DE3590392C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 bis 11, 13 und 14 ange­ gebenen PEG modifizierten Antikörper sowie ein Reagens für einen immuno­ histochemischen und immunologischen Vorgang nach den Ansprüchen 12, 15 und 16.

Diagnostische und therapeutische Verfahren, die von der Immunoreaktion von Antikörpern abhängen, werden häufig sowohl durch die Immunisierungsfähigkeit der Reagentien in klini­ schen Anwendungsfällen als auch durch Verbinden mit Zellen­ oberflächen-Fc-Rezeptoren behindert. Einem Immunansprechen auf Antikörper und andere Fremdproteine, die sowohl durch allergische Phänomene als auch die Inaktivierung des Proteins gekennzeichnet sind, muß durch Behandlung des Proteins entgegengewirkt werden, um einer Stimulierung des Wirt- Immunsystems zu begegnen, während eine erwünschte proteinbio­ logische Aktivität beibehalten wird. Zusätzlich ist es erwünscht, eine Antikörperspezifizität dadurch zu erhöhen, daß die Fc-Bindung mit den Zellenoberflächenrezeptoren reduziert oder eliminiert wird.

Es sind eine Vielzahl von proteinmodifizierenden Verfahren verwendet worden, um die Immunisierungsfähigkeit von Fremd­ proteinen zu verringern. Insbesondere wurde eine Unter­ drückung der humanimmunologischen Ansprechverhalten auf Fremd­ antikörper ohne Beeinflussung der Antikörperaktivität durch enzymatische Verdauung des Antikörpers erzielt, um den Fc-Anteil des Moleküls zu spalten. Die Produkt-F(ab)¹-Frag­ mente behalten die Bindekapazität für Antigene bei und können mit einer Vielzahl von Chemikalien gekoppelt werden, um Komplexe geringer Immunisierungsfähigkeit zu erzielen. Die Proteaseverdauung von Antikörpern ist jedoch ein langsamer Vorgang mit geringer Ausbeute, der eine Trennung der Produkt­ fragmente erforderlich macht.

Ein günstigerer Weg war die vorgeschlagene Modifizierung von Antikörpern, um Produkte zu erzielen, die eine hohe Antigen­ bindungsfähigkeit, eine geringe Immunisierungsfähigkeit und praktisch keine Toxizität besitzen. Derartige vorgeschlagene Modifikationen basieren weitgehend auf den bekannten immun­ hemmenden Einflüssen von hydrophilen Polymeren, z. B. Poly­ äthylen-Glykol (PEG) und Polyvinylalkohol (PVA) auf thera­ peutisch nützlichen Enzymen. Hierzu wird verwiesen auf J. Biol. Chem. 252, S. 3578-3586 (1977); Biochim. Biophys. Acta 660, S. 293-298 (1981); Clin. Exp. Immunol. 46, S. 649- 652 (1981); Biochim. Biophys. Acta 578, S. 47-53 (1979); Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 56, S. 159-170 (1978); J. Immunol. 126, S. 407-413 (1981); und Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 63, S. 1-13 (1980). Die angegebenen Modifi­ kationsvorgänge sind nicht generell auf Antikörper anwendbar; bei einer beispielhaften Untersuchung, von der in Radioimmuno­ imaging und Radioimmunotherapy, Elsevier Science Publishing Co., New York, New York 1983, berichtet wurde, wurde ein PEG- 6000-Derivat von Kaninchen-Antihumanserum Albumin unter Verwendung eines Kopplungsvorganges mit Cyanurchlorid erfolgreich bei der Modifizierung von Albumin mit PEG hergestellt (J. Biol. Chem. 252, S. 3578-3581, 1977). Während das Produkt eine verringerte Immunisierungsfähigkeit zeigte, war der Verlust an Reaktionsfähigkeit für Antigen nicht brauchbar (nahezu 70% Verringerung der Bindungskapazi­ tät). Ein ähnliches Ergebnis wurde in einer damit zusammen­ hängenden Studie J. Immunol. Methods 59, S. 327 (1983) erhalten, bei der festgestellt wurde, daß eine PEG-Modifizie­ rung von Ig, die durch Cyranurchlorid ausgemittelt wurde, die Antikörperaktivität zerstörte.

Die vorbeschriebene Literaturstelle J. Biol. Chem. 252 stellt die ursprüngliche Arbeit über die Kopplung von PEG mit Proteinen unter Verwendung von Cyanurchlorid dar. Daraus geht hervor, daß Rinderserum-Albumin (BSA) gekoppelt mit PEG die Immunisierungsfähigkeit verliert; BSA ist jedoch kein Antikörper. Aus dieser Entgegenhaltung kann hergeleitet werden, daß eine Verringerung der Immunisierungsfähigkeit von z. B. Immunoglobulinen dadurch erreicht werden kann, daß die Globuline PEG nach der Cyanurchlorid-Methode gekoppelt werden.

Des weiteren sind aus dem Journal of Immunological Methods, 59, S. 327-337, 1983, mit Monometoxy-Polyäthylenglycol kovalent modifizierte Antikörper bekannt; diese Entgegenhal­ tung lehrt, daß ein Antikörper, der nach dem Verfahren der vorstehend erörterten Entgegenhaltung (J. Biol. Chem. 252) modifiziert wird, einen erheblichen Teil seiner Bindungskapazi­ tät verliert, selbst bei einem verhältnismäßig geringen Modifizierungsgrad (Seiten 328 und 330). Derartige Antikörper sind bei Anwendungsfällen nutzlos, bei denen eine Abhängig­ keit von der Bindungsaktivität von Antikörper zu Antigen besteht.

Aus der Zeitschrift für Naturforschung 38c, S. 94-99, 1983, ist eine PEG-Verkettung mit Proteinen, z. B. BSA, über aktive Ester-Kopplungsvorgänge bekannt. Durch eine derartige Methode wird jedoch weder eine Verkettung mit Antikörpern offenbart noch wird ein immunogener Effekt auf die gebundenen Proteine in Betracht gezogen.

Aufgabe der Erfindung ist es, PEG-modifizierte Antikörper­ moleküle mit reduzierter Immunogenisierungsfähigkeit durch kovalente Modifikation des Antikörpers mit PEG unter Verwendung eines aktiven Ester-Zwischenmittels anzugeben und modifizierte Antikörper mit verringerter Bindekapazität für Fc-Zellenober­ flächen-Rezeptoren zu schaffen, die nicht toxisch sind und die die volle Antigen-Bindeaktivität beibehalten.

Gemäß der Erfindung sind solche Antikörper durch die Merkmale nach dem Anspruch 1 gekennzeichnet. Weitere Ausgestaltungen dieser Antikörper sind Gegenstand der Unteransprüche.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Polyäthylen-Glycol- Antikörperderivat, wobei der Antikörperkovalent mit Polyäthylen­ glycol (PEG) unter Verwendung eines aktiven Ester-Zwischen­ mittels erfolgt. Derivatisierte Antikörper zeichnen sich durch beibehaltene Antigen-Bindungsaktivität, niedrige Bindekapazität für Zellenoberflächen-Fc-Rezeptoren, verrin­ gerte Immunisierungsfähigkeit, gute Lagerstabilität und Nichttoxizität aus und sind zweckmäßig anwendbar bei konven­ tionellen immunologischen Techniken, wie z. B. bei der Tumorabbildung, der Chemotherapie, der Radiotherapie und immunohistochemischen Verfahren. Dabei ist ein großer Bereich von diagnostischen und therapeutischen Antikörpern einschließ­ lich monoclonaler Antikörper so modifizierbar, daß modifizierte Antikörper mit verringerter Immunisierungsfähig­ keit und geringer nichtspezifischer biologischer Aktivität erzielt werden.

Nachstehend wird die Erfindung in Verbindung mit der Zeich­ nung anhand von Ausführungsbeispielen erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine SDS-Scheiben-Gel-Elektrophorese von Kaninchen- Antikonalbumin modifiziert mit dem N-Hydroxyd-Succi­ nimid-Ester von mPEG-Succinat. Das jeweilige Gel wurde mit Koomassieblau gefärbt und in einem Densito­ meter bei 600 nm abgetastet. Die Zahlen in der Figur entsprechen dem Prozentsatz von mit mPEG modifizier­ ten Aminogruppen.

Fig. 2 stellt die Immunisierungsfähigkeit von 50 µg Kanin­ chen-Anti-CALB dar, das Ha/ICR-Mäusen aufgegeben wurde; es wurde unter Verwendung von EIA-Titrationen mit einem Kaninchen-Antimaus-IgG-Alkaline-Phospha­ tase-Reagens als zweitem Schritt ausgewertet. Die Zeit der Immunisierung ist mit Pfeil angedeutet. Das Anti-Kaninchen-IgG-Ansprechen, das durch unmodi­ fiziertes Kaninchen-Anti-CALB ausgelöst wurde, ist durch das Dreieck dargestellt. Das mit PEG modifi­ zierte (18% von Aminogruppen) ausgelöste Ansprechen ist durch die Kreise dargestellt.

Fig. 3 zeigt den Einfluß der mPEG-Modifizierung auf die Immunisierungsfähigkeit von Kaninchen-Anti-Conal­ bumin. Mäuse wurde mit 50 µg Antigen in PBS immunisiert, und das Antikörper-Ansprechen wurde unter Verwendung einer Enzym-Immuno-Probe ausgewer­ tet. Die Darstellung A zeigt den Antikörper-Titer (Nachweis) zwölf Tage nach der ersten Immunisierung, die Darstellung B den Antikörper-Titer achtzehn Tage nach der ersten Immunisierung und drei Tage nach der zweiten Immunisierung, und die Darstellung C den Antikörper-Titer 35 Tage nach der ersten Immuni­ sierung und neun Tage nach der dritten Immunisie­ rung.

Fig. 4 zeigt den Einfluß der Behandlung, den mit mPEG modifizierten Kaninchen-Anti-Konalbumin auf das Antikörperansprechen gegenüber nichtmodifiziertem Kaninchen-Anti-Konalbumin hat. Die Mäuse wurden entweder nicht behandelt (Kreis) oder mit 50 µg von nicht immunogenem mPEG (Dreieck) 5 und 20 Tage vor der Immunisierung mit 50 µg nichtmodifiziertem Kaninchen-Anti-Konalbumin (Tag 20) immunisiert. Der Mäuse-Anti-Kaninchen-Immunoglobulin-Titer wurde unter Verwendung einer enzymgekoppelten Probe bestimmt.

Fig. 5 zeigt die Bindung von Immunkomplexen mit P388.Dl.-Zel­ len. Immunkomplexe wurden aus Kaninchen-Anti-Konalbumin und mit Fluoreszin markiertem Hühnerei-Konalbumin (3 Mol Konalbumin/Mol von Antikörper) präpariert. Ein gleicher Anteil (aliquot) aus jedem Immunkomplex von 10⁶ Zellen wurde 30 Minuten lang inkubiert, wobei die Konzentration des Immunkomplexes auf der Abszisse dargestellt ist. Die Anzahl von fluoreszierenden Zellen wurde nach der Durchfluß-Zytometrie bestimmt.

Fig. 6 zeigt die Bindung von Immunkomplexen, die unter Verwendung von 3 Mol von durch Fluoreszin markiertem Hühnerei-Konalbumin und 1 Mol von mPEG-modifiziertem Kaninchen-Anti-Konalbumin auf P388.Dl-Zellen herge­ stellt wurden. Ein aliquoter Teil von 40 µg (bestimmt aus den Daten in Fig. 5) eines jeden Immunkomplexes wurde mit 10⁶ P388.Dl-Zellen dreißig Minuten lang inkubiert. Die Anzahl von fluoreszierenden Zellen wurde nach der Durchfluß-Cytometrie bestimmt. Die prozentuale mPEG-Modifizierung wurde durch TNBS-Amino­ gruppen-Analyse nachgewiesen. In 17% der Zellen wurde Autofluoreszenz beobachtet. Unterschiedliche Symbole zeigen Experimente, die an unterschiedlichen Tagen mit unterschiedlichen Mustern von mit PEG-modi­ fizierten Antikörpern durchgeführt wurden.

Fig. 7 zeigt die Bindung von mit Fluoreszin markiertem Kaninchen-Antimaus-Immunoglobulin (▲) und mit mPEG-modifiziertem, mit Fluoreszin markiertem, durch Affinität gereinigtem Kaninchen-Antimaus-Immunoglo­ bulin (⚫) an 10⁶-Maus-Splenozyten. Fluoreszierende Zellen wurden nach der Durchfluß-Cytometrie bestimmt. Die Darstellung A zeigt die Anzahl von fluoreszieren­ den Zellen als Funktion der Antikörper-Konzentration. Darstellung B gibt die Anzahl von Zellen an, in denen eine Fluoreszenzintensität auf dem Durchfluß-Cytome­ ter den Skalenwert überschritten hat.

Fig. 8 stellt eine konkurrierende Inhibition der Bindung von mit Fluoreszin markiertem Kaninchen-Antimaus-Immuno­ globulin gegen Maus-Splenocyten dar. Gereinigtes Maus-IgG in dem auf der Abszisse aufgeführten Betrag wurde bei Vorhandensein von entweder 8 µg mit Fluoreszin markiertem Kaninchen-Antimaus-Immunoglobu­ lin (▲) oder 8 µg des gleichen Reagens, das eben­ falls mit mPEG modifiziert war (⚫) sowie einmal 10⁶- Murin-Spenocyten inkubiert. Anschließend an das Waschen der Zellen mit PBS wurde die Anzahl von fluoreszierenden Zellen nach der Durchfluß-Cytometrie bestimmt. Bei diesem Versuch wurde Autofluoreszenz in 8% der Zellen beobachtet. Wenn kein Inhibitor beigefügt wurde, zeigen die mit mPeg modifizierten Antikörper 39% der Zellen und die nichtmodifizierten Antikörper 65%.

Fig. 9 zeigt den Einfluß der Modifikation auf Fluoreszenz- Emissionspektren von mit mPEG-modifizierten, mit Fluoreszin markierten Antikörpern. Ein durch Affini­ tät gereinigtes Kaninchen-Antimaus-Immunoglobulin- Reagens wurde mit FITC bis zu einem F/P-Verhältnis von 3,7 (M) modifiziert. Ein Bruchteil dieses Reagens wurde mit mPEG (30% von Aminogruppen modifiziert) modifiziert und die Fluoreszenz-Emissionsspektren der mit mPEG modifizierten (▲) und der nichtmodifizier­ ten (⚫) mit Fluoreszin markierten Antikörper wurden mit 0,80 mg/ml in einer 0,30-cm-Kuvette bestimmt, wobei ein AMINCO-Spektrofluorometer mit einer Erregerwellenlänge von 493 nm verwendet wurde.

Gemäß der Erfindung wird die Immunisierungsfähigkeit von Antikörpern durch eine kovalente Modifizierung des Antikörpers mit Polyäthylen-Glycol (PEG) reduziert oder eliminiert, indem ein PEG-aktives Ester-Zwi­ schenmittel verwendet wurde. Im Gegensatz zu bekannten Modifizierungen ergibt die PEG-Modifizierung von Antikörpern nach dem Verfahren nach der Erfindung ein Derivat, das die Reaktionsfähigkeit für Antigen beibehält, während es eine verringerte Immunisierungsfähigkeit zeigt. Ein besonderer Vorteil nach vorliegender Erfindung ist darin zu sehen, daß eine deutliche Reduzierung in nichtspezifischen Bindungen auftritt, was als Beitrag zur Inaktivierung des Fc-Teiles des Antikörper-Moleküls angesehen wird. Das Verfahren eliminiert somit die Bindung des Antikörpers mit den Zellen­ oberflächen-Fc-Rezeptoren und beschleunigt auf Antikörperkon­ zentration zielendes Gewebe in Anwendungsfällen, wie z. B. bei der Tumorabbildung und bei immunohistochemischen Techniken.

Bestimmte PEG-Polymere, die bei dem Verfahren nach der Erfindung zweckmäßig angewendet werden, weisen substituierte oder nichtsubstituierte PEG-Polymere mit Molekulargewichten von etwa 1000-5000 auf, die selbst schwache Immunogene sind und die unter Verwendung eines aktiven Ester-Zwischenmittels mit Antikörper gekoppelt werden können; der resultierende modifizierte Antikörper muß biologisch aktiv und weitgehend nichttoxisch und nichtimmunogen sein. Monomethoxypolyäthylen­ glykol (mPEG) erfüllt diese Kriterien und ist ein besonders geeigneter Modifizierer für Antikörper. Eine kovalente mPEG-Modifikation von Antikörpermolekülen unter Verwendung der gegebenen aktiven Esternäherung wird bei voller Beibehaltung der Bindeaktivität erzielt und ergibt sehr gut voraussagbare und reduzierbare Modifikationen.

Eine Antikörpermodifikation nach vorliegender Erfindung erfolgt über eine kovalente Verbindung von PEG mit TNBS-verfügbaren (Trinitrobenzol-Sulfosäure) Aminogruppen an dem Antikörpermole­ kül. Die Immunisierungsfähigkeit von mit PEG modifizierten Derivaten variiert mit dem Grad der Modifizierung, der auf einfache Weise durch eine entsprechende Auswahl des Verhält­ nisses von aktivem Ester zu Antikörper gesteuert wird. Bei optimalen Bereichen der Derivatisierung (mit einer Modifi­ zierung von typischerweise etwa 10-20% der verfügbaren Aminogruppen) geben die meisten Antikörper keinen Anlaß zu einem Immunansprechen, wenn sie dem modifizierten Antikörper in üblichen diagnostischen und therapeutischen Beträgen ausgesetzt worden sind. Bei höheren oder geringeren Graden der Modifizierung kann die Immunisierungsfähigkeit wieder hergestellt oder sogar verstärkt werden, je nach dem verwen­ deten Antikörper und dem verwendeten PEG-Modifizierer. Im allgemeinen fehlt Immunoglobulinmolekülen, bei denen zwischen 13 und 18% der Aminogruppen mit mPEG modifiziert sind, die anzeigbare Immunisierungsfähigkeit; bei einem geringen oder höheren Grad der Modifizierung kann jedoch der mPEG-Antikör­ perkomplex ein Immunansprechen in das nichtmodifizierte Molekül induzieren und es wird in vielen Fällen eine Verstär­ kung des Antikörperansprechens beobachtet. Antikörper-mPEG- Derivate nach dem vorliegenden Verfahren behalten ihre volle Antigen-Bindeaktivität bis zu einer Modifizierung von 35% der Aminogruppen bei; da es sich als schwierig herausgestellt hat, mehr als 35% verfügbarer Aminogruppen mit mPEG zu modifizieren, wirkt unter Verwendung eines noch höheren Überschusses an aktivem Ester die Modifikation mit mPEG in vorteilhafter Weise in dieser Hinsicht selbst begrenzend. Die meisten Antikörper-mPEG-Derivate, die eine ausreichend reduzier­ te Immunisierungsfähigkeit haben, behalten auch eine effek­ tive Antigen-Bindeaktivität unter den gewünschten Verfahrensbe­ dingungen aufrecht. Da die modifizierten, hier beschriebenen Präparationen eine Verteilung von Molekülen enthalten, sind die erwähnten Anteile der Modifizierung ein Mittelwert dieser Verteilung. Es ist möglich, daß die Bereiche von dem Grad der Reinheit abhängen und insbes., daß eine ausreichend reduzier­ te Immunisierungsfähigkeit über einen breiteren Bereich der Modifizierung mit erhöhter Reinheit der Ausgangsmaterialien erzielbar ist.

PEG ist in kovalenter Weise mit dem Antikörpermolekül nach der Erfindung in folgender Weise verbunden:

• 1. PEG+Karboxylierungsmittel→PEG-COOH
• 2. PEG-COOH+Carboxylgruppenaktivierungsmittel→aktiver Ester von PEG-COOH (PEG*)
• 3. Antikörper+PEG*→Antikörper-PEG

Wie in diesen Gleichungen zusammengefaßt, wird PEG karboxyli­ siert, und das gereinigte Produkt (PEG-COOH) mit einem geeigneten Karboxylaktivierungsmittel verestert, um den aktiven Ester-PEG* zu bilden. Dieses aktive Esterzwischenmit­ tel wird dann mit dem Antikörpermolekül gekoppelt, wobei der Aktivierungsanteil verloren geht. Wie bereits erwähnt, ergibt die Modifizierung eine Verteilung von Antikörpermolekülen, die in verschiedenartiger Weise mit PEG modifiziert werden; das Produkt kann genauer als Antikörper-PEG)_x dargestellt werden, wobei x die Anzahl von PEG-Gruppen an dem Antikörpermolekül ist. Die Anzahl von PEG-Gruppen x variiert entsprechend der Anzahl von reaktiven Aminogruppen, die am Antikörpermolekül vorhanden sind. Wenn ein ungereinigtes Reaktionsprodukt verwendet wird, ist es wichtig, daß die Menge an nichtsubstituiertem Antikörper (x=0) gering ist, um die Möglichkeit zu vermeiden, ein Immunansprechen mit dem bloßen Antikörpermolekül zu vermeiden.

Die Karboxylierung von PEG in PEG-COOH und die Aktivierung in den Aktivester PEG* wird durch eine aus einer Reihe von bekannten Methoden ausgewählte Methode durchgeführt; diese Methoden verwenden beispielsweise karboxylierende Mittel, z. B. Bernsteinsäureanhydrid oder klassische Schulbuch-Verfah­ ren, z. B. die Oxidation, an die sich eine Äthersynthese nach Williamsson anschließt. Bei einer besonders zweckmäßigen Ausführungsform wird die ausgewählte PEG-Spezies zuerst mit Bernsteinsäureanhydrid succinyliert, um PEG-COOH in einem Schritt (1) der Reaktion auszubilden; dann wird PEG-COOH (succinyliert) mit N-Hydroxysuccinid verestert, um das Aktivester PEG* im Schritt (2) der Reaktion auszubilden. Der N-Hydroxysuccinimid-Aktivester geht dann mit dem gewünschten Antikörper eine Reaktion ein, um im Schritt (3) das PEG-Antikörper­ konjugat auszubilden; dabei ergibt sich ein Verlust des Veresterungsanteils. Carboxyl-aktivierende Agentien, die zum Aktivieren von PEG-COOH geeignet sind, sind in der Technik bekannt; neben N-Hydroxysuccinimid ist Trinitrophenol ein Beispiel hierfür. Im Gegensatz zu bekannten Methoden, z. B. denen, die vorstehend zur Verbindung von PEG mit Antikörper erläutert worden sind, ergibt das Verfahren nach vorliegender Erfindung ein aktives, nichttoxisches Produkt, das die biologische Spezifität beibehält, das aber weitgehend eine nichtspezifische Reaktivität verloren hat.

Das Verfahren nach vorliegender Erfindung ist auf einen weiten Bereich von Antikörpern anwendbar, um die Immunisie­ rungsfähigkeit der Antikörper zu reduzieren, wenn sie in ein Säugetier, insbes. einen Menschen, eingeführt werden. Während das Verfahren besonders zweckmäßig zum Reduzieren der Immunisierungsfähigkeit von heterologen Spezien von Antikörpern ist, ist das Verfahren auch anwendbar auf homologe Spezien von Antikörpern. Antikörper sind Proteine von besonderem Interesse, da durch das Verfahren nach vorliegender Erfindung die Spezifität und Reaktionsfähigkeit der Antikörpermoleküle beibehalten wird, während nichtspezifische Bindungen der Antikörpermoleküle mit dem zellulären Fc-Rezeptor und eine rasche Freigabe des Antikörpers aus der Zirkulation beobach­ tet wird. Drogen, Toxine, fluoreszierende Materialien, Radionuclide oder andere aktive Anteile können auf einfache Weise mit dem modifizierten Antikörpermolekül über den PEG-Substituenten verbunden werden, um eine Abgabe an ausgewähltem Gewebe, insbes. an Tumorgewebe, für die Diagnose oder die Therapie zu erreichen. Aufgrund der verringerten nichtspezifischen Aktivität von Komplexen, die aktive Anteile konjugiert mit PEG-modifiziertem Antikörper aufweisen, wird eine vorzeitige Dissoziierung des Komplexes vermieden, und eine stark selektive Abgabe erreicht.

Monoclonale Antikörper, die nach der Erfindung modifiziert sind, haben mit der derzeitigen klinischen Anwendung von unmodifizierten MAbs mit Mausursprung im Immunansprechen des Wertes auf das Fremdprotein zugenommen, wodurch das MAb inaktiviert wird und auch die Möglichkeit für die Entwicklung von allergischen Reaktionen oder Serumerkrankungen geschaffen wird. Die klinische Verwendung von Human-Monoclonal-Antikör­ pern kann teilweise einem derartigen Immunansprechen entge­ genwirken. Selbst Human-MAbs führen jedoch allotypische und idiotypische antigenische Stellen, die das Ansprechen stimulieren können. Zusätzlich kann eine Behandlung mit intaktem humanem MAb mit einem aktiven, damit verbundenen Anteil äquivalent der Immunisierung mit einem Hapten-konju­ gierten Protein sein, das ein Antihapten-Ansprechen hervor­ rufen kann. Eine Modifizierung von Human- und Tier-MAbs nach vorliegender Erfindung ist somit insbes. geeignet zum Eliminieren all dieser Immunansprechen.

Die modifizierten Antikörper nach der Erfindung sind auch zweckmäßig anwendbar bei bekannten Gewebe- und Zell-Färbevor­ gängen als Substituenten für intakte Antikörper, um eine nichtspezifische Färbung aufgrund einer Zwischenwirkung zwischen zellulären Fc-Rezeptoren und dem Fc-Teil des Antikörpers zu vermeiden.

Die folgenden Beipiele zeigen die praktische Ausführung vorliegender Erfindung.

Beispiele Materialien und Verfahren Präparieren von Anti-Conalbumin-Antikörpern

Kaninchen-Anticonalbumin-Antiserum wurde durch Emulsifieren von Hühnerei-Conalbumin aufgelöst in PBS mit vollständigem Freund'schem Adjuvans mit einer End-Conalbumin-Konzentra­ tion von 1,0 mg/ml hergestellt. Kaninchen wurden in den Fußballen mit einem 1,0-ml-Aliquot der Emulsion immunisiert und 12-14 Tage später mit 1 mg emulsifiertem Antigen unter der Haut injiziert. Blutproben aus immunisierten Kaninchen wurden laufend auf Antikörpergehalt nach der Ouchterlony-Ana­ lyse überwacht. Für die übrigen Experimente wurde nur Antiserum mit hohem Titer (Normalität) und spätem Verlauf verwendet.

Der Anti-Conalbumin-Antikörper wurde von dem Kaninchen-Anti­ serum durch Affinitäts-Chromatographie auf einer CM-Biogel-A- Säule isoliert, die mit Conalbumin gekoppelt war, wobei der wasserlösliche Karbo­ dimid-Vorgang verwendet wurde. Es wurde der Affinitätssäule Antiserum aufgegeben, und die Säule wurde mit 0,5 M Natrium- Thiocyanat gewaschen und der resultierende Antikörper gleichzeitig entsalzen und konzentriert, wozu eine Mikro Pro di Con Einrichtung verwendet wurde. Der gereinigte Antikörper wurde bei 4° steril gespeichert.

Messung von Anti-Conalbumin-Aktivität

Die Antigen-Bindeaktivität der durch Affinität gereinigten und chemisch modifizierten Antikörper wurde durch Bewertung ihrer Fähigkeit bestimmt, konkurrierend die Bindung eines Kaninchen-Anticonalbumin-Alkali-Phosphatase-Konjugats mit mit Conalbumin überzogenen Mikroelisa-Platten zu behindern. Der enzymgekoppelte Antikörper für diese Prüfung wurde durch eine Modifizierung des von Avermeas beschriebenen Verfahrens hergestellt (Immuno. Chem. 6: 43, 1969) und wurde zur Erzielung einer maximalen Empfindlichkeit auf den mit Antigen überzogenen Platten vor Verwendung im Test titriert. Die mit Conalbumin überzogenen Mikroelisa- Platten wurden durch Verdünnen von Conalbumin bis 10 µg/ml in 0,05 M NaHCO₃ mit einem pH-Wert von 9,6 und einer Inkuba­ tionsdauer von 18 Stunden bei Raumtemperatur hergestellt. Gleiche Volumina von Antikörper- und Enzymkonjugat mit der geeigneten Verdünnung wurden dann in den mit Antikörper überzogenen Platten inkubiert, während zwei bis fünf Stunden lang bei Raumtemperatur konstant gemischt wurde. Im Anschluß an das Waschen der Platten mit H₂O wurde ein 300 ml entspre­ chender Anteil (aliquot) von p-Nitrophenyl-Phosphat, 0,25 mg/ml, in 0,1 N Tris-Cl mit einem pH-Wert von 10 jeder Quelle hinzugefügt und nach einer entsprechenden Inkubation wurde die Absorptionsfähigkeit bei 410 nm und 650 m unter Verwen­ dung einer Dynatech-Mikroelisa-Lesevorrichtung ausgelesen. Bei allen Tests wurden modifi­ zierte Antikörper gleichzeitig mit einer Standardkurve von nichtmodifizierten, durch Affinität gereinigten Antikörpern erprobt und die Daten als relativer Wert von mg Antikörpern/mg Protein ausgedrückt. Bei dieser Bindeprüfung wird ein durch Affinität gereinigter, unmodifizierter Antikörper so defi­ niert, daß er einen Wert von 1 mg Antikörper/mg Protein hat. Chemische Modifikationen entweder mit Blockantigenbindung oder Denaturierung des Antikörpers sind durch eine Abnahme dieser Zahl gekennzeichnet.

Kennzeichnung eines modifizierten Antikörpers

Es wurden drei unterschiedliche Messungen verwendet, um den modifizierten Antikörper zu charakterisieren. Die Protein- Konzentration wurde sowohl durch optische Dichtemessungen bei 280 mn bestimmt, wobei ein E % 280 nm=14 angenommen wurde (Methode, Immunol. Immuochem. 2: 343, 1968), und indem die Farbbindeprüfung (Analyt. Biochem. 72: 248, 1976) mit einer Standardkurve von Kaninchen-Gammaglobulin angewendet wurde. Die Konzentration des Standards wurde durch direkte Nessler­ isierung einer Kjeldahl-Verdauung bewertet (Stanford Med. Bull. 6: 97, 1948). Protein-Aminogruppen wurden durch TNBS-Titrationen bestimmt, wie von Habeed beschrieben (Analyt. Biochem. 14: 328, 1966). Das Ausmaß der PEG-Modifi­ zierung wurde ferner durch Messen einer Zunahme in der Proteingröße bewertet. Für diese Messung wurde die Protein­ größe unter Verwendung eines 6%igen diskontinuierlichen SDS-Elektrophorese-Gelsystems bewertet. SDS-Gelgrößenschät­ zungen von mit Polymer modifiziertem Immunoglobulin, die auf einer Standardkurve von globulären Proteinen basieren, enthalten jedoch starke Fehler. Deshalb werden Resultate berichtet, die einen Wanderungsabstand ohne die begleitenden Proteinstandardwerte zeigen.

Bestimmung der Immunisierungsfähigkeit

Die Immunisierungsfähigkeit von Kaninchen-Antikörper und den PEG-modifizierten Derivaten wurde durch Messen des Antikör­ peransprechens von Swiss-Mäusen auf eine intraperitoneale Injektion von 50 µg des Antigens (Kaninchen-Antikörper) in PBS bestimmt. Das Maus-Antikörperansprechen wurde unter Verwendung einer zweistufigen, enzymgekoppelten Prüfung festgelegt. Kurz gesagt, wurden mehrere zweifache Verdünnun­ gen von Mausseren auf einer mit Kaninchen-Immunoglobulin überzogenen Mikroelisa-Platte zwei bis fünf Stunden lang inkubiert. Nach einem ausgiebigen Waschen wurde die Platte mit einem Kaninchen-Antimaus-Alkalin-Phosphatase-Konjugat weitere zwei bis fünf Stunden lang inkubiert. Im Anschluß an diese zweite Inkubation wurde ungebundenes Konjugat durch ausgiebiges Waschen mit H₂O entfernt und die Quellen wurden erneut mit 300 ml von P-Nitrophenyl-Phosphat, 0,25 mg/ml in 0,1 N Tris-Cl mit pH-Wert 10 gefüllt. Nach einer zweistündi­ gen Inkubationsperiode wurde die Absorptionsfähigkeit bei 410 nm und 630 nm gemessen, wie weiter oben beschrieben. Bei dieser Anordnung wird Antikörper-Titer als die größte Verdünnung definiert, die ein Absorptionsfähigkeitsablesen ergibt, das wesentlich über Voranzapfwerten liegt.

Chemische Modifikationen

Zwei unterschiedliche Möglichkeiten wurden verwendet, um Antikörper mit mPEG zu modifizieren. Monomethoxypolyäthylen- Glycol (av MW=5000) wurde mit Antikörper unter Verwendung des Cyanur-Chlorid-Verfahrens (Eastman Chemical Co., Rochester, NY), das in Abuchewski (J. Biol. Chem. 252: 3578, 1977) beschrieben ist, gekoppelt. Zusätzlich wurde ferner mPEG mit Antikörper unter Verwendung eines aktiven Ester-Zwischenmittels gekoppelt. Um dieses Derivat herzustellen, wurde mPEG unter Verwendung eines Überschusses an Succinanhydrid in trockenem Pyridin succinyliert. Pyridin wurde durch eine Kombination von Blitzverdampfung und Lyophilisierung entfernt, und die verunreinigende Succinsäure wurde durch Dialyse entfernt. Gereinigtes mPEG-Succinat wurde lyophilisiert und in Methy­ len-Chlorid über einem Molekularsieb 4A getrocknet. Das mPEG-Succinat wurde dann in einem gleichen molaren Gemisch von DCC und N-Hydroxysuccinimid verestert, und der resultie­ rende N-Hydroxysuccinimid-Ester wurde durch Petroleumäther­ ausfälle wiedergewonnen. Der N-Hydroxy-Succinimid-Ester von mPEG-Succinat wurde durch wiederholtes Auskristallisieren von Benzol mit Petroleumäther gereinigt und dann in trockenem DMF gelöst und unter raschem Mischen einer Lösung von Antikörper beigefügt, die in 0,7 M, NaHCO₃ mit pH-Wert 9,6 modifiziert wurde. Das Ausmaß der Modifizierung wurde durch Veränderung des aktiven Esters auf Antikörperverhältnis gesteuert. Der resultierende mPEG-modifizierte Antikörper wurde durch ausgiebige Dialyse gegen PBS modifiziert.

Modifizierung von Protein mit FITC

Proben von Conalbumin und durch Affinität gereinigtem Kaninchen-Antimaus-Immunoglobulin wurden unter Verwendung des Verfahrens von Goding (J. Immunol. Meth. 13: 215, 1976) mit FITC durch Fluoreszenz markiert. Nur Proteinproben mit zwischen zwei und vier Mol Fluoreszein, enthalten pro Mol Protein, wurden für weitere Studien verwendet.

Polyäthylen-Glycol-Modifizierung

Durch Affinität gereinigter Kaninchen-Antikörper wurde mit Polyäthylenglycol unter Verwendung des N-Hydroxysuccinimid­ esters von Monomethoxypolyäthylen-Glycol-Succinat (mittleres Molekulargewicht=5000) verwendet. Für jede modifizierte Präparation wurde das Ausmaß der Modifizierung sowohl durch TNBS-Aminogruppenanalyse (Analyt. Biochem. 14: 328, 1966) und durch nichtreduzierende SDS-Gel-Elektrophorese auf 6%igen Polyacrylamidgels (Nature 227: 680, 1979) aufgebaut.

Bewertung der Zellenoberflächenbindung

Um eine Bindung von immunen Komplexen von Antikörperpräpara­ tionen auf Zellenoberflächen zu bewerten, wurde ein gleich­ wertiger Anteil von 1×10⁶ Zellen mit dem Testmittel in PBS bei 0° 30 Minuten lang inkubiert. Im Anschluß an diese anfängliche Inkubation wurde nichtgebundenes Material durch dreimaliges Waschen der Zellen mit PBS bei 0° entfernt. Das fertige Zellenpellet wurde in 1 ml PBS suspendiert und der Zellenbesatz auf Fluoreszenz unter Verwendung eines fluores­ zierenden, aktivierten Zellensortierers analysiert. Bei jeder Analyse wurden mehr als 1000 Zellen gezählt. Die Zellen wurden ferner durch Fluores­ zenzmikroskopie geprüft, um sicherzustellen, daß die Zellen­ oberflächenfluoreszenz untersucht wurde. Für diese Experi­ mente wurden zwei unterschiedliche Populationen von Zellen verwendet. Splenocyten wurden aus Swiss-Mäusen erhalten, und die verunreinigenden Erythrocyten wurden unter Verwendung der Ammonium-Chlorid- Technik (Mishell et al., Preparation of Mouse Cell Suspensions in Selected Methods of Cellular Immunology B. Mishell and S. Shiigi, W. H. Freeman and Col., San Francisco, p. 23, 1980) analysiert.

Zellenlinien

Die Murine-Macrophage-Linie P388.Dl wurde im Labor aus einer Zucht gezogen, die anfangs von American Type Tissue Collec­ tion, Bethesda, Maryland, erworben wurde.

Beispiel I Der Einfluß von mPEG-Modifikationen auf die Antikörper-Aktivität

Der Einfluß von mPEG-Modifikationen in Verwendung von Cyanurchlorid und aktiven Ester-Kopplungsvorgängen auf Antikörperaktivität ergibt sich aus den Tabellen I und II. Aus diesen Resultaten läßt sich entnehmen, daß selbst bei niedrigen Modifikationen eine wesentliche Herabsetzung der Antikörper-Bindeaktivität bei Cyanurchlorid vorhanden ist. Experimente, mit denen die Geschwindigkeit und die Form des aktivierten PEG verändert wurden, zusammen mit Experimenten, die die Reaktionsdauer und Temperatur verändert haben, haben die Wiedergewinnung von aktivem Antikörper nicht wesentlich verbessert. Im Gegensatz dazu führt die Verwendung von aktivem Ester zur Modifizierung eines Antikörpers mit PEG-Resultaten zu keinem meßbaren Verlust des Antikörper-Ti­ ters oder der Antikörper-Aktivität.

Tabelle I

Antigen-Bindeaktivität von Kaninchen-Anticonalbumin modifi­ ziert mit mPEG unter Verwendung des Cyanur-Chloridverfahrens

Tabelle II

Antigen-Bindeaktivität von Kaninchen-Anticonalbumin modifi­ ziert mit mPEG unter Verwendung des N-Hydroxy-Succinimid- Esters von mPEG-Succinat

Beispiel II Effektivität der Modifizierung von Antikörpern nach Beispiel I mit mPEG nach der Erfindung

Um nachzuweisen, daß ein Antikörper entscheidend durch dieses Verfahren modifiziert wurde, werden alle mPEG-modifizierten Antikörperpräparationen durch SDS-Gel-Elektrophorese analy­ siert. Ein Beispiel für eine Serie von Derivaten ist in Fig. 1 dargestellt. Resultate aus diesem Experiment zeigen eindeutig, daß die meisten oder alle Moleküle in der Popula­ tion modifiziert sind und daß im Anschluß an die Modifizie­ rung das Molekulargewicht erheblich ansteigt. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die modifizierten Antikörper, die geprüft wurden, eine Verteilung von Molekülen darstellen, deren jedes eine unterschiedliche Anzahl von PEG-Molekülen pro Antikörper enthält. Die angegebene prozentuale Modifizie­ rung ist dann ein Mittelwert dieser Verteilung.

Beispiel III Immunisierungsfähigkeit von Kaninchen-Anti­ conalbumin, das nach der Erfindung modifiziert ist

Die Immunisierungsfähigkeit bei Swiss-Mäusen von mit mPEG modifiziertem Kaninchen-Anticonalbumin (18% Aminogruppen modifiziert) (aktives Esterkopplungsmittel) verglichen mit der Immunisierungsfähigkeit von nichtmodifiziertem Kaninchen- Antikörper ist in Fig. 2 gezeigt. Diese Figur zeigt klar, daß unter den geeigneten Modifizierungsbedingungen die Immunisie­ rungsfähigkeit von Kaninchen-Antikörper wesentlich eliminiert werden kann. Der modifizierte Antikörper, der bei diesem Experiment untersucht wurde, behielt seine vollständige Antigen-Bindeaktivität bei. Der Effekt der Veränderung des mPEG-Gehaltes von modifiziertem Kaninchen-Antikörper auf die Immunisierungsfähigkeit in der Maus ist in Fig. 3 gezeigt. Ähnliche Resultate ergeben sich nach primären, sekundären und tertären Immunisierungen, und diese Resultate sind im wesentlichen identisch mit denen, die daraus erhalten wurden, daß Kaninchen-Antikörper durch das Cyanur-Chloridverfahren hergestellt wurde (Beispiel I). Im Gegensatz zu den Deriva­ ten, die mit Cyanur-Chlorid hergestellt wurden, behielten alle Kaninchen-Antikörper, die bei diesem Experiment geprüft wurden, die vollständige Antikörperaktivität bei. Ähnliche Resultate wurden mit Antihumanserum-Albumin-Antikörper erzielt.

Beispiel VI Bewertung des Maus-Immunansprechens auf Kanin­ chen-Antikörper

A. Um die Möglichkeit zu eliminieren, daß das Fehlen eines Ansprechens auf mPEG-modifizierte Antikörper durch das Einführen einer Toleranz bedingt wurde, wurden Swiss-Mäuse zweimal mit 50 µg von nichtimmunogenem mPEG-modifiziertem Antikörper immunisiert. Nach der Festlegung, daß die immunisierten Tiere kein Ansprechen auf Kaninchen-Anti­ körper, das mit mPEG modifiziert wurde, zeigen, wurden nach der Erfindung die immunen Tiere und unbehandelte Vergleichstiere mit einer anteiligen Menge von 50 µg nichtmodifiziertem Kaninchen-Antikörper behandelt. Zwölf Tage nach dieser Behandlung wurde das Maus-Antikaninchen- Immunoglobulin festgestellt. Die Resultate dieses Experi­ ments, die in Fig. 4 dargestellt sind, zeigen keine Unterschiede im Ansprechen der beiden Testgruppen von Tieren auf Kaninchen-Antikörper, was darauf schließen läßt, daß der mPEG-modifizierte Antikörper die Versuchs­ tiere weder toleriert noch angeregt hat.

B. Die Hyperansprechbarkeit, die durch einige der mPEG-modi­ fizierten Kaninchen-Antikörper in A (wie oben) induziert wurde, wurde durch Bewertung der unterstützenden Eigen­ schaften von PEG untersucht. Swiss-Mäuse wurden mit 50 µg von Kaninchen-Immunoglobulin bei Vorhandensein von sich ändernden PEG-Konzentrationen bis zu 1 mg/ml PEG immuni­ siert und das Antikörperansprechen 15 Tage später festge­ stellt. Bei diesem Experiment war das PEG nicht kovalent mit dem Kaninchenprotein verbunden. Die Resultate (es sind hierfür keine Daten dargestellt) ergeben keine Unterschiede in der Immunisierungsfähigkeit bestimmter dieser Proben, und es ist zu vermuten, daß PEG selbst kein Adjuvant ist.

Beispiel V Eliminierung der Fc-Rezeptorbindung durch mPEG-Antikörpermodifizierung nach der Erfindung

A. Die Bindung von Immunkomplexen, die aus Kaninchen-Anticon­ albumin-Antikörper und mit Fluoreszin markiertem Conalbu­ min mit der Murin-Macrophage P388.Dl-Zellenlinie herge­ stellt wurden, ist in Fig. 5 gezeigt. Diese Daten zeigen eine von der Konzentration abhängige Bindung der immunen Komplexe mit den meisten Zellen in der Population. Diese Bindekurve wurde nicht entscheidend geändert, wenn immune Komplexe unter Verwendung mehrerer unterschiedlicher Antigen-Antikörper-Verhältnisse hergestellt wurden.

Um den Einfluß der mPEG-Modifikation auf die Fc-Bindung zu untersuchen, wurde eine Konzentration von immunen Komple­ xen aus der Kurve in Fig. 5 ausgewählt, damit eine annähernd 75%ige Bindung erhalten wurde, und diese Konzentration wurde in anschließenden Experimenten verwendet. Die Bindeexperimente, die in Fig. 5 beschrieben wurden, wurden dann mit immunen Komplexen wiederholt, die unter Verwendung von mPEG-modifizierten Antikörpern nach der Erfindung hergestellt wurden. Die Resultate eines typischen Experiments (wie in Fig. 6 dargestellt) zeigen eine vollständige Inhibition von Fc-Bindung, wenn weniger als 20% der Aminogruppen mit mPEG modifiziert worden waren. Die mPEG-modifizierten Antikörper, die bei diesen Experimenten verwendet wurden, behielten alle 100% ihrer anfänglichen Antikörperaktivität bei, wie sie in verglei­ chenden, durch Enzyme gekoppelten Immunproben festgestellt wurden. Wiederholungen dieses Experimentes unter Verwen­ dung von Immunkomplexen, die aus unterschiedlichen Mengen an mPEG-modifiziertem Antikörper hergestellt wurden, ergaben eine ähnliche Inhibition der Fc-Bindung. Somit kann die Fc-Bindung vollständig inhibiert werden, wenn der Antikörper, der im Immunkomplex vorhanden ist, 15-20% seiner Aminogruppen enthält, die mit mPEG in einer aktiven, mit Ester ausgemittelten Reaktion modifiziert werden.

B. Um den Einfluß der mPEG-Modifikation der Fc-Bindung weiter zu untersuchen, wurde eine Probe eines mit Fluoreszin modifizierten Kaninchen-Antimaus-Immunoglobulins mit mPEG nach vorliegender Erfindung modifiziert und eine Bindung dieses doppelt modifizierten Reagens wurde an Maus-Spleno­ cyten getestet. Fig. 7 vergleicht die Titrierkurven von fluoresziniertem Kaninchen-Antikörper an Maus-Splenocyten vor und nach der mPEG-Modifizierung. Aus dieser Figur ergibt sich, daß beide Reagentien gleich stark empfindlich auf die Anzeige von Maus-B-Zellen reagieren (Fig. 7A). Unter Verwendung eines Überschusses von fluoresziniertem Reagens scheinen jedoch die durch den mPEG-modifizierten Antikörper angezeigten Zellen eine obere Grenze für die zelluläre Fluoreszenzintensität zu haben, während Zellen, die durch das Reagens angezeigt wurden, das nicht mPEG-mo­ difiziert war, eine erhöhte Fluoreszenzintensität haben (Fig. 7B).

C. Es wurde gezeigt, daß das mit mPEG modifizierte Reagens sich mit dem Immunoglobulin der Zelloberfläche verbindet, während das nicht mit mPEG modifizierte Reagens eine nichtspezifische Bindung mit den Fc-Rezeptoren der Oberfläche zeigt. Um diese Feststellung zu bewerten, wurde gereinigtes Maus-Immunoglobulin verwendet, um die Verbind­ dung beider Reagentien mit Maus-Splenocyten vergleichend zu inhibieren. Die Resultate dieses Experimentes, die in Fig. 8 gezeigt sind, legen eindeutig fest, daß die Verbindung des klassischen fluoreszierenden Reagens (nicht mit mPEG modifiziert) nicht vollständig durch Antigen inhibiert werden kann, während eine Bindung des mit mPEG modifizierten Reagens vollständig inhibiert wurde. Ferner war die Menge an Maus-Immunoglobulin, die erforderlich war, um die Bindung des mit mPEG modifizierten Reagens mit Maus-Splenozyten vergleichend zu inhibieren, die Konzen­ tration, die auf der Basis von theoretischen Bindungs­ berechnungen inhibierbar wäre.

D. Da unter Bedingungen sich sättigender Reagenskonzentration die Zellen, die unter Verwendung eines klassischen Reagens angezeigt wurden, heller als Zellen waren, die unter Verwendung des mit mPEG modifizierten Reagens angezeigt wurden, bestand die Möglichkeit, daß eine mPEG-Modifika­ tion die Fluoreszenz unterdrücken könnte. Um diese Möglichkeit zu prüfen, wurden die Fluoreszenz-Emissions­ spektren für das Kaninchen-Antimaus-Immunoglobulin-Reagens vor und nach der mPEG-Modifizierung festgestellt. Diese Emissionsspektren sind in Fig. 9 gezeigt. Es wird kein Einfluß auf die mPEG-Modifizierung bei der Emissionsinten­ sität oder den Spektren beobachtet. Diese Daten lassen vermuten, daß bei der Konzentration von mPEG, die in den Beispielen zur Modifizierung von Antikörper verwendet worden ist, kein Verlust an Empfindlichkeit auftritt.

Ergebnisse

PEG-modifizierte Antikörper nach der Erfindung zeigen eine bemerkenswert verringerte Immunisierungsfähigkeit, eine niedrige spezifische Bindekapazität für Zellenoberflächen-Fc- Rezeptoren und eine Retention der Antigen-Bindeaktivität. Die mPEG-Modifikation von Antikörpern eliminiert auch entschei­ dend die Fc-Rezeptor-Bindung. Eine kovalente Modifikation von mehr als 15% von Aminogruppen des Kaninchen-Anticonalbumin- Antikörpers mit mPEG hat vollständig verhindert, daß immune Komplexe mit diesem Antikörper aufgrund der Bindung mit dem Fc-Rezeptor auf der Murin-Makrophage-Zellinie P388.Dl hergestellt wurden. Ähnliche Empfindlichkeiten werden für die mit mPEG modifizierten, mit Fluoreszin markierten Antikörper beobachtet, da eine mPEG-Modifikation die Fluoreszin-Fluoreszenz nicht zum Löschen bringt. Ein mit Fluoreszin markiertes Kaninchen-Antimaus-Immunoglobulin, das mit mPEG modifiziert war, zeigte keine wahrnehmbare Bindung mit Murin-Splenozyt- Fc-Rezeptoren nach der Durchflußcytometrie. Somit ist die mPEG-Modifizierung ein praktisches Verfahren zum Eliminieren der Fc-Bindung zur Verwendung bei der Zell- und Gewebe-Fär­ bung, z. B. in immunhistochemischen Vorgängen und in der Durchflußcytometrie. Das Fehlen von Toxizität des PEG-modifi­ zierten Antikörpers in Vivo legt die Vermutung nahe, daß auch ein Verfahren zur Abnahme der Hintergrundgewebebindung wie auch zur Reduzierung der Immunogenisierungsfähigkeit bei den diagnostischen und therapeutischen Anwendungen von Antikör­ pern im menschlichen Körper erzielt wird.

Claims (16)

1. Antikörper, der mit Polyäthylenglykol durch Reaktion von karboxyliertem Polyäthylenglykol mit einem Karboxyl aktivierenden Mittel zur Ausbildung eines polyäthylen­ glykolaktiven Esterzwischenmittels, und durch Reaktion des aktiven Esterzwischenmittels mit einem Antikörper zur Bildung eines biologisch aktiven Polyäthylenglykol-Anti­ körperderivats mit einer verringerten Immunisierungs­ fähigkeit und unter Beibehaltung der Reaktionsfähigkeit für das Antigen kovalent modifiziert ist.

2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyäthylenglykol ein substituiertes oder nichtsub­ stituiertes Polymer mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bis 5000 ist.

3. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyäthylenglykol Monomethoxypolyäthylenglykol ist.

4. Monoclonaler Antikörper, der mit Polyäthylenglykol nach Anspruch 1 kovalent modifiziert ist.

5. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Polyäthylenglykol Monomethoxypolyäthylenglykol ist.

6. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das karboxylierte Polyäthylenglykol succinyliertes Polyäthylenglykol ist, und daß das Karboxyl aktivierende Mittel n-Hydroxysuccinimid ist.

7. Antikörper nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Glykol Monomethoxypolyäthylenglykol ist.

8. Antikörper nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der modifizierte Antikörper eine erhöhte biologische Spezifizität im Vergleich zu dem nicht modifizierten Antikörper hat.

9. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er mit einem aktiven Anteil zusammengesetzt ist.

10. Antikörper nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil ein Radionucleid-, Drogen-, Toxin- oder fluoreszierendes Reagens ist.

11. Antikörper nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Antitumor-Antikörper ist.

12. Reagens für einen immunohistochemischen Vorgang, gekenn­ zeichnet durch einen Antikörper, der nach Anspruch 1 kovalent modifiziert ist.

13. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der modifizierte Antikörper eine deutliche Reduzierung in verringerte nichtspezifische Bindungen aufweist.

14. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der modifizierte Antikörper eine niedrige spezifische Bindungs­ kapazität für Zellenoberflächen-Fc-Rezeptoren hat.

15. Reagens für einen immunologischen Vorgang, gekennzeichnet durch einen Antikörper, der nach Anspruch 1 kovalent modifiziert ist.

16. Reagens für einen immunologischen, diagnostischen oder therapeutischen Vorgang, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper nach Anspruch 1 über den PEG-Substituenten mit einem Drogen-, Radionukleid-, Toxin- oder fluoreszierenden Reagenskomplex zusammengesetzt ist.