gleichem Erfolg wurden folgende weitere Adsorbermaterialien getestet:
Qüatodex - ein quartärer Anionenaustauscher der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala. Die Harzmatrix ist ein mit Epichlorhydrin
vernetztes Dextran.
Cytodex 1 - ein tertiärer Anionenaustauscher der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,
dessen Ankergruppe die Struktur
CH3-CH3
-0-CH2-CH2-N hat.
CH3-CH3
Beispiel 2
Es wurde weiteres Ionenaustauschermaterial (Zetaprep , AMF CUNO, Meriden, Connecticut, USA) bestehend aus gewickelten Fasermatten auf Cellulosebasis, auf die DEAE-Gruppen als Ankergruppen aufgebracht sind, getestet.
Dazu wurden 2000 ml Humah-Pool-Plasma mit einer Lösung von 2000 ml 0,2 M Natriumacetatpuffer, pH 4,88/0,9 % NaCl-Lösung (1 : 1 v/v) , der 50 000 IE/Liter Heparin zugesetzt waren, vermischt. Der Lipoprotein-Heparin-Komplex wurde durch Filtration über einen 0,4 Um-1FiI-ter abgetrennt.
Das Filtrat wurde mit einer Geschwindigkeit von
50 ml/Minute über den Heparin-Adsorber gepumpt, der
als Austauscher-Material die genannten Zetaprep -Fa-
sermatten mit DEAE-Beschichtung enthielt. Bei einigen Adsorptionsversuchen wurde die Heparinkonzentration in dem Acetatpuffer auf 100 000 IE/Liter erhöht.
Fasermatte Bezugsquelle Belegung Eingesetzte
(%) Heparinkonz.
im Acetat
puffer
Z"IE · !'1J
ZetaprepR 100-1 AMF-CUNO, 60 50 000
Ileriden, USA
11 100-2 Il 50 50 000
" 250-1 Il 60 100 000
" 250-2 Il 50 100 000
11 250-3 Il 40 50 000
Die Zetaprep -Kapseln unterscheiden sich in der Anzahl der spiralförmig auf einen Kern gewickelten Lagen des Cellulose-Ionenaustauscher-Materials (DEAE). Die handelsüblichen Kapseln entsprechen dabei einer Belegung von 100 %. Der Grad der Belegung der hier verwendeten Kapseln wurde auf diese maximale Belegung bezogen.
Wie. die Ergebnisse in den Tabellen 2 bis .6 zeigen, bleibt die Gesamtkonzentration des Gesamteiweiß vor
und nach der DEAE-Zetaprep -Kapsel unverändert. Dagegen wird die Heparinkonzentration stark erniedrigt bzw. auf einen nicht mehr meßbaren Wert abgesenkt. Es ist dabei einsichtig, daß die Heparinbindung von der Anzahl der gewickelten Ionenaustauscherschichten bei gegebener Durchflußgeschwindigkeit abhängig ist und deshalb für jede Durchflußgeschwindigkeit optimiert werden kann. Das Heparinfilter Zetaprep 250-1 erfüllt die gestellten Anforderungen hinsichtlich effizienter
:-: ■'.'-if'-/ '-''"" 342249A
Heparinadsorption und minimaler Proteinadsorption. Nach dem Adsorptionsversüch wurden die Austauscher mit 0,2 M Natriumacetatpuffer, pH 5,11/0,9 % NaCl (1:1, v/v) nachgespült und gebundene Proteine mit 0,2 M Natriumacetat, pH 4,85, 2 M NaCl eluiert. Die Proteinbe-
Ö5 Stimmung nach Lowry ergab eine Gesamtproteinadsorption
R
an den Zetaprep -Kapseln von weniger als 0,5 %.
10 15
25 30
Tabelle 2
■— R
Adsorptionsversuch mit Zetaprep DEAE 100-1:
Die Heparinkonzentration in Acetatpuffer lag bei 50.000 IE/Liter
Fraktion Volumen
ml		 Heparinkonz.
IE/Liter		 Gesamtheparin
IE		 Cholesterin
g/i		 Gesamteiweiß
g/i
vor 0,4 pm
Filter		 4.000 24 96.000 0,71 27,9
nach 0,4 pm
Filter ca.		 4.000 13,8 55.200 0,43 25,2
nach DEAE-
Zetaprep-
Filter
1 800 0 0 0,39 23,2
2 800 .0,17 136 0,41 25,4
3 800 0,71 568 0,41 25,2
4 880 2,00 1760 0,41 25,7
5 520 2,55 1326 0,40 25,0
Gesammelte
Fraktionen 3800
1 .00
3800
25,7
Tabelle 3
.Rr
Adsorptionsversuch mit Zetaprep DEAE 100-2:
Die Heparinkonzentration in Acetatpuffer lag bei 50.000 IE/Liter
Fraktion
Volumen
ml
nach DEAE
Zetaprep-Filter
750
750
750
75o'
800
Gesammelte
Fraktionen 3800
Heparinkonz. IE/Liter
Gesamtheparin IE
0,2
0,79
2,35
2,90
5,25
2,45
150
593
1763
2175
4200
9310
Cholesterin
g/i
0,36 0,37 0,37 0,37 0,37
0, Gesamteiweiß
g/i
vor 0, 4 pm 4. 000 23, 5 94 .000 o, 73 27 ,2
Filter
nach 0 ,4 pm 4. 000 14, 1 56 .400 0, 39 24 ,3
Filter ca.
23,6
24,9
24,8
25,3
25,2
25,0
CO
K) ISJ
4>« CD -O-
Tabelle 4 Adsorptionsversuch mit Zetaprep DEAE 250-1:
Die Heparinkonzentration in Acetatpuffer lag bei 100.000 IE/Liter
Fraktion
Volumen ml
nach DEAE-
Zetaprep-
Filter
1 800
2 800
3 800
4 800
5 500
Gesammelte
Fraktionen 3700
Heparinkonz. IE/Liter
Gesamtheparin
IE
Cholesterin
g/i
0,08
0,18
0,22 0,24 0,23 0,22 0,22
0,23
Gesamteiweiß
g/i
vor 0,4 pm • 4. 000 45 5 180 .000 O ,80 29 ,2
Filter
nach 0,4 pm 4. 000 22, 90 .000 0 ,25 25 ,8
Filterca
24,0 25,8 25,9 25,7 26,0
26,1
Tabelle 5
.Rr
Adsorptionsversuch mit Zetaprep^DEAE 250-2:
Die Heparinkonzentration in Acetatpuffer lag bei 100.000 IE/Liter
Fraktion Volumen Heparinkonz.
ml IE/Liter
Gesamtheparin
IE Cholesterin
Gesamteiweiß
g/i
vor 0,4 pm
Filter 4.000 50
nach 0,4 pm
Filter ca. 4.000 23,8
nach DEAE-
Zetaprep-
Filter		 800 0
1 820 0,27
2 930 1 ,35
3 810 2,35
4 350 2,60
5 3710 1.24
Gesammelte
Fraktionen
200.000 95.200
221 1256 1904
910
4600
0,22 0,23 0,23 0,23 0,23
27,6 24,6
22,5 24,2 24,2 23,9 24,4
23,7
Tabelle 6 Adsorptionsversuch mit Zetaprep DEAE 250-3:
Die Heparinkonzentration in Acetatpuffer lag bei 50.000 IE/Liter
Fraktion Volumen
ml		 Heparinkonz.
IE/Liter		 Gesamtheparin
IE		 Cholesterin
g/i		 Gesamteiweiß
g/l		 I
5
vor 0,4 pm
Filter		 4.000 22,5 90.000 0,69 27,5 I....
nach 0,4 pm
Filter ca.		 4.000 13,5 54.000 0,43 25,0
nach DEAE-
Zetaprep-
Filter
1 800 0 0 0,38 22,9
2 800 0 0 0,41 25,3
3 800 < 0,1 - 0,41 23,4
4 870 0,29 252 0,42 24,8
5 430 0,43 185 0,42 25,7
Gesammelte
Fraktionen 3700 < 0,1
24,6
:---'^L:»: * : τ 342249Α
Beispiel 3;
In einem weiteren Adsorptionsversuch wurden die Austauscher 2058/83, 2059/83 und 2060/83 der Bayer AG, Leverkusen, getestet.
Es handelt sich dabei um vernetzte makroporöse Acrylatharze mit tertiären Ankergruppen. Die mittlere Korngröße der Austauscher ist in der Tabelle 7 angegeben :
Tabelle 7:
2058/83 448
2059/83 273
2060/83 195
1Ö Korngrößen der in Beispiel 3 verwendeten Austauscherharze auf Acrylatbasis:
Mittlere Korngröße (μίη) % Anteil 300 μΐη
2058/83 448 7
22 47
Die Vorbehandlung des Human-Plasmas mit Heparin und Acetat erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben.
Die Austauscher wurden vor dem Versuch mit 0,2 M Acetatpuffer, pH 5,11/0,9 % NaCl (1:1, v/v) aquilibriert. Die Heparinkonzentration nach der Abtrennung des LDL-Heparinkomplexes lag bei 18 ΙΕ/ml. Je 100 ml Plasma/Acetatmischung mit Heparin wurden mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/h über 5 ml der Austauscher gepumpt.
Die Ergebnisse sind den nachfolgenden Tabellen 8 und 9 zu entnehmen.
Tabelle 8:
Heparinadsorption und Proteinadsorption an Austauscherharze auf Acrylatbasis.
ml Plasma/Acetat,
pH 5.1(10 IE/ml
Heparin)		 Austauscher % Heparin
adsorbiert		 Adsorbiertes
Protein (mg)		 nicht ad
sorbiert
'rotein/mg)		 % Adsorbiert
Protein		 !
100 2058/83 97 8,7 2 595 0,33
100 2059/83 99 12,5 2 595 0,48
100 2060/83 100 13,2 2 600 0,51
170 2060/83 100
200 2060/83 100
Tapelle 9
Proteinkonzentrationen und Eiweißelektrophoresen der Acetat/Plasmamischung vor und nach Ionenaustauscher 2058/Ö-3, 2059/83 und 2060/83
Total Albumin Eiweißelektrophorese Transferrin Ferritin Antithrombin III
protein
g/dl g/dl Alb. oC-1 *£-2 β mg/dl ng/ml %
Plasma 5.60 3.80 ' 55.8 3.4 8.4 11.3 21.1 240 45 88
vor 2058/A
nach "		 5.22
5.19		 3.75
3.76		 66.1
61.2 		3.0
3.3		 6.9
8.3		 8.7
9.7		 15.. 3
17.5 		226
227		 44
46		 68
56
vor 2059/A
nach "		 5.21
5.19		 3.22
3.28		 63.7
65.3		 3.1
2.4		 7.1
6.4 		8.3
8.2		 17.8
17.7 		244
197		 41
43		 61
41
vor 2060/A
nach "		 5.23
5.20		 3.26
3.62		 54.2
58.3		 4.8
3.7		 9.5
9.7		 11.3
10.3		 20.2
19.0		 212
212		 50
51		 72
53
vor 2060/B
nach "		 5.39
5.40		 3.70
3.57·		 63.8
64.9		 2.9
2.7		 6.8
7.2		 8.5
8.5		 18.0
16.7		 207
206		 48
48		 70
48
Beispiel 4;
Die Durchführung eines Adsorptionsversuches von Heparin aus Plasma, wie in Beispiel 3 beschrieben, unter Verwendung von 5 ml Lewatit MP 500 A mit einem makroporösen Anionenaustauscher der Bayer AG, Leverkusen, ergab ebenfalls eine vollständige Bindung des Heparins.
Es wurden jedoch etwa 3 % der über die Säule geleiteten Plasmaproteine an den Anionenaustauscher gebunden.
Beispiel 5:
Es wurde geprüft, ob auch andere, an sich bekannte, polyanionische heparinähnliche Glycosaminoglykane wie Heparansulfat, Dermatansulfat, oder auch Heparinderivate, wie durch Säurehydrolyse hergestelltes N-desulfatiertes Heparin und dessen Derivate und Heparinfraktionen unterschiedlichen Molekulargewichtes ebenso wie Heparin gebunden werden, wenn man mit Acetatpuffer auf einen pH-Wert von 5,1 eingestelltes Humanplasma durch
eine mit Zetaprep -Fasermatten bestückte Adsorberkapsel leitet. Als Vergleich diente Heparin.
Es wurde ferner überprüft, ob hinsichtlich der Bindungseigenschaften für Heparine unterschiedlicher Provenienz oder in Abhängigkeit von der Salz form (Kationen) des Heparins als Natrium- oder Calciumsalz Unterschiede in der Adsorption am Austauscher bestehen. Weiterhin wurden in gleicher Weise handelsübliche He-
parinoide, wie SP 54 , (Bene-Chemie, München) und
Arteparon (Luitpold-Werk, München) mit untersucht. Da zahlreiche dieser Substanzen keine in vitro-Gerinnungs-35
3A2249A
aktivität aufweisen, wurde zur Kontrolle der Adsorption ein elektrophoretisches Detektionsve^fahren gewählt. (H. Wohl, L. Weekly: Thrombos. Res. ^O, 543-546 (1983)) .
In Tabelle 10 sind die Ergebnisse der Adsorptionsversuche zusammegestellt.
Anstelle der 100 000 IE Heparin pro Liter Acetatpuffer wurden die Prüfsubstanzen in einer Konzentration von 700 mg/Liter Acetatpuffer eingesetzt.
Die Durchführung erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben mit je 2000 ml Human-Pool-Plasma und 2000 ml Acetatpuffer, pH 5,1.
15
Eingesetzt wurde eine mit 0,2 M Acetatpufferlösung pH 5,10/0,9 % NaCl-Lösung (1 : 1 v/v) äquilibrierte ZetaprepR-Kapsel DEAE 250-1 der AMF-CUNO, Meriäen,
20 Tabelle 10:
Adsorption verschiedener Heparine, Heparinderivate, Heparinoide, Glycosaminoglykane aus Humanplasma / Acetatpuffer bei pH 5,1 mit DEAE-ZetaprepR 250-1.
Substanz Herstellung/Bezug % adsorbiert
aus Plasma
Heparin-Na, handelsüblich
aus Schweine- 99
mucosa
Heparin-Ca,
handelsüblich 99
35 aus Schweinemucosa
Portsetzung Tabelle 10:
Substanz
Herstellung/Bezug
% adsorbiert aus Plasma
Heparin-Na, Rinderlunge 99
10
Heparin-Na, aus Schafsmucosa
98
Heparin-Na, aus Rindermucosa
Heparansulfat, Schweinemucosa Calbiochem-Behring Frankfurt
98
97
Dermatansulfat Calbiochem-Behring Frankfurt
98
Calbiochem-Behring Frankfurt
Chondroitinsulfat, Typ C, aus Haifischknorpel
Arteparon (Mucopolysaccharidpolyschwefelsäure ester)
SP 54R
(Natrium-Pento- Bene Chemie, Ilüchen 35 sanpolysulfat)
Luitpold-Werke,
München
95
95
95
Fortsetzung Tabelle 10:
Substanz Herstellung/Bezug % adsorbiert
aus Plasma
Heparin-Na,
niedermolekular,
Mw = 4000
hergestellt 99
durch Abbau mit H NO2 gemäß
PCT/ÜS 81/00519
Heparin-Na, niedermolekular Mw = 5000
hergestellt durch 99
Abbau mit Hepa-
rinase aus Flavo-
bacterium Heparinum 20
Heparin-Na,
hochmolekular
Mw = 9000
hergestellt durch 98
Gelfiltration über
SephadexR G
aus handelsüblichem
Heparin-Natrium
Heparin-Na,
desulfatiert, dies
ist eine Zwischen- 95
stufe gemäß
US Patent 3118 35
-Vl-Portsetzung Tabelle 10:
Substanz Herstellung/Bezug
% adsorbiert aus Plasma
Succinilxertes Heparin, Herstellung gemäß US-Patent 3 118 816
Heparin-Na, desulfatiert Herstellung gemäß: dies ist eine Zwischenstufe der DE-OS 31 23
succiniliertes Derivat eines desulfatierten Heparins Herstellung gemäß: DE-OS 31 23
Chondroitinsulfat, Typ A, aus Rindertracheen
Heparin, Fast Moving gemäß: B. Casu et al Pharmacol. Res. Comm. JL-I, 297 (1979)
SERVA, Heidelberg
Calbiochem-Behring,
Frankfurt
Heparin, Slow Moving gemäß: B. Casu et al Pharmacol. Res, Comm. JlJL, 297 (1979)
Calbiochem-Behring,
Frankfurt
Beispiel 6:
Gemäß der in der DE-OS 31 35 814 beschriebenen Anord-
nung wurde eine Zetaprep DEAE-Kapsel, die vorher mit 0,2 M Natriumacetatpuffer, pH 5,1, äquilibriert würde, in den Plasmastrom zwischen den Filter 21 und den Hämodialysator 26 (Fig. 1 der DE-OS 31 35 814) zwischengeschaltet.
Gemäß der Beschreibung der DE-OS 31 35 814 wurden
2000 ml Humanplasma eingesetzt, das LDL durch Heparin als LDL-Heparinkomplex präzipitiert und mit 50 ml pro Minute über ein Heparinadsorptionssystem (Zetaprep DEAE 250-1) geleitet.
Die in der Plasmabehandlung insgesamt eingesetzte Heparinmenge lag bei 50 000 IE pro Liter Plasmaacetat.
In einem Kontrollexperiment wurde die LDL-Fällung ohne das Heparinadsorptionssystem getestet.
In Tabelle 11 sind einige Meßwerte der Plasmakönzentration vor Beginn der Behandlung sowie jeweils nach der Behandlung - mit und ohne Heparinadsorber - angegeben. Wie die Meßwerte zeigen, wird der Gehalt zahlreicher Plasmabestandteile durch das Heparinadsorp* tionssystem nicht beeinflußt. Die Heparinkonzentration wird dagegen auf nicht mehr meßbare Werte reduziert.
Tabelle 11:
Heparinadsorption nach LDL-Fällung mit Heparin.
Parameter Humanplasma Humanplasma, mit Heparm-
ohne Behand behandelt adsorber
lung ohne Heparin- Zetaprep
adsorber DEAE 250-1
Heparin 50 IE/ml 23 IE/ml 0
Gesamt-
eiweiß 6,06 g/dl 4,62 g/dl 4,70 g/dl
AT III 103 % 64 % 60 %
APO-B 106 g/dl 9 g/dl 11 g/dl
APO-Al
(= HDL) 40,5 g/dl nicht ge 34,9
messen
Comple
ment C3 100 % 50 % 50 %
Comple
ment C4 100 % 33 % 33 %
Fibrino
gen 190 mg/dl 0 0
Die an dem Adsorbermaterial gebundene Proteinmenge lag
die Zetaprep -Kapsel
weit unter 1 % des über geleiteten Gesamtproteins.
Beispiel 7:
Die Adsorption von Heparin wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Dabei wurde ein gemäß der DE-OS 31 15 245 hergestelltes Polyaminharz zur Adsorption eingesetzt. Es wurde eine Bindung von 95 % der Gesamtheparinmenge erreicht. Die Proteinbindung lag bei 0,8 %.

Claims (20)

Patentansprüche
1. Verfahren zur spezifischen Adsorption von Heparin, Heparinfraktionen, Heparinderivaten, Heparin-Fragmenten und/oder Heparinoiden aus Vollblut, Plasma und/ Oder Vollblut oder Plasma enthaltenden Lösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man, ausgehend von Vollblut aus einem extrakorporalen Kreislauf oder aus Blutkonserven,
a) gegebenenfalls korpuskulare Blutbestandteile und Blutplasma nach an sich bekannten Methoden voneinander trennt, darauf folgend
b) Plasma oder Plasma enthaltende Lösungen, die Heparin, Heparinfraktionen, Heparinderivate, HeparinFragmente oder Heparinoide in Mengen von 1000 bis 200 000 IE/1 oder im Falle der Heparinoide, Heparinfraktionen, Heparin-Fragmente und Heparinderivate bis zu 2 g/l enthalten, durch Zugabe eines Puffers auf einen pH-Wert zwischen 4,0 und 5,5 einstellt,
c) die gepufferten Flüssigkeiten mit einer Durchflussgeschwindigkeit zwischen 60 ml/h und 25 l/h durch eine sterilisierte, zylinderförmige, einen Deckel und einen Boden mit zentralen Zulaufstutzen und Ablaufstutzen und kreisförmige Doppelsiebe von 50 bis 100 μπι Maschenweite in Deckel und Boden aufweisende, ein Heparin, Heparinderivate, Heparinfraktionen, Heparin-Fragmente oder Heparinoide adsorbierendes, wasserfeuchtes Medium enthaltende Adsorberkapsel führt, wobei eine Heparinadsorption von 80 bis 100 % des ursprünglich in den Flüssigkeiten vorhandenen Heparins bewirkt wird,
d) die von Heparin und/oder Heparinoiden befreiten Flüssigkeiten einer Bicarbonatdialyse zur Anhebung des pH-Wertes auf physiologische Bedingungen unterwirft,
e) gegebenenfalls entheparinisiertes Plasma und korpuskulare Blutbestandteile wieder vereinigt und
f) die von Heparin, Heparinfraktionen, Heparinderivaten, Heparinfragmenten oder Heparinoiden befreiten Flüssigkeiten re-infundiert oder einer üblichen
05 Blutkonserve wieder zuführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man es in einem geschlossenen extrakorporalen Kreislauf führt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man es an nach bekannten Methoden hergestellten und konditionierten Konserven von Vollblut oder Plasma durchführt.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trennung von korpuskularen Blutbestandteilen und Blutplasma nach bekannten Methoden mittels eines oder mehrerer hintereinander geschalteter Membran-Plasmafilter oder mittels einer Filterkaskade durchführt.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer Natriumacetat verwendet.
6. Verfahren nach Ansprüchen 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem pH-Bereich von 4,7 bis 5,2 arbeitet.
7. Verfahren nach Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß man Durchflußgeschwindigkeiten zwischen 1,5 und 12 l/h einstellt.
8» Verfahren nach Ansprüchen 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine ein als Anionenaustauscher wirkendes Ionenaustauscherharz enthaltende Adsorberkapsel verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine ein makroporöses Anionenaustauscherharz mit basischen Ankergruppen enthaltende Adsorberkapsel verwendet.
10. Verfahren nach Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine mit einer Adsorptions-Filterpatrone bestückte Adsorberkapsel verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man eine aus einem massiven oder einem hohlen Kern und einem Stützgitter, auf das eine als' aktives Adsorbens wirkende Fasermatte, die Anionenaustauschereigenschaften aufweist, gewickelt ist, bestehende Adsorptions-Filterpatrone als Bestückung für die Adsorberkapsel verwendet.
12. Verfahren nach Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine mit einem Anionenaustauscher-Eigenschaften aufweisenden, wasserfeuchten Gel gefüll-
25 te Adsorberkapsel verwendet.
13. Verfahren nach Ansprüchen 1 - 12, dadurch gekennzeichnet, daß man Adsorberkapseln verwendet, die unter Anwendungsbedingungen mindestens eine Heparinkapazität von 5000 bis 300 000 IE Heparin, bevorzugt von 10 000 bis 100 000 IE Heparin, oder eine entsprechende Kapazität für Heparinoide, Heparinfraktionen, Heparin-Fragmente, oder Heparinderivate bis zu 2 g haben.
14. Verfahren nach Ansprüchen 1 - 13, dadurch gekennzeichnet, daß man mit Ionenaustauschern gefüllte Adsorberkapseln verwendet, deren Adsorbermaterial eine anionische Kapazität von mindestens 0,2 mval/g enthält.
15. Verfahren nach Ansprüchen 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß man Adsorberkapseln mit Deckeln verwendet, deren Zulaufstutzen und Ablaufstutzen kreisförmige Doppelsiebe mit Maschenweiten zwischen 60 und 90
10 μπι aufweisen.
16. Verfahren nach Ansprüchen 1-15, dadurch gekenn-
zeichnet, daß man eine durch Gammabestrahlung, durch Behandlung mit Ethylenoxid oder anderen chemischen Sterilisationsmitteln oder durch Hitzebehandlung sterilisierte Adsorberkapsel verwendet.
17. Vorrichtung zur spezifischen Adsorption von Heparin, Heparinfraktionen, Heparin-Fragmenten, Heparinderivaten und/oder Heparinoiden aus Vollblut, Plasma oder Lösungen, bestehend aus
a) einer zylinderförmigen sterilisierten Adsorberkapsel aus an sich bekannten physiologisch verträglichen Materialien mit einer Länge von 4 bis
30 cm, einem Durchmesser von 2 bis 10 cm, deren
Deckelfläche und Bodenfläche zentrale Zulaufstutzen und Ablaufstutzen aufweisen, und die gegebenenfalls kreisförmige Doppelsiebe von 50 bis
100 um Maschenweite enthalten, und die mit einem
Heparin, Heparinfraktionen, Heparinderivate und/
oder Heparinoide adsorbierenden, als Anionenaustauscher wirkenden Medium gefüllt ist,
b) mit den genannten Stutzen verbundenen auswechselbaren Zuleitungen und Ableitungen aus an sich be-
35 kannten Materialien sowie
c) an sich bekannten Pumpen und Kontrolleinrichtungen.
18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorberkapsel ein als Anionenaustauscher wirkendes Harz in Kugelform mit Korngrößen von 100 bis 2000 um, bevorzugt zwischen 300 bis 1000 μπι enthält.
19. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorberkapsel eine Adsorptions-Filterpatrone enthält, die aus einem massiven oder hohlen Kern und einem Stützgitter besteht, auf das eine als aktives Adsorbens wirkende Fasermatte gewickelt ist, die
10 Anionenaustauscher-Eigenschaften aufweist.
20. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorberkapsel ein Heparin, Heparinfräktionen, Heparin-Fragmente, Heparinderivate und/oder ΐέ Heparinoide adsorbierendes wasserfeuchtes Gel enthält.
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