DE3517629C2

DE3517629C2 -

Info

Publication number: DE3517629C2
Application number: DE3517629A
Authority: DE
Inventors: Hidemichi Akasaka; Hisayuki Komasaki; Takayuki Yokohama Kanagawa Jp Arai
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 1984-05-25
Filing date: 1985-05-15
Publication date: 1987-09-03
Also published as: FR2564859A1; FR2564859B1; DE3517629A1; IT8520869A0; JPH0378116B2; KR850007983A; KR870001815B1; IT1183674B; JPS60251898A; US4801539A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Hyaluronsäure.

Bisher wurde Hyaluronsäure aus der Hyaloid-Flüssigkeit von Rinderaugen, Hahnenkämmen, Nabelschnüren und der Articulus (Gelenkflüssigkeit) von Hühnern isoliert. Die Säure kann als Substanz verwendet werden, welche einen gelee- oder gallertartigen Zustand bei Bindung an Proteine oder andere Mucopolysaccharide und Wasser beibehält, wodurch sie wie ein Gleitmittel wirkt, unter Verhinderung des Eindringens von Bakterien und Zurückhaltung von Wasser. Es hat sich jedoch gezeigt, daß die bekannten Verfahren zur Isolierung Hyaluronsäure schon deshalb nachteilig sind, weil die damit verbundenen Kosten der Gewinnung von Hyaluronsäure zu hoch sind.

Es ist ferner bekannt, z. B. aus B. Holmström, "Appl. Microbial", 15 (6), 1409-1413, 1967, J. B. Woolcock, "J. Gem. Microbial", 85, 372-375, 1974 und E. Kjem, "Acta Pathol. Microbial. Scand.", 84 (3), 162-164, 1976, daß Hyaluronsäure auf relativ billige Weise durch Einsatz von Bakterienstämmen gewonnen werden kann, die zur Gattung Streptococcus gehören, z. B. Streptococcus pyogenes, Streptococcus equi, Streptococcus equisimilis, Streptococcus dysgalactiae und Streptococcus zooepidemicus. Nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8. Ausgabe, 1974) gehören die erwähnten Stämme jedoch zu biogenen Gruppen der Gattung Streptococcus, z. B. Milchsäure- und Bakterien vom A- oder C-Typ einer Lancefield-Serumgruppe. Das heißt, bei diesen Stämmen handelt es sich um Bakterien, die ganz allgemein als hämolytische Streptococcen bekannt sind und die eine β-Hämolyse durch lösliches Hämolysin, d. h. Streptolysin zeigen. Obgleich die wechselseitige Beziehung zwischen der Streptolysin erzeugenden Eigenschaft und dem pathogenen Charakter noch nicht ganz geklärt ist, hat sich doch gezeigt, daß das erhaltene Hyaluronsäureprodukt in unvorteilhafter Weise mit den vorerwähnten Proteinen verunreinigt ist, wenn Hyaluronsäure im industriellen Maßstab durch Kultivierung der oben beschriebenen Stämme erzeugt wird. Insbesondere dann, wenn Hyaluronsäure in medizinische Präparate für eine äußere Anwendung eingesetzt wird oder zur Herstellung von kosmetischen Präparaten, ist es erwünscht, daß Streptolysin vollständig von dem Hyaluronsäureprodukt abgetrennt wird, wenn die Präparate auf die Haut aufgebracht werden sollen.

Wird die Subkultivierung der oben erwähnten Stämme fortgesetzt, so nimmt nicht nur die Hämolyse allmählich ab, sondern vielmehr wird auch die Fähigkeit zur Erzeugung der Hyaluronsäure vermindert, und die Mucoid-Kolonien verschwinden. Weiterhin hat sich gezeigt, daß die Hämolyse der Stämme auch bei wiederholter Subkultivierung erhalten bleibt. Infolgedessen ist es außerordentlich schwierig oder praktisch unmöglich, Hyaluronsäure in effektiver Weise zu erzeugen, die nicht nur durch Streptolysin verunreinigt ist.

Aufgabe der Erfindung ist es demzufolge, ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Streptolysin-freier Hyaluronsäure anzugeben.

Es wurde gefunden, daß die gestellte Aufgabe mittels eines anhämolytischen Mikroorganismus gelöst werden kann, der in effektiver Weise Hyaluronsäure zu produzieren vermag.

Gegenstand der Erfindung ist ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Streptolysin-freier Hyaluronsäure, wie es im Anspruch gekennzeichnet ist.

Die Zeichnungen dienen der Erläuterung der Erfindung. Im einzelnen sind dargestellt in:

Fig. 1 ein Diagramm, welches die Wechselbeziehung zwischen der produzierten Menge an Hyaluronsäure in g/l, der Glucosemenge in % oder dem Zellenwachstum (OD₆₆₀) und der Kultivierungsdauer in Stunden während der Kultivierung, wie in Beispiel 2 beschrieben, veranschaulicht und

Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der gemäß dem Verfahren des Beispieles 2 hergestellten Hyaluronsäure.

Bei dem Mikroorganismus, der im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt wird, handelt es sich um einen Mutanten, der zur Gattung Streptococcus gehören und anhämolytisch ist.

Der Mikroorganismus ist im Fermentation Research Institute (FRI), d. h. einem Internationalen Hinterlegungsinstitut nach dem Budapester Abkommen, in Tsukuba, Japan unter der Bezeichnung FERM Bp-784 hinterlegt worden. Eine andere Bezeichnung ist Streptococcus zooepidemicus NH-131. Der Mikroorganismus wurde isoliert aus dem Stamm des Streptococcus zooepidemicus, der erhalten wurde aus der tunica conjunctiva bulbi eines Meerschweinchens, wie in Beispiel 1 näher beschrieben.

Anhämolytische Mutanten vom Streptococcus zooepidemicus lassen sich selektiv wie folgt isolieren: Zellen des Stammes Streptococcus zooepidemicus werden einer Subkultivierung unterworfen, um Zellen des Stammes auszuwählen, die eine verminderte oder reduzierte Hämolyse zeigen. Die ausgewählten Zellen werden dann einer üblichen Mutationsbehandlung unterworfen, z. B. durch Anwendung von ultraviolettem (UV) Licht oder einer Behandlung mit N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin (abgekürzt NTG). Die in der Weise behandelten Zellen werden dann auf einem Blut-Agar-Medium verteilt und nach dem Wachstum werden Mutanten, die durch eine Anhämolyse gekennzeichnet sind und viskose Kolonien zu bilden vermögen, selektiv isoliert. Auf diese Weise lassen sich die gewünschten Mutanten erhalten.

Die morphologischen Charakteristika von Streptococcus zooepidemicus FERM BP-784 sind im folgenden zusammengefaßt. Streptococcus zooepidemicus FERM BP-784 hat im wesentlichen die gleichen morphologischen Charakteristika wie jene des Mutterstammes Streptococcus zooepidemicus, wie sie in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, Seite 498 (1974) angegeben sind, mit der Ausnahme, daß der Stamm FERM BP-784 Gram-positiv ist und ein β-hämolytischer(-) Streptococcus ist und transparente viskose Kolonien auf einem Schafsblut-Agar-Medium bildet.

(1) Gram-Stamm:+ (2) β-Hämolyse:- (3) Thermische Widerstandsfähigkeit bei
60°C, 30 Minuten- (4) Widerstandsfähigkeit gegenüber
40%iger Gallenlösung:- (5) Widerstandsfähigkeit gegenüber
6,5%iger Salzlösung:- (6) Alkali-Widerstandsfähigkeit bei
pH-Wert von 9,6:- (7) Zersetzbarkeit durch Natriumhippurat:- (8) Zersetzbarkeit durch Esculin:- (9) Löslichkeit in Gelatine:- (10) Sensibilität auf Bacitracin:+ (11) Zersetzbarkeit von Zucker:
Glucose:+ Maltose:± Lactose:- Saccharose:+ Sorbitol:- Salicin:- Glycerin:- Mannitol:- Trehalose:-

Bemerkungen:
+: positiv
±: pseudopositiv
-: negativ

Der erfindungsgemäß eingesetzte Streptococcus zooepidemicus FERM BP-784 läßt sich in einem Kulturmedium züchten, das vorzugsweise enthält: Kohlenstofflieferanten, anorganische Salze und ggf. Spuren von organischen Nährstoffen. Beispiele für geeignete Kohlenstofflieferanten sind organische Säuren und aliphatische Alkohole. Vorzugsweise werden als Kohlenstofflieferanten solche verwendet, die Zucker enthalten, z. B. Stärke-Hydrolysate, Glucose, Saccharose, Galactose und Fructose. Typische Beispiele für Stickstofflieferanten, die im Kulturmedium eingesetzt werden könnten, sind Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, sekundäres Ammoniumphosphat, d. h. Diammoniumhydrogenphosphat, Fleischextrakt, Peptone, Mischungen von verschiedenen Aminosäuren sowie Hefeextrakt. Zusätzlich zu diesen Komponenten können dem Nährmedium beispielsweise zugesetzt werden Salze wie Natriumchlorid, Magnesium-, Kalium-, Eisen-, Calcium- und andere Metallsalze der Phosphorsäure, Schwefelsäure und Kohlensäure sowie ferner ggf. Vitamine.

Die Zucker können dabei sämtlich in einem Mal einem Kulturmedium zugesetzt werden. In vorteilhafterer Weise können die Zucker jedoch einem Kulturmedium in kleinen Anteilen zugesetzt werden, um dadurch die Ausbeute an Hyaluronsäure zu erhöhen.

Die Züchtung kann dabei in vorteilhafter Weise unter aeroben Bedingungen erfolgen, beispielsweise mittels einer Schüttelkultur oder einer Belüftungskultur bei einer Temperatur von beispielsweise 30 bis 37°C. Insbesondere dann, wenn die Züchtung durch Einstellung eines pH-Wertes des Mediums auf 5,5 bis 9,0 mit einer wäßrigen alkalischen Lösung erfolgt, läßt sich die erwünschte Hyaluronsäure in stabiler Weise in großen Mengen erzeugen. Beispiele für wäßrige alkalische Lösungen sind Lösungen von einer oder mehreren üblichen alkalischen Verbindungen, wie beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, basische Aminosäuren und kurzkettige Amine. Nach der Züchtung kann die Hyaluronsäure, die sich in der Kultivierungsmischung angesammelt hat, nach üblichen bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren für Polysaccharide abgetrennt und gereinigt werden. Vorzugsweise erfolgt jedoch eine Ansäuerung der Kulturbrühe vor der Isolierung der Säure, da dadurch die Reinheit der gewonnenen Hyaluronsäure erhöht werden kann.

Beispielsweise läßt sich die Hyaluronsäure aus dem Kultivierungsmedium wie folgt isolieren: Die Zellen und andere unlösliche Bestandteile der Kulturbrühe werden zunächst durch Filtration oder Abzentrifugieren abgetrennt. Dann werden die in dem erhaltenen Filtrat vorhandenen Proteine entfernt, beispielsweise mittels Trichloressigsäure oder einer Mischung aus Chloroform und Isoamylalkohol, einem Absorptionsmittel, beispielsweise aktivierter Kohle oder aktiviertem Ton oder einem Protein-Zersetzungsenzym, z. B. Pepsin, Papain oder Pronase. Die in dem Kulturmedium verbliebenen Verunreinigungen von niedrigem Molekulargewicht können durch Ultrafiltration, Dialyse, Ausfällungsverfahren durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels, einem kationischen oberflächenaktiven Mittel oder durch eine Absorptionsmethode unter Verwendung eines Ionenaustauschharzes entfernt werden. Die erhaltene Hyaluronsäure läßt sich aus dem erhaltenen Kulturmedium beispielsweise durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknung oder ein Ausfällungsverfahren mittels eines organischen Lösungsmittels abtrennen.

Die Erfindung ermöglicht die Herstellung einer Streptolysin-freien Hyaluronsäure in hoher Ausbeute. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Hyaluronsäure läßt sich in vorteilhafter Weise zur Herstellung medizinischer Präparate für eine äußere Anwendung und zur Herstellung kosmetischer Präparate, die auf die Haut aufgebracht werden oder mit der Haut in Berührung kommen, verwenden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen. Sämtliche Prozentangaben beziehen sich auf Gewichtsprozent, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Zellen von Streptococcus zooepidemicus, isoliert aus der tunica conjunctiva bulbi von Meerschweinchen wurden bei einer Temperatur von 37°C in einem Gehirn-Herz-Infusionsmedium kultiviert. Die während der logarithmischen Wachstumsphase anfallenden Zellen wurden aufgenommen und die zentrifugale Abtrennung wurde bei vergleichsweise niedriger Temperatur wiederholt, worauf die abgetrennten Zellen sterilisiert wurden, indem sie zweimal mit einer 1/20 M Phosphatpufferlösung gewaschen wurden. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen wurden dann bei einer Temperatur von 37°C 20 Minuten lang in 1/20 m Phosphat-Pufferlösungen mit 100 bis 500 µg NTG/ml geschüttelt und dann auf Eis gekühlt. Die Zellen wurden dann zweimal mit 1/20 M Phosphat-Pufferlösung bei vergleichsweise niedriger Temperatur gewaschen und dann zur Inokulierung eines Gehirn-Herz-Infusionsmediums verwendet. Die Kultivierung erfolgte 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 37°C. Auf diese Weise wurde ein Mutant erhalten, der keine hämolytischen Eigenschaften aufwies und der viskose Kolonien bildete, wenn er auf einem Blut-Agar-Medium verteilt wurde. Dieser Mutant wurde in dem Fermentation Research Institute (Japan) als Streptococcus zooepidemicus FERM BP-784 hinterlegt.

Streptococcus zooepidemicus FERM BP-784 wurde in eine Schüttkultur in einer Teströhre gebracht, die ein Gehirn-Herz-Infusionskulturmedium enthielt. Nachdem Pferdeblut zu dem Kulturmedium zugesetzt worden war und dieses bei einer Temperatur von 37°C 2 Stunden lang stehengelassen wurde, hatten das Erythroyt, das sich am Boden der Teströhre abgeschieden hatte, und das Überstehende Ende die Farbe des Kulturmediums. Somit wurde bestätigt, daß dieser Mutant keine hämolytischen Eigenschaften besaß.

Beispiel 2

Verwendet wurde ein Kulturmedium mit 6% Glucose, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Polypepton und 0,005% eines Antischaummittels vom Polyethertyp. 10 l des Kulturmediums, mit Ausnahme der Glucose, wurden in ein 30 l fassendes Rüttel-Fermentationsgefäß eingebracht. Nach einer Sterilisation bei einer Temperatur von 121°C, 20 Minuten lang, wurde der zuvor gezüchtete Streptococcus zooepidemicus FERM BP-784 in das Kulturmedium inokuliert. Die Belüftungskultivierung erfolgte bei einer Temperatur von 35°C während 2 Tagen, wobei der pH-Wert des Mediums mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt wurde.

Die Glucose wurde getrennt vom Kulturmedium sterilisiert und ein Anteil von 0,2% der 6%igen Glucoselösung wurde dem Rüttel-Fermentationsbehälter zu Beginn der Kultivierung zugegeben, während der restliche 5,8%-Anteil etwa zu Beginn des logarithmischen Wachstums zugesetzt wurde, d. h. 5 bis 7 Stunden nach Beginn der Kultivierung. Aus Fig. 1 ergibt sich die Veränderung in der Erzeugung der Hyaluronsäure in g/l (×-×), die Glucosmenge (%) (⚫-⚫), und das Zellenwachstum (OD₆₆₀) (○-○) im Verlaufe der Kultivierungsdauer.

Die Bestimmung der Veränderungen während des Kultivierungsprozesses erfolgt wie folgt:

(1) Die erzeugte Menge an Hyaluronsäure wurde durch Wiegen der gereinigten, von einer Probe isolierten Hyaluronsäure bestimmt.
(2) Die Glucosemenge wurde mittels eines Zucker-Analysiergerätes vom Typ YSI, Modell 27 bestimmt.
(3) Das Zellenwachstum wurde durch Messung der Absorption einer Probe bei einer Wellenlänge von 660 nm in einem Spektrophotometer ermittelt.

Die erzeugte Menge an Hyaluronsäure stieg im Verlaufe der Zeit an und ebenfalls erhöhte sich die Viskosität des Kultivierungsmediums. Die Kultivierung wurde unterbrochen, als die Viskosität des Kultivierungsmediums fast das Maximum erreicht hatte (nach einem oder 2 Tagen nach Beginn der Kultivierung).

Die Kulturbrühe wurde dann zentrifugiert, um die unlöslichen Bestandteile von der Mischung abzutrennen. Die Proteinkomponenten, die in der erhaltenen Mischung vorhanden waren, wurden mittels einer Mischung aus Chloroform und Isoamylalkohol im Verhältnis 5 : 1 entfernt, worauf die in der anfallenden Mischung noch vorhandenen Substanzen von niedrigem Molekulargewicht durch Ultrafiltration entfernt wurden. Schließlich wurden 3,6 g Hyaluronsäure aus 1 l der Kultivierungsflüssigkeit nach einem Gefrier-Trocknungsverfahren gewonnen.

Das in Form von weißen Fasern erhaltene Hyaluronsäureprodukt war in Wasser löslich, jedoch unlöslich in organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Aceton, Chloroform und Ether und besaß keinen Geschmack und keinen Geruch. Das Infrarot-Absorptionsspektrum des Produktes bestätigte, daß das Produkt aus Hyaluronsäure bestand. In entsprechender Weise wurde durch Elektrophorese und einem Zerfallstest mittels Pilz-Hyaluronidase bestätigt, daß es sich bei dem erhaltenen Produkt um Hyaluronsäure handelte. Das Infrarot-Absorptionsspektrum der erhaltenen Hyaluronsäure ist in Fig. 2 dargestellt.

Claims

Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Hyaluronsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Kulturmedium Streptococcus zooepidemicus FERM BP-784 züchtet und aus dem Kultivierungsmedium Streptolysin-freie Hyaluronsäure isoliert.