DE3600083C2 - Verwendung von alpha-Interferon zur Behandlung des respiratorischen Erkrankungskomplexes bei Rindern - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft allgemein Verwendung von Interferon in niedrigen Dosierungen zur Verhinderung und Behandlung des respiratorischen Erkrankungskomplexes bei Rindern.

"Interferon" ist ein allgemeiner Begriff, der eine Gruppe von Glycoproteinen und Proteinen von Wirbeltieren umfaßt, die bekanntlich verschiedene biologische Wirkungen zeigen, z. B. Antivirus-, Antiproliferations- und Immunmodulations­ wirkungen bei Tierarten, aus denen diese Substanzen gewonnen werden können. Die folgende Definition von Interferon ist von einem internationalen Komitee für die Erstellung eines Systems für eine ordnungsgemäße Nomenklatur der Interferone akzeptiert worden: "Um als Interferon angesehen zu werden, muß ein Faktor ein Protein sein, das virusunspezifische, antivirale Wirkungen mindestens in homologen Zellen durch zelluläre metabolische Prozesse unter Einbeziehung sowohl der RNA- als auch der Proteinsynthese aufweist."; vgl. Journal of Interferon Research, 1, S. VI (1980).

Seit den ersten Berichten über Interferon von Isaacs und Lindeman (See, Proc. Roy. Soc. London (Ser. B), Bd. 147, S. 258 ff (1957) und US-PS 3 699 222) ist Interferon auf der ganzen Welt das Ziel von intensiven Forschungsarbeiten ge­ wesen. Es gibt eine Unzahl von Veröffentlichungen über die Synthese von Interferon; M. Wilkinson und A. G. Morris, Interferon and the Immune System 1: Induction of Interferon by Stimulation of the Immune System, Interferons: From Molecular Biology to Clinical Application, Hrsg. D. C. Burke und A. G. Morris, Cambridge Univ. Press, 1983, S. 149-179; P. I. Marcus, Kap. 10, Interferon Induction by Virus, Inter­ ferons and Their Applications, Hrsg. P. E. Came und W. A. Carter, Springer Verlag, (Handbook of Experimental Pharma­ cology V. 71) 1984, 5. 205-232;
vorgeschlagene molekulare Eigenschaften; P. B. Sehgal, How Many Human Interferons Are There? Interferon 1982, Hrsg. I. Gresser, Academic Press, 1982, S. 1-22; J. Collins, Structure and Expression of the Human Interferon Genes, Interferons: From Molecular Biology to Clinical Application, Hrsg. D. C. Burke und A. G. Morris, Cambridge Univ. Press, 1983, S. 35-65; K. C. Zoon und R. Wetzel, Kap. 5, Comparative Structures of Mammalian Inter­ ferons, 1a: Interferons and Their Applications, Hrsg. P. E. Came und W. A. Carter, Springer Verlag, (Handbook of Expe­ rimental Pharmacology V. 71) 1984, S. 79-100;
klinische Anwendungen; M. Krim, Kap. 1, Interferons and Their Appli­ cations: Past, Present, and Future, Interferons and Their Applications, Hrsg. P. E. Came und W. A. Carter, Springer Verlag, (Handbook of Experimental Pharmacology V. 71) 1984; S. B. Greenberg und M. W. Harmon, Kap. 21, Clinical Use of Interferons: Localized Applications in Viral Diseases, Ibid. S. 433-453;
vorgeschlagener Mechanismus der Antitumor-, Antivirus- und Immunsystemwirkung; G. M. Scott, The Antiviral Effects of Interferon, From Molecular Biology to Clinical Application, Hrsg. D. C. Burke und A. G. Morris, Cambridge Univ. Press, 1983, S. 279-311; M. McMahon und I. M. Kerr, The Biochemistry of the Antiviral State, Ibid. S. 89-108; J. S. Malpas, The Antitumor Effects of Interferon, Ibid. S. 313-327; J. Taylor-Papadimitrion, The Effects of inter­ feron on the Growth and Function of Normal and Malignant Cells, Ibid. S. 109-147.

Wegen der Intensität und der unterschiedlichen Herkunft der Forschungsarbeiten über Interferon und seine Eigenschaften sowie Verwendungen besteht ein erheblicher Mangel an Ein­ heitlichkeit bei solchen Gesichtspunkten wie Klassifikation der Interferontypen. Es gibt auch zahlreiche, gelegentlich widersprüchliche Theorien über die Wirkungsweise des Inter­ ferons bei der Hervorrufung klinischer Effekte. Die folgende kurze Zusammenfassung des gegenwärtigen Wissensstandes über Interferon wird beim Verständnis der vorliegenden Erfindung helfen.

Obwohl ursprünglich aus Geflügelzellen isoliert (allantoische Zellen von Hühnern) ist die Interferonbildung in Zellen sämt­ licher Klassen von Wirbeltieren einschließlich Säugetieren, Amphibien und Reptilien beobachtet worden. Die Interferon­ bildung durch Wirbeltierzellen erfolgt selten spontan, sondern wird häufig in leichter Weise bei der Behandlung von Zellen (in vivo oder in vitro) mit einer Vielzahl von Substanzen "induziert", welche Viren, Nucleinsäuren (einschließlich solcher aus Viren als auch synthetischer Polynucleotide), Lipopolysaccharide und verschiedene Antigene und Mitogene einschließen.

Interferone sind im allgemeinen nach den Arten der die Sub­ stanz produzierenden Zellen bezeichnet worden (z. B. Mensch, Maus oder Rind), weiterhin nach der betreffenden Zellart (z. B. Leukocyten, Lymphoblastoide, Fibroblaste) und gelegentlich nach der Type des für die Interferonproduktion verantwort­ lichen induzierenden Materials (z. B. Virus, Immun). Interferon ist von einigen Wissenschaftlern oberflächlich nach der Induktionsart als Typ I oder Typ II klassifiziert worden, wobei die erste Klasse virus- und nucleinsäureinduziertes Interferon und die zweite Klasse das als Lymphokin gebildete Material durch Induktion durch Antigene und Mitogene ein­ schließt. Neuerdings klassifiziert das internationale Komitee, das sich mit dem ordnungsgemäßen Nomenklatursystem für Inter­ feron befaßt, Interferon nach Typen auf der Grundlage der Antigenspezifität. In dieser neueren Klassifizierung werden die Bezeichnungen alpha (α), beta (β) und gamma (γ) verwendet, die den früheren Bezeichnungen von Leukocyten-, Fibroblasten- und Typ II (Immun)-Interferonen entsprechen. Alpha- und beta- Interferone sind gewöhnlich säurestabil und entsprechen den­ jenigen, die früher als Typ I-Interferone bezeichnet wurden. Gamma-Interferone sind gewöhnlich säurelabil und entsprechen denjenigen, die früher Typ II-Interferone genannt wurden. Die Nomenklaturempfehlungen des internationalen Komitees betreffen lediglich menschliche und Mäuseinterferone. Journal of Inter­ feron Research, 1, S. VI (1980).

Die Bestimmung der präzisen Molekülstruktur des Interferons war einige Zeit mit den Mitteln des Standes der Technik nicht möglich. In den Jahren, nachdem Interferon zuerst als protein­ artig charakterisiert wurde, und zwar auf der Grundlage seiner Desaktivierung durch Trypsin, waren Versuche zu seiner Rei­ nigung und eindeutigen Charakterisierung unmöglich wegen seiner hohen spezifischen Aktivität und seiner augenscheinlichen Heterogenität. Heute ist für Interferon einige Präzision bei der Bestimmung der Molekülstruktur erreicht worden, vgl. P. B. Sehgal, a.a.O.; J. Collins, a.a.O.; K. C. Zoon und R. Wetzel, a.a.O.

In seinen frühesten Anwendungen wurde Interferon ausschließlich als Antivirusmittel angewendet. Die erfolgreichste klinisch­ therapeutische Anwendung bis heute fand bei der Behandlung von Viruserkrankungen statt. Es zeigte sich jedoch, daß exogenes Interferon bei verschiedenen Metastasenerkrankungen manchmal eine Regression oder Remission hervorrufen kann. Eine Über­ sicht über gegenwärtige klinische Versuche mit Interferon als therapeutisches Antivirusmittel und Antiproliferations­ mittel bis zum Anfang des Jahres 1983 ist in The Biology of the Interferon System 1983, Proceedings of the Second International TNO Meeting on the Biology of the Interferon System, Rotterdam, The Netherlands, 18.-22. April 1983, und Antiviral Research, March 1983, Special Abstract Issue, Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Netherlands, ent­ halten.

Das klinische Mittel der Wahl für diese Arbeit ist mensch­ liches Leukocyteninterferon gewesen, im "Großmaßstab" her­ gestellt durch Verfahren, die die Sammlung und Reinigung von großen Mengen von Leukocyten aus menschlichem zentrifugiertem Blut, die Induktion mit Viren und die Isolation aus Kultur­ medien einschließen. Der Bedarf an Interferon menschlichen Ursprungs liegt in dem seit langem bestehenden Schluß be­ gründet, daß Interferon "artenspezifisch", d. h. biologisch wirksam in vivo nur in solchen Arten ist, die homolog zu den Produktionszellen sind.

In den oben beschriebenen Arbeiten wurde Interferon paren­ teral verabreicht, d. h. intramuskulär und intradermal, wobei über einige erfolgreiche topische und intranasale Anwendungen berichtet worden ist. Es ist selten intravenös verabreicht worden, und zwar wegen erheblicher nachteiliger Effekte, die "Verunreinigungen" in rohen und selbst in hochgereinigten Isolaten zugeschrieben werden. Die Erfindung der Anmelder gemäß US-PS 4 462 985 und gemäß PCT-Anmeldung PCT/US 81/01103, eingereicht am 18. August 1981 und veröffentlicht am 4. März 1982 - auf deren Inhalt hier Bezug genommen wird - betrifft die Verwendung von Interferon aus heterologen Arten und weiterhin auch orale Verabreichung.

Vor diesen Veröffentlichungen hat es keine Berichte über therapeutisch erfolgreiche orale Verabreichungen von Inter­ feron gegeben. Dies steht im Einklang mit der weitverbreiteten Auffassung, daß Interferon in der Umgebung des Verdauungs­ traktes von Tieren nicht stabil ist.

Zusätzlich zu der Verwendung in der Antivirus- und Antitumor­ therapie wurde kürzlich gefunden, daß Interferon auch immuno­ modulatorische Wirkungen zeigt, und zwar sowohl immunopoten­ zierende als auch immunosupressive Wirkungen. B. Lebleu und J. Content, Mechanisms of Interferon Action: Biochemical and Genetic Approaches, Interferon 1982, Hrsg. I. Gresser, Academic Press, 1982, S. 47-94; M. Moore, Interferon and the Immune System, 2: Effect of IFN on the Immune System, Interferons: From Molecular Biology to Clinical Application, Hrsg. D. C. Burke und A. G. Morris, Cambridge Univ. Press, 1983, S. 181-209; H. Smith-Johannsen, Y-T Hou, X-T Liu, und Y-H Tan, Kap. 6, Regulatory Control of Interferon Synthesis and Action, Interferons and Their Applications, Hrsg. P. E. Came und W. A. Carter, Springer Verlag, (Handbook of Expe­ rimental Pharmacology V. 71) 1984, S. 101-135; J. L. Raylor, J. L Sabram, und S. E. Grossberg, Kap. 9, The Cellular Effects of Interferon, Ibid. S. 169-204; J. M. Zarling, Effects of Interferon and Its Inducers on Leukocytes and Their Immuno­ logic Functions, Ibid. S. 403-431; R. Ravel, The Interferon System in Man: Nature of the Interferon Molecules and Mode of Action, Antiviral Drugs and Interferon: The Molecular Basics of Their Activity, Hrsg. Y. Becker, Martinus Nÿhoff Pub., 1984 S. 357-433.

Weiterhin werden ständig "neue" biologische Wirkungen für exogenes und endogenes Interferon festgestellt. K. Berg, M. Hokland, und I. Heron, Biological Activities of Pure HuIFN-Alpha Species, Interferon, Properties, Mode of Action, Production, Clinical Application, Hrsg. K. Munk und H. Kirchner, (Beiträge zur Onkologie V. 11) S. 118-126; S. Pestka et al., The Specific Molecular Activities of Inter­ ferons Differ for Antiviral, Antiproliferative and Natural Killer Cell Activities, The Biology of the Interferon System, 1983, Hrsg. E. DeMaeyer und H. Schellekens, S. 535-549; P. K. Weck und P. E. Cane, Kap. 16, Comparative Biologic Activities of Human Interferons, Interferons and Their Applications, Hrsg. P. E. Came und W. A. Carter, Springer Verlag, (Handbook of Experimental Pharmacology V. 71) 1984, S. 339-355.

Eine Viruserkrankung, die bisher noch nicht mit Interferon oder anderen Mitteln behandelt werden konnte, ist der respiratorische Erkrankungskomplex bei Rindern (BRDC). BRDC ist ein umfassender Begriff, der eine akute, an­ steckende Infektion bei Rindern bezeichnet, die durch eine Entzündung der oberen Luftwege und der Trachea gekennzeich­ net ist. BRDC führt zu einer Pneumonie mit klinischen An­ zeichen von Dyspnöe, Anorexie, Fieber, Depression, muco­ purulentem nasalem und okularem Ausfluß; dies führt zu einer hohen Morbidität und Mortalität. BRDC ist ein wich­ tiger Faktor bei dem Verlust an Rindern durch Erkrankungen. Der wirtschaftliche Schaden der Züchter bei der Behandlung, dem Gewichtsverlust, dem Verlust durch Tod und durch Aus­ merzen wird auf etwa 333.000.000 US-$ pro Jahr geschätzt (National Cattlemen′s Association, 1980).

Wenn BRDC bei Vieh nach dem Transport auf Fütterstationen oder Weiden festgestellt wird, bezeichnet man es häufig als "Transportfieber". Auf dem Weg zu den Fütterungsstellen erfahren die Kälber den Streß von intensiven Handhabungs­ techniken, von Transport ohne Futter oder Wasser und einer Vielzahl von infektiösen Agentien. Nach der Ankunft an der Fütterstation erfahren die Kälber weiteren Streß durch Entwöhnen, Kastration, Enthornen, Markieren mit Brandzeichen, Ohrenkennzeichnen, Entwurmen, Impfen und Entlausen. In vielen Situationen werden die Kälber zusätzlich noch durch Umstellungen in der Ernährung und Umwelteinflüsse gestreßt.

Die infektiösen Agentien, denen Kälber beim Eintritt in das Marketing-System ausgesetzt werden, schließen Viren (infek­ tiöse Rinderrhinotracheitis (IBR), Parainfluenza Typ 3, virale Rinderdiarrhöe, respiratorische Syncytia, Adenoviren, Enteroviren, Rhinoviren, Parvoviren und Reoviren), Bakterien (Pasteurella hemolytica, Pasteurella multocida und Hemophilus somnus), Mycoplasmen (M. dispar, M. bovirhinis, M. bovis und M. arginini) und Chlamydien ein.

Der Herpesvirus, IBR-Virus, ist eines der infektiösen Agen­ tien, das am häufigsten in diagnostischen veterinär medi­ zinischen Laboratorien bei BRDC isoliert wird. Obwohl es einige handelsübliche Impfstoffe für IBR gibt, haben sie sich in der Vergangenheit nicht als vollständig befriedigend er­ wiesen, und zwar zum Teil weil die Immunisierung von trans­ portgestreßten Kälbern die klinischen Anzeichen der Krankheit verschlimmern kann. Einige Kälber entwickeln auch keine Antikörper nach der Impfung, so daß sie immer noch infiziert werden können. Weiterhin sind viele handelsübliche Impfstoffe so beschaffen, daß sie einen Schutz nicht eher als nach 14 Tagen nach der Impfung gewährleisten, wenn man dem Immunogenitätstest der uS-Landwirtschaftsbehörde folgt. Wegen der Unzuträglichkeiten der in der Vergangenheit ein­ gesetzten Impfbehandlungen und der damit verbundenen enormen wirtschaftlichen Verluste besteht ein Bedürfnis für ver­ besserte Verfahren zur Verhinderung und Behandlung der respiratorischen Rindererkrankung.

In der gesamten bekannten Interferon-Forschung zur Feststellung ihrer Antivirus-, Antiproliferations- oder Appetitbeein­ flussungswirkung sind die eingesetzten Interferondosen im allgemeinen hoch gewesen. Die Erfinder haben jetzt über­ raschenderweise festgestellt, daß wesentlich niedrige Dosierungen überlegene Wirkungen zeigen.

Durch die Erfindung kann der respirato­ rische Erkrankungskomplex des Rindes verhindert und behan­ delt werden. Durch die Verabreichung eines biologisch aktiven Interferons an Rindern in einer Dosierung von nicht mehr als 11 IU/kg Körpergewicht pro Tag können die durch Appetit und Futterausbeutung hervorgerufenen Symptome sowie auch andere BRDC-Symptome verbessert werden. Diese Verfahren gestatten die wirksame Behandlung von transportgestreßtem Vieh einschließlich Vieh, das unter infektiöser Rinderrhino­ tracheitis leidet.

Die gegenwärtig bevorzugte Methode besteht in der Verabreichung von menschlichem alpha-Interferon oral bei einer Dosierung zwischen 0,22 und 3,3 IU/kg Körpergewicht pro Tag. Eine Behandlung an drei aufeinanderfolgenden Tagen ist bevorzugt, obwohl auch andere Verabreichungspläne erstellt werden können.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine Wirkung bei Inter­ ferondosen, die wesentlich kleiner als die bisher angewendeten sind. Zusätzlich zu der günstigen biologischen Wirkung macht der Einsatz geringerer Dosierungen diese Verfahren selbst­ verständlich weniger kostenintensiv.

Das verabreichte Interferon kann heterologer oder homologer Herkunft sein. ("heterologe Herkunft" bedeutet, daß das Interferon aus Zellen einer Gattung gewonnen wurde, die sich von derjenigen, an die es verabreicht wird, unterscheidet).

Die optimale Dosierung von Interferon schwankt in gewissem Umfang von Art zu Art und wahrscheinlich auch von Tier zu Tier. Effekte, die ähnlich zu denjenigen sind, wie sie mit einer gegebenen täglichen Dosierung, verabreicht für eine gegebene Anzahl von Tagen erreicht werden, können auch er­ zielt werden, indem man eine geringfügig niedrigere Dosierung für eine geringfügig größere Anzahl von Tagen oder eine geringfügig höhere Dosierung für eine geringfügig kleinere Anzahl von Tagen verabreicht. Dementsprechend kann die zu verabreichende Dosierung etwas reduziert werden, um den gleichen biologischen Effekt zu erhalten, wenn das Tier eine Infektion hat, die es zur Ausscheidung von etwas natürlichem Interferon veranlaßt.

Die erfindungsgemäße Verwendung kann mit Interferon durchgeführt werden, das nach üblichen Methoden erhältlich ist. Eine besonders geeignete Methode zur Herstellung eines Interferons wird im folgenden beschrieben.

Beispiel 1

Menschliches alpha-Interferon kann mittels des folgenden Verfahrens, das im allgemeinen als Cantell-Verfahren be­ zeichnet wird, hergestellt werden. Das Verfahren geht aus von Gebinden menschlicher Leukocyten, die in diesem Falle von dem Gulf Coast Regional Blood Center, Houston, Texas, erhalten wurden. Die in diesen Gebinden enthaltenen Leuko­ cytenfilme werden in Zentrifugenflaschen gesammelt und anschließend mit 0,83% Ammoniumchlorid verdünnt. Das Gemisch wird 15 Minuten mit unterbrochenem Schütteln inkubiert und wird dann 20 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Die Zellpellets werden in einem minimalen Volumen steriler, phosphatge­ pufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. Das Gemisch wird anschließend mit Ammoniumchlorid verdünnt und zentri­ fugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird erneut verworfen. Die zurückbleibenden Zellpellets werden mit einem minimalen Volumen eines Gewebekulturmediums, z. B. einem minimalen essentiellen Medium (MEM) erhältlich von KC Biological, resuspendiert. Die Zellkonzentration wird mit einem Coulter- Zähler bestimmt.

Die Interferoninduktion erfolgt in Glas- oder Plastikflaschen. Das Induktionsmedium enthält MEM, 75 mM Hepes (erhältlich von Calbiochem), 75 mM Tricine (erhältlich von Sigma Chemical Co.), menschliches Agamma-Serum (18 mg/ml) und Gentamycinsulfat (von M.A. Bioproducts; 50 mcg/ml). Die Zellen werden in die Induktionsgefäße bis zu einer Endkonzentration von etwa 5 bis 10 Millionen Zellen pro Milliliter gegeben. Das In­ duktionsgefäß wird in einem Wasserbad bei 37°C inkubiert, und alpha-Interferon wird als Primer zugesetzt.

Nach zwei Stunden wird das Induktionsgemisch mit Sendaivirus versetzt. Dies veranlaßt die Produktion von alpha-Interferon in der überstehenden Flüssigkeit durch die Leukocyten. Nach einer Inkubationszeit von 12 bis 18 Stunden wird das Induk­ tionsgemisch zentrifugiert. Die Zellen werden verworfen; die überstehende Flüssigkeit wird gereinigt.

Das Rohinterferon wird auf 10°C oder weniger in einem Eisbad gekühlt. 5-molares Kaliumthiocyanat wird zugesetzt, bis man eine Endkonzentration von 0,5 M erhält. Die Lösung wird 15 Minuten gerührt; anschließend wird ihr pH auf 3,3 durch Zugabe von Salzsäure herabgesetzt. Das Gemisch wird an­ schließend bei 2800 U/min 30 Minuten lang zentrifugiert; die überstehende Flüssigkeit wird verworfen.

Die Pellets werden dann in 95% Ethanol resuspendiert und 15 Minuten gerührt. Diese Suspension wird 20 Minuten bei 2800 U/min zentrifugiert. Die Pellets werden verworfen. Der pH der überstehenden Flüssigkeit wird anschließend mit Natriumhydroxid auf 5,8 eingestellt. Das Gemisch wird 10 Minuten gerührt und anschließend 20 Minuten bei 2800 U/min zentrifugiert. Die Pellets werden verworfen. Der pH der überstehenden Flüssigkeit wird anschließend mit Natrium­ hydroxid auf 8 eingestellt. Diese Lösung wird 10 Minuten gerührt, gefolgt von einer Zentrifugierung bei 2800 U/min für 20 Minuten. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Die Pellets werden mit 0,5 M Kaliumthiocyanat in einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer resuspendiert. Diese Suspension wird bei 4°C gerührt.

Anschließend wird die Suspension bei 2800 U/min 20 Minuten lang zentrifugiert. Die Pellets werden verworfen. Der pH der überstehenden Flüssigkeit wird mit Salzsäure auf 5,3 eingestellt. Nach 10minütigem Rühren und Zentrifugieren wird der pH der überstehenden Flüssigkeit mit Salzsäure auf 2,8 eingestellt, gefolgt von einem 20minütigen weiteren Rühren. Dieses Gemisch wird bei 2800 U/min zentrifugiert. Das erhaltene Pellet ist gereinigtes humanes alpha-Interferon.

Das Pellet wird mit 0,5 M Kaliumthiocyanat in 0,1 M Natrium­ phosphatpuffer mit einem pH von 8,0 resuspendiert. Es wird anschließend gegen PBS bei 4°C mit zweimaligem Austausch des PBS dialysiert. Dieses Gemisch wird anschließend zen­ trifugiert; der Niederschlag wird verworfen. Das erhaltene gereinigte alpha-Interferon wird durch Filtration durch ein 0,2 Mikron-Filter sterilisiert.

Ein menschliches alpha-Interferon wird gemäß diesem Verfahren von Immuno Modulators Laboratories, Inc., Stafford, Texas, hergestellt und unter dem Warenzeichen Agriferon±C ver­ trieben.

Es sind andere, dem Fachmann geläufige Verfahren zur Her­ stellung von Interferonen vorhanden, z. B. von alpha-Inter­ feron und menschlichem gamma-Interferon. So beschreiben z. B. die US-PS 4 376 821 und 4 460 685 Verfahren zur Herstellung von menschlichem gamma-Interferon. Ein Verfahren zur Her­ stellung von Fibroblasten-Rinderinterferon ist in der oben genannten Patentanmeldung der Anmelder offenbart.

Beispiel 2

Dieser Versuch zeigt wirksame Wege für die Verabreichung und Dosierung von menschlichem alpha-Interferon als Hilfs­ mittel in der Verhinderung und/oder Behandlung von IBR-Virus­ infektionen bei Vieh. 36 Kälber mit einem Alter von 9 bis 12 Monaten und einem Gewicht zwischen 197,9 und 294,2 kg wurden von der Texas Agricultural Experiment Station, Amarillo, Texas bezogen. Die Kälber wurden in drei Gewichtsgruppen aufgeteilt und willkürlich in Behandlungsgruppen überstellt. Die Behandlung mit menschlichem alpha-Interferon erfolgte oral (OS), intranasal (IN) oder intravenös (IV). Tabelle 1 zeigt die Zahl von Kälbern für jeden Weg der Verabreichung und der Dosierung.

Tabelle 1

Anzahl von Kälbern, behandelt mit verschiedenen Wegen der Verabreichung und Dosierung von Interferon

Kontrollkälber erhielten MEM als Placebo. Das Interferon wurde täglich für drei aufeinanderfolgende Tage verabreicht, und zwar beginnend mit dem Zeitpunkt der Inokulation mit einem virulenten IBR-Virus (Cooper-Stamm), erhalten von dem National Animal Disease Laboratory, Ames, Iowa. Die Expo­ sitionsdosis dieses Virus betrug 10^6,6 TCID₅₀ pro Kalb. Die Kälber waren zum Zeitpunkt der Virusexposition IBR- Virus-seronegativ.

IBR-Virus-Inokulationen wurden intranasal mittels einer Spritze in einer 2 ml-Dosis pro Nüster gegeben. Körperge­ wicht und Rektaltemperaturen wurden periodisch aufgezeichnet. Jedem Kalb wurden Blutproben für Seruminterfon und Serumanti­ körperbestimmungen entnommen. Nasalabstriche wurden für die Virusisolierung entnommen. Nasaltampons wurden verwendet, um Nasalsekretproben für die Interferonbestimmung zu er­ halten.

Die Ergebnisse der Tabelle werden im folgenden wiedergegeben. Tabelle 2 zeigt die Rektaltemperaturen der Kälber zu ver­ schiedenen Zeiten nach der Inokulation. Tabelle 3 zeigt den IBR-Virustiter in den Nasalsekreten der Kälber. Tabelle 4 zeigt den Interferontiter in den Nasalsekreten der Kälber. Tabelle 5 zeigt die Serumantikörpertiter für IBR-Virus. Tabelle 6 zeigt den Futterverbrauch der Kälber (gemessen unter Verwendung von Zielgeräten der UIS Inc., Cookeville, Tennessee). Tabelle 7 zeigt Leistungsdaten für die Kälber. Tabelle 8 zeigt Mortalitäts- und Leistungsdaten.

Tabelle 4

Geometrischer mittlerer Interferontiter im Nasalsekret

Tabelle 5

Geometrischer mittlerer Antikörpertiter für IBR Virus nach Exposition

Tabelle 7

Gewichtsveränderung nach 14 Tagen

Tabelle 8

Mortalität und Gewichtsveränderung nach 27 Tagen

Die Kälber zeigten einen Fieberanstieg von mehr als 40°C am dritten Tag nach der Inokulation und kehrten am 14. Tag zu einer normalen Temperatur zurück; dies zeigt eine erfolgreiche virale Exposition. Bei der höch­ sten Interferondosierung bei oraler oder intranasaler Verabreichung wurde der Fieberanstieg um einen Tag ver­ zögert.

Gleichzeitig mit diesem Temperaturanstieg ergab sich eine Zunahme des geometrischen mittleren IBR-Virus-Titers ent­ sprechend Tabelle 3. Wenn Interferon intranasal bei der höchsten Dosierung verabreicht wurde, trat eine signifi­ kante Zunahme des geometrischen Mitteltiters am Tag 3 im Vergleich zu den anderen intranasalen Dosierungen auf. Wenn jedoch das Interferon oral gegeben wurde, unterschied sich die höchste Dosierung signifikant am Tag 9 im Vergleich zu den anderen oralen Dosierungen. Dies könnte auf eine Über­ dosierung des Interferons hinweisen, was zu einer Zunahme der Virusexkretion führt. Die Spitze der IBR-Virusexkretion trat am spätesten in der Gruppe der niedrigsten oralen Dosierungen auf. Alle drei oral behandelten Gruppen schieden mehr Viren als die Kontrolltiere am 9. Tag aus, jedoch nur die Gruppe mit der höchsten oralen Dosierung war signifikant höher als die der Kontrolltiere. Die maximale IBR-Virusex­ kretion trat am 5. Tag in der Gruppe der mittleren und niedrigen intranasalen Dosierung auf, jedoch am 2. Tag in der Gruppe der höchsten intranasalen Dosierung. Bei der Gruppe der höchsten oralen Dosierung wurden mehr Viren aus­ geschieden. Bei sowohl der oralen als auch der intranasalen Verabreichung führte die niedrigste Dösierung zu einer geringeren IBR-Virusexkretion am 2. und am 3. Tag, diese war jedoch höher während den späteren Stadien der Infektion. Beobachtungen der Kälber mit intranasaler Dosierung zeigten, daß der größte Teil der aufgewendeten Dosierung geschluckt und einiges aus den Nasenkanälen ausgestoßen wurde, so daß die intranasale Route eine unwirksame Methode zu sein scheint.

Am 4. Tag nach der Inokulation wurden IBR-Virusantikörper in allen Kälbern entdeckt. IBR-Virusantikörper wurden nicht durch irgendeine Dosierung oder einen Verabreichungsweg des Interferons verzögert.

Kälber, die menschliches alpha-Interferon bei der höchsten oralen Dosierung erhielten, verbrauchten signifikant weniger Futter als % Körpergewicht am 5., 6. und 9. Tag im Vergleich zu den anderen Gruppen mit oraler Dosierung. Die signifikant verringerte Futteraufnahme bei der höchsten oralen Dosierung, die von keinerlei Unterschieden zwischen der niedrigsten oralen Dosierung und den Kontrolltieren begleitet wurde, zeigt, daß hohe Interferondosierungen für Zwecke der Appetitbeeinflus­ sungen weniger erwünscht als niedrige Dosierungen sind.

Während alle anderen Gruppen Gewicht verloren, nahmen die Kälber mit der niedrigsten oralen Dosierung während des 14tägigen Zeitraums der Virusinfektion an Gewicht zu. Die Gruppe mit der höchsten oralen Dosierung zeigte einen signifikant geringeren Gewichtsverlust am 14. Tag als die Gruppe mit der niedrigsten oralen Dosierung oder als die Kontrolltiere. Obwohl vier der Kälber an bakterieller Pneumonie starben, konnte keine Pathologie beobachtet werden, die der Interferonverabreichung zuzuordnen war.

Insgesamt scheint menschliches alpha-Interferon oral ver­ abreicht bei der niedrigsten Dosierung (39,6 IU/kg) die beste Verabreichungsform und Dosierung zu sein. Mehr Inter­ feron scheint nicht besser zu sein als weniger.

Beispiel 3

Dieser Versuch zeigt die wirksame orale Dosierung von Inter­ feron zur Erzeugung eines antiviralen Effektes gegenüber virulentem IBR-Virus in einem Expositionsmodell. Vierzig Kälber im Alter zwischen 9 und 12 Monaten mit einem Gewicht von 195,2 bis 340,5 kg wurden von der Texas Agricultural Experiment Station bezogen. Die Kälber wurden in fünf Gruppen mit gleichem Gewicht von jeweils acht Kälbern unterteilt. Jede Gruppe wurde willkürlich Behandlungen unterzogen. Den Behandlungsgruppen wurden ungefähr 0, 0,02, 0,22, 2,2 oder 22,0 Einheiten menschlichen alpha-Interferons pro Pfund Körpergewicht verabreicht. Die 0-Behandlungsgruppe erhielt MEM als Placebo.

Beginnend zwei Tage vor der Exposition mit virulentem IBR- Virus erhielten die Kälber einzelne, tägliche orale Dosie­ rungen von Interferon (oder Placebo) für einen Zeitraum von drei Tagen, wobei die abschließende Dosierung am Tag der Inokulation erfolgte. IBR-Virusinokulationen erfolgten mit einer Spritze in einer 2 ml Dosis pro Nüster (10^6,6 TCID₅₀ pro Kalb). Alle Kälber in dieser Untersuchung waren IBR-Virus­ seronegativ zum Zeitpunkt der Inokulation. Sieben Kälber wurden aus der Untersuchung genommen, weil zwei von ihnen am Tag der Inokulation IBR-Virusantikörper entwickelten und fünf keine Nahrung aus dem Futterverbrauchsmeßapparat auf­ nahmen.

Tabelle 9 zeigt die Anzahl der Kälber mit der jeweils gege­ benen Interferondosierung; Tabelle 11 zeigt eine Zusammen­ fassung dieser Ergebnisse. Das Futter/Zunahme-Verhältnis in Tabelle 11 gibt die verbrauchte Futtermenge in kg, geteilt durch die Zunahme in kg innerhalb der ersten elf Tage wieder.

Tabelle 9

Interferondosierungen

Tabelle 10

Geometrischer mittlerer IBR-Virustiter in Nasalsekreten (Plaquebildende Einheiten)

Tabelle 11

Zusammenfassung der Ergebnisse

Kälber, die etwa 1,0 Einheiten pro kg Körpergewicht (Gruppe D) erhielten, zeigten die kürzeste Fieberdauer und die niedrigste Fieberspitze von allen Gruppen. Die höchste In­ terferondosierung war signifikant nachteilig, wie sich aus höherem Fieber und geringerem Gewichtsverlust ergibt. Der Antivirusschutz der Gruppe D-Dosierung, 0,43 bis 0,59 Ein­ heiten pro kg, ergibt sich aus Tabelle 10. Drei Tage nach der Virusinokulation schieden die Gruppe D-Kälber signifikant weniger IBR-Viren als die Kontrolltiere aus (26.000 plaque­ formende Einheiten gegenüber 193.000 PFU). Sieben Tage nach der Virusinokulation schieden die Gruppe D-Kälber immer noch weniger Viren (29.000 PFU gegenüber 86.000 PFU) aus, obwohl der Unterschied nicht signifikant war. Alle Kälber schieden am 14. Tag nach der Inokulation keine Viren aus.

Die meisten Kälber in sämtlichen Gruppen verloren nach der IBR-Virus-Exposition Gewicht, und nahmen dann während der Dauer der Untersuchung an Gewicht zu. Die Gruppe D-Kälber hatte den niedrigsten Gewichtsverlust während der Infektion und die größte Gewichtszunahme am Ende der Untersuchung, wie sich aus Tabelle 11 ergibt. Die Interferondosierung hat eine signifikante negative Korrelation mit dem Gewichts­ verlust, der nach der Interferonverabreichung und der Virus­ inokulation bei den Gruppen A bis D auftrat.

Dies bestätigt die Ergebnisse des Beispiels 2 und stellt weiterhin klar, daß die wirksamste Dosis von menschlichem alpha-Interferon eine außerordentlich niedrige orale Dosis ist. Die Dosierung von etwa 2,2 IU/kg Körpergewicht führt zu einer verringerten Virusexkretion, der kürzesten Fieber­ dauer, dem geringsten Gewichtsverlust, der niedrigsten Fie­ berspitze, der größten durchschnittlichen täglichen Gewichts­ zunahme und der besten Futterkonversion.

Beispiel 4

Dieser Versuch zeigt die Praktikabilität und den wirtschaft­ lichen Nutzen der Verabreichung von menschlichem alpha-Inter­ feron an Transportkälber mit einer gemischten viralen Infek­ tion in einem Transportfiebermodell. Die Kälber wurden so nahe wie möglich gehalten, wie sie dies in einem tatsächlichen Marketing-System erfahren. Vierzig Kälber wurden von einem Aufkäufer in Tennessee erworben, und zwar in ähnlicher Weise wie dies bei einem Zuchtkalbbetrieb erfolgt, und wurden per Lastwagen nach Amarillo, Texas (1.899 km) innerhalb von 24 Stunden ohne Futter oder Nahrung transportiert. Die Kälber waren zwischen 9 und 12 Monaten alt, wogen 183,9 bis 247,4 kg und waren von dem Aufkäufer auf verschiedenen Auktionsmärkten im Südosten der Vereinigten Staaten erworben worden.

Die Kälber wurden in drei Behandlungsgruppen unterteilt, mit Ohrenmarken für die Identifizierung versehen und willkürlich Behandlungsgruppen zugewiesen: zehn Kälber erhielten eine orale Dosierung von bis 2,2 bis 3,3 Einheiten/kg zehn Kälber erhielten zwei orale Dosen bei der gleichen Dosierung an aufeinanderfolgenden Tagen und zwanzig Kälber dienten als unbehandelte Kontrolltiere. Die letzte Interferondosierung wurde zwei Tage vor dem Transport verabreicht.

Bei der Ankunft an der Zuchtstation in Amarillo wurden die Kälber gewogen und ihre Rektaltemperaturen gemessen. An­ schließend erhielten die Kälber Futter und Wasser. Am nächsten Tag wurden sie behandelt, erneut gewogen und ihre Temperaturen bestimmt. Die Behandlung bestand aus Entwurmen, vier-Wege-Clostridiumbakterin, Entlausen mit einem externen Insekticid, einer Injektion von A- und D-Vitaminen und einer Blutentnahme für die Serologie.

Es kam zu einem natürlichen Ausbruch an Transportfieber, und drei Kälber starben an Pneumonie: ein Kontrolltier und zwei Tiere, denen eine Dosis von Interferon gegeben worden war.

37 Tage nach der Behandlung hatten die zehn Kälber, denen zwei Interferondosierungen vor dem Transport gegeben worden waren, eine signifikant größere Gewichtszunahme als die Kon­ trollkälber. Die Kälber mit einer Dosierung nahmen besser zu als die Kontrolltiere, jedoch nicht so gut wie die Kälber mit zwei Dosierungen. Die Kälber mit Interferon wandelten auch aufgenommenes Futter besser in eine Gewichtszunahme als die Kontrolltiere um. Die günstigen Ergebnisse der Be­ mit zwei Dosierungen. Die Kälber mit Interferon wandelten auch aufgenommenes Futter besser in eine Gewichtszunahme als die Kontrolltiere um. Die günstigen Ergebnisse der Be­ handlung sind in Tabelle 12 zusammengefaßt.

Tabelle 12

Vorteile von HuIFN-A bei trans­ portgestreßten Zuchtkälbern

Beispiel 5

Vierzig Zuchtkälber wurden willkürlich in vier Behandlungs­ gruppen von jeweils zehn Kälbern unterteilt. Sämtliche Kälber waren IBR-Virus-seronegativ. Die Kälber erhielten Placebo oder Interferon (menschliches alpha) oral bei drei unter­ schiedlichen Dosierungen (0,11, 1,1 oder 11,0 IU/kg Körper­ gewicht). Eine Dosis von Interferon oder Placebo wurde am Tag vor, am Tag nach und am Tag der IBR-Virus-Inokulation gegeben. Jedes Kalb erhielt 10³ plaquebildende Einheiten (PFU) IBR-Virus pro Nüster.

Die Tabellen 13 bis 18 zeigen die Ergebnisse dieses Tests.

Tabelle 14

Durchschnittliche tägliche Zunahme 14 Tage nach der Inokulation

Tabelle 15

Futterverbrauch und Zunahme für 14 Tage nach der Inokulation

Tabelle 16

Futterverbrauch und Zunahme für 27 Tage nach der Inokulation

Tabelle 17

Geometrische mittlere Serumantikörpertiter gegen IBR-Virus

Tabelle 18

Geometrischer mittlerer IBR-Virustiter (plaquebildende Einheiten) im Nasalsekret

Die Rektaltemperaturen der Rinder unterschieden sich nicht signifikant unter den vier Behandlungsgruppen nach einer Inokulation mit dem IRB-Virus. Wie Tabelle 13 zeigt, hatten jedoch mehr Kälber mit der Dosierung von 1,1 IU/kg Fieber mit mindestens 40°C in den fünf bis neun Tagen nach der Inokulationsperiode.

Die Tabellen 14 und 15 zeigen, daß die Kälber mit 1,1 IU/kg- Dosierungen innerhalb der ersten 14 Tage erheblich mehr an Gewicht zunahmen als die Kontrolltiere und eine verbesserte Futterkonversion aufwiesen. Die Ergebnisse für Gewichtszunahme und Futter/Gewichtszunahme-Verhältnis bei 27 Tagen begünstigen alle drei der behandelten Gruppen gegenüber den Vergleichs­ tieren, jedoch nicht in signifikanter Weise, wie sich aus Tabelle 16 ergibt.

IBR-Virus-Antikörper wurden von allen Gruppen gebildet. Tabelle 17 zeigt, daß die Bildung signifikant schneller in der mit 1,1 IU/kg behandelten Gruppe auftrat. Die Nasal­ exkretion des IBR-Virus trat auch bei der 1,1 IU/kg Behand­ lungsgruppe schneller auf, wie sich aus Tabelle 18 ergibt. Von der 1,1 IU/kg Gruppe wurden signifikant mehr Viren aus­ geschieden, und zwar bei drei Tagen im Vergleich zu den Kontrolltieren (221 PFU gegenüber 2 PFU) und auch nach sieben Tagen (20.749 PFU gegenüber 204 PFU) nach der Virusinokula­ tion. Nach 14 Tagen schieden die Kontrolltiere jedoch mehr Viren als irgendeine andere, mit Interferon behandelte Gruppe aus (12.078 PFU gegenüber 298 oder 7 oder 132 PFU). Diese Daten zeigen, daß die anfängliche Virusinfektion bei Interferon-behandelten Kälbern intensiviert und verkürzt worden ist, was zu einer rascheren Erholung und besseren Leistungen führt.

Zusammenfassend gesagt, stimuliert menschliches alpha-Inter­ feron bei oraler Verabreichung in einer Menge von 1,1 IU/kg Körpergewicht signifikant die Entwicklung von Antikörpern, verbessert die Gewichtszunahme bei 14 Tagen nach der IBR- Virus Inokulation und vergrößert die IBR-Virusexkretion bei 3 und 7 Tagen, verringert jedoch die Virusexkretion bei 14 Tagen nach der Inokulation. Diese Dosierung verbessert die Wirksamkeit der Futterausnutzung während der ersten 14 Tage.

Claims (4)

1. Verwendung eines biologisch aktiven α-Interferons in einer oralen Dosierung von nicht mehr als 11 IU/kg Körpergewicht pro Tag zur Behandlung des respiratorischen Erkrankungs­ komplexes bei Rindern.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das α-Interferon humanes α-Interferon ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Dosierung zwischen 0,22 und 3,3 IU/kg Körpergewicht pro Tag verwendet.

4. Verwendung nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch eine Interferon-Dosierung an drei aufeinanderfolgenden Tagen.