DE3517629A1 - Verfahren zur herstellung von hyaluronsaeure durch fermentation - Google Patents
Verfahren zur herstellung von hyaluronsaeure durch fermentationInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Fermentationsverfahren zur Erzeugung
von Hyaluronsäure. Ganz speziell betrifft die Erfindung ein fermentatives Verfahren zur Erzeugung von Streptolysin-freier
Hyaluronsäure durch Kultivierung (oder Inkubierung) eines Mikroorganismus der Gattung Streptococcus.
Bisher wurde Hyaluronsäure aus der Hyaloid-Flüssigkeit von Rinderaugen,
Hahnenkämmen, Nabelschnüren und der Articulus (Gelenkflüssigkeit) von Hühnern isoliert. Die Säure kann als Substanz verwendet
werden, welche einen gelee- oder gallertartigen Zustand bei
Bindung an Proteine oder andere Mucopolysaccharide und Wasser beibehält, wodurch sie wie ein Gleitmittel wirkt, unter Verhinderung
des Eindringens von Bakterien und Zurückhaltung von Wasser. Es hat sich jedoch gezeigt, daß die bekannten Verfahren zur Isolierung
von Hyaluronsäure schon deshalb nachteilig sind, weil die damit verbundenen Kosten der Gewinnung von Hyaluronsäure zu hoch sind.
Es ist ferner bekannt, z. B. aus B. Holmström, "Appl. Microbial",
15(6), 1409-1413, 1967, J.B. Woolcock, "J. Gem. Microbial", 85, 372-375, 1974 und E. Kjem, "Acta Pathol. Microbial. Scand.", 84(3),
162-164, 1976, daß Hyaluronsäure auf relativ billige Weise durch
Einsatz von Bakterienstämmen gewonnen werden kann, die zur Gattung Streptococcus gehören, z. B. Streptococcus pyogenes, Streptococcus
equi, Streptococcus equisimilis, Streptococcus dysgalactiae und
Streptococcus zooepidemicus. Nach Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology (8. Ausgabe, 1974) gehören die erwähnten Stämme jedoch zu biogenen Gruppen der Gattung Streptococcus, ζ. B. Milchsäure-
und Bakterien vom A- oder C-Typ einer Lancefield-Serumgruppe. D. h., bei diesen Stämmen handelt es sich um Bakterien, die ganz allgemein
als hämolytische Streptococcen bekannt sind und die eine ß-Hämolyse
durch lösliches Hämolysin, d. h. Streptolysin zeigen. Obgleich die wechselseitige Beziehung zwischen der Streptolysin erzeugenden
Eigenschaft und dem pathogenen Charakter noch nicht ganz geklärt ist, hat sich doch gezeigt, daß das erhaltene Hyaluronsäureprodukt
in unvorteilhafter Weise mit den vorerwähnten Proteinen verunreinigt ist, wenn Hyaluronsäure im industriellen Maßstab durch Kultivierung
der oben beschriebenen Stämme erzeugt wird. Insbesondere dann, wenn
BADORiGINAL
Hyaluronsäure in medizinische Präparate für eine äußere Anwendung eingesetzt wird oder zur Herstellung von kosmetischen Präparaten,
ist es erwünscht, daß Streptolysin vollständig von dem Hyaluronsäureprodukt
abgetrennt wird, wenn die Präparate auf die Haut aufgebracht werden sollen.
Wird die Subkultivierung (subculturing) der oben erwähnten Stämme
fortgesetzt, so nimmt nicht nur die Hämolyse allmählich ab, sondern
vielmehr wird auch die Fähigkeit zur Erzeugung der Hyaluronsäure vermindert, und die Mucoid-Kolonien verschwinden. Weiterhin hat
sich gezeigt, daß die Hämolyse der Stämme auch bei wiederholter Subkultivierung erhalten bleibt. Infolgedessen ist es außerordentlich
schwierig oder praktisch unmöglich, Hyaluronsäure in effektiver Weise zu erzeugen, die nicht durch Streptolysin verunreinigt ist.
Aufgabe der Erfindung ist es demzufolge, ein Verfahren anzugeben, daß es ermöglicht Hyaluronsäure zu erzeugen, die nicht durch Streptolysin verunreinigt ist.
Es wurde gefunden, daß die gestellte Aufgabe mit einem Fermentationsverfahren
gelöst werden kann, zu dessen Durchführung ein anhämolytischer Mikroorganismus eingesetzt wird, der in effektiver Weise
Hyaluronsäure zu produzieren vermag.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein fermentatives Verfahren zur
Erzeugung von Streptolysin-freier Hyaluronsäure, das durch die folgenden Stufen gekennzeichnet ist:
Ca) Kultivierung eines Mikroorganismus der Gattung Streoptococcus,
der anhämolytisch ist und Hyaluronsäure zu produzieren vermag in einar Kulturmedium und
(b) Isolierung der Streptolysin-freien Hyaluronsäure aus dem
Kultivierungsprodukt.
BAD ORIGINAL
Die Zeichnungen dienen der Erläuterung der Erfindung. Im einzelnen
sind dargestellt in:
Fig. 1 ein Diagramm, welches die Wechselbeziehung zwischen der produzierten Menge an Hyaluronsäure in g/l , der Glucosemenge ;{
in \ oder dem Zellenwachstum (ÖDfiftn) und der Kultivierungs- Ii
dauer in Stunden während der Kultivierung, wie in Beispiel 2 beschrieben j veranschaulicht und ,
Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der gemäß dem Verfahren des Beispieles 2 hergestellten Hyaluronsäure.
Bei den Mikroorganismen, die im Rahmen des erfindungs gemäßen
Fermentationsverfahrens eingesetzt werden können, handelt es sich um Mutanten, die zur Gattung Streptococcus gehören, die anhämolytisch
sind und Hyaluronsäure zu produzieren vermögen. Ein typisches Beispiel für einen solchen Mutanten ist Streptococcus zooepidemieus
NH-131, bei dem es sich um einen anhämolytisehen Mutanten eines
Stammes handelt, der zu Streptococcus zooepidemieus gehört und der seit dem 14. April 1984 in Japan in dem Fermentation Research
Institute (FRI) als FERM P-7580 hinterlegt worden ist sowie ferner
im Fermentation Research Institute (FRI) (d. h., dem Internationalen
Hinterlegungsinstitut nach dem Budapester Abkommen in Tsukuba, Japan) unter der Bezeichnung FERM BP-784.
Der Stamm Streptococcus zooepidemieus NH-131 wurde isoliert aus
dein Stamm des Streptococcus zooepidemieus, der erhalten wurde aus
der tunica conjunctiva bulbi eines Meerschweinchens, wie in Beispiel 1
näher beschrieben.
Die anhämolytischen Mutanten vom Streptococcus zooepidemieus lassen
sich selektiv wie folgt isolieren: Die Zellen des Stammes Streptococcus zooepidemieus
werden einer Subkultivierung unterworfen (subcultured), um Zellen des Stammes auszuwählen, die eine verminderte
oder reduzierte Hämolyse zeigen. Die ausgewählten Zellen werden dann einer Üblichen Mutationsbehandlung unterworfen, z. B. durch Anwendung
von ultraviolettem (UV) Licht oder einer Behandlung mit N -Methyl-
BAD ORIGINAL
N'-nitro-N-nitrosoguanidin (abgekürzt NTG). Die in der Weise behandelten
Zellen werden dann auf einem Blut-Agar-Medium verteilt
und nach dem Wachstum werden Mutanten, die durch eine Anhämolyse
gekennzeichnet sind und viskose Kolonien zu bilden vermögen selektiv
isoliert. Auf diese Weise lassen sich die gewünschten Mutanten erhalten.
Die morphologischen Charakteristika von Streptococcus zooepidemicus
NH-131 sind im folgenden zusammengefaßt. Die Streptococcus zooepidemicus
NH-131 Mutanten haben im wesentlichen die gleichen
morphologischen Charakteristika wie jene der Mutterstämme Streptococcus zooepidemicus,
wie sie in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, Seite 49 8 (1974) angegeben sind, mit der
Ausnahme, daß der Stamm NH-131 Gram-positiv ist und ein ß-hämolytischer(-)
Streptococcus ist und transparente viskose Kolonien auf einem Schafsblut-Agar-Medium bildet.
(1) Gram-Stamm: +
(2) ß-Hämolyse: -
(3) Thermische Widerstandsfähigkeit bei 600C,
30 Minuten: -
(4) Widerstandsfähigkeit gegenüber 40 liger
Gallenlösung: -
(5) Widerstandsfähigkeit gegenüber 6,5 liger
Salzlösung:
(6) Alkali-Widerstandsfähigkeit bei Ph-Wert von 9,6:-
(7) Zersetzbarkeit durch Natriumhippurat:
(8) Zersetzbarkeit durch Esculin: -
(9) Löslichkeit in Gelatine: -
(10) Sensibilität auf Bacitracin: +
(11) Zersetzbarkeit von Zucker:
Glucose: +
Maltose: +
Lactose:
Glucose: +
Maltose: +
Lactose:
Sucrose: +
Sorbitol: -
Salicin: -
Glycerin: -
Mannitol: - ^
Trehalose:
+: positiv
t: pseudopositiv
-": negativ
Die erfindüngsgemäß eingesetzten Streptococcus zooepidemicus-Mutanten
lassen sich in einem Kulturmedium kultivieren oder züchten, das vorzugsweise enthält: Kohlenstofflieferanten,
anorganische Salze und ggf. Spuren von organischen Nährstoffen. Beispiele für geeignete Kohlenstofflieferanten sind organische
Säuren und aliphatische Alkohole. Vorzugsweise werden erfindungsgemäß
als Kohlenstofflieferanten solche verwendet, die Zucker enthalten, z. B. Stärkehydrolysate, Glucose, Sucrose, Galactose und
Fructose. Typische Beispiele für Stickstofflieferanten, die im Kulturmedium eingesetzt werden können, sind Ammoniumsulfat, Natriumnitrat,
sekundäres Ammoniumphosphat, d. h. Diammoniumhydrogenphosphät,
Fleischextrakt, Peptone, Mischungen von verschiedenen Aminosäuren sowie Hefeextrakt. Zusätzlich zu diesen Komponenten können dem
Nährmedium beispielsweise zugesetzt werden Salze-.wie Natriumchlorid,
Magnesium-, Kalium-, Eisen-, Calcium- und andere Metallsalze der Phosphorsäure, Schwefelsäure und Kohlensäure sowie ferner ggf.
Vitamine.
Die Zucker können dabei sämtlich in einem Mal einem Kulturmedium
zugesetzt werden. In vorteilhafterer Weise können die Zucker jedoch
eiern Kulturmedium in kleinen Anteilen zugesetzt werden, um dadurch
die Ausbeute an Hyaluronsäure zu erhöhen.
Die Kultivierung oder Züchtung kann dabei in vorteilhafter Weise unter aeroben Bedingungen erfolgen, beispielsweise mittels einer
Schüttelkultur oder einer Belüftung-Spinner-Kultur bei einer
Temperatur von beispielsweise 30 bis 370C. Insbesondere dann, wenn
die Kultivierung durch Einstellung eines pH-WeTtes des Mediums auf 5,5 bis 9,0 mit einer wäßrigen alkalischen Lösung erfolgt,
läßt sich die erwünschte Hyaluronsäure in stabiler Weise in großen Mengen erzeugen. Beispiele für wäßrige alkalische Lösungen sind
Lösungen von einer oder mehreren üblichen alkalischen Verbindungen,
BAD ORIGINAL
wie beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, basische Aminosäuren und kurzkettige Amine . Nach der Kultivierung kann die
Hyaluronsäure, die sich in der Kultivierungsmischung angesammelt
hat, nach üblichen bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren für Polysaccharide abgetrennt und gereinigt werden. Vorzugsweise erfolgt
jedoch eine Ansäuerung der Kultivierungsmischung vor der Isolierung der Säure, da dadurch die Reinheit der gewonnenen
Hyaluronsäure erhöht werden kann.
Beispielsweise läßt sich die Hyaluronsäure aus dem Kulturmedium
wie folgt isolieren: Die Zellen und andere unlösliche Bestandteile
des Kulturmediums werden zunächst durch Filtration oder Abzentrifugieren
abgetrennt. Dann werden die in dem erhaltenen Filtrat
vorhandenen Proteine entfernt, beispielsweise mittels Trichloressigsäure
oder einer Mischung aus Chloroform und Isoamylalkohol„
einem Absorptionsmittel, beispielsweise aktivierter Kohle oder aktivierten». Ton oder einem Protein-Zersetzungsenzym, z. B. Pepsin,
Papain oder Pronase. Die in dem Kulturmedium verbliebenen Verunreinigungen von niedrigem Molekulargewicht können durch Ultrafil- ^
tration, Dialyse, Ausfällungsverfahren durch Zugabe eines organischen
Lösungsmittels, einem kationischen oberflächenaktiven Mittel oder durch eine Absorptionsmethode unter Verwendung eines Ionenaus
tauschharze s entfernt werden. Die erhaltene Hyaluronsäure läßt sich aus dem erhaltenen Kulturmedium beispielsweise durch Gefriertrocknung,
Sprühtrocknung oder ein Ausfällungsverfahren mittels eines
organischen Lösungsmittels abtrennen.
Die Erfindung ermöglicht die Herstellung einer Streptolysin-freien
Hyaluronsäure in hoher Ausbeute. Die nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren erzeugte Hyaluronsäure läßt sich in vorteilhafter Weise
zur Herstellung medizinischer Präparate für eine äußere Anwendung und zur Herstellung kosmetischer Präparate, die auf die Haut aufgebracht
werden oder mit der Haut in Berührung kommen, verwenden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.
Sämtliche Prozentangaben beziehen sich auf Gewichtsprozent, sofern
nichts anderes angegeben ist.
BAD ORIGINAL
Zellen von Streptococcus zooepidemicus, isoliert aus der tunica
conjunctiva bulbi von Meerschweinchen wurden bei einer Temperatur von 370C in einem Gehirn-Herz-Infusionsmedium (brain heart infusion
medium), Hersteller Eiken Kagaku Co., Japan, kultiviert. Die während
der logarithmischen Wachstumsphase anfallenden Zellen wurden aufgenommen und die zentrifugale Abtrennung wurde bei VeTgIeIChSWeISe1
niedriger Temperatur wiederholt, worauf die abgetrennten Zellen sterilisiert wurden, indem sie zweimal mit einer 1/20 M Phosphat^-
pufferlösung gewaschen wurden. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen
wurden dann bei einer Temperatur von 370C 20 Minuten lang in 1/20 M
Phosphat-Pufferlösungen mit 100 bis 500yg/ml geschüttelt und dann auf Eis gekühlt. Die Zellen wurden dann zweimal mit 1/20 M Phosphat-Pufferlösung
bei vergleichsweise niedriger Temperatur gewaschen und dann zur Inokulierung eines Gehirn-Herz-Infusionsmediums verwendet.
Die Kultivierung erfolgte 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 370C. Auf diese Weise wurde ein Mutant erhalten, der keine hämoly-
^ tischen Eigenschaften aufwies und der viskoseKolonien bildete, wenn
er auf einem Blut-Agar-Medium (Hersteller: Eten Kagaku Co., Japan)
verteilt würde. Dieser Mutant, Streptococcus zooepidemicus NH-131
wurde in dem Fermentation Research Institute (Japan) hinterlegt.
Der Streptococcus zooepidemicus NH-131 (d. h. PERM BP-784) wurde
in eine Schüttelkultur in einer Teströhre gebracht, die ein Gehirn-Herz-Infusionskulturmedium
enthielt. Nachdem Pferdeblut zu dem Kulturmedium zugesetzt worden war und dieses bei einer Temperatur
von 370C 2 Stunden lang stehengelassen wurde, hatten das Erythroyt,
das sich am Boden der Teströhre abgeschieden hatte, und das Oberstehende die Farbe des Kulturmediums. Somit wurde bestätigt, daß
dieser Mutant keine hämolytischen Eigenschaften besaß.
Verwendet wurde ein Kulturmedium mit 6 % Glucose, 0,5 % Hefeextrakt
(erhältlich vom Oriental Yeast Co., Japan), 1,0 % Polypepton
(Hersteller Daigo Eiyo Kagaku Co., Japan) und 0,005 ! eines Anti-
BAD ORIGINAL
schaummittels vom Polyethertyp, nämlich Adekanol LG-805, Hersteller
Asahi Denka Kogyo Co., Japan. 10 1 des Kulturmediums, mit Ausnahme
der Glucose, wurden in ein 30 1 fassendes Rüttel-Fermentationsgefäß
eingebracht. Nach einer Sterilisation bei einer Temperatur von 1210C, 20 Minuten lang, wurde der zuvor gezüchtete Streptococcus
zooepidemicus NH-131 in das Kulturmedium inokuliert. Die Belüftungs-Spinner-Kultivierung
erfolgte bei einer Temperatur von 35 C während 2 Tagen, wobei der pH-Wert des Mediums mit Natriumhydroxid auf 7,0
eingestellt wurde.
Die Glucose wurde getrennt vom Kulturmedium sterilisiert und ein
Anteil von 0,2 I der 6 !igen Glucoselösung wurde dem Rüttel-Fermentationsbehälter
zu Beginn der Kultivierung zugegeben, während der restliche 5,8 t-Anteil etwa zu Beginn des logarithmsichen Wachstums
zugesetzt wurde, d. h. 5 bis 7 Stunden nach Beginn der Kultivierung.
Aus Fig. 1 ergibt sich die Veränderung in der Erzeugung der Hyaluronsäure in g/l (x-x), die Glucosemenge (V) (·-·), und das
Zellenwachstum (OEggrJ (o-o) im Verlaufe der Kultivierungsdauer. ':
Die Bestimmung der Veränderungen während des Kultivierungsprozesses
erfolgten wie folgt:
(1) Die erzeugte Menge an Hyaluronsäure wurde durch Wiegen der
gereinigten,von einer Probe isolierten Hyaluronsäure bestimmt.
(2) Die Glucosemenge wurde mittels eines Zucker-Analysiergerätes vom Typ YSI, Modell 27 (Hersteller Yellow Springs Instrument ;
Co., USA) bestimmt.
(3) Das Zellenwachstum wurde durch Messung der Absorption einer Probe bei einer Wellenlänge von 660 nm in einem Spektrophotometer
ermittelt.
Die erzeugte Menge an Hyaluronsäure stieg im Verlaufe der Zeit an
und ebenfalls erhöhte sich die Viskosität des Kultivierungsmediums. Die Kultivierung wurde urterbrochen, als die Viskosität des Kultivierungsmediums
fast das Maximum erreicht hatte (nach einem oder
BAD ORIGINAL
- 10 2 Tagen nach Beginn der Kultivierung).
Die Kultivierungsmischung wurde dann zentrifugiert, um die unlöslichen Bestandteile von der Mischung abzutrennen. Die
Proteinkomponenten, die in der erhaltenen Mischung vorhanden waren, wurden mittels einer Mischung aus Chloroform und Isoamylalkohol
im Verhältnis 5:1 entfernt, worauf die in der anfallenden
Mischung noch vorhandenen Substanzen von niedrigem Molekulargewicht
durch Ultrafiltration entfernt wurden. Schließlich wurden 3,6 g Hyaluronsäure aus 1 1 der Kultivierungsflüssigkeit nach einem
Gefrier-T r ocknungsverfahren gewonnen.
Das in Form von weißen Fasern erhaltene Hyaluronsäureprodukt war
in Wasser löslich, jedoch unlöslich in organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Aceton, Chloroform und Ether und besaß keinen
Geschmack und keinen Geruch. Das Infrarot-Absorptionsspektrum des Produktes bestätigte, daß <?as Produkt aus Hyaluronsäure bestand.
In entsprechender Weise wurde durch, Elektrophorese und einem Zerfallstest mittels fungus hyaluronidase bestätigt, daß es sich bei dem
erhaltenen Produkt um Hyaluronsäure handelte. Das Infrarot-Absorptionsspektrum der erhaltenen Hyaluronsäure ist in Fig. 2 dargestellt.
- Leerseite -
Claims (3)
- Reg. Nr. 85 003 PatentanwälteH. Bartels Dipl.-Ing. H.FinkSHISEIDO COMPANY LTD. Dr.-Ing.M.Held7-5-5, Ginza, Chuo-kuTokio/Japan ·13. Mai 1985 25/28Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure durch FermentationPatentansprücheVerfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure, dadurch gekennzeichnet, daß manin einem Kulturmedium einen anhämolytischen, Hyaluronsäure produzierenden Mikroorganismus der Gattung Streptococcus züchtet undaus dem Kultivierungsmedium Streptolysin-freie Hyaluronsäure isoliert.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen Stamm von Streptococcus zooepidemicus verwendet.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptococcus zooepidemicus FERM BP-784 verwendet.BAD RiGiAIAL' ■ ■ ■ ' ■■■■■■ ' ■ nt
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