DE3600083A1

DE3600083A1 - Verwendung von interferon zur verbesserung der wirksamkeit der futterverwertung und zur beeinflussung des appetits von tieren

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Publication number: DE3600083A1
Application number: DE19863600083
Authority: DE
Inventors: Joseph M. Amarillo Tex. Cummins
Original assignee: Texas A&M University System
Current assignee: Texas A&M University System
Priority date: 1985-01-04
Filing date: 1986-01-03
Publication date: 1986-09-18
Anticipated expiration: 2006-01-04
Also published as: BR8600071A; AU583332B2; IT1207573B; ZA859894B; AU5163085A; FR2575655A1; IT8619011A0; DE3600083C2; US4820515A; FR2575655B1; NZ214702A

Description

Die Erfindung betrifft allgemein ein neues Verfahren zur Verwendung von Interferon in niedrigen Dosierungen zur Beeinflussung des Appetits und der Wirksamkeit der Futterausbeutung bei warmblütigen Wirbeltieren. Die Erfindung betrifft weiterhin eine neuartige Verwendung des Interferons in niedriger. Dosierung zur Verhinderung und Behandlung des respiratorischen Erkrankungskomplexes bei Rindern.

"Interferon" ist ein allgemeiner Begriff, der eine Gruppe von Glycoproteinen und Proteinen von Wirbeltieren umfaßt, die bekanntlich verschiedene biologische Wirkungen zeigen, z.B. Antivirus-, Antiproliferations- und Immunmodulationswirkungen bei Tierarten, aus denen diese Substanzen gewonnen werden können. Die folgende Definition von Interferon ist von einem internationalen Komitee für die Erstellung eines Systems für eine ordnungsgemäße Nomenklatur der Interferone akzeptiert worden: "Um als Interferon angesehen zu werden, muß ein Faktor ein Protein sein, das virusunspezifische, antivirale Wirkungen mindestens in homologen Zellen durch zelluläre metabolische Prozesse unter Einbeziehung sowohl der RNA- als auch der Proteinsynthese aufweist."; vgl. Journal of Interferon Research, J_, S. VI (1980).

Seit den ersten Berichten über Interferon von Isaacs und Lindeman (See, Proc. Roy. Soc. London (Ser. B), Bd. 147, S. 258 ff (1957) und US-PS 3 699 222) ist Interferon auf der ganzen Welt das Ziel von intensiven Forschungsarbeiten gewesen. Es gibt eine Unzahl von Veröffentlichungen über die

Synthese von Interferon; M. Wilkinson und A. G. Morris, Interferon and the Immune System 1: Induction of Interferon by Stimulation of the Immune System, Interferons: From Molecular Biology to Clinical Application, Hrsg. D. C. Burke und A. G. Morris, Cambridge Univ. Press, 1983, S. 149-179; P. I. Marcus, Kap. 10, Interferon Induction by Virus, Interferons and Their Applications, Hrsg. P. E. Came und W. A. Carter, Springer Verlag, (Handbook of Experimental Pharmacology V. 71) 1984, S. 205-232; vorgeschlagene molekulare Eigenschaften; P. B. Sehgal, How Many Human Interferons Are There? Interferon 1982, Hrsg. I. Gresser, Academic Press, 1982, S. 1-22; J. Collins, Structure and Expression of the Human Interferon Genes, Interferons: Prom Molecular Biology to Clinical Application, Hrsg. D. C. Burke und A. G. Morris, Cambridge Univ. Press, 1983, S. 35-65; K. C. Zoon und R. Wetzel, Kap. 5, Comparative Structures of Mammalian Interferons, 1a: Interferons and Their Applications, Hrsg. P. E. Came und W. A. Carter, Springer Verlag, (Handbook of Experimental Pharmacology V. 71) 1984, S. 79-100; klinische Anwendungen; M. Krim, Kap. 1, Interferons and Their Applications: Past, Present, and Future, Interferons and Their Applications, Hrsg. P. E. Came und W. A. Carter, Springer Verlag, (Handbook of Experimental Pharmacology V. 71) 1984; S. B. Greenberg und M. W. Harmon, Kap. 21, Clinical Use of Interferons: Localized Applications in Viral Diseases, Ibid. S. 433-453; vorgeschlagener Mechanismus der Antitumor-, Antivirus- und Immunsystemwirkung. G. M. Scott, The Antiviral Effects of Interferon, From Molecular Biology to Clinical Application, Hrsg. D. C. Burke und A. G. Morris, Cambridge Univ. Press, 1983, S. 279-311; M. McMahon und I. M. Kerr, The Biochemistry of the Antiviral State, Ibid. S. 89-108; J. S. Malpas, The Antitumor Effects of Interferon, Ibid. S. 313-327; J. Taylor-Papadimitrion, The Effects of Interferon on the Growth and Function of Normal and Malignant Cells, Ibid. S. 109-147.

Wegen der Intensität und der unterschiedlichen Herkunft der Forschungsarbeiten über Interferon und seine Eigenschaften sowie Verwendungen besteht ein erheblicher Mangel an Einheitlichkeit bei solchen Gesichtspunkten wie Klassifikation der Interferontypen. Es gibt auch zahlreiche, gelegentlich widersprüchliche Theorien über die Wirkungsweise des Interferons bei der Hervorrufung klinischer Effekte. Die folgende kurze Zusammenfassung des gegenwärtigen Wissensstandes über Interferon wird beim Verständnis der vorliegenden Erfindung helfen.

Obwohl ursprünglich aus Geflügelzellen isoliert (allantoische Zellen von Hühnern) ist die Interferonbildung in Zellen sämtlicher Klassen von Wirbeltieren einschließlich Säugetieren, Amphibien und Reptilien beobachtet worden. Die Interferonbildung durch Wirbeltierzellen erfolgt selten spontan, sondern wird häufig in leichter Weise bei der Behandlung von Zellen (in vivo oder in vitro) mit einer Vielzahl von Substanzen "induziert", welche Viren, Nucleinsäuren (einschließlich solcher aus Viren als auch synthetischer Polynucleotide), Lipopolysaccharide und verschiedene Antigene und Mitogene einschließen.

Interferone sind im allgemeinen nach den Arten der die Substanz produzierenden Zellen bezeichnet worden (z.B. Mensch, Maus oder Rind), weiterhin nach der betreffenden Zellart (z.B. Leukocyten, Lymphoblastoide, Fibroblaste) und gelegentlieh nach der Type des für die Interferonproduktion verantwortlichen induzierenden Materials (z.B. Virus, Immun). Interferon ist von einigen Wissenschaftlern oberflächlich nach der Induktionsart als Typ I oder Typ II klassifiziert worden, wobei die erste Klasse virus- und nucleinsäureinduziertes Interferon und die zweite Klasse das als Lymphokin gebildete

Material durch Induktion durch Antigene und Mitogene einschließt. Neuerdings klassifiziert das internationale Komitee, das sich mit dem ordnungsgemäßen Nomenklatursystem für Interferon befaßt, Interferon nach Typen auf der Grundlage der Antigenspezifität. In dieser neueren Klassifizierung werden die Bezeichnungen alpha (α), beta (3) und gamma (γ) verwendet, die den früheren Bezeichnungen von Leukocyten-, Fibroblasten- und Typ II (Immun)-Interferonen entsprechen. Alpha- und beta-Interferone sind gewöhnlich säurestabil und entsprechen denjenigen, die früher als Typ I-Interferone bezeichnet wurden. Gamma-Interferone sind gewöhnlich säurelabil und entsprechen denjenigen, die früher Typ Il-Interferone genannt wurden. Die Nomenklaturempfehlungen des internationalen Komitees betreffen lediglich menschliche und Mäuseinterferone. Journal of Interferon Research, I_-, S. VI (1980).

Die Bestimmung der präzisen Molekülstruktur des Interferons war einige Zeit mit den Mitteln des Standes der Technik nicht möglich. In den Jahren, nachdem Interferon zuerst als proteinartig charakterisiert wurde, und zwar auf der Grundlage seiner Desaktivierung durch Trypsin, waren Versuche zu seiner Reinigung und eindeutigen Charakterisierung unmöglich wegen seiner hohen spezifischen Aktivität und seiner augenscheinlichen Heterogenität. Heute ist für Interferon einige Präzision bei der Bestimmung der Molekülstruktur erreicht worden, vgl. P. B. Sehgal, a.a.O.; J. Collins, a.a.O.; K. C. Zoon und R. Wetzel, a.a.O.

In seinen frühesten Anwendungen wurde Interferon ausschließlich als Antivirusmittel angewendet. Die erfolgreichste klinischtherapeutische Anwendung bis heute fand bei der Behandlung von Viruserkrankungen statt. Es zeigte sich jedoch, daß exogenes Interferon bei verschiedenen Metastasenerkrankungen manchmal eine Regression oder Remission hervorrufen kann. Eine Über-

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sieht über gegenwärtige klinische Versuche mit Interferon als therapeutisches Antivirusmittel und Antiproliferationsmittel bis zum Anfang des Jahres 1983 ist in The Biology of the Interferon System 1983, Proceedings of the Second International TNO Meeting on the Biology of the Interferon System, Rotterdam, The Netherlands, 18.-22. April 1983, und Antiviral Research, March 1983, Special Abstract Issue, Elsevier /North-Holland Biomedical Press, Netherlands, enthalten.

Das klinische Mittel der Wahl für diese Arbeit ist menschliches Leukocyteninterferon gewesen, im "Großmaßstab" hergestellt durch Verfahren, die die Sammlung und Reinigung von großen Mengen von Leukocyten aus menschlichem zentrifugiertem Blut, die Induktion mit Viren und die Isolation aus Kulturmedien einschließen. Der Bedarf an Interferon menschlichen Ursprungs liegt in dem seit langem bestehenden Schluß begründet, daß Interferon "artenspezifisch", d.h. biologisch wirksam in vivo nur in solchen Arten ist, die homolog zu den Produktionszellen sind.

In den oben beschriebenen Arbeiten wurde Interferon parenteral verabreicht, d.h. intramuskulär und intradermal, wobei über einige erfolgreiche topische und intranasale Anwendungen berichtet worden ist. Es ist selten intravenös verabreicht worden, und zwar wegen erheblicher nachteiliger Effekte, die "Verunreinigungen" in rohen und selbst in hochgereinigten Isolaten zugeschrieben werden. Die Erfindung der Anmelder gemäß US-PS 4 462 985 und gemäß PCT-Anmeldung PCT/US 81/01103, eingereicht am 18. August 1981 und veröffentlicht am 4. März 1982 - auf deren Inhalt hier Bezug genommen wird - betrifft die Verwendung von Interferon aus heterologischen Arten und weiterhin auch orale Verabreichung.

Vor diesen Veröffentlichungen hat es keine Berichte über therapeutisch erfolgreiche orale Verabreichungen von Interferon gegeben. Dies steht im Einklang mit der weitverbreiteten Auffassung, daß Interferon in der Umgebung des Verdauungstraktes von Tieren nicht stabil ist.

Zusätzlich zu der Verwendung in der Antivirus- und Antitumortherapie wurde kürzlich gefunden, daß Interferon auch immunomodulatorische Wirkungen zeigt, und zwar sowohl immunopotenzierende als auch immunosupressive Wirkungen. B. Lebleu und J. Content, Mechanisms of Interferon Action: Biochemical and Genetic Approaches, Interferon 1982, Hrsg. I. Gresser, Academic Press, 1982, S. 47-94; M. Moore, Interferon and the Immune System, 2: Effect of IFN on the Immune System, Interferons: From Molecular Biology to Clinical Application, Hrsg. D. C. Burke und A. G. Morris, Cambridge Univ. Press, 1983, S. 181-209; H. Smith-Johannsen, Y-T Hou, X-T Liu, und Y-H Tan, Kap. 6, Regulatory Control of Interferon Synthesis and Action, Interferons and Their Applications, Hrsg. P. E. Came und W. A. Carter, Springer Verlag, (Handbook of Experimental Pharmacology V. 71) 1984, S. 101-135; J. L. Raylor, J. L Sabram, und S. E. Grossberg, Kap. 9, The Cellular Effects of Interferon, Ibid. S. 169-204; J. M. Zarling, Effects of Interferon and Its Inducers on Leukocytes and Their Immunologie Functions, Ibid. S. 403-431; R. Ravel, The Interferon System in Man: Nature of the Interferon Molecules and Mode of Action, Antiviral Drugs and Interferon: The Molecular Basics of Their Activity, Hrsg. Y. Becker, Martinus Nijhoff Pub., 1984 S. 357-433.

Weiterhin werden ständig "neue" biologische Wirkungen für exogenes und endogenes Interferon festgestellt. K. Berg, M. Hokland, und I. Heron, Biological Activities of Pure

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HuIFN-Alpha Species, Interferon, Properties, Mode of Action, Production, Clinical Application, Hrsg. K. Munk und H. Kirchner, (Beiträge zur Onkologie V. 11) S. 118-126; S. Pestka et al., The Specific Molecular Activities of Interferons Differ for Antiviral, Antiproliferative and Natural Killer Cell Activities, The Biology of the Interferon System, 1983, Hrsg. E. DeMaeyer und H. Schellekens, S. 535-549; P. K. Weck und P. E. Cane, Kap. 16, Comparative Biologie Activities of Human Interferons, Interferons and Their Applications, Hrsg. P. E. Came und W. A. Carter, Springer Verlag, (Handbook of Experimental Pharmacology V. 71) 1984, S. 339-355.

Vor der Erfindung gemäß US-Patentanmeldung Nr. 448 951 vom 13. Dezember 1982 (P 33 45 092.7) - auf deren Offenbarung hier Bezug genommen wird - hat es keine Berichte über die Fähigkeit des Interferons gegeben, den Appetit und die Futterausbeutung bei warmblütigen Wirbeltieren zu beeinflussen. Diese Anmeldung offenbart, daß Interferon eine solche Wirksamkeit hat.

Eine Viruserkrankung, die bisher noch nicht mit Interferon oder anderen Mitteln behandelt werden konnte, ist der respiratorische Erkrankungskomplex bei Rindern (BRDC). BRDC ist ein umfassender Begriff, der eine akute, ansteckende Infektion bei Rindern bezeichnet, die durch eine Entzündung der oberen Luftwege und der Trachea gekennzeichnet ist. BRDC führt zu einer Pneumonie mit klinischen Anzeichen von Dyspnöe, Anorexie, Fieber, Depression, mueopurulentem nasalem und okularem Ausfluß; dies führt zu einer hohen Morbidität und Mortalität. BRDC ist ein wichtiger Faktor bei dem Verlust an Rindern durch Erkrankungen. Der wirtschaftliche Schaden der Züchter bei der Behandlung,

dem Gewichtsverlust/ dem Verlust durch Tod und durch Ausmerzen wird auf etwa 333.000.000 US-$ pro Jahr geschätzt (National Cattlemen's Association, 1980).

Wenn BRDC bei Vieh nach dem Transport auf Fütterstationen oder Weiden festgestellt wird, bezeichnet man es häufig als "Transportfieber". Auf dem Weg zu den Fütterungsstellen erfahren die Kälber den Streß von intensiven Handhabungstechniken, von Transport ohne Futter oder Wasser und einer Vielzahl von infektiösen Agentien. Nach der Ankunft an der Fütterstation erfahren die Kälber weiteren Streß durch Entwöhnen, Kastration, Enthornen, Markieren mit Brandzeichen, Ohrenkennzeichnen, Entwurmen, Impfen und Entlausen. In vielen Situationen werden -die Kälber zusätzlich noch durch Umstellungen in der Ernährung und Umwelteinflüsse gestreßt.

Die infektiösen Agentien, denen Kälber beim Eintritt in das Marketing-System ausgesetzt werden, schließen Viren (infektiöse Rinderrhinotracheitis (IBR), Parainfluenza Typ 3, virale Rinderdiarrhöe, respiratorische Syncytia, Adenoviren, Enteroviren, Rhinoviren, Parvoviren und" Reoviren), Bakterien (Pasteurella hemolytica, Pasteurella multocida und Hemophilus somnus), Mycoplasmen (M. dispar, M. bovirhinis, M. bovis und M. arginini) und Chlamydien ein.

Der Herpesvirus, IBR-Virus, ist eines der infektiösen Agentien, das am häufigsten in diagnostischen Veterinär medizinischen Laboratorien bei BRDC isoliert wird. Obwohl es einige handelsübliche Impfstoffe für IBR gibt, haben sie sich in der Vergangenheit nicht als vollständig befriedigend erwiesen, und zwar zum Teil weil die Immunisierung von transportgestreßten Kälbern die klinischen Anzeichen der Krankheit verschlimmern kann. Einige Kälber entwickeln auch keine

Antikörper nach der Impfung, so daß sie immer noch infiziert werden können. Weiterhin sind viele handelsübliche Impfstoffe so beschaffen, daß sie einen Schutz nicht eher als nach 14 Tagen nach der Impfung gewährleisten, wenn man dem Immunogenitätstest der US-Landwirtschaftsbehörde folgt. Wegen der Unzuträglichkeiten der in der Vergangenheit eingesetzten Impfbehandlungen und der damit verbundenen enormen wirtschaftlichen Verluste besteht ein Bedürfnis für verbesserte Verfahren zur Verhinderung und Behandlung der respiratorischen Rindererkrankung.

Es besteht weiterhin auch ein Bedürfnis für verbesserte Verfahren zur Regulierung des Appetits und der Wirksamkeit der Futterverwertung bei warmblütigen Wirbeltieren. In der gesamten bekannten Interferon-Forschung zur Feststellung ihrer Antivirus-, Antiproliferations- oder Appetitbeeinflussungswirkung sind die eingesetzten Interferondosen im allgemeinen hoch gewesen. Die Erfinder haben jetzt überraschenderweise festgestellt, daß wesentlich niedrige Dosierungen überlegene Wirkungen zeigen.

Verfahren gemäß der Erfindung verwenden niedrige Dosierungen von Interferon zum Erreichen bestimmter erwünschter biologischer Effekte bei warmblütigen Wirbeltieren. Ein Verfahren gemäß der Erfindung, durch das die Wirksamkeit der Futterausbeute in warmblütigen Wirbeltieren erreicht werden kann, ist dadurch gekennzeichnet, daß man einem warmblütigen Wirbeltier ein biologisch aktives Interferon in einer Dosierung von nicht mehr als etwa 5 internationalen Einheiten (IU)/Ib (0,454 kg) Körpergewicht pro Tag verabreicht. Die gegenwärtig bevorzugte Methode besteht in der Verabreichung von menschlichem alpha-Interferon oral bei einer Dosierung zwischen etwa 0,10 und 1,5 IU/lb Körpergewicht pro Tag. Eine

Behandlung an drei aufeinanderfolgenden Tagen ist bevorzugt, obwohl auch andere Verabreichungspläne erstellt werden können.

Durch das Verfahren der Erfindung kann auch der respiratorische Erkrankungskomplex des Rindes verhindert und behandelt werden. Durch die Verabreichung eines biologisch aktiven Interferons an Rindern in einer Dosierung von nicht mehr als etwa 5 IU/Ib Körpergewicht pro Tag können die durch Appetit und Futterausbeutung hervorgerufenen Symptome sowie auch andere BRDC-Symptome verbessert werden. Diese Verfahren gestatten die wirksame Behandlung von transportgestreßtem Vieh einschließlich Vieh, das unter infektiöser Rinderrhinotracheitis leidet.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine Wirkung bei Interferondosen, die wesentlich kleiner als die bisher angewendeten sind. Zusätzlich zu der günstigen biologischen Wirkung macht der Einsatz geringerer Dosierungen diese Verfahren selbstverständlich weniger kostenintensiv. Verfahren gemäß der Erfindung können bei Tierarten wie Rindern, Schweinen, Ziegen, Schafen, Geflügel, Katzen, Hunden und Pferden und auch bei Menschen angewandt werden.

Das verabreichte Interferon kann heterologer oder homologer Herkunft sein, ("heterologe Herkunft" bedeutet, daß das Interferon aus Zellen einer Gattung gewonnen wurde, die sich von derjenigen, an die es verabreicht wird, unterscheidet).

Die optimale Dosierung von Interferon schwankt in gewissem Umfang von Art zu Art und wahrscheinlich auch von Tier zu Tier. Effekte, die ähnlich zu denjenigen sind, wie sie mit einer gegebenen täglichen Dosierung, verabreicht für eine

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gegebene Anzahl von Tagen erreicht werden, können auch erzielt werden, indem man eine geringfügig niedrigere Dosierung für eine geringfügig größere Anzahl von Tagen oder eine geringfügig höhere Dosierung für eine geringfügig kleinere Anzahl von Tagen verabreicht. Dementsprechend kann die zu verabreichende Dosierung etwas reduziert werden, um den gleichen biologischen Effekt zu erhalten, wenn das Tier eine Infektion hat, die es zur Ausscheidung von etwas natürlichem Interferon veranlaßt.

y\j Die frühere Patentanmeldung, US-Nr. 448 951 vom 13. Dezember 1982 der Anmelder offenbart, daß der Appetit von warmblütigen Wirbeltieren durch ein Verfahren beeinflußt werden kann, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den warmblütigen Wirbeltieren eine biologisch aktive Fraktion Interferon in einer Menge verabreicht, die zur Veränderung der Futteraufnahme des Tiers oder der Wirksamkeit der Futterverwertung ausreicht. Die Anmeldung offenbart, daß man Interferon aus beliebigen Zellen verwenden kann, dies schließt auch gentechnisch hergestelltes Interferon ein. Fibroblasteninterferon, das in Zellen von Rinderrassen gefunden wird, wird als ein geeignetes Interferon angegeben; die orale Verabreichung ist eine bevorzugte Form der Behandlung. Die folgende Beschreibung zeigt, daß solche Effekte erreicht werden können, indem man niedrige Dosierungen an Interferon einsetzt.

Das Verfahren der Erfindung kann mit Interferon durchgeführt werden, das nach üblichen Methoden erhältlich ist. Eine besonders geeignete Methode zur Herstellung eines Interferons wird im folgenden beschrieben.

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Beispiel 1.

Menschliches alpha-Interferon kann mittels des folgenden Verfahrens, das im allgemeinen als Cantell-Verfahren bezeichnet wird, hergestellt werden. Das Verfahren geht aus von Gebinden menschlicher Leukocyten, die in diesem Falle von dem Gulf Coast Regional Blood Center, Houston, Texas, erhalten wurden. Die in diesen Gebinden enthaltenen Leukocytenfilme werden in Zentrifugenflaschen gesammelt und anschließend mit 0,83% Ammoniumchlorid verdünnt. Das Gemisch wird 15 Minuten mit unterbrochenem Schütteln inkubiert und wird dann 20 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Die Zellpellets werden in einem minimalen Volumen steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. Das Gemisch wird anschließend mit Ammoniumchlorid verdünnt und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird erneut verworfen. Die zurückbleibenden Zellpellets werden mit einem minimalen Volumen eines Gewebekulturmediums, z.B. einem minimalen essentiellen Medium (MEM) erhältlich von KC Biological, resuspendiert. Die Zellkonzentration wird mit einem Coulter-Zähler bestimmt.

Die Interferoninduktion erfolgt in Glas- oder Plastikflaschen. Das Induktionsmedium enthält MEM, 75mM Hepes (erhältlich von Calbiochem), 75mM Tricine (erhältlich von Sigma Chemical Co.), menschliches Agamma-Serum (18mg/ml) und Gentamycinsulfat (von M.A. Bioproducts; 50mcg/ml). Die Zellen werden in die Induktionsgefäße bis zu einer Endkonzentration von etwa 5 bis 10 Millionen Zellen pro Milliliter gegeben. Das Induktionsgefäß wird in einem Wasserbad bei 37⁰C inkubiert, und alpha-Interferon wird als Primer zugesetzt.

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Nach zwei Stunden wird das Induktionsgemisch mit Sendaivirus versetzt. Dies veranlaßt die Produktion von alpha-Interferon in der überstehenden Flüssigkeit durch die Leukocyten. Nach einer Inkubationszeit von 12 bis 18 Stunden wird das Induktionsgemisch zentrifugiert. Die Zellen werden verworfen; die überstehende Flüssigkeit wird gereinigt.

Das Rohinterferon wird auf 10⁰C oder weniger in einem Eisbad gekühlt. 5-molares Kaliumthiocyanat wird zugesetzt, bis man eine Endkonzentration von 0,5M erhält. Die Lösung wird Minuten gerührt; anschließend wird ihr pH auf 3,3 durch Zugabe von Salzsäure herabgesetzt. Das Gemisch wird anschließend bei 2800 ü/min 30 Hinuten lang zentrifugiert; die überstehende Flüssigkeit wird verworfen.

Die Pellets werden dann in 95% Ethanol resuspendiert und 15 Minuten gerührt. Diese Suspension wird 20 Minuten bei 2800 ü/min zentrifugiert. Die Pellets werden verworfen. Der pH der überstehenden Flüssigkeit wird anschließend mit Natriumhydroxid auf 5,8 eingestellt. Das Gemisch wird 10 Minuten gerührt und anschließend 20 Minuten bei 2800 U/min zentrifugiert. Die Pellets werden verworfen. Der pH der überstehenden Flüssigkeit wird anschließend mit Natriumhydroxid auf 8 eingestellt. Diese Lösung wird 10 Minuten gerührt, gefolgt von einer Zentrifugierung bei 2800 U/min für 20 Minuten. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Die Pellets werden mit 0,5M Kaliumthiocyanat in einem 0,1M Natriumphosphatpuffer resuspendiert. Diese Suspension wird bei 4⁰C gerührt.

Anschließend wird die Suspension bei 2800 U/min 20 Minuten lang zentrifugiert. Die Pellets werden verworfen. Der pH der überstehenden Flüssigkeit wird mit Salzsäure auf 5,3 eingestellt. Nach lOminütigem Rühren und Zentrifugieren

wird der pH der überstehenden Flüssigkeit mit Salzsäure auf 2,8 eingestellt, gefolgt von einem 20minütigen weiteren Rühren. Dieses Gemisch wird bei 2800 U/min zentrifugiert. Das erhaltene Pellet ist gereinigtes humanes alpha-Interferon.

Das Pellet wird mit 0,5M Kaliumthiocyanat in 0,1M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 8,0 resuspendiert. Es wird anschließend gegen PBS bei 4⁰C mit zweimaligem Austausch des PBS dialysiert. Dieses Gemisch wird anschließend zentrifugiert; der Niederschlag wird verworfen. Das erhaltene gereinigte alpha-Interferon wird durch Filtration durch ein 0,2 Mikron-Filter sterilisiert.

Ein menschliches alpha-Interferon wird gemäß diesem Verfahren von Immuno Modulators Laboratories, Inc., Stafford, Texas, hergestellt und unter dem Warenzeichen Agriferon±-C vertrieben.

Es sind andere, dem Fachmann geläufige Verfahren zur Herstellung von Interferonen vorhanden, z.B. von alpha-Interferon und menschlichem gamma-Interferon. So beschreiben z.B. die US-PS 4 376 821 und 4 460 685 Verfahren zur Herstellung von menschlichem gamma-Interferon. Ein Verfahren zur Herstellung von Fibroblasten-Rinderinterferon ist in der oben genannten Patentanmeldung der Anmelder offenbart.

Beispiel 2.

Dieser Versuch zeigt wirksame Wege für die Verabreichung und Dosierung von menschlichem alpha-Interferon als Hilfsmittel in der Verhinderung und/oder Behandlung von IBR-Virusinfektionen bei Vieh. 36 Kälber mit einem Alter von 9 bis Monaten und einem Gewicht zwischen 436 und 648 Pfund wurden

von der Texas Agricultural Experiment Station, Amarillo, Texas bezogen. Die Kälber wurden in drei Gewichtsgruppen aufgeteilt und willkürlich in Behandlungsgruppen überstellt. Die Behandlung mit menschlichem alpha-Interferon erfolgte oral (OS), intranasal (IN) oder intravenös (IV). Tabelle zeigt die Zahl von Kälbern für jeden Weg der Verabreichung und der Dosierung.

Tabelle 1

Anzahl von Kälbern, behandelt mit verschiedenen Wegen der Verabreichung und Dosierung von Interferon

Dosierung Verabrexchuhgsweg

(IU/lb) OS IN IV

1953.0 - 3

1938.0 3

953.7 - - 3

201.1 3 - -

197.7 - 3

94.9 - - 3

20.0 4

18.0 3

10.3 - - 3

0 2 2 4

Kontrollkälber erhielten MEM als Placebo. Das Interferon wurde täglich für drei aufeinanderfolgende Tage verabreicht, und zwar beginnend mit dem Zeitpunkt der Inokulation mit einem virulenten IBR-Virus (Cooper-Stamm), erhalten von dem

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National Animal Disease Laboratory, Ames, Iowa. Die Expositionsdosis dieses Virus betrug 10 ' TCID₅₀ pro KaIb. Die Kälber waren zum Zeitpunkt der Virusexposition IBR-Virus-seronegativ.

IBR-Virus-Inokulationen wurden intranasal mittels einer Spritze in einer 2 ml-Dosis pro Nüster gegeben. Körpergewicht und Rektaltemperaturen wurden periodisch aufgezeichnet. Jedem Kalb wurden Blutproben für Seruminterfon und Serumantikörperbestimmungen entnommen. Nasalabstriche wurden für die Virusisolierung entnommen. Nasaltampons wurden verwendet, um Nasalsekretproben für die Interferonbestimmung zu erhalten.

Die Ergebnisse der Tabelle werden im folgenden wiedergegeben. Tabelle 2 zeigt die Rektaltemperaturen der Kälber zu verschiedenen Zeiten nach der Inokulation. Tabelle 3 zeigt den IBR-Virustiter in den Nasalsekreten der Kälber. Tabelle 4 zeigt den Interferontiter in den Nasalsekreten der Kälber. Tabelle 5 zeigt die Serumantikörpertiter für IBR-Virus. Tabelle 6 zeigt den Futterverbrauch der Kälber (gemessen unter Verwendung von Zielgeräten der UIS Inc., Cookeville, Tennessee). Tabelle 7 zeigt Leistungsdaten für die Kälber. Tabelle 8 zeigt Mortalitäts- und Leistungsdaten.

Tabelle 2

Rektaltemperatuf (⁰F)

	Kälber	Dosierung	0	2	Tage Trach. IBR Virusinokulation	5	6	7	9	14
Zugabe	behandelt		102.8	102.4	3	104.9	105.5	105.2	103.9	102.3
IN	3	1953.0	102.1	104.1	105.7	104.9	105.6	104.4	104.4	102.8
IN	3	197.7	103.4	104.6	106.3	105.2	105.2	104.5	104.4	102.4
IN	4	20.0	102.7	102.8	105.4	106.0	106.1	105.0	104.2	102.0
OS	3	1928.0	102.4	103.7	105.6	105.3	105.8	104.5	103.3	101.6
OS ·	3	201.1	102.9	104.2	104.4	105.3	106.3	104.5	103.4	101.4
OS	3	18.0	102.6	104.0	104.5	105.7	105.0	104.2	102.8	102.0
OS-IN*	t 4	0.0	102.8	103.3	104.8	105.8	105.7	104.4	104.3	102.1
IV	3	953.7	102.8	104.4	106.0	105.3	105.4	104.8	104.1	100.8
IV	3	94.9	102.6	104.1	104.8	106.1	105.9	105.1	104.3	103.2
IV.	3 ·	• 10.3	102.3	103.9	105.2	106.2	.106.2	105.5	104.6	102.3
IV	4	0.0		105.3

*Placebos oral an 2 Kälber und intranasal an 2 Kälber.

CD O O CD OO

Tabelle 3

Geometrischer mittlerer IBR-Virus-Titer im Nasalsekret

	3	Dosierung	0	Tage	2	nach IBR Virusinokulation	5	9	14
Kälber	3	flU/lbi	0	2,996,000	3	1,090,30-0	1,142	0
Zuqabe behandelt	4	1953.0	0	244,900	2,125,300	575,300	4,191	0
IN	3	197.7	0	357,500	201,700	813,000	1,123	0
IN	3	20.0	0	1,129,200	"358,300	660,400	39,300	0
IN	3	1938.0	0	1,153,800	889,600	279,500	1,940	0
OS	4 .	201.1	0	163,900	405,900	1,406,800	2,844	0
OS	3	18.0	0	535,722	342,100	1,305,884	276	0
OS	3	0.0	0	338,800	414,925	526,100	2,303	0
OS-IN*	3 .	953.7	0	1,248,000	756,000	1,788,400	4,066	0
IV	4	• 94.9	0	560,800	607,300	853,400	26,000	0
IV	10.3	0	1,172,872	726,800	485,911	2,759	0
IV	0.0	834,018
IV

*Placebos oral an 2 Kälber und intranasal an .2 Kälber.

CD CD O CD OO

Tabelle 4

Geometrischer mittlerer Interferontiter im Nasalsekret

Kälber Dosierung Tage nach IBR Virusinokulation Zugabe behandelt (iu/lb)

IN	3
IN	3
IN	4
OS	3
OS	3
OS	3
OS-IN*	4

U/lb)	0	2	3	5	9	14
1953.0	0	605	2,378	1,241	0	0
197.7	0	236	550	1,030	26	0.
20.0	0	541	767	1,012	0	0
1938.0	0	318	2,540	627	43	0
201.1	0 .	270	1,370	3,003	0	0
18.0	0	652	466	876	0	0
0.0	0	786	1,011	481	0	0

IV	3
IV	3
IV	3
IV	4

953.7	157	1,481	959	0
94.9	695	3,842	727	0
10.3	429	1,542	548	0
0.0	251	3,559	707	24

*Placebos oral an 2 Kälber und intranasal an 2 Kälber.

Tabelle 5

Geometrischer mittlerer Antikörpertiter für IBR Virus nach Exposition

	Kälber ..	Dosierung Tage	nach	IBR Virusinkulati	.on
Zugabe	behandelt	(IU/lb)	0	14	27
IN	3	1953.0	<4	10.1	80.6
IN	3	197.7	<4	50.8	101.6
IN	4	20.0	<4	16.0	90.5
OS	3	1938.0	<4	12.7	64.0
OS	3	201.1	<4	6.3	101.6
OS	3	18.0	<4	6.3	161.3
OS-IN*	4	0.0	<4	19.0	107.6
IV	3	953.7	<4	12.7	128.0
IV	3	94.9	<4	64.0	64,0
IV	3	10.3	<4	32.0	64.0
IV	4	0.0	<4	16.0	152.2

*Placebos oral an 2 Kälber und intranasal an 2 Kälber.

Tabelle 6

Futterverbrauch (täglicher Verbrauch als'% des Körpergewichts)

Kälber

Dosierung

Prior**

0

2

Tage

nach IBR

Virusi

nokulati

on

9

11

13

Zugabe

behandelt

(IU/lb)

3.56

2.96

2.85

3

5

6

7

2.67

2.41

3.52

IN

3

1953.0

3.28

2.59

1.30

1.51

0.92

0.81

0.82

1.55

2.62

3.34

IN

3

197.7

3.49

2.92

1.75

0.45

0.89

0.74

1.29

2.38

3.23

3.78

IN

4

20.0

3.38

2.97

3.19

1.66

1.29

1.65

1.89

0.56

1.46

2.52

OS

3

1938.0

3.29

3.99

2.21

1.39

0.18

0.04

0.34

2.90

3.26

3.55

OS

3

201.1

3.13

3.31

2.71

1.60

1.55

0.88

1.90

3.17

2.81

3.58

OS

3

18.0

3.23

3.19

2.56

1.37

1.39

1.70

2.00

2.73

4.08

4.82
K.

OS-IN*

4

0.0

3.10

3.43

1.75

1.00

1.26

1.64

1.76

1.88

2.64

2.15

IV

3

953.7

2.75

2.47

1.90

0.89

0.82

0.48

0.80

1.78

2.08

2.82

IV

3

94.9

3.13

3.44

2.40

1.02

0.60

0.40

0.72

0.99

1.53

2.13

IV

3

10.3 .

3.26

3.03

1.93

0.96

0.69

0.42

0.18

1.52

1.97

2.95

IV

4

0.0

1.08

0.74

0.85

0.84

* Placebos oral an 2 Kälber und intranasal an 2 Kälber.
** Vebrauch (vor dem Versuch) als % des Körpergewichts.

CD CD CD CD CO CO

Tabelle 7

Gewxchtsver.änderung nach 14 Tagen

Zugabe	Kälber behandelt	Dosierung (IU/lb)	14 Tage- Zunahme (Ib)
IN	3	1953.0	-5.3
IN	3	197.7	-29.4
IN	4	20.0	-1.8
OS	3	1938.0	-56.0
OS	3	201.1	-15.6
OS	3	18.0	+ 5.7
OS-IN*	4	0.0	-6.0
IV	3	953.7	-36.3
IV	3	94.9	-58.7
IV	3	10.3	-35.7
IV	4	0.0	-41.3

*Placebos oral an 2 Kälber und xntranasal an 2 Kälber.

Tabelle 8
Mortalität und Gewichtsveränderung nach 27 Tagen

3600033

Zugabe	Kälber Dehandelt	Dosierung (Iü/lb)	Zahl der toten Kälber	tägliche Ge wichtszunahme (lbs) (27 Tage)
IN	3	1953.0	0	0.28
IN	3	197.7	0	0.34·
IN	4	20.0	0	0.70
OS	3	1938.0	1	0.74
OS	3	201.1	0	0.22
OS	3	18.0	0	1.74
OS-IN*	4	0.0	0	0.54
IV	3	953.7	• 1	1.19
IV	3	94.9	1	0.74
IV	3	10.3	1	1.24
IV	4	0.0	0	-0.47

*Placebos oral an 2 Kälber und intranasal an 2 Kälber.

Die Kälber zeigten einen Fieberanstieg von mehr als 104⁰F am dritten Tag nach der Inokulation und kehrten am 14. Tag zu einer normalen Temperatur zurück; dies zeigt eine erfolgreiche virale Exposition. Bei der höchsten Interferondosierung bei oraler oder intranasaler Verabreichung wurde der Fieberanstieg um einen Tag verzögert.

Gleichzeitig mit diesem Temperaturanstieg ergab sich eine Zunahme des geometrischen mittleren IBR-Virus-Titers entsprechend Tabelle 3. Wenn Interferon intranasal bei der höchsten Dosierung verabreicht wurde, trat eine signifikante Zunahme des geometrischen Mitteltiters am Tag 3 im Vergleich zu den anderen intranasalen Dosierungen auf. Wenn jedoch das Interferon oral gegeben wurde, unterschied sich die höchste Dosierung signifikant am Tag 9 im Vergleich zu den anderen oralen Dosierungen. Dies könnte auf eine Überdosierung des Interferons hinweisen, was zu einer Zunahme der Virusexkretion führt. Die Spitze der IBR-Virusexkretion trat am spätesten in der Gruppe der niedrigsten oralen Dosierungen auf. Alle drei oral behandelten Gruppen schieden mehr Viren als die Kontrolltiere am 9. Tag aus, jedoch nur die Gruppe mit der höchsten oralen Dosierung war signifikant höher als die der Kontrolltiere. Die maximale IBR-Virusexkretion trat am 5. Tag in der Gruppe der mittleren und niedrigen intranasalen Dosierung auf, jedoch am 2. Tag in der Gruppe der höchsten intranasalen Dosierung. Bei der Gruppe der höchsten oralen Dosierung wurden mehr Viren ausgeschieden. Bei sowohl der oralen als auch der intranasalen Verabreichung führte die niedrigste Dosierung zu einer geringeren IBR-Virusexkretion am 2. und am 3. Tag, diese war jedoch höher während den späteren Stadien der Infektion. Beobachtungen der Kälber mit intranasaler Dosierung zeigten, daß der größte Teil der aufgewendeten Dosierung geschluckt und einiges aus den Nasenkanälen ausgestoßen wurde, so daß die intranasale Route eine unwirksame Methode zu sein scheint.

Am 4. Tag nach der Inokulation wurden IBR-Virusantikörper in allen Kälbern entdeckt. IBR-Virusantikörper wurden nicht durch irgendeine Dosierung oder einen Verabreichungsweg des Interferons verzögert.

Kälber, die menschliches alpha-Interferon bei der höchsten oralen Dosierung erhielten, verbrauchten signifikant weniger Futter als % Körpergewicht am 5., 6. und 9. Tag im Vergleich zu den anderen Gruppen mit oraler Dosierung. Die signifikant verringerte Futteraufnahme bei der höchsten oralen Dosierung, die von keinerlei Unterschieden zwischen der niedrigsten oralen Dosierung und den Kontrolltieren begleitet wurde, zeigt, daß hohe Interferondosierungen für Zwecke der Appetitbeeinflussungen weniger erwünscht als niedrige Dosierungen sind.

Während alle anderen Gruppen Gewicht verloren, nahmen die Kälber mit der niedrigsten oralen Dosierung während des 14tägigen Zeitraums der Virusinfektion an Gewicht zu. Die Gruppe mit der höchsten oralen Dosierung zeigte einen signifikant geringeren Gewichtsverlust am 14. Tag als die Gruppe mit der niedrigsten oralen Dosierung oder als die Kontrolltiere. Obwohl vier der Kälber an bakterieller Pneumonie starben, konnte keine Pathologie beobachtet werden, die der Interferonverabreichung zuzuordnen war.

Insgesamt scheint menschliches alpha-Interferon, oral verabreicht bei der niedrigsten Dosierung (18,0 Iü/lb) die beste Verabreichungsform und Dosierung zu sein. Mehr Interferon scheint nicht besser zu sein als weniger.

Beispiel 3.

Dieser Versuch zeigt die wirksame orale Dosierung von Interferon zur Erzeugung eines antiviralen Effektes gegenüber virulentem IBR-Virus in einem Expositionsmodell. Vierzig Kälber im Alter zwischen 9 und 12 Monaten mit einem Gewicht von 430 bis 749 Pfund wurden von der Texas Agricultural Experiment Station bezogen. Die Kälber wurden in fünf Gruppen

mit gleichem Gewicht von jeweils acht Kälbern unterteilt. Jede Gruppe wurde willkürlich Behandlungen unterzogen. Den Behandlungsgruppen wurden ungefähr 0,0,01/ 0,10, 1,0 oder 10,0 Einheiten menschlichen alpha-Interferons pro Pfund Körpergewicht verabreicht. Die O-Behandlungsgruppe erhielt MEM als Placebo.

Beginnend zwei Tage vor der Exposition mit virulentem IBR-Virus erhielten die Kälber einzelne, tägliche orale Dosierungen von Interferon (oder Placebo) für einen Zeitraum von drei Tagen, wobei die abschließende Dosierung am Tag der Inokulation erfolgte. IBR-Virusinokulationen erfolgten mit einer Spritze in einer 2 ml Dosis pro Nüster (10 ' TCID₅₀ pro Kalb). Alle Kälber in dieser Untersuchung waren IBR-Virusseronegativ zum Zeitpunkt der Inokulation. Sieben Kälber wurden aus der Untersuchung genommen, weil zwei von ihnen am Tag der Inokulation IBR-Virusantikörper entwickelten und fünf keine Nahrung aus dem Futterverbrauchsmeßapparat aufnahmen .

Tabelle 9 zeigt die Anzahl der Kälber mit der jeweils gegebenen Interferondosierung; Tabelle 11 zeigt eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse. Das Futter/Zunahme-Verhältnis in Tabelle 11 gibt die verbrauchte Futtermenge in Pfund, geteilt durch die Zunahme in Pfund innerhalb der ersten elf Tage wieder.

Tabelle 9

Interferondo s ierungen

Zahl der Einheiten HuIFN-A Gruppen Kälber pro Ib Körpergewicht

A 6

B 8 0,01

C 8 0,08-0,12

D 7 0,94-1,3

E 4 8,70-13,00

Tabelle 10

Geometrischer mittlerer 'IBR-Virustiter

in Nasalsekreten (Plaquebildende Einheiten)

Kälber- Behandlung Tage nach IBR Virusinokulation

Lippen	zahl	(Iü/lb)	0	0	3	7	000	11	14
A	6	0	0	193,000	86,	,000	1.3	0
B	8	0.01	0	342,000	142	,000	3.2	0
C	8	0.08-0.12	0	22,000	218	000	7.7	0
D	7	0.94-1.30	0	26,000	29,	,000	1.5	0
E	4	8.7-13.00	95,000	146	1.2	0

3,0	4,2
105,3	106,6
23,9	52,0
2,2	0,2
2,1	1,6

31

Tabelle 11

Zusammenfassung der Ergebnisse

Behandlung (Iü/lb)

Veränderungen 0 0,01 0,08-0,12 0,94-1,30 8,7-13,00

Fieberdauer >104°F 5,0 3,9 3,9

(Tage)

Durchschn. Fieber- 106,1 105,8 105,6 spitze (⁰F)

Max. Gewichtsverlust 38,7 44,8 45,0 in der Infektion (Ib)

Durchschn. tägliche -0,4 1,4 -1,1 Zunahme in 11 Tagen (Ib)

Durchschn. tägliche 1,6 1,6 1,5 Zunahme in 31 Tagen (Ib)

GMT IBR Virus (x 1000)

Tag 3 193,0 342,0 22,0 26,0 95,0

Tag 7 86,0 142,0 218,0 29,0 146,0

Futter/Zunahme-Verhältnis für die ersten 11
Tage negativ 10,28 negativ 6,88 79,89

Kälber, die etwa 1,0 Einheiten pro Ib Körpergewicht (Gruppe D) erhielten, zeigten die kürzeste Fieberdauer und die niedrigste Fieberspitze von allen Gruppen. Die höchste Interferondosierung war signifikant nachteilig, wie sich aus höherem Fieber und geringerem Gewichtsverlust ergibt. Der Antivirusschutz der Gruppe D-Dosierung, 0,94 bis 1,30 Einheiten pro Ib, ergibt sich aus Tabelle 10. Drei Tage nach der VirusInokulation schieden die Gruppe D-Kälber signifikant weniger IBR-Viren als die Kontrolltiere aus (26.000 plaqueformende Einheiten gegenüber 193.000 PFU). Sieben Tage nach

3600033

der Virusinokulation schieden die Gruppe D-Kälber immer noch weniger Viren (29.000 PFU gegenüber 86.000 PFU) aus, obwohl der Unterschied nicht signifikant war. Alle Kälber schieden am 14. Tag nach der Inokulation keine Viren aus.

Die meisten Kälber in sämtlichen Gruppen verloren nach der IBR-Virus-Exposition Gewicht, und nahmen dann während der Dauer der Untersuchung an Gewicht zu. Die Gruppe D-Kälber hatte den niedrigsten Gewichtsverlust während der Infektion und die größte Gewichtszunahme am Ende der Untersuchung, wie sich aus Tabelle 11 ergibt. Die Interferondosierung hat eine signifikante negative Korrelation mit dem Gewichtsverlust, der nach der Interferonverabreichung und der Virusinokulation bei den Gruppen A bis D auftrat.

Dies bestätigt die Ergebnisse des Beispiels 2 und stellt weiterhin klar, daß die wirksamste Dosis von menschlichem alpha-Interferon eine äußerordentlich niedrige orale Dosis ist. Die Dosierung von etwa 1,0 IU/lb Körpergewicht führt zu einer verringerten Virusexkretion, der kürzesten Fieberdauer, dem geringsten Gewichtsverlust, der niedrigsten Fieberspitze, der größten durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahme und der besten Futterkonversion.

Beispiel 4.

Dieser Versuch zeigt die Praktikabilität und den wirtschaftlichen Nutzen der Verabreichung von menschlichem alpha-Interferon an Transportkälber mit einer gemischten viralen Infektion in einem Transportfiebermodell. Die Kälber wurden so nahe wie möglich gehalten, wie sie dies in einem tatsächlichen Marketing-System erfahren. Vierzig Kälber wurden von einem Aufkäufer in Tennessee erworben, und zwar in ähnlicher Weise wie dies bei einem Zuchtkalbbetrieb erfolgt, und wurden per

Lastwagen nach Amarillo, Texas (1.180 Meilen) innerhalb von 24 stunden ohne Futter oder Nahrung transportiert. Die Kälber waren zwischen 9 und 12 Monaten alt, wogen 405 bis 545 Pfund und waren von dem Aufkäufer auf verschiedenen Auktionsmärkten im Südosten der Vereinigten Staaten erworben worden.

Die Kälber wurden in drei Behandlungsgruppen unterteilt, mit Ohrenmarken für die Identifizierung versehen und willkürlich Behandlungsgruppen zugewiesen; zehn Kälber erhielten eine orale Dosierung von 1,0 bis 1,5 Einheiten/lb; zehn Kälber erhielten zwei orale Dosen bei der gleichen Dosierung an aufeinanderfolgenden Tagen und zwanzig Kälber dienten als unbehandelte Kontrolltiere. Die letzte Interferondosierung wurde zwei Tage vor dem Transport verabreicht.

Bei der Ankunft an der Zuchtstation in Amarillo wurden die Kälber gewogen und ihre Rektaltemperaturen gemessen. Anschließend erhielten die Kälber Futter und Wasser. Am nächsten Tag wurden sie behandelt, erneut gewogen und ihre Temperaturen bestimmt. Die Behandlung bestand aus Entwurmen, vier-Wege-Clostridiumbakterin, Entlausen mit einem externen Insekticid, einer Injektion von A- und D-Vitaminen und einer Blutentnahme für die Serologie.

Es kam zu einem natürlichen Ausbruch an Transportfieber, und drei Kälber starben an Pneumonie: ein Kontrolltier und zwei Tiere, denen eine Dosis von Interferon gegeben worden

war.

37 Tage nach der Behandlung hatten die zehn Kälber, denen zwei Interferondosierungen vor dem Transport gegeben worden waren, eine signifikant größere Gewichtszunahme als die Kontrollkälber. Die Kälber mit einer Dosierung nahmen besser zu als die Kontrolltiere, jedoch nicht so gut wie die Kälber

mit zwei Dosierungen. Die Kälber mit Interferon wandelten auch aufgenommenes Futter besser in eine Gewichtszunahme als die Kontrolltiere um. Die günstigen Ergebnisse der Behandlung sind in Tabelle 12 zusammengefaßt.

Tabelle 12

Vorteile von HuIFN-A bei transportgestreßten Zuchtkälbern.

Kälber- Zahl Tägliche Zahl der Behänd- φ Gewichts- Futter/ zahl der Dosie- tiberle- lungsge- zunähme in Zunahme-Tage rung benden wicht (Ib) 37 Tagen (Ib) verhältnis (Iü/lb)

20	0	1	0	,5	19	438	,2	48	,5	16	,6
10	1	1	,0-1	,5	8	430	,8	92		6	,0
10	2	/0-1	10	443	,8	112	,3	5	,9

Beispiel 5.

Vierzig Zuchtkälber wurden willkürlich in vier Behandlungsgruppen von jeweils zehn Kälbern unterteilt. Sämtliche Kälber waren IBR-Virus-seronegativ. Die Kälber erhielten Placebo oder Interferon (menschliches alpha) oral bei drei unterschiedlichen Dosierungen (0,05, 0,5 oder 5,0 Iü/lb Körpergewicht) . Eine Dosis von Interferon oder Placebo wurde am Tag vor, am Tag nach und am Tag der IBR-Virus-Inokulation gegeben. Jedes Kalb erhielt 10 plaquebildende Einheiten (PFU) IBR-Virus pro Nüster.

Die Tabellen 13 bis 18 zeigen die Ergebnisse dieses Tests.

Tabelle 13

Zahl der Kälber mit einer" Temperatur von
mindestens 104⁰F.

	Behandlungs gruppe	1	0	1	2-4	5	6	Taqe	nach	IBR-Vi ι	10	mc;	18	19	23	25	Total
	Vergleich	1	0	2	1	0	1	7	8	9	0	14	4	1	2	0	18
	0.05 IU/lb	0	1	1	0	2	3	1	2	0	4	3	2	0	2	0	29
	0.5 IU/lb	1	0	1	0	2	5	4	4	3	1	2	0	0	0	0	25
in ro	5.0 IU/lb		1	1	1	3	2	7	6	3	0	0	2	0	2	0	25
						6	4	1	1

36000S3

Tabelle 14

Durchschnittliche tägliche Zunahme 14 Tage nach der Inokulation

Behandlungs	Durchschnittliche tägliche Zunahm	1,35	0
gruppe	-3	1,05	1 ,29
Vergleich	0,38	2,99	0,89
0,05 10/Ib	-0,24	1,69	2,74
0,5 IU/lb	1 ,43	1,54
5,0 IU/lb	-0,08

Tabelle 15
Futterverbrauch und Zunahme für 14 Tage nach der Inokulation

Behandlungs	φ tägliche	φ täglicher	Futter/
gruppe	Zunahme	Verbrauch	Zunahme
Vergleich	1,29	16,1	12,5
0,05 IU/lb	0,89	15,3	17,2
0,5 IU/lb	2,74	14,7	5,4
5,0 IU/lb	1,54	15,0	9,6

Tabelle 16

Futterverbrauch und Zunahme für 27 Tage nach der Inokulation

geschätzter φ

Behandlungs- φ tägliche täglicher Ver- Futter/

gruppe Zunahme (Ib) Zunahme brauch (lb/Tag) Zunahme

Vergleich	500	1,85	16,4	8,9
0,05 IU/Ib	534	1,98	15,2	7,7
0,5 IU/lb	634	2,35	14,9	6,4
5,0 IU/lb	586	2,10	14,9	7,1

Tabelle 17

Geometrische mittlere Serumantikorpertiter gegen IBR-Virus

Behandlungs	0	Tage nach Virus	25
gruppe	0	14	29,8
Vergleich	0	1,9	27,9
0,05 IU/lb	0	3,7	24,3
0,5 IU/lb	0	8,8	21,1
5,0 IU/lb	4,6

O	2	3	204	6.310	12.078
O	21	20	,396	174.582	298
O	221	4	.749	20.184	7
O	71	.130	43.451	132

Tabelle 18

Geometrischer mittlerer IBR-Virustiter (plaquebildende Einheiten) im Nasalsekret

Behandlungs- Tage nach der Inokulation

gruppe 0 3 7 10 14

Vergleich 0,05 IU/lb 0,5 IU/lb 5,0 IU/lb

Die Rektaltemperaturen der Rinder unterschieden sich nicht signifikant unter den vier Behandlungsgruppen nach einer Inokulation mit dem IRB-Virus. Wie Tabelle 13 zeigt, hätten jedoch mehr Kälber mit der Dosierung von 0,5 IU/lb Fieber mit mindestens 104⁰F in den fünf bis neun Tagen nach der Inokulationsperiode.

Die Tabellen 14 und 15 zeigen, daß die Kälber mit 0,5 IU/lb-Dosierungen innerhalb der ersten 14 Tage erheblich mehr an Gewicht zunahmen als die Kontrolltiere und eine verbesserte Futterkonversion aufwiesen. Die Ergebnisse für Gewichtszunahme und Futter/Gewichtszunahme-Verhältnis bei 27 Tagen begünstigen alle drei der behandelten Gruppen gegenüber den Vergleichstieren, jedoch nicht in signifikanter Weise, wie sich aus Tabelle 16 ergibt.

IBR-Virus-Antikörper wurden von allen Gruppen gebildet. Tabelle 17 zeigt, daß die Bildung signifikant schneller in der mit 0,5 IU/lb behandelten Gruppe auftrat. Die Nasalexkretion des IBR-Virus trat auch bei der 0,5 lU/lb-Behand-

lungsgruppe schneller auf, wie sich aus Tabelle 18 ergibt. Von der 0,5 IU/lb-Gruppe wurden signifikant mehr Viren ausgeschieden, und zwar bei drei Tagen im Vergleich zu den Kontrolltieren (221 PFU gegenüber 2 PFU) und auch nach sieben Tagen (20.749 PFU gegenüber 204 PFU) nach der Virusinokulation. Nach 14 Tagen schieden die Kontrolltiere jedoch mehr Viren als irgendeine andere, mit Interferon behandelte Gruppe aus (12.078 PFU gegenüber 298 oder 7 oder 132 PFU). Diese Daten zeigen, daß die anfängliche Virusinfektion bei Interferon-behandelten Kälbern intensiviert und verkürzt worden ist, was zu einer rascheren Erholung und besseren Leistungen führt.

Zusammenfassend gesagt, stimuliert menschliches alpha-Interferon bei oraler Verabreichung in einer Menge von 0,5 IU/lb Körpergewicht signifikant die Entwicklung von Antikörpern, verbessert die Gewichtszunahme bei 14 Tagen nach der IBR-Virusinokulation und vergrößert die IBR-Virusexkretion bei 3 und 7 Tagen, verringert jedoch die Virusexkretion bei 14 Tagen nach der Inokulation. Diese Dosierung verbessert die Wirksamkeit der Futterausnutzung während der ersten 14 Tage.

Claims

The Texas A&M University System

Verwendung von Interferon zur Verbesserung der Wirksamkeit der Futterverwertung und zur Beeinflussung des Appetits von Tieren

Patentansprüche

1 . Verwendung eines biologisch wirksamen Interferons in einer Menge von nicht mehr als etwa 5 IU/lb (0,454 kg) Körpergewicht pro Tag zur Verbesserung der Wirksamkeit der Futterverwertung bei warmblütigen Wirbeltieren.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ₌( das Interferon oral verwendet. "*
3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Interferon humanes α-Interferon verwendet.
4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Dosierung von etwa zwischen 0,10 und 1,5 IU/lb Körpergewicht pro Tag verwendet.
5. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

man das Interferon an 3 aufeinanderfolgenden Tagen verwendet.
6. Verwendung eines biologisch aktiven Interferons in einer Menge von nicht mehr als etwa 5 IU/lb Körpergewicht pro Tag

. .2

zur Verhinderung und Behandlung des respiratorischen Erkrankungskomplexes bei Rindern.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Interferon oral verwendet.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Interferon humanes α-Interferon verwendet.
9. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Interferon in einer Dosierung von etwa zwischen 0,10 und 1,5 IU/Ib Körpergewicht pro Tag verwendet.
10. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Interferon an 3 aufeinanderfolgenden Tagen verwendet.
11. Verwendung eines biologisch aktiven Interferons in einer Dosierung von nicht mehr als etwa 5 IU/Ib Körpergewicht
pro Tag zur Behandlung eines transportgestreßten. Rindes.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das Interferon oral verwendet.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Interferon humanes α-Interferon verwendet.
14. Verwendung nach Anspruch 12_t dadurch gekennzeichnet, daß man das Interferon in einer Dosierung von etwa zwischen 0,10 und 1,5 IU/Ib Körpergewicht pro Tag verwendet.
15. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das Interferon an 3 aufeinanderfolgenden Tagen verwendet.
16. Verwendung von menschlichem Interferon in einer Dosierung zwischen etwa 0,10 und 1,5 IU/lb Körpergewicht pro Tag an 3 aufeinanderfolgenden Tagen zur Verhinderung und Behandlung der infektiösen Rinderrhinotracheitis.