DE3526565A1 - Resorufin-derivate, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung in fluoreszenzimmunoassays - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Resorufin-Derivate, die in Fluoreszenz-Immunoassays als fluoreszenz-markierte, nieder- oder hochmolekulare Verbindungen verwendet werden können, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.

Kompetitive Immunoassays basieren auf der Konkurrenz zwischen einem in einer Probe zu bestimmenden Liganden und einem markierten, in bekannter Konzentration vorliegenden Liganden um eine bekannte, aber begrenzte Anzahl von Ligandenbindungsstellen auf Antikörpern, welche sowohl für die zu bestimmenden als auch für die markierten Liganden spezifisch sind. Die Konzentration des zu bestimmenden Liganden in der Probe ist ausschlaggebend dafür, wieviel markierte Ligandenmoleküle an die Antikörper gebunden werden. Die Konzentration an Komplexen aus Antikörpern und fluoreszenzmarkierten Liganden kann mit spektroskopischen Methoden ermittelt werden. Sie ist umgekehrt proportional zu der in der Probe befindlichen zu bestimmenden Ligandenkonzentration. Als markierte Liganden, die der Probe mit dem zu bestimmenden Liganden in bekannter Konzentration zugesetzt werden, wurden ursprünglich überwiegend mit Radioisotopen markierte Liganden verwendet. Wegen der bekannten Nachteile einer Radioisotopenmarkierung gewinnt die Markierung mit fluoreszierenden Verbindungen immer mehr an Bedeutung. Fluoreszierende Verbindungen werden hierbei an Moleküle der zu bestimmenden Substanz gebunden. Diese Konjugate können dann prinzipiell für die unterschiedlichsten Fluoreszenzimmunoassays wie z. B. Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay, Fluoreszenz-Quenching-Immunoassays oder Fluoreszenz-Enhancement- Immunoassays, eingesetzt werden.

Als Markierung eignen sich prinzipiell alle Fluoreszenzfarbstoffe, die einen großen Extinktionskoeffizienten und eine hohe Quantenausbeute sowie ausreichende Stabilität unter den Testbedingungen besitzen. Bisher wurden deshalb üblicherweise Fluorescein oder Fluoresceinderivate verwendet (J. Landon & R.S. Kamel in: Immunoassays 80s, Univ. Park Press, Baltimore, Md., 1980, Seite 91-112). Die mit Fluorescein oder dessen Derivaten markierten hoch- oder niedermolekularen Verbindungen besitzen jedoch Nachteile. Absorptions- und Emissionsmaxima der fluorescein-markierten Substanzen liegen im Wellenlängenbereich zwischen 490 und 520 nm. Da ein erheblicher Teil analytischer Methoden vor allem der Fluoreszenzimmunoassay-Verfahren in Körperflüssigkeiten, wie z. B. Serum, durchgeführt wird, treten in dem genannten Spektralbereich Störungen durch die Eigenfluoreszenz biologischen Materials in den Proben auf. Hauptverantwortlich hierfür ist Bilirubin, das ebenfalls in dem Bereich um 500 nm Licht absorbiert und Fluoreszenz emittiert.

Manche Maßanordnungen erfordern Marker-Substanzen mit einem möglichst großen Stokes-Shift. Bei den Fluoresceinderivaten beträgt dieser Shift maximal 30 nm. Dies führt zu Lichtstreuungsproblemen, welche die Empfindlichkeit der Fluoreszenzmessungen beeinträchtigen. Für solche Fälle wären Verbindungen mit einem größeren Stokes-Shift als dem von Fluoresceinderivaten wünschenswert.

Aufgabe der vorliegenden Anmeldung war es, Verbindungen bereitzustellen, die diese Nachteile nicht mehr aufweisen. Gelöst wird diese Aufgabe durch die erfindungsgemäßen Resorufin-Derivate.

Gegenstand der Erfindung sind somit Resorufin-Derivate der allgemeinen Formlen Ia und Ib in denen
R¹, R² R³, R⁴ und R⁵, die jeweils gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, Halogen, eine Carboxy-, Carboxamido-, Niederalkoxycarbonyl-, Cyano-, Nitrogruppe, einen Niederalkyl- oder Niederalkoxy-Rest, die jeweils durch Carboxy-, Carboxamido-, Niederalkoxycarbonyl-, Cyano oder Nitrogruppen substituiert sein können, wobei R⁴ und R⁵ zusammen einen anellierten Aromaten vorstellen können,
Z ein Brückenglied
A den Rest eines Liganden oder eines Ligandenanalogons und
n eine ganze Zahl von 1 bis 200
bedeuten.

Die Niederalkyl- bzw. Niederalkoxygruppen in der Definition von R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ enthalten
Kohlenwasserstoffketten mit 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt sind Methyl und Ethyl bzw. Methoxy und Ethoxy.

Halogen in der Definition von R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ bedeutet Fluor, Chlor, Brom oder Jod. Chlor und Brom sind besonders bevorzugt.

Der von den Substituenten R⁴ und R⁵ gegebenenfalls gebildete anellierte Aromat ist vorzugsweise Benzol oder Nephthalin. Besonders bevorzugt ist Benzol. Die genannten Aromaten können unsubstituiert sein oder jeweils einen oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe SO₃H, CO₂H oder C₁-C₅-Alkoxy, tragen.

Das Brückenglied Z wird durch übliche Additions- bzw. Kondensationsreaktionen zwischen einem reaktiven Substituenten X¹ des Resorufin-Grundgerüstes und einer reaktiven Gruppe X² des Liganden bzw. Ligandenanalogons, gegebenenfalls unter Zwischenschalten einer bifunktionellen Verbindung X³-M-X⁴, in der X³ und X⁴ reaktive Gruppen und M den restlichen Molekülteil darstellen, gebildet.

In der folgenden Tabelle 1 sind beispielhaft einige mögliche Bedeutungen für solche reaktiven Substituenten X¹ und X² sowie die bei der Umsetzung resultierenden Brückenglieder Z aufgeführt.

Tabelle 1: Einige Bedeutungen für die reaktiven Gruppen X¹, X² und das daraus resultierende Brückenglied Z

* T bedeutet einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine elektronegative aktivierte Estergruppe, wie z. B. die N-Hydroxysuccinimidestergruppe

** T¹ bedeutet einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen

*** m bedeutet eine ganze Zahl von 0 bis 3

Als bifunktionelle Verbindung X³-M-X⁴ sind Diamine, Dicarbonsäuren sowie deren Derivate, Dialdehyde, Aminocarbonsäuren und weitere Verbindungen, die üblicherweise zur Herstellung derartiger Verknüpfungen eingesetzt werden, bevorzugt. Beispielhaft für solche Substanzen werden Piperazin, 1,2-Ethylen-diamin, Bernsteinsäure, Glutardialdehyd, Glycin, Sarcosin und β-Alanin genannt.

Unter einem Liganden in der Definition von A sind Haptene, wie Arzneistoffe, Steroide, Hormone, Kohlenhydrate usw., und Antigene, wie Proteine, z. B. Immunglobuline, Enzyme usw. zu verstehen.

Ein Ligandenanalogon in der Definition von A ist eine Substanz, die sich geringfügig von dem entsprechenden Liganden unterscheidet, aber noch eine vergleichbare Avidität gegenüber dem Liganden-spezifischen Antikörper besitzt. Der Unterschied zwischen Ligandenanalogon und Liganden kann z. B. auf einem zusätzlichen Substituenten oder einem fehlenden Molekülteil beruhen.

Grundsätzlich können alle Liganden zur Bildung erfindungsgemäßer Verbindungen Ia oder Ib verwendet werden, die freie Amino-, Hydroxyl-, Sulfhydryl- oder Carboxylgruppen tragen, über die sich erstere mit dem Resorufingrundkörper gegebenenfalls unter Zwischenschaltung eines Brückengliedes verknüpfen lassen. Besonders vorteilhaft sind freie Amino- oder Carboxylgruppen. Unter freien Aminogruppen sind sowohl primäre als auch sekundäre Aminogruppen zu verstehen. Besitzen Liganden keine geeigneten Gruppen, so müssen auf synthetischem Wege solche Gruppen, wie z. B. Amino- oder Carboxygruppen, eingeführt werden. Es ist ferner möglich, gegebenenfalls vorhandene, nicht reaktive funktionelle Gruppen von solchen Liganden chemisch zu aktivieren. Da die so entstandenen Substanzen nicht mehr völlig mit den ursprünglichen Verbindungen identisch sind, spricht man von Ligandenanaloga.

Die Zahl n gibt an, wieviele Resorufinmoleküle an einen Liganden oder ein Ligandenanalogon gebunden sind. Diese Zahl hängt ab von der Anzahl reaktiver Gruppen in dem entsprechenden Liganden oder Ligandenanalogon. Je mehr reaktive Gruppen der Ligand oder das Ligandenanalogon besitzen, desto mehr Resorufinmoleküle können gebunden werden. Die Zahl n liegt üblicherweise bei 1 bis 200, besonders bevorzugt bei 1 bis 100.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formeln Ia und Ib. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise Verbindungen der allgemeinen Formeln II a und II b in denen
R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ die in den allgemeinen Formeln I a und I b angegebenen Bedeutungen haben und X¹ eine reaktive Gruppe vorstellt,

a) mit einem Liganden oder Ligandenanalogon der allgemeinen Formel

in der
X² eine reaktive Gruppe und
A den Rest des Liganden bzw. Ligandenanalogons vorstellt,
oder

b) mit einer bifunktionellen Verbindung der allgemeinen Formel

in der
X³ und X⁴ reaktive Gruppen und
M den Rest der bifunktionellen Verbindung bedeuten,
und einem Liganden oder Ligandenanalogon der allgemeinen Formel

in der
X² und A die oben angegebene Bedeutung haben,
umsetzt, wobei gegebenenfalls bei einzelnen Verfahrensschritten Schutzgruppen eingeführt und nachträglich wieder abgespalten sowie einzelne reaktive Gruppen X¹, X², X³ und X⁴ in andere reaktive Gruppen überführt werden können.

Verbindungen der allgemeinen Formeln II a und II b erhält man in vorteilhafter Weise aus Nitrosresorcinderivaten der allgemeinen Formel V in der R³, R⁴ und R⁵ die in den allgemeinen Formeln Ia und Ib angegebene Bedeutung besitzen,
mit Resorcin-Derivaten der allgemeinen Formel VI in der R¹ und R² die in den allgemeinen Formeln Ia und Ib angegebene Bedeutung besitzen und X¹ eine reaktive Gruppe vorstellt.

Die Umsetzung von Verbindungen der allgemeinen Formel V mit Derivaten der allgemeinen Formel VI erfolgt zweckmäßigerweise in Anwesenheit von Braunstein und Schwerfelsäure bei niedrigen Temperaturen. Es entstehen dabei zunächst Resazurin-Derivate, die sich leicht in Resorufin-Derivate der allgemeinen Formeln IIa und IIb überführen lassen.

Die Reaktion der Verbindungen der allgemeine Formel V mit Verbindungen der allgemeinen Formel VI wird überlicherweise bei einer Temperatur zwischen -10 bis 50°C, vorzugsweise zwischen 0 und 36°C durchgeführt. Besonders schonend verläuft die Umsetzung wenn man die Substanzen der allgemeinen Formel V und der Formel VI bei ungefähr 0°C vermischt und das Reaktionsgemisch sich anschließend auf Raumtemperatur erwärmen läßt. Die Konzentration an Braunstein soll zweckmäßigerweise bei 0,5 bis 5, vorzugsweise bei 1 bis 2 mol/l liegen. Die Schwefelsäurekonzentration sollte 0,5 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 mol/l betragen.

Die Reduktion der zunächst entstehenden Resazurin-Derivate zu Resorufinen der allgemeinen Formlen IIa und IIb wird vorzugsweise in ammoniakalischer Lösung mit Zinkstaub durchgeführt (vgl. Nietzki et al., Ber. Dtsch. Chem. Ges. 22, 3020 [1889]) oder mit Natriumborhydrid. Als Lösungsmittel verwendet man zweckmäßigerweise Wasser-Alkohol-Gemische, bevorzugt ein Gemisch aus einem Teil Wasser mit 0 bis 4 Teilen Methanol. Pro Mol zu reduzierender Substanz werden 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 5 Mol Zinkstaub bzw. Natriumborhydrid zugegeben. Die Temperatur der Reaktionslösung wird dabei bei -10 bis +35°C, vorzugsweise +5 bis +10°C gehalten. Die genaue Einhaltung des Temperaturbereiches hat sich als notwendig für einen eindeutigen Reaktionsverlauf erwiesen. Ohne Kühlung führt die exotherme Reaktion zu Nebenprodukten, die schwer abtrennbar sind.

Unter den gewählten milden Bedingungen verläuft die Umsetzung zwischen den Substanzen der allgemeinen Formel V und der allgemeinen Formel VI eindeutig und mit guter Ausbeute. Der gewählte Syntheseweg ist variationsfähig. Dies eröffnet insbesondere im Hinblick auf die Darstellung unsymmetrisch substituierter Resorufin-Derivate zahlreiche Synthesemöglichkeiten. Bedingt durch dieses äußerst variationsfähige Herstellungsverfahren ist eine Vielzahl von Resorufin-markierten Verbindungen zugänglich, die durch ihre unterschiedlichen Substituenten an unterschiedlichen Positionen im Chromophor einen weiten Farbbereich abdecken.

Vor der Umsetzung der Resorufin-Derivate der allgemeinen Formel IIa und IIb mit Verbindungen der allgemeinen Formel III bzw. mit Verbindungen der allgemeinen Formeln IV und III werden erstere zweckmäßigerweise in Triacyldihydroresorufin-Derivate der allgemeinen Formel VII überführt, in der
R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und X¹ die in den allgemeinen Formeln Ia ud Ib angegebene Bedeutung haben und R⁶ ein Niederalkyl-, Aryl- oder Aralkylrest ist.

Niederalkyl in der Definition von R⁶ bedeutet eine Alkylgruppe mit 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt sind Methyl und Ethyl. Als Arylgruppe ist der Phenylrest besonders bevorzugt. Der Aralkylrest enthält vorzugsweise als Arylteil eine Phenylgruppe, der Alkylteil enthält 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatome. Als Aralkylgruppe ist der Benzylrest ganz besonders bevorzugt.

Zur Herstellung der Triacylderivate der allgemeinen Formel VII werden die entsprechenden Resorufin-Derivate der allgemeinen Formeln IIa und IIb zunächst mit einem starken Reduktionsmittel, wie z. B. Zinn II-chlorid oder Chrom-II-acetat, oder elektrochemisch reduziert. Zur Reduktion erwärmt man das Resorufin-Derivat 10 Minuten bis eine Stunde mit 2 bis 10, bevorzugt 2 bis 6 Äquivalenten Reduktionsmittel in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise Zinn-II-chlorid in 5 bis 35%iger wäßriger Salzsäure. Beim Abkühlen fällt die Dihydroverbindung aus. Die Acylierung erfolgt in üblicher Weise mit einem geeigneten Acylierungsmittel, z. B. Acetatanhydrid, Benzoylchlorid usw. Bevorzugt werden die Verbindungen der allgemeinen Formel VII in einem Eintopfverfahren durch reduktive Acylierung der Resorufin-Derivate IIa und IIb hergestellt. Das entsprechende Resorufin-Derivat wird hierzu mit 2 bis 6 Äquivalenten-Reduktionsmittel 5 Minuten bis 3 Stunden in Gegenwart des Acylierungsmittels in einem geeigneten Lösungsmittel unter Rückfluß erhitzt oder bei Raumtemperatur 4 bis 16 Stunden gerührt.

In den so erhaltenen Triacyl-dihydroresorufin-Derivaten VII kann die reaktive Gruppe X¹ vor der weiteren Umsetzung gegebenenfalls in eine andere reaktive Gruppe überführt werden. Insbesondere, wenn X¹ eine Carboxylgruppe bedeutet, ist es zweckmßig, diese in eine Carbonsäurechlorid-, Carbonsäureanhydrid oder reaktive Esterfunktion umzuwandeln. Dies kann auf die unterschiedlichste Art und Weise erfolgen, so z. B. mit Carbodiimiden, Alkoholen, Halogeniden, N-Hydroxysuccinimid usw. Es stehen dem Fachmann zahlreiche literaturbekannte Verfahren zur Verfühung. Besonders bevorzugt ist die Überführung der Carbonsäurefunktion in ein Carbonsäurechlorid, z. B. mit Thionylchlorid/Dimethylformamid oder Oxalylchlorid/Dimethylformamid, sowie in einen aktivierten Ester, z. B. den N-Hydroxysuccinimidester.

Besitzen Liganden oder Ligandenanloga freie Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppen, so können diese als reaktive Gruppen X² reagieren. Die Liganden bzw. Ligandenanloga X²-A können dann direkt mit Verbindungen II a und II b, gegebenenfalls nach vorheriger Umwandlung in Triacyl-dihydroresorufin-Derivate oder/und nach Aktivierung der Gruppe X¹ unter Bildung von Amid-, Ester oder Thioesterbindungen umgesetzt werden. Aufgrund ihrer Stabilität ist die Bildung mindestens einer Amidbindung besonders bevorzugt, wobei zu deren Bildung vorzugsweise von Verbindungen der allgemeinen Formeln II a/II b bzw. VII ausgegangen wird, in denen X¹ ein Carbonsäurehalogenid darstellt. Dessen Umsetzung mit einem aminogruppenhaltigen Liganden bzw. Ligandenanalogon erfolgt nach üblichen Methoden, beispielsweise in einem organischen Lösungsmittel, wie Dichlormethan, unter Zusatz eines tertiären Amins, wie Triethylamin, als Base. Je nach Größe des Liganden bzw. Ligandenanalogons und damit zusammenhängend der Zahl seiner freien Aminogruppen und der eingesetzten Menge an Verbindungen II a/II b können pro Liganden- bzw. Ligandenanalogonmolekül mehrere Chromophere gebunden werden.

Werden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formeln Ia und Ib Triacyl-Derivate der allgemeinen Formel VII eingesetzt, so müssen nach der Umsetzung die als Schutzgruppen verwendeten Acylreste des Dihydroresorufinteils selektiv abgespalten und der resultierende Leukofarbstoffrest zum Chromophor der Verbindung Ia/Ib oxidiert werden.

Die O-Acylreste des Dihydroresorufinteils werden besonders vorteilhaft durch Reaktion mit 2 bis 10 Mol, bevorzugt 2 bis 4 Mol Natriumsulfit in einem Gemisch aus Wasser und einem wasserlöslichen Lösungsmittel, wie 1,4-Dioxan, Methanol oder Ethanol, bevorzugt Wasser/1,4-Dioxan 1 : 1, abespalten. Die Reaktionstemperatur beträgt 20 bis 100°C, bevorzugt 80 bis 100°C. Unter diesen Reaktionsbedingungen lassen sich N-Acyldihydroresorufinderivate in hohen Ausbeuten herstellen.

Die Oxidation des Dihydroresorufinteils zu Verbindungen der allgemeinen Formeln Ia und Ib kann mit milden Oxidationsmitteln im basischen pH-Bereich durchgeführt werden. Bevorzugt wird Kaliumhexacyanoferat-III, welches in 2 bis 6-fachem molarem Überschuß, besonders bevorzugt in 2 bis 4-fachem molarem Überschuß gegenüber dem Leukofarbstoff bei pH 8 bis 9 in einem Gemisch aus Wasser und einem wasserlöslichen Lösungsmittel, wie 1,4-Dioxan, Methanol oder Ethanol, bevorzugt Wasser/Methanol 3 : 1, verwendet wird. Die Reaktionstemperatur beträgt 10 bis 40°C, bevorzugt ist Raumtemperatur.

Besonders vorteilhaft kann die selektive Abspaltung des schützenden N-Acylrestes und die Oxidation des Dihydroresorufinteils in einer Eintopfreaktion erfolgen. Hierzu wird das N-acylierte Dihydroresorufinderivat in Wasser/Methanol 3 : 1 zunächst mit 2 bis 4 Mol Natriumhydrogencarbonat und einer äquimolaren Menge 1 N Natronlauge und anschließend mit einem 2 bis 4-fachem molarem Überschuß an Kaliumhexacyanoferat-III versetzt. Nach etwa 10 Minuten bis 2 Stunden, bevorzugt 0,5 Stunden bei Raumtemperatur ist die Reaktion abgeschlossen.

In manchen Fällen ist es zweckmäßig, die Verbindungen IIa/IIb nicht direkt mit dem Liganden bzw. dem Ligandenanalogon III, sondern unter Zwischenschalten einer Spacergruppierung X³-M-X⁴ zu verknüpfen. Als Spacer können alle üblicherweise zu solchen Zwecken eingesetzten Verbindungen mit mindestens zwei reaktiven Gruppen verwendet werden. Besonders bevorzugt sind Diamine oder Aminocarbonsäuren. Die Wahl richtet sich dabei nach der Art der funktionellen Gruppen X¹ und X², die mit dem Spacer verknüpft werden sollen.

Bedeutet X¹ in den allgemeinen Formeln IIa/IIb bzw. VII eine Carbonsäurefunktion, bzw. eine hiervon abgeleitete reaktive Gruppe und stellen die reaktiven Gruppen X² des Liganden bzw. Ligandenanalogons Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppen dar, so wird man zweckmäßigerweise einen Spacer X³-M-X⁴ wählen, wobei X³ eine Aminogruppe und X⁴ eine Carbonsäurefunktion bzw. ein reaktives Derivat hiervon bedeuten. Das Aminoende kann an die Carbonsäurefunktion der Substanzen IIa/IIb bzw. VII, das Carboxylende an den Liganden oder das Ligandenanalogon X²-A gebunden werden. Stellen jedoch sowohl X¹ als auch X² jeweils eine Carbonsäurefunktion bzw. ein hiervon abgeleitetes aktiviertes Derivat vor, so haben sich Diamine als Spacer bewährt.

Die Umsetzung von Resorufin-Derivaten der allgemeinen Formel II a und II b mit einer bifunktionellen Spacergruppierung IV und dem Liganden bzw. Ligandenanalogon III erfolgt vorteilhaft in zwei Stufen. Zunächst können die Verbindungen IIa/IIb, gegebenenfalls nach vorherigem Überführen in die aktiven Verbindungen VII mit dem Spacer IV verknüpft werden. Die hieraus resultierenden Derivate können dann im zweiten Schritt mit dem Liganden bzw. Ligandenanalogon III umgesetzt werden. Es ist selbstverständlich auch die umgekehrte Vorgehensweise möglich, im ersten Schritt den Spacer IV an den Liganden bzw. an das Ligandenanalogon III zu binden und das erhaltene Produkt im zweiten Schritt mit dem Resorufin-Derivat IIa/IIb bzw. der aktivierten Verbindung VII reagieren zu lassen.

Als Aminocarbonsäuren werden bevorzugt α-Aminocarbonsäuren eingesetzt. Als besonders vorteilhaft haben sich Glycin, Alanin und Sarcosin erwiesen. Die Kupplung von Resorufinderivaten der allgemeinen Formeln IIa/IIb bzw. VII mit Aminocarbonsäuren unter Ausbildung einer Amidbildung erfolgt nach Methoden, die jedem Fachmann geläufig sind. Ganz besonders vorteilhaft ist hierzu der Einsatz von Methyl- oder tert-Butylestern der entsprechenden Aminosäuren. Nach erfolgter Amidbildung werden gegebenenfalls vorher eingeführte Schutzgruppen nach üblichen Methoden selektiv abgespalten. Wird beispielsweise ein aktiviertes Derivat VII mit einer carboxygeschützten α-Aminocarbonsäure umgesetzt, so ist es erforderlich, die O- und N-Acylgruppen des Dihydroresorufingerüstes selektiv zu hydrolisieren, den Leukofarbstoff wieder zum Resorufinsystem zu oxidieren und abschließend die Carboxyschutzgruppe der gebundenen Aminocarbonsäure unter üblichen Bedingungen, bevorzugt mit Trifluoressigsäure, abzuspalten. Die freie Carboxylgruppe kann dann zur Konjugation eines Liganden oder Ligandenanalogons III in entsprechender Weise, wie für Resorufinderivate der allgemeinen Formeln IIa und IIb beschrieben, aktiviert werden. Auch die Durchführung der Konjugation selbst erfolgt analog, wie für die direkte Konjugation von Liganden oder Ligandenanaloga an Resorufinderivate der allgemeinen Formeln IIa und IIb ausgeführt.

Im Falle carboxylgruppenhaltiger Liganden oder Ligandenanaloga ist es zweckmäßig, Resorufinderivate der allgemeinen Formeln IIa/IIb bzw. VII in aminogruppenhaltige Verbindungen überzuführen, die sich dann mit den carboxylgruppenhaltigen Liganden bzw. Ligandenanaloga unter Amidbindungsbildung umsetzen lassen. Hierzu hat sich als besonders einfach und vorteilhaft die Umsetzung von Verbindungen IIa/IIb bzw. VII mit Diaminen (Formel IV mit X³ und X⁴ Aminogruppe) erwiesen. Bevorzugte Diamine in diesem Sinne sind z. B. Piperazin, 1,2-Diaminoethan oder 1,-Diaminopropan.

Die Überführung von Resorufinderivaten der allgemeinen Formeln IIa/IIb bzw. VII mit Diaminen in Derivate mit freier Aminogruppe erfolgt nach Methoden, die jedem Fachmann geläufig sind. Um besonders hohe Ausbeuten an monosubstituierten Diaminen zu erzielen, werden bevorzugt solche Diamine zur Reaktion gebracht, die nur eine reaktive Aminogruppe besitzen und deren zweite funktionelle Gruppe durch eine Schutzgruppe blockiert ist. Grundsätzlich sind alle üblichen Aminoschutzgruppen verwendbar, die ohne Beeinträchtigung der Amidbindungen wieder abgespalten werden können. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung der t-Butoxycarbonyl- bzw. der Benzoyl-oxy-carbonyl-Schutzgruppe erwiesen.

Nach der Reaktion monogeschützter Diamine mit Resorufinderivaten der allgemeinen Formeln IIa/IIb bzw. VII werden gegebenenfalls eingeführte Schutzgruppen wieder abgespalten und gegebenenfalls als Zwischenstufe auftretender Leukofarbstoff zum Resorufinsystem oxidiert. Die Abspaltung der Aminoschutzgruppe des gebundenen Diamins erfolgt hierbei unter üblichen Bedingungen, bevorzugt mit Trifluoressigsäure.

Die so erhaltenen aminogruppenhaltigen Resorufinderivate können in üblicher Weise mit Liganden oder Ligandenanaloga III, die als reaktive Gruppen X² Carboxylgruppen besitzen, konjugiert werden. Vorteilhafterweise sollen diese Carboxylgruppen aktiviert sein. Dies kann in der oben beschriebenen Weise erfolgen. Bevorzugt ist der Einsatz von Liganden oder Ligandenanaloga der allgemeinen Formel III, in dr X² aktivierte Estergruppen bedeuten. Als besonders vorteilhaft haben sich vor allem N-Hydroxysuccinimidester erwiesen. Die Durchführung der Konjugation selbst erfolgt grundsätzlich analog der oben für die direkte Konjugation von Resorufinderivaten mit Liganden oder Ligandenanaloga beschriebenen Vorgehensweise unter Berücksichtigung der vertauschten Rollen der funktionellen Gruppen.

Vorzugsweise erfolgt die weitere Umsetzung der Produkte, die nach der Verknüpfung von Resorufinderivaten IIa/IIb bzw. VII mit einem Zwischenglied X³-M-X⁴ der Formel IV erhalten werden, mit niedermolekularen Liganden X²-A, z. B. Haptenen, in einem Gemisch aus Wasser oder Puffer und einem wasserlöslichen Lösungsmittel, wie z. B. 1,4-Dioxan, Methanol oder Ethanol. Bevorzugt wird die Mischung 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,5/1,4-Dioxan im Verhältnis 1 : 1. Die Konjugation hochmolekularer Verbindungen, der allgemeinen Formel III wie z. B. von Proteinen, erfolgt bevorzugt in Puffer, besonders vorteilhaft in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0 bis 9,0. Die Reaktionstemperatur kann jeweils 10 bis 35°C betragen. Bevorzugt wird die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt. Es ist möglich, den Reaktionsverlauf dünnschichtchromatographisch zu verfolgen. Die Reaktionsdauer kann zwischen 1 bis 24 Stunden betragen, meist ist die Reaktion bereits nach 1 bis 18 Stunden vollständig abgelaufen.

Aufgrund ihrer besonders günstigen spektralen Eigenschaften ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formeln Ia und Ib in fluoreszenzimmunologischen Verfahren.

In heterogenen Immunoassays ist eine Trennung von an Antikörper gebundenen Liganden und freien Liganden durch Fällung mit geeigneten Substanzen oder durch Verwendung von an feste Träger gebundenen Antikörpern erforderlich, bevor entweder die Konzentration freier oder gebundender Liganden bestimmt wird. Im homogenen Immunoassay erfolgt die Untersuchung der Antikörper-Liganden-Komplexbildung in der Probe ohne eine solche Abtrennung. Zu den homogenen Immunoassay-Methoden sind beispielsweise Fluoreszenz-Quenching-, Fluoreszenz-Enhancement- und Fluoreszenzpolarisations-Methoden zu zählen, bei denen fluoreszierende Substanzen als Markierungsmittel verwendet werden. Besonders die letztgenannte Methode litt bisher unter den in der Einleitung bereits genannten Nachteilen der verwendeten gebräuchlichen Fluoreszenzmarker. Da die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formeln Ia oder Ib Absorptions- und Emissionsmaxima besitzen, die weitgehend außerhalb des in Körperflüssigkeiten durch seine Eigenfluoreszenz störenden biologischen Materials liegen, sind sie besonders zur Verwendung in Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays (FPIA) geeignet. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen liegt darin, daß sie bei geeigneter Substitution einen besonders hohen Stokes-Sift bis zu etwa 70 nm aufweisen.

FPIA-Verfahren basieren grundsätzlich auf dem Prinzip üblicher Fluoreszenz-Immunoassays.

Werden geeignete fluoreszenzmarkierte Liganden mit linear polarisiertem Licht zur Fluoreszenz angeregt, so kann aufgrund der geringen zeitlichen Verzögerung zwischen Anregung und Emission, das Molekül, bevor es Strahlung emittiert, rotieren. Damit wird die Ebene des linear polarisierten Lichts ebenfalls um einen bestimmten Winkel gedreht. Eine Vielzahl von Molekülen kann innerhalb dieses kurzen Zeitraums durch Rotationsdiffusion zu einer gewissen Depolarisation der Fluoreszenzemission führen. Für die Polarisation der emittierten Fluoreszenz gilt, daß sie um so größer ist, je größer das Molekül, und infolgedessen je langsamer die Rotation ist. Diesen Zusammenhang kann man für die Messung der Bindung von Liganden an Antikörper nutzen, denn freie, markierte Liganden besitzen ein kleineres Molekülvolumen als Komplexe aus an Antikörper gebundenen, markierten Liganden. Die Polarisation ist umgekehrt proportional zu der in der Probe befindlichen zu bestimmenden Ligandenkonzentration.

Die Konzentration des markierten Liganden oder Ligandenanalogons und des für solche immunologischen Verfahren erforderlichen Antikörpers richten sich nach der verwendeten Meßapparatur sowie nach den jeweiligen charakteristischen Eigenschaften des verwendeten markierten Liganden oder Ligandenanalogons und des Antikörpers selbst. Grundsätzlich hängen diese Konzentrationen natürlich auch von der Konzentration des zu bestimmenden Liganden ab und müssen deshalb empirisch festgelegt werden. Diese Festlegung kann von jedem Fachmann durch einfache Optimierung getroffen werden.

Die Ligandenkonzentration die bestimmt werden soll, schwankt im allgemeinen von etwa 10^-2 bis etwa 10^-13 molar. Besonders vorteilhaft ist es, für die Messung eine Ligandenkonzentration in der zu bestimmenden Probe von etwa 10^-4 bis etwa 10^-10 molar einzustellen. Höhere Ligandenkonzentrationen können nach Verdünnung der ursprünglichen Probe gemessen werden.

Die Messung erfolgt bei bestimmten pH-Werten, welche von etwa 3 bis 12 reichen können. Gewöhnlich liegen sie im Bereich von etwa 5 bis 10, vorzugsweise im pH-Bereich von etwa 6 bis etwa 9. Zur Erzielung und Aufrechterhaltung des pH-Wertes während der Messung können unterschiedliche Puffer verwendet werden, wie z. B. Borat-, Phosphat-, Carbonat- oder Tris-Puffer. Welcher Puffer verwendet wird, ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend. Die Auswahl richtet sich in erster Linie nach dem eingesetzten Antikörper, nach dem Liganden, der bestimmt werden soll, sowie dem eingesetzten Fluoreszenzmarker.

Vorzugsweise wird die FPIA-Methode bei konstanter Temperatur durchgeführt. Normalerweise kann eine Temperatur im Bereich von etwa 0 bis 50°C, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 40°C gewählt werden.

Der genaue Zusammenhang zwischen Polarisation und Konzentration eines zu bestimmenden Liganden oder Ligandenanalogans ist jeweils aus Eichkurven ablesbar. Diese werden erhalten, indem die Polarisationswerte von Lösungen unterschiedlicher aber bekannter Konzentrationen entsprechender Substanzen gemessen werden. Unbekannte Ligandenkonzentrationen einer zu untersuchenden Probe können dann bei Kenntnis der Polarisation aus solchen Eichkurven ermittelt werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Verdeutlichung der Erfindung. Sie sollen die grundsätzliche Möglichkeit der Markierung nieder- oder hochmolekularer Verbindungen und deren Verwendung in fluoreszenzimmunologischen Verfahren zeigen.

Beispiel 1 Resorufin-4-carbonsäure [3-(1-diphenylhydantoinyl)ethyl-carbonyl]-piperazid

a) Resorufin-4-carbonsäure
16 g Nitrosoresorcin, 15,5 g 2,6-Dihydroxybenzoesäure und 8,6 g Braunstein werden in 200 ml Methanol suspendiert und auf 0°C gekühlt. Dazu tropft man 10,6 ml konz. Schwefelsäure und rührt dann noch 2 Stunden bei Raumtemperatur. Die ausgefallene rote Resazurin-4-carbonsäure wird abfiltriert, mit Methanol gewaschen und getrocknet.

Das Resazurinderivat wird in 200 ml Wasser und 50 ml 25%igen Ammoniak aufgenommen und filtriert. Zu dem blauen Filtrat gibt man unter Eiskühlung portionsweise 50 g Zinkstaub und läßt auf Raumtemperatur erwärmen. Der Reduktionsverlauf läßt sich leicht dünnschichtchromatographisch verfolgen (Fließmittel: Methanol/Essigester 1 : 1; Kieselgel DC-Platten). Die Reaktionslösung wird filtriert, danach säuert man das Filtrat mit Eisessig und wenig konz. Salzsäure an. Die ausgefallene Resorufin-4-carbonsäure wird abfiltriert und über Phosphorpentoxid im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 16,33 g
Rf (Kieselgel; Fließmittel : n-Butanol/Eisessig/Wasser 4 : 1 : 1) = 0.4.

b) N,O,O-Triacetyldihydroresorufin-4-carbonsäure
12,9 g Resorufin-4-carbonsäure werden in 30 ml Eisessig und 30 ml Acetanhydrid aufgenommen, mit 27,6 g Zinn-II-chlorid versetzt und 1 Stunde bei 80°C gerührt. Man gibt auf 600 ml Eiswasser, rührt 1 Stunde und filtriert den Niederschlag ab. Nach Trocknen wird der Feststoff in 500 ml Aceton aufgenommen. Man saugt ab, dampft das Filtrat ein und erhält nach Trocknen 11,3 g Produkt.
¹H-NMR ([D₆]-DMSO): δ = 2.24, 2.26 und 2.29 (je s, 9 H); 6.94 (dd, J = 8.5 und 2.2 Hz, 1 H); 6.98 (d, J = 2.2 Hz, 1 H); 7.04 (d, J = 9 Hz, 1 H); 7.61 (d, J = 8,5 Hz, 1 H); 7.67 ppm (d, J = 9 Hz, 1 H).
Rf (Kieselgel, Fließmittel : Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,46

c) N,O,O-Triacetyldihydroresorufin-4-carbonsäurechlorid
38,5 g des in Beispiel 1b) beschriebenen Triacetats werden mit 54 ml Oxalylchlorid versetzt und auf 0°C gekühlt. Dazu gibt man einen Tropfen Dimethylformamid und läßt auf Raumtemperatur erwärmen. Das Edukt löst sich dabei unter Gasentwicklung. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein, nimmt je 3 mal mit 200 ml trockenem Methylenchlorid auf und dampft wiederum zur Trockne ein.
Ausbeute: 41 g.

c) N-BOC-Piperazin
12,61 g N-Benzhydrylpiperazin (EMKA-Chemie) werden in 100 ml 1,4-Dioxan/Wasser 3 : 1 aufgenommen. Dazu tropft man 12,0 g Di-tert-butyldicarbonat, gelöst in 50 ml 1,4-Dioxan. Nach 1/2 Stunde Rühren tropft man 50 ml Wasser zu, filtriert und trocknet den Niederschlag.
Ausbeute: 16,2 g N-BOC-N′-Benzhydrylpiperazin.
Rf (Kieselgel, Laufmittel : Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,92.

7 g N-BOC-N′-Benzhydrylpiperazin werden in 100 ml Essigester und 5 ml Eisessig aufgenommen. Mit 0,3 g Palladium auf Aktivkohle wird hydriert, danach vom Katalysator filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird mit 100 ml Wasser und 20 ml 1 N HCl versetzt und filtriert. Man extrahiert das Filtrat zweimal mit Essigester und macht dann die wässrige Phase mit Natronlauge basisch. Das ölig ausgefallene produkt wird mit Dichlormethan extrahiert. Nach Trocknen mit Natriumsulfat und Eindampfen erhält man 3,2 g N-BOC-Piperazin als Öl, das nach einigen Tagen vollständig kristallisiert.
Rf (Kieselgel, Laufmittel : Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,05 wird mit Ninhydrin blau.

e) N,O,O-Triacetyldihydroresorufin-4-carbonsäure- (N′-BOC-piperazid)
Zu 25 g des in Beispiel 1c) beschriebenen Säurechlorids und 17,3 ml Triethylamin in 450 ml Dichlormethan tropft man bei 0°C eine Lösung von 13,8 g N-BOC-Piperazin in 50 ml Dichlormethan. Man rührt noch 1 Stunde ohne Kühlung, schüttelt dreimal mit Wasser aus und dampft die organische Phase ein.
Ausbeute: 36,0 g.
Rf (Kieselgel, Laufmittel : Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) = 0,64

f) N-Acetyldihydroresorufin-4-carbonsäure-(N′-BOC-piperazid)
34,3 g des in Beispiel 1e) beschriebenen Triacetats und 17,1 g Natriumsulfit werden 1 Stunde bei 60°C in 500 ml 1,4-Dioxan/Wasser 1 : 1 gerührt. Man dampft anschließend ein, nimmt in Essigester auf, filtriert von den unlöslichen Salzen und chromatographiert an 2 l Kieselgel (Eluens: Essigester/Dichlormethan 4 : 1, sobald das Produkt eluiert wird, wird auf reinen Essigester umgestellt).
Ausbeute: 14,8 g
Rf (Kieselgel, Laufmittel : Essigester/Dichlormethan 4 : 1) : 0,28.

g) Resorufin-4-carbonsäure-(N′-BOC-piperazid)
5 g der in Beispiel 1f) beschriebenen N-Acetylverbindung werden in 200 ml Methanol und 600 ml Wasser gelöst. Man gibt 1,8 g Natriumhydrogencarbonat und 10,7 ml 1 N NaOH zu, danach 14 g Kalumhexacyanoferrat-III. Nach 1/2 Stunde Rühren bei Raumtemperatur stellt man den pH auf 5. Das Produkt fällt aus und wird abgesaugt.
Ausbeute: 2,72 g.
Rf (Kieselgel, Laufmittel : Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,28.

h) Resorufin-4-carbonsäurepiperazid-trifluoracetat
1 g des in Beispiel 1g) beschriebenen BOC-Derivats werden 15 min in 20 ml Trifluoressigsäure stehengelassen. Man dampft ein, digeriert mit Ether und filtriert das Produkt ab.
Ausbeute: 0,96 g
Rf (Kieselgel, Laufmittel : Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,02.

i) Kopplung von Resorufin-4-carbonsäurepiperazid mit 3-(1-Diphenylhydantoinyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester
191 mg des in Beispiel 1h) beschriebenen Piperazid-trifluoracetats und 210 mg 3-(1-Diphenylhydantoinyl)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (hergestellt aus Diphenylhydantoin-Natrium-Salz und 3-Brom-essigsäureethylester analog Cook et al., Res. Communications in Chemical Pathology and Pharmacology 5 (1973), S. 767) werden 15 Stunden in 20 ml Dioxan und 20 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 8,5 gerührt. Man filtriert vom ausgefallenen Produkt, dampft das Filtrat ein und chromatographiert an Kieselgel RPl8 (Eluens: Isopropanol), wobei zusätzlich Produkt gewonnen wird. Man kristallisiert aus Essigester/Methanol und erhält insgesamt 250 mg Kopplungsprodukt.
Rf (Kieselgel, Laufmittel : Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1): 0,61
1H-NMR([D₆]-DMSO); δ = 2.6-2.8 (m, 2H); 3.0-3.8 (m, 10H); 6,74 (d, J = 2.2 Hz, 1H); 6.82 (d, J = 9.5 Hz, 1H); 6,91 (dd, J = 9,5 und 2.2 Hz); 7.25-7.33 (m, 10H); 7,55 und 7,66 ppm (je d, J = 9.5 Hz, 2H).
UV/VIS(0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5): λ _max = 576,8 nm.
Fluoreszenzemission: λ _max = 592 nm.

Beispiel 2 Kopplung von Resorufin-4-carbonsäurepiperazid mit 3-(1-Diphenylhydantoinyl)essigsäure-N-hydroxysuccinimidester

Analog Beispiel 1i) erhält man aus 365 mg Resorufin-4-carbonsäurepiperazid-trifluoracetat und 339 mg 3-(1-Diphenylhydantoinyl)essigsäure-N-hydroxysuccinimidester 210 mg gewünschtes Produkt.
Rf (Kieselgel, Fließmittel : n-Butanol/Eisessig/Wasser 4 : 1 : 1): 0,82.
¹H-NMR ([D₆]-DMSO: δ = 3.2-4.5 (m 10H); 6.60 (d, J = 2.4 Hz, 1 H);
6.71 (d, J = 9.5 Hz, 1 H); 6.80 (dd, J = 9.05 und 2.4 Hz, 1 H);
7.39 ("s", 10 H); 7.52 (d, J = 9.5 Hz, 1 H); 7.61 (d, J = 9.0 Hz, 1 H);
9.65 ppm (s, 1 H).
UV/VIS (0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0): λ _max = 575,4 nm.
Fluoreszenzemission: λ _max = 592 nm.

Beispiel 3 Kopplung von Resorufin-4-carbonsäurepiperazid mit N-BOC-L-Thyroxin-N-hydroxysuccinimidester

Analog Beispiel 1i) erhält man aus 212 mg Resorufin-4-carbonsäurepiperazid-trifluoracetat und 419 mg N-BOC-L-Thyroxin-N-hydroxysuccinimidester 320 mg Produkt.
Rf (Kieselgel, Fließmittel : Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,58
Den N-BOC-L-Thyroxin-N-hydroxysuccinimidester erhält man auf folgende Weise:

a) N-BOC-Thyroxin
Die Lösung von 10 g (12,5 mmol) L-Tyhroxin-Na-Salz · H₂O in einem Gemisch aus 300 ml Dioxan/Wasser = 2/1 und 15 ml 1 N Natronlauge wird mit 3 g (13,75 mmol) Di-tert.Butyl-dicarbonat (BOC)₂O versetzt und 2 Std. unter Lichtausschluß bei Raumtemperatur gerührt.
Mit 2 M KHSO₄-Lsg. wird auf pH 2 gestellt, mit Essigester extrahiert, der Essigester-Extrakt mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der feste Rückstand wird mit Petrolether angerieben, abgesaugt und im Exsikkator getrocknet.
Ausbeute: 9,45 g = 86% d. Th.
Rf (Kieselgel, Laufmittel: CHCL₃/Ligroin/Essigsäure = 6 : 3 : 1): = 0,6

b) N-BOC-Thyroxin-N-hydroxysuccinimidester
Zu einer Lösung von 8,8 g L-BOC-Thyroxin in 200 ml Ethylenglykoldimethylether werden 1,2 g (9,5 mmol) N-Hydroxysuccinimid gegeben. Die Lösung wird auf 10°C abgekühlt und tropfenweise mit einer Lösung von 2,3 g (9,9 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 40 ml Ethylenglykoldimethylether versetzt. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abgesaugt und das Filtrat im Vakuum bei 40°C eingedampft. Der Rückstand wird mit Isopropanol angerieben und abgesaugt. Im Exsikkator wird bei Raumtemperatur getrocknet.
Ausbeute: 9,19 g = 94% d. Th. (Gesamtausbeute bez. auf Thyroxin = 81%)
Rf (HPTLC-RP 18; Laufmittel: Nitromethan/Ethanol = 9 : 1): 0,8; oder (HPTLC-RP 18; Laufmittel: Acetonitril/H₂O = 8 : 2): 0,6
¹H-NMR ([D₆]DMSO): δ = 1,36 (s, 9H); 2,81 (s, 4H); 2,9-3,2 (m, 2H); 4,5-4,9 (m, 1H); 7,03 (s, 2H); 7,63 (d, j = 9 Hz, 1H); 7,90 (s, 2H); 9,2 (s, 1H);

Beispiel 4 Kopplung von Resorufin-4-carbonsäurepiperazid mit 3-O-[3-(N-Succinimidoxycarbonyl)propyl]östradiol

Analog Beispiel 1i) erhält man aus 212 mg Resorufin-4-carbonsäurepiperazid-trifluoracetat und 220 mg 3-O-[3-(N-Succinimidyloxycarbonyl)propyl]östradiol 295 mg Produkt.
Rf (Kieselgel, Fließmittel: Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,58

3-O-[3-(N-Succinimidoxycarbonyl)propyl]östradiol erhält man in üblicher Weise aus 3-O-Carboxypropyl-Östradiol (aus Östradiol und Brombuttersäure analog Lübke et al. in Immunologische Teste für niedermolekulare Wirkstoffe, G. Thieme Verlag, Stuttgart, S. 94) und N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid.

Beispiel 5 Kopplung von Resorufin-4-carbonsäurepiperazid mit N-[3-(N-Succinimidoxycarbonyl)propyl]phenobarbital

Analog Beispiel 1i) erhält man aus 212 mg Resorufin-4-carbonsäurepiperazid-trifluoracetat und 205 mg N-[3-(N-Succinimidoxycarbonyl)propyl]phenobarbital 220 mg Produkt.
Rf (Kieselgel, Fließmittel:Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,45

N-[3-(N-Succinimidoxycarbonyl)propyl]-phenobarbital erhält man in üblicher Weise aus Phenobarbital-1-buttersäure (T. Nistikawa et al., Clin. Chim. Acta 91 (1979) S. 59) und N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid.

Beispiel 6 Kopplung von Resorufin-4-carbonsäurepiperazid mit Teophyllin-7-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester

Aus 212 mg Resorufin-4-carbonsäurepiperazid-trifluoracetat und 175 mg Theophyllin-7-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester erhält man analog Beispiel 1i) 200 mg Produkt.
Rf (Kieselgel, Fließmittel:Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,44

Theophyllin-7-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester erhält man in üblicher Weise aus Theophyllin-7-propionsäure (T. Nistikawa et al., Chem. Pharm. Bull 27 (1979) S. 893) und N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von Dicylohexylcarbodiimid.

Beispiel 7 Kopplung von N-(4-Resorufinylcarbonyl)sarcosin-N′-hydroxysuccinimidester mit 1-(2-Aminoethyl)diphenyl-hydantoin

a) N,O,O-Triacetyldihydroresorufin-4-carbonsäure (tert-butoxycarbonylmethyl)methylamid
10 g des in Beispiel 1c) beschriebenen Säurechlorids werden analog Beispiel 1e) mit Sarcosin-tert.-butylester umgesetzt.
Ausbeute: 7,5 g
Rf (Kieselgel, Fließmittel:Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,77

b) N-Acetyldihydroresorufin-4-carbonsäure(tert.-butoxycarbonylmethyl)me-thylamid
7,5 g des in Beispiel 7a) beschriebenen Produkts werden analog Beispiel 1f) deacetyliert.
Ausbeute: 5,2 g
Rf (Kieselgel, Fließmittel:Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,56.

c) Resorufin-4-carbonsäure(tert.-butoxycarbonylmethyl) methylamid
4,5 g des in Beispiel 7b) beschriebenen Produkts werden analog Beispiel 1g) umgesetzt.
Ausbeute: 2,6 g
Rf (Kieselgel, Fließmittel:Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,64.

d) Resorufin-4-carbonsäure(carboxymethyl)methylamid
0,55 g des in Beispiel 7c) beschriebenen Produkts werden 1 Stunde bei Raumtemperatur in 6 ml Trifluoressigsäure stehengelassen. Man dampft zur Trockne ein, reibt mit Ether an und filtriert.
Ausbeute: 0,45 g
Rf (Kieselgel, Fließmittel:Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,11.

e) N-(4-Resorufinylcarbonyl)sarcosin-N′-hydroxysuccinimidester
200 mg des Produkts aus Beispiel 7d) werden mit 72 mg N-Hydroxysuccinimid und 138 mg Dicyclohexylcarbodiimid 14 Stunden in 40 ml Tetrahydrofuran gerührt. Man filtriert vom ausgefallenen Harnstoff, dampft ein und chromatographiert an Kieselgel RP 18 (Eluens: Nitromethan/Ethanol 4 : 1).
Ausbeute: 150 mg.
Rf (Kieselgel RP-18, Fließmittel:Nitromethan/Ethanol 4 : 1) : 0,79.

f) Kopplung von N-(4-Resorufinylcarbonyl)-sarocosin- N′-hydroxysuccinimidester mit 1-(2-Aminoethyl)diphenylhydantoin
125 mg des N-Hydroxysuccinimidesters aus Beispiel 7e) werden mit 90 mg 1-(2-Aminoethyl)diphenylhydantoin in 40 ml Dioxan/Kaliumphosphatpuffer, pH 8,5, 1 : 1 1 Stunde gerührt. Man dampft das Dioxan ab, gibt bis zum vollständigen Farbumschlag Ammoniak zu, filtriert und fällt das Produkt mit HCl aus dem Filtrat.
Ausbeute: 110 mg.
Rf (Kieselgel, Fließmittel:n-Butanol/Eisessig/Wasser 4 : 1 : 1) : 0,78.
UV/VIS (0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0): λ _max = 575 nm.
Fluoreszenzemission: λ _max = 592 nm.

Beispiel 8 Resorufin-4-carbonsäure-2(1-diphenylhydantoinyl)ethylamid

a)N,O,O-Triacetyldihydroresorufin-4-carbonsäure- 2(1-diphenylhydantoinyl)ethylamid
Analog Beispiel 1e) werden 1,37 g 1-(2-Aminoethyl)diphenylhydantoin mit 1,2 g N,O,O-Triacetyldihydroresorufincarbonsäurechlorid umgesetzt. Man erhält 1,9 g Produkt als leicht gefärbten Schaum.

b) Resorufin-4-carbonsäure-2(1-diphenylhydantoinyl)ethylamid
Das in Beispiel 8a) erhaltene Produkt wird analog den Beispielen 1f) und 1g) oxidativ deacetyliert. Aus 1,9 g Edukt erhält man 600 mg Produkt.
Rf (Kieselgel, Fließmittel:Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,68.
¹-NMR ([D₆]-DMSO): δ = 3.2-3.6 (m, 4 H); 6.73 (d, J = 2.2 Hz, 1 H);
6.84 (d, J = 9.5 Hz, 1 H); 6.86 (dd, J = 9.5 und 2.2 Hz, 1 H);
7.2-7.4 (m, 10 H); 7,62 und 7,66 (je d, J = 9,5 Hz, 2 H);
8.66 (t, breit, J = 5 Hz, 1 H); 9,58 ppm (s, 1 H).
UV/VIS 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0): λ _max = 575 nm.
Fluoreszenzemission: λ _max = 591 nm.

Beispiel 9 Kupplung von 6-Methylresorufin-4-carbonsäure-piperazid mit [2-(1-Diphenylhydantoinyl)essigsäure-N-hydroxysuccinimidester

a) 2-Methyl-4-nitrosoresorcin
19,8 g 2-Methylresorcin und 13,4 g Kaliumhydroxid werden in 120 ml Ethanol gelöst und auf 5°C gekühlt. Dazu tropft man 24 ml Isopentylnitrit, rührt 3 Stunden und saugt den Niederschlag ab. Der gelbe Feststoff wird in 200 ml 5 N Schwefelsäure eingerührt. Dabei fällt das hellgelbe Produkt aus.
Ausbeute: 22 g.
Rf (Kieselgel, Fließmittel:Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,53

b) 6-Methylresazurin-4-carbonsäure
15,3 g 2-Methyl-4-nitrosoresorcin, 15,4 g 2,6-Dihydroxybenzoesäure, 8,8 g Braunstein und 11 ml konzentrierte Schwefelsäure werden analog Beispiel 1a) umgesetzt.
Ausbeute: 28,7 g.
Rf (Kieselgel, Fließmittel:Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,15

c) N,O,O-Triacetyl-6-methyldihydroresorufin-4-carbonsäure
Aus 10 g 6-Methylresazurin-4-carbonsäure, 19,8 g Zinn-II-chlorid, 20 ml Acetanhydrid und 150 ml Eisessig erhält man analog Beispiel 1b) direkt die triacetylierte Leukoverbindung. Das Rohprodukt wird durch Auskochen mit Aceton gereinigt.
Ausbeute: 7,3 g.
Rf (Kieselgel, Fließmittel:Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,51
¹H-NMR ([D]₆-DMSO): w = 2.10, 2.25, 2.29, 2.33 (je s, 12 H);
7.00, 7.09, 7.50 und 7.74 ppm (je d, J = 8.8 Hz, 4 H)

d) N,O,O-Triacetyl-6-methyldihydroresorufin-4-carbonsäure-N′-BOC- piperazid
Analog den Beispielen 1d) bis 1e) erält man aus 5 g N,O,O-Triacetyl-6-methyldihydroresorufin-4-carbonsäure, 10,7 ml Oxalylchlorid und 2 g N-BOC-Piperazin 3 g Produkt.
Rf (Kieselgel, Fließmittel: Essigester) : 0,57

e) 6-Methylresorufin-4-carbonsäurepiperazid-trifluoracetat
1 g des in Beispiel 9d) beschriebenen Triacetylderivats werden analog den Beispielen 1g) bis 1h) umgesetzt.
Ausbeute: 0,43 g

f) Kupplung von 6-Methylresorufin-4-carbonsäurepiperazid mit 2-(1-Diphenylhydantoinyl)essigsäure-N-hydroxysuccinimidester
222 mg der in Beispiel 9e) erhaltenen Verbindung werden mit 200 mg 2-(1-Diphenylhydantoinyl)essigsäure-N- hydroxysuccinimidester umgesetzt.
Ausbeute: 250 mg
UV/VIS (0.1 M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0): λ _max = 584 nm
Fluoreszenzemission: λ _max = 600 nm.

Beispiel 10 Kupplung von 9-Hydroxy-5-benzo[a]phenoxazon-8-carbonsäure-piperazid mit [2-(1-Diphenylhydantoinyl)essigsäure-N-hydroxysuccinimidester

a) 9-Hydroxy-5-beno[a]phenoxazon-8-carbonsäure-12-oxid
2,84 g 1,3-Dihydroxy-4-nitrosonaphthalin, 2,31 g 2,6-Dihydroxybenzoesäure, 1,29 g Braunstein und 1,6 ml konzentrierte Schwefelsäure werden analog Beispiel 1a) umgesetzt.
Ausbeute: 2,8 g
Rf (Kieselgel, Fließmittel:n-Butanol/Eisessig/Wasser 4 : 1 : 1) : 0,63

b) 12-Acetyl-5,9-diacetoxybenzo[a]phenoxazon-8-carbonsäure
Analog Beispiel 9c) erhält man aus 2,4 g 9-Hydroxy-5-benzo[a]phenoxazon-8-carbonsäure-12-oxid 1,8 g der triacetylierten Dihydroverbindung.
Rf (Kieselgel, Fließmittel: Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,31

c) 12-Acetyl-5,9-diacetoxybenzo[a]phenoxazin-8-carbonsäure- N′-BOC-piperazid
1,6 g der in Beispiel 10b) beschriebenen Triacetylverbindung werden analog Beispiel 9d) mit Oxalylclorid und N-BOC-Piperazin umgesetzt.
Ausbeute: 1,2 g
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1,49 (s, 9 H); 2.12; 2.27; 246 (je s, 12 H);
3.0-3.9 (m, 8 H); 7.03 (d, J = 9 Hz, 1 H); 7.16-7.94 ppm (m, 6H)

d) 9-Hydroxy-5-benzo[a]phenoxazon-8-carbonsäure-N′-BOC-piperazid
Analog Beispiel 1f) erhält man aus 0,93 g der Triacetylverbindung von Beispiel 10c) 0,51 g Produkt.
Rf (Kieselgel, Fließmittel: Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,69

e) 9-Hydroxy-5-benzo[a]phenoxazon-8-carbonsäurepiperazidtrifluoracetat
Aus 0,5 g der in Beispiel 10 d) beschriebenen BOC-geschützen Verbindung erhält man analog Beispiel 1h) 0,5 g Produkt.
Rf (Kieselgel, Fließmittel: Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,02

f) Kopplung von 9-Hydroxy-5-benzo[a]-phenoxazon-8-carbonsäurepiperazid mit 2-(1-Diphenylhydantoinyl)essigsäure-N-hydroxysuccinimidester
Aus 50 mg Piperazid, hergestellt nach Beispiel 10e) und 150 mg 2-(1-Diphenylhydantoinyl)essigsäure-N-hydroxy succinimidester erhält man analog Beispiel 1i) 70 mg Produkt.
Rf (Kieselgel, Fließmittel: Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,57
UV/VIS (0,1 M Kaliumphosphatpuffer p 8,0): λ _max = 560 nm.
Fluoreszenzemission: λ _max = 625 nm.
¹H-NMR ([D]₆-DMSO): δ = 3.0-4.5 (m, 10 H); 6.37 (s, 1H); 6.80 (d, J = 8 z, 1 H);
7.2-7.35 (m, 10 H); 7.35-8,0 (m, 3 H); 8.10 (dd, J = 8 und 2 Hz, 1 H); 8.56 (dd, J = 8 und 2 Hz, 1 H); 9.60 ppm (s, 1 H)

Beispiel 11 Kopplung von 8-Chlororesorufin-1-carbonsäure-piperazid mit Theophyllin-7-propionsäure(2-amminoethyl)amid

a) 8-Chlororesorufin-1-carbonsäure
Man löst 8,7 g 4-Chlor-6-nitrosoresorcin und 7,71 g 3,5-Dihydroxybenzoesäure in 200 ml Methanol, gibt bei 0°C 4,8 g Braunstein und portionsweise 5,3 ml konzentrierte Schwefelsäure zu. Man rührt 2 Stunden bei Raumtemperatur, filtriert und gibt bis zum Farbumschlag nach blau Ammoniak und 200 ml Wasser zu. Die Lösung wird filtriert, das Filtrat mit 25 ml konzentriertem Ammoniak und 20 g Zinkstaub bei Eiskühlung versetzt und danach ohne weitere Kühlung ca. 15 Minuten gerührt. Man gibt 200 mg Aktivkohle zu, filtriert, säuert auf pH 2 an und zentrifugiert das ausgefallene Resorufinderivat ab.
Ausbeute: 3,9 g
Rf (Kieselgel, Fließmittel n-Butanol/Eisessig/Wasser 4 : 1 : 1) : 0,88

b) N, O, O-Triacetyl-8-chlordihydroresorufin-1-carbonsäure
Aus 3,5 g 8-Chlororesorufin-1-carbonsäure erhält man analog Beispiel 1b) 3,2 g Produkt.
Rf (Kieselgel, Fließmittel Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,43

c) 8-Chlororesorufin-1-carbonsäurepiperazid-trifluoracetat
Aus 3 g Triacetylverbindung, hergestellt in Beispiel 11b), erhält man analog den Beispielen 1c) bis 1h) 1,4 g Produkt.
Rf (Kieselgel, Fließmittel:Chloroform/Methanol/Eisessig 9 : 1 : 0,1) : 0,08

d) Kupplung von 8-Chlororesorufin-1-carbonsäurepiperazid mit Theophyllin-7-propionsäure-(2-aminoethyl)amid
Analog Beispiel 8 erält man aus 420 mg N,O,O-Triacetyl-8- chlor-dihydroresorufin-1-carbonsäurepiperazid und 300 mg Theophyllin-7-propionsäure (2-aminoethyl)amid 190 mg Produkt.

Beispiel 12 Resorufinmarkiertes Immunoglobulin G

100 mg Human-IgG werden in 10 ml 0.1 M Kaliumphosphatpuffer pH 8.0 gelöst und mit 5 mg N-(4-Resorufinylcarbonyl)sarcosin- N′-hydroxy-succinimidester (vgl. Beispiel 7e) versetzt. Man läßt 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen und chromatographiert dann an Ultrogel ACA 202 (LKB). Das markierte Protein wird dabei vor dem freien niedermolekularen Resorufin eluiert. Der Markierungsgrad wird mittels Extinktionsmessung ermittelt. Er beträgt 2, d. h. pro Molekül IgG sind 2 Moleküle des Resorufinderivates gebunden.

Beispiel 13 Diphenylhydantoin-Bestimmung in Humanserum mittels FPIA

1950 µl 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,8) weden mit 5 µl Probe⁽¹⁾, 25 µl Antikörperlösung⁽²⁾ und 25 µl Diphenylhydantoin-Resorufinlösung⁽³⁾ versetzt. Nach 5-minütiger Inkubation bei 37°C wird die Fluoreszenzpolarisation gemessen. (Anregungswellenlänge: 575 nm, Emissionswellenlänge 594 nm, Messgerät: Fluoreszenz-Spektrometer 650-10S, Hitachi).

1) Probe: mit bekannter Menge Diphenylhydantoin aufgestocktes humanes Spenderserum. Zur Aufstellung einer Eichkurve wird humanes Spenderserum, welches Diphenylhydantoin in Konzentrationen von

a) 2,5 µg/ml

b) 5 µg/ml

c) 10 µg/ml

d) 20 µg/ml

e) 40 µg/ml enthält, verwendet.

2) Antikörperlösung: 450 µg Antikörper/ml 0,1 M
Natriumphosphat-Puffer (pH 7,8).
Die Antikörper werden durch Immunisierung von Schafen mit Diphenylhydantoin, das über Glutardialdehyd an Rinderserumalbumin gebunden ist, nach üblichen Verfahren gewonnen.
Das Antiserum wurde über Ammoniumsulfatfällung und Chromatographie an DEAE-Cellulose gereinigt.

3) Diphenylhydantoinresorufinlösung (10^-6M):
Diphenylhydantoin-Resorufinkonjugat aus Beispiel 1i) in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,8)
Die Meßergebnisse, die mit den Diphenylhydantoin-Lösungen 1 a), 1 b), 1 c), 1 d) und 1 e) erhalten werden, sind in Abb. 1 dargestellt. Es sind dort die Diphenylhydantoinkonzentrationen der Proben (µg/ml) gegen die gemessenen Polarisationswerte (mP) aufgetragen.
Mit Hilfe einer solchen Eichkurve kann auch die Diphenylhydantoin-Konzentration in Proben mit unbekanntem Diphenylhydantoin-Gehalt bestimmt werden.
Eine vergleichbare Eichkurve erhält man auch, wenn anstelle des oben eingesetzten Diphenylhydantoinkonjugates aus Beispiel 1i) jeweils das Diphenylhydantoinkonjugat aus den Beispielen 2), 7), 8) oder 10f) verwendet wird.

Claims (8)

1. Resorufin-Derivate der allgemeinen Formel Ia und Ib in denen
R¹, R², R³, R⁴ und R⁵, die jeweils gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, Halogen, eine Carboxy-, Carboxyamido-, Niederalkoxycarbonyl-, Cyano- oder Nitrogruppe, einen Niederalkyl- oder Niederalkoxy-Rest, die jeweils durch Carboxy-, Carboxamido-, Niederalkoxycarbonyl-, Cyano- oder Nitrogruppen substituiert sein können, wobei R⁴ und R⁵ zusammen einen anellierten Aromaten vorstellen können,
Z ein Brückenglied
A den Rest eines Liganden oder eines Ligandenanalogons und
n eine ganze Zahl von 1 bis 200
bedeuten.

2. Resorufin-Derivate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest A ein Hapten oder Antigen sowie ein Analogon hiervon bedeutet.

3. Verfahren zur Herstellung von Resorufin-Derivaten der allgemeinen Formeln Ia und Ib in denen
R¹, R², R³, R⁴ und R⁵, die jeweils gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, Halogen, eine Carboxy-, Carboxamido-, Niederalkoxycarbonyl, Cyano- oder Nitrogruppe, einen Niederalkyl- oder Niederalkoxy-Rest, die jeweils durch Carboxy-, Carboxamido-, Niederalkoxycarbonyl-, Cyano- oder Nitrogruppen substituiert sein können, wobei R⁴ und R⁵ zusammen einen anellierten Aromaten vorstellen können,
Z ein Brückenglied
A den Rest eines Liganden oder eines Ligandenanalogons und
n ein ganze Zahl von 1 bis 200
bedeuten,
dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise Verbindungen der allgemeinen Formeln IIa und IIb, in denen R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ die in den allgemeinen Formeln Ia und Ib angegebenen Bedeutungen haben und X¹ eine reaktive Gruppe vorstellt,
a) mit einem Liganden oder Ligandenanalogon der allgemeinen Formel in der
X² eine reaktive Gruppe und
A den Rest des Liganden bzw. Ligandenanalogons vorstellt,
oder
b) mit einer bifunktionellen Verbindung der allgemeinen Formel in der
X³ und X⁴ reaktive Gruppen und
M den Rest der bifunktionellen Verbindung bedeuten,
und einem Liganden oder Ligandenanalogon der allgemeinen Formel in der
X² und A die oben angegebene Bedeutung haben
umsetzt, wobei gegebenenfalls bei einzelnen Verfahrensschritten Schutzgruppen eingeführt und nachträglich wieder abgespalten sowie einzelne reaktive Gruppen X¹, X², X³ und X⁴ in andere reaktive Gruppen überführt werden können.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als bifunktionelle Verbindungen X³-M-X⁴ ein Diamin, eine Dicarbonsäure oder ein Derivat hiervon, ein Dialdehyd oder eine Aminocarbonsäure verwendet wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als bifunktionelle Verbindung Piperazin, 1,2-Ethylendiamin, Glycin, Sarcosin oder β-Alanin verwendet wird.

6. Verwendung der Resorufin-Derivate gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 in fluoreszenzimmunologischen Verfahren.

7. Resorufin-Derivate der allgemeinen Formel II a und II b in denen
R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ die in den allgemeinen Formeln I a und I b angegebenen Bedeutungen haben und
X¹ eine reaktive Gruppe vorstellt.

8. Verwendung der Resorufin-Derivate gemäß Anspruch 7 zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formeln I a und I b in denen
R¹, R², R³, R⁴ und R⁵, die jeweils gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, Halogen, eine Carboxy-, Carboxamindo-, Niederalkoxycarbonyl-, Cyano- oder Nitrogruppe, einen Niederalkyl- oder Niederalkoxy-Rest, die jeweils durch Carboxy-, Carboxamido-, Niederalkoxycarbonyl-, Cyano- oder Nitrogruppen substituiert sein können, wobei R⁴ und R⁵ zusammen einen anellierten Aromaten vorstellen können,
Z ein Brückenglied
A den Rest eines Liganden oder eines Ligandenanalogons und
n eine ganze Zahl von 1 bis 200
bedeuten.