DE3545398A1 - Verfahren zur steigerung der quanten-ausbeute bei der oxidation von luminol durch peroxide in gegenwart von peroxidase - Google Patents
Verfahren zur steigerung der quanten-ausbeute bei der oxidation von luminol durch peroxide in gegenwart von peroxidaseInfo
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- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steigerung der
Quantenausbeute der Chemilumineszenz bei der Oxidation
von Luminol oder Luminolderivaten durch Peroxidverbindungen
in Gegenwart von Peroxidase (POD).
Chemilumineszenzreaktionen sind Vorgänge, bei denen ein
fluoreszenzfähiges Molekül durch chemische Energie in
einen angeregten Elektronenzustand gebracht wird, aus
dem dann Energie als sichtbares Licht abgegeben wird.
Biolumineszenzreaktionen sind enzymatisch katalysierte
Chemilumineszenzreaktionen, bei denen Sauerstoff als
Elektronenakzeptor wirkt. Die Quantenausbeuten (Verhältnis
von Chemilumineszenz-Lichtquanten pro umgesetzte
Moleküle) liegen allerdings nur bei etwa 1%
(vgl. K. D. Gundermann, Angew. Chemie 77 (1965) 572 bis
580; Chemiker-Zeitung 99 (1975) Nr. 6, 279 bis 285).
Die durch Peroxidase (POD) katalysierte Reaktion von
Luminol (3-Amino-phthalsäurehydrazid) oder von Luminolderivaten
mit Peroxiden wird als Indikatorreaktion in
Immuno-Assays verwendet, wobei entweder POD oder Luminol
als Marker dienen kann. Peroxidase (POD; Donor: H2O2-
Oxidoreduktase, EC 1.11.1.7) bezeichnet eine Gruppe von
Enzymen, welche die Oxidation einer großen Anzahl organischer
Verbindungen katalysieren.
Bedeutung hat die POD-Bestimmung vor allem in Verbindung
mit vorgeschalteten Reaktionen, bei denen H2O2 gebildet
wird, beispielsweise für die Blutzuckerbestimmung sowie
bei enzym-immunologischen Bestimmungsverfahren, die POD
als Markierungsenzym verwenden, erlangt. Andere Analysenmethoden,
bei denen die POD-Bestimmung von Bedeutung
ist, sind beispielsweise die Galactose-, Wasserstoffperoxid-,
Katalase- oder Oxidasenbestimmung.
Es ist bekannt, POD durch Abnahme des H2O2 oder des
Wasserstoffdonators sowie durch Entstehung der oxidierten
Verbindung zu messen. Besondere Bedeutung hat dabei die
letztere Methoden gefunden, wobei als Substrate beispielsweise
Di-o-anisidin, Guajacol oder ABTS (2,2′-Azinodi
[3-äthyl-benzthiazolin-(6)-sulfonsäure]) verwendet
werden.
Diese bekannten Methoden haben sich zwar bewährt, es besteht
jedoch ein Bedarf an Methoden höherer Empfindlichkeit,
um die POD-Bestimmung im Rahmen von Enzym-Immun-
Tests zu verkürzen. POD spielt z. B. als Markierungsenzym
bei den sog. "Enzym-Immono-Assays" nach dem ELISA-
Prinzip (enzyme-linked immuno sorbent assay) eine große
Rolle. Mit den zahlreichen handelsüblichen
Testreagenzien, die auf diesem System beruhen, ist die
Dauer der eigentlichen POD-Bestimmung, z. B. mit ABTS
als Substrat, die bei ca. 60 Minuten liegt, aber
äußerst unbefriedigend.
Zur Lösung dieses Problems wurde versucht, die durch
Peroxidase katalysierte Reaktion von Luminol mit Peroxidverbindungen
durch Erhöhung der Quantenausbeute
empfindlicher zu machen.
Aus der DE-AS 29 06 732 ist ein Verfahren zur Aktivitätsbestimmung
von Peroxidasen mit Hilfe einer Chemilumineszenzreaktion
bekannt, welches eine gute Quantenausbeute
liefert und es damit ermöglicht, im Rahmen von Enzym-
Immuno-Assays die Empfindlichkeit der POD-Bestimmung zu
erhöhen und die Dauer der Bestimmung wesentlich herabzusetzen.
Der Chemilumenszenzreaktion liegt die Umsetzung von
Luminol mit einer Peroxidverbindung zugrunde; es wird
aber anstelle von Luminol das 7-Dimethylamino-
naphthalin-1,2-dicarbonsäure-hydrazid eingesetzt, wodurch
eine Steigerung der Quantenausbeute der Chemilumineszenz
(Chemiluneszenzausbeute) erreicht wird.
Aus Whitehead et al, Nature 305 (1983), 158-159, ist
es bekannt, die Lumineszenzausbeute der POD-katalysierten
Oxidation von Luminol durch einen Zusatz von firefly-
Luciferin (Feuerfliegen-Luciferin) um ein Vielfaches zu
steigern; eine solche Steigerung ist auch durch einen
Zusatz von 6-Hydroxy-benzothiazolen bekannt (vgl.
Thorpe et al, Anal. Biochem. 145 (1985) 96-100), oder
durch einen Zusatz von Phenolderivaten (vgl. Thorpe et
al, Clin Chem. 31 (1985) 1335-1341; EP-A-01 16 454).
Mit diesem Verfahren kann zwar eine Steigerung der
Quantenausbeute erreicht werden; sie besitzen aber den
Nachteil, daß die erforderlichen Zusätze (Aktivatoren)
nicht leicht erhältlich sind und/oder aufgrund ihrer
schlechten Löslichkeit in Wasser nur in Mischung mit
organischen Lösungsmitteln einsetzbar sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Bereitstellung
eines Verfahrens zur Steigerung der Quantenausbeute
bei der Oxidation von Luminol durch Peroxidverbindungen
in Gegenwart von POD, das die vorstehend genannten
Nachteile vermeidet, und das sich für eine
empfindliche und rasche Bestimmung von POD in Enzym-
Immun-Assay eignet. Diese Aufgabe wird mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren gelöst.
Es wurde gefunden, daß sich die Quantenausbeute bei der
Oxidation von Luminol durch Peroxidverbindungen in
Gegenwart von POD steigern läßt, wenn man die Umsetzung
in Gegenwart von Fluorescein durchführt, wobei es einen
Konzentrationsbereich von Fluorescein gibt, in dem eine
überadditive (synergistische) Quantenausbeute erhalten
wird, die größer ist als die Summe der Quantenausbeuten
der einzelnen chemilumineszierenden Stoffe.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren
gemäß Patentanspruch 1 zur Steigerung der Quantenausbeute
bei der Oxidation von Luminol oder 7-Dialkyl-
amino-naphthalin-1,2-dicarbonsäure-hydrazid, worin die
Alkylgruppen 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthalten, durch
Peroxidverbindungen in Gegenwart von POD, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man die Umsetzung in Gegenwart
von Fluorescein durchführt, wobei die Konzentration des
Fluoresceins in einem Konzentrationsbereich liegt, der
eine Quantenausbeute ergibt, die größer ist als die
Summe der Quantenausbeuten der einzelnen chemilumineszierenden
Stoffe.
Zweckmäßige Ausführungsformen dieses Verfahrens sind
Gegenstand der Ansprüche 2 bis 6.
Es ist bekannt, daß auch Fluorescein unter der Einwirkung
von Wasserstoffperoxid Chemilumineszenzerscheinungen
zeigt (vgl. Nilsson und Kearns, J. Phys.
Chem. 78 (1974) 1681-1683); dies wird zur Bestimmung
von mit Fluorescein markierten Verbindungen in Immuno-
Assays verwendet (vgl. EP-A-00 54 952; EP-A-00 46 563;
DE-A-31 32 491). Aus der Arbeit von B. A. Rusin et al,
Khim, Vys. Energ. 11 (1) (1977) 93-94 (referiert in
CA 86 (1977), S. 595, 130 321 s) ist es bekannt, daß
die Chemilumineszenz bei der Oxidation von Luminol
durch Fluorescein gequencht wird. Es muß deshalb als
überraschend angesehen werden, daß es einen
Konzentrationsbereich gibt, in dem eine überadditive
(synergistische) Steigerung der Quantenausbeute der
Chemilumineszenzreaktion eintritt.
Die Alkylgruppe im 7-Dialkylamino-naphthalin-1,2-dicarbonsäure-
hydrazid können verschieden oder vorzugsweise
gleich sein, sowie verzweigt oder vorzugsweise
geradkettig sein, und sind z. B. Methyl, Äthyl, Propyl
und/oder Isopropyl.
Bevorzugt wird das 7-Dimethylamino-naphthalin-1,2-dicarbonsäure-
hydrazid eingesetzt.
Als Peroxide eignen sich neben Wasserstoffperoxid auch
alle mit POD verträglichen Peroxidverbindungen mit vergleichbarem
Oxidationspotential, wie z. B. Alkaliperoxide,
Anlagerungsverbindungen von Wasserstoffperoxid an Borsäure
(Perborate) ode an Harnstoff; vorzugsweise wird
insbesondere für Enzym-Immuno-Assays, Natriumperborat
und in erster Linie H2O2 eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren wir zweckmäßg bei einem
pH-Wert von 7,5 bis 9 durchgeführt, und insbesondere
bei einem pH-Wert von ca. 8,5. Als Puffer wird Kaliumphosphatpuffer
oder Glycin-NaOH-Puffer bevorzugt, obwohl
auch andere übliche Puffer, wie z. B. Tris-HCl, Tris-
Sulfat und Tris-Acetat geeignet sind. Die bevorzugte
Pufferkonzentration beträgt dabei 10 bis 1000 mmol/l.
Die Konzentration von Luminol oder 7-Dialkylamino-
naphthalin-1,2-dicarbonsäure-hydrazid, oder von Wasserstoffperoxid
liegt, sofern diese Konzentrationen nicht
mit dieser Reaktion bestimmt werden sollen, in dem für
diese Chemilumineszenzreaktion üblichen Konzentrationsbereich;
Luminol oder 7-Dialkylamino-naphthalin-1,2-dicarbonsäure-
hydrazid werden zweckmäßigerweise in einer
Menge im Bereich von 10 µmol/l bis 100 mmol/
eingesetzt. Das erfindungsgemäße Verfahren wird
zweckmäßigerweise bei den für enzymatische Bestimmungen
üblichen Temperaturen, die in der Regel zwischen 20 und
37°C liegen, durchgeführt, wobei aber für das
Verfahren selber auch niedrigere oder höhere
Temperaturen in Frage kommen; besonders bevorzugt ist
der Temperaturbereich zwischen
22 und 30°C.
Der Konzentrationsbereich von Fluorescein, in dem eine
überadditive (synergistische) Steigerung der Quantenausbeute
der Chemiluinineszenzreaktion eintritt, kann von
der Art und Konzentration der übrigen Reaktionsteilnehmer
und den Reaktionsbedingungen abhängen; für die angewandten
jeweiligen Bedingungen läßt sich der optimale
Bereich aber leicht durch wenige orientierende Versuche
bestimmen. Vorzugsweise wird, insbesondere als Indikatorreaktion
für Enzy-Immuno-Assay, Luminol und Wasserstoffperoxid
in Gegenwart von POD oxidiert; diese Umsetzung
wird vorzugsweise in Gegenwart von Fluorescein
durchgeführt, wobei mit einer Fluorescein-Konzentration
im Bereich von 10 bis 1000 µmol/l, vorzugsweise von 20
bis 100 µmol/l gearbeitet wird; in diesem Bereich wird
eine Steigerung der Quantenausbeute erhalten, die etwa
dem zehnfachen der Ausbeute entspricht, die sich aus
der Summe der Quantenausbeuten der jeweils einzelnen
chemilumineszierenden Stoffe ergibt.
Aufgrund der hohen Quantenausbeute kann das erfindungsgemäße
Verfahren als Indikatorreaktion (Chemilumenszenz-
Test) zur Bestimmung der POD-Aktivität in Immuno-
Assays dienen, wobei gegenüber einem Test mit Luminol
als alleiniges Substrat eine Steigerung der Empfindlichkeit
um das zehnfache erreicht wird. Außer zur Bestimmung
von POD ist das erfindungsgemäße Verfahren
aber auch zur Bestimmung der an der Reaktion teilnehmenden
Peroxide, wie z. B. Wasserstoffperoxid,
oder zur Bestimmung von Luminol oder von 7-Dialkyl-
amino-naphthalin-1,2-dicarbonsäure-hydrazid geeignet.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es somit z. B.
möglich, die Meßzeit für die reine Enzymaktivitätsbestimmung
bei den ELISA-Tests bei einer hohen Empfindlichkeit
auf ca. 2 bis 3 Minuten herabzusetzen. Die
Messung erfolgt vorzugsweise derart, daß die in einem
bestimmten Zeitintervall emittierte Lichtmenge gemesssen
wird.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung
des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung
von POD oder von Luminol oder 7-Dialkylamino-naphthalin-
1,2-dicarbonsäure-hydrazid, die insbesondere als Markersubstanzen
in Immuno-Assays dienen.
Die POD-Bestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen
Verfahrens kann z. B. im Rahmen einer immunologischen
Hapten-Bestimmung durchgeführt werden, bei
der man eine bekannte Menge eines mit POD markierten
Haptens der zu untersuchenden, eine unbekannte Menge
des Haptens enthaltenden Probe zusetzt, die Probe dann
mit einem an einen festen Träger gebundenen spezifischen
Antikörper des Haptens kontaktiert, die feste
von der flüssigen Phase trennt und in einer der beiden
Phasen die POD-Aktivität mißt (ELISA-Test). Mit diesen
Tests kann z. B. Digoxin, Thyroxin (T4) oder Insulin im
Blutserum bestimmt werden, wobei man z. B. nach einer
der in der DE-AS 29 06 732 beschriebenen Methoden arbeiten
kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch ein Reagenz
zur Bestimmung der POD nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es
Luminol oder 7-Dialkylamino-naphthalin-1,2-dicarbonsäure-
hydrazid, mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen
pro Alkylgruppe, Fluorescein, einen Wasserstoffperoxid-
Lieferanten, eine Puffersubstanz (pH 7,5-9) und gegebenenfalls
ein Sequestrierungsmittel enthält.
Ein bevorzugtes Reagenz für einen Liter Testlösung enthält:
10 bis 1000 µmol7-Dialkylamino-naphthalin-1,2-dicarbonsäure-
hydrazid oder vorzugsweise
Luminol,
10 bis 1000 µmolFluorescein,
50 bis 500 mmolKaliumphospaht- oder Glycin-Puffer
(pH 7,5-9),
10 bis 550 mmolH2O2, und gegebenenfalls
0,01 bis 1 mmoleines Sequestrierungsmittels.
Als gegebenenfalls zu verwendendes Sequestrierungsmittel
kommen die hierfür bekannten Substanzen, wie
Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) und ähnliche, dafür
übliche Verbindungen in Betracht. Außerdem kann das
Reagenz übliche Stabilisierungsmittel, wie Serumalbumin,
Kohlehydrate und dergleichen, enthalten. Als H2O2-
Lieferant können H2O2 selbst sowie die bekannten, H2O2
freisetzenden Substanzen, wie z. B. Harnstoff-perhydrat
("festes H2O2") und ähnliche.
Außer den obengenannten Bestandteilen kann das erfindungsgemäße
Reagenz auch mit POD markiertes Hapten sowie
einen trägergebundenen spezifischen Antikörper gegen
das jeweilige Hapten enthalten, wenn das Reagenz im
Rahmen eines Enzym-Immun-Tests verwendet werden soll.
Daneben können die anderen, z. B. in derartigen ELISA-
Reagenzien üblichen Bestandteile, wie weitere Puffersubstanzen,
Stabilisierungsmittel und dergleichen, enthalten
sein.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung
näher, ohne sie darauf zu beschränken. Wenn nicht anders
angegeben, beziehen sich Temperaturangaben auf die
Celsius-Skala und Prozent- und Mengenangaben auf Gewichtsprozent
und Gewichtsteile.
Dieses Beispiel veranschaulicht den Einfluß der Fluorescein-
Konzentration auf die Quantenausbeute.
Alle Versuche wurden mit einem Biolumineszenz-Meßgerät
der Fa. Berthold, Wildbad, vom Typ Bolumat LB 9500
durchgeführt. Das Testvolumen betrug 500µl, die Temperatur
30°C.
Es wurden folgende Konzentrationen (Endkonzentrationen
im Test) verwendet:
Wasserstoffperoxid0,1 mmol/l
Luminol25 µmol/l
Peroxidase20 mg/l
Tris-HCl-Puffer (pH = 8,5)90 mmol/l
In der Fig. 1 wird die Abhängigkeit der Lichtemission
von der Fluorescein-Konzentration graphisch dargestellt.
Wie die Fig. 1 zeigt, wird die Lichtemission bei einer
Fluorescein-Konzentration zwischen 10 und 1000 µmol/l
um ein Vielfaches aktiviert.
Dieses Beispiel veranschaulicht den überadditiven
(synergistischen) Effekt beim Zusammenwirken von Luminol
und Fluorescein im Vergleich zu einer alleinigen Verwendung
von Luminol oder von Fluorescein.
12
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Es wurde mit folgenden Konzentrationen (Endkonzentrationen
im Test) gearbeitet:
Luminol0,1 mmol/l
Fluorescein25 µmol/l
POD20 ng/l
Wasserstoffperoxid0,1 mmol/l
Tris-HCl-Puffer (pH = 8,5)90 mmol/l
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die erhaltenen Ergebnisse
zusammengestellt. I max bedeutet die Zahl der
Lichtemissionen/2 Sekunden.
Aus der Tabelle 1 ist der synergistische Effekt beim
Zusammenwirken von Luminol und Fluroescein klar erkennbar:
Bei Anwesenheit von Luminol und Fluorescein ist
die maximale Lichtintensität (I max ) ca. zehnmal so groß
wie die Summe der Intensitäten der Reaktionen unter Anwesenheit
von Luminol bzw. von Fluorescein allein (Test
Nr. 4 und 2). Der Tabelle ist weiterhin zu entnehmen,
daß Fluorescein in Gegenwart von POD auch bereits mit
Luftsauerstoff unter Chemilumineszenz reagiert (vgl.
Test Nr. 5).
Dieses Beispiel zeigt den Einfluß der POD-Konzentration
auf die Umsetzung.
Die Messung erfolgte wie in den vorhergehenden Beispielen.
Es wurde mit den folgenden Konzentrationen
(Endkonzentrationen im Test) gearbeitet:
Luminol0,1 mmol/l
Wasserstoffperoxid0,1 mmol/l
Fluorescein25 µmol/l
Tris-HCl-Puffer (pH = 8,5)90 mmol/l
Es wurden die folgenden, in Tabelle 2 zusammengestellten
Ergebnisse erhalten.
Dieses Beispiel zeigt den Einfluß des pH-Werts auf die
Reaktion. Es wurde mit den in Beispiel 3 angegebenen
Konzentrationen gearbeitet. Die POD-Konzentration betrug
9 × 10-10 Mol/l, die Konzentration an Tris-HCl-
Puffer mit verschiedenen pH-Werten betrug 90 mmol/l.
Die pH-Werte von 12,6 wurden durch Zugabe von 1 mol/l
Natronlauge erreicht.
In der Fig. 2 ist der Einfluß des pH-Werts auf die
Lichtemission (I max ) graphisch dargestellt.
Es wurde wie in Beispiel 2 gearbeitet, aber anstelle
von Wasserstoffperoxid wurde Natriumperborat als Oxidationsmittel
verwendet.
In der nachfolgenden Tabelle 3 sind die dabei erhaltenen
Ergebnisse zusammengestellt.
Auch aus den Ergebnissen der Tabelle 3 ist der beim
Arbeiten in Gegenwart von Luminol und Fluorescein erhaltene
überadditive Effekt klar erkennbar.
Dieses Beispiel zeigt die Anwendung des erfindungsgemäßen
Verfahrens in einem Enzym-Immun-Assay nach dem
ELISA-Prinzip zur Bestimmung von Speichel-α-Amylase.
Der Test wurde auf folgende Weise durchgeführt:
1. Lumineszenzröhrchen (Lumacuvette P Polystyrene,
Recorder Nr. 4960 von Lumac Systems AG, Basel,
Schweiz) werden mit einem die humane Speichelanalyse
spezifisch bindenden monoklonalen Antikörper
(5 µg/ml) gegen humane Speichel-α-Amylase
in 50 mM Carbonatpuffer (pH = 9,3) (500 µl) 18
Stunden bei 4°C inkubiert. Dieser monoklonale
Antikörper ist unter der Bezeichnung NCACC 84111305
bei der Nation Collection of Animal Cell Culture,
Porton Down, GB hinterlegt und wird gemäß EP 01 50 309
hergestellt.
2. Die Röhrchen werden einmal mit 150 mM Phosphatpuffer
(pH = 7,2, 145 mM NaCl) und 1% Rinderserumalbumin
(BSA) gewaschen.
3. Es folgt eine Nachbehandlung der Röhrchen (Nachbeschichtung)
mit 150 mmol/l Phosphatpuffer (pH 7,2),
145 mmol/l NaCl und 2% Rinderserumalbumin. Die
Röhrchen werden dann eine Stunde bei Raumtemperatur
belassen.
4. Die Röhrchen werden wie unter 2. angegeben gewaschen.
5. Humane Speichel-α-Amylase-POD-Konjugat wird in
verschiedenen Konzentrationen 4 Stunden lang bei
37°C in den Lumineszenzröhrchen inkubiert (500 µl).
6. Es wird fünfmal wie unter Punkt 2. beschrieben gewaschen.
7. a) Zur Entwicklung wird 1 ml ABTS-Reagenz (aus Enzymun-
Test Digoxin, Boehringer Mannheim GmbH,
Katalog Bestellnummer 199656) in jedes Röhrchen
gegeben. Nach genau 9 Minuten wird die Extintion
bei 405 nm gegen nicht inkubiertes
ABTS-Reagenz bestimmt.
b) Es werden 500 µl Lumineszenzreagenz ohne Fluorescein
(Endkonzentration siehe Beispiel 2) in
jedes Röhrchen gegeben. Nach genau 30 Sekunden
oder 27 Minuten wird die Lumineszenz gemessen
(Gerät: Biolumineszenz-Meßgerät der Fa. Berthold,
Wildbad, des Typs Biolumat LB 9500 T; Integrationszeit
60 sek).
c) Es werden 500 µl Lumineszenzlösung mit Fluorescein
(Endkonzentration siehe Beispiel 2) zugegeben
und dann die Luminszenz wie unter 7. b) beschrieben
gemessen.
Die Fig. 3 zeigt die mit Indikatiorreaktion a), b) und
c) erhaltenen Eichkurven. Hierbei ist das erhaltene Meßsignal
(im Falle a: Lichtabsorption; in den Fällen b
und c: Lichtemission) als Funktion der Konzentration
des gebundenen Speichelamylase-POD-Konjugats
dargestellt.
Synergistischer Effekt bei Verwendung von 7-Dimethylamino-
naphthalin-1,2-dicarbonsäurehydrazid (DNH).
Es wurde analog Beispiel 1 gearbeitet. Die Endkonzentrationen
im Test betragen:
DNH0,1 mmol/l
Fluorescein25 µmol/l
POD20 ng/l
Wasserstoffperoxid 0,1 mmol/l
Tris-HCl-Puffer (pH 8,5)90,0 mmol/l
Aus Tabelle 4 ergibt sich, daß bei Verwendung von 7-Dimethylamino-
naphthalin-1,2-dicarbonsäurehydrazid und
Fluorescein ein synergistischer Effekt festgestellt
werden kann.
Claims (10)
1. Verfahren zur Steigerung der Quantenausbeute bei
der Oxidation von Luminol oder 7-Dialkylamino-
naphthalin-1,2-dicarbonsäure-hydrazid, worin die
Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält,
durch Peroxidverbindungen in Gegenwart von Peroxidase
(POD), dadurch gekennzeichnet,
daß man die Umsetzung in Gegenwart
von Fluorescein durchführt, wobei die Konzentration
des Fluoresceins in einem Konzentrationsbereich
liegt, der eine Quantenausbeute ergibt,
die größer ist als die Summe der Quantenausbeuten
der einzelnen chemilumineszierenden Stoffe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Peroxidverbindung
Wasserstoffperoxid einsetzt.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß
man die Umsetzung bei einem pH-Wert von 7,5 bis 9
durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der pH-Wert 8,5
ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß
man Luminol mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart
von POD oxidiert.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß
man die Umsetzung in Gegenwart von 10 bis 1000 µmol/l
Fluorescin durchführt.
7. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1
bis 6 zur Bestimmung von POD, von Wasserstoffperoxid
oder von Luminol oder 7-Dialkylamino-
naphthalin-1,2-dicarbonsäure-hydrazid.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß man POD, Luminol
oder 7-Dialkylamino-naphthalin-1,2-dicarbonsäure-
hydrazid als Markierungssubstanz in Immuno-Assays
bestimmt.
9. Reagenz zur Bestimmung von POD, dadurch
gekennzeichnet, daß es Luminol
oder 7-Dialkylamino-naphthalin-1,2-dicarbonsäure-
hydrazid, mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen
pro Alkylgruppe, Fluorescein, einen Wasserstoffperoxid-
Lieferanten, eine Puffersubstanz (pH 7,5
bis 9) und gegebenenfalls ein Sequestrierungsmittel
enthält.
10. Reagenz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß es
10 bis 1000 µmol/l Luminol oder 7-Dialkylamino- naphthalin-1,2-dicarbonsäure- hydrazid,
10 bis 1000 µmol/l Fluorescein,
50 bis 500 mmol/l Kaliumphosphat- oder Glycerin- Puffer,
10 bis 200 µmol/l Wasserstoffperoxid, und gegebenenfalls
0,01 bis 1 mmol/l eines Sequestrierungsmittels enthält.
10 bis 1000 µmol/l Luminol oder 7-Dialkylamino- naphthalin-1,2-dicarbonsäure- hydrazid,
10 bis 1000 µmol/l Fluorescein,
50 bis 500 mmol/l Kaliumphosphat- oder Glycerin- Puffer,
10 bis 200 µmol/l Wasserstoffperoxid, und gegebenenfalls
0,01 bis 1 mmol/l eines Sequestrierungsmittels enthält.
Priority Applications (10)
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