DE3705686C2

DE3705686C2 - Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern

Info

Publication number: DE3705686C2
Application number: DE3705686A
Authority: DE
Inventors: Thomas Dipl Chem Dr Rer Geiger; Wolf Dieter Dr Rer Nat Engel
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1987-02-23
Filing date: 1987-02-23
Publication date: 1995-11-30
Anticipated expiration: 2007-02-24
Also published as: EP0280211A2; JP2626657B2; EP0280211B1; ATE113723T1; US4945042A; DE3705686A1; EP0280211A3; JPS63229368A; ES2062994T3; DE3851967D1; USRE34312E

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Antikörpers durch Inkubation mit drei verschiede nen Rezeptoren R₁, R₂ und R₃, von denen R₁ und R₃ in flüssiger Phase vorliegen und mit dem Antikörper binde fähig sind, R₂ in fester Phase vorliegt und mit R₁ bindefähig ist und R₃ eine Markierung trägt, Trennung der festen von der flüssigen Phase und Messung der Markierung in der festen Phase.

Antikörper sind Proteinmoleküle, die nach Kontakt mit dem passenden Antigen von B-Lymphocyten und Plasmazel len produziert werden und spezifisch gegen das ihre Bildung auslösende Antigen gerichtet sind. Der Nachweis von Antikörpern gegen bestimmte Antigene kann daher Aufschluß geben über das Stadium einer Krankheit oder über das Vorliegen von Autoimmunkrankheiten.

Antikörper können empfindlich nachgewiesen werden durch Verfahren nach dem Prinzip des Immunoassays. Hier sind verschiedene Varianten möglich. So kann beispielsweise das Antigen kovalent an einen Träger gebunden werden, mit der Lösung, die den zu bestimmenden Antikörper ent hält, in Kontakt gebracht werden und anschließend mit einem gegen diesen Antikörper gerichteten Antikörper, in der Regel ein Anti-Ig-Antikörper, der in bekannter Weise markiert ist, umgesetzt werden. Das Maß an gebun dener Markierung gibt dann Rückschluß auf die Menge an dem Antikörpergehalt. Nachteil dieses Verfahrens ist es, daß durch unspezifische Bindung von in der Probe enthalte nem, nicht spezifischem Antikörper falsch positive Werte erhal ten werden. Außerdem kann diese Bestimmung nur in zwei aufein anderfolgenden Schritten durchgeführt werden. Ein weiterer Test zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung eines Antikörpers besteht darin, Antigen gegen den zu bestimmenden Antikörper an einer Festphase zu fixieren. Anschließend gibt man Patientense rum zusammen mit einer vorbestimmten Menge des zu bestimmenden Antikörpers, der jedoch eine Markierung trägt, zu und mißt anschließend die an der Festphase gebundene Markierung. Es handelt sich hierbei also um einen kompetitiven Test, dessen Empfindlichkeit zu wünschen übrig läßt. Eine weitere Möglich keit besteht darin, an eine Festphase einen Anti-Ig-Antikörper zu binden und dann mit der Testlösung umzusetzen. Anschließend wird ein für den zu bestimmenden Antikörper spezifisches Anti gen, an das eine Markierung gebunden ist, zugegeben. Nachteil dieser Methode ist die begrenzte Bindekapazität der Festphase, da außer dem zu bestimmenden Antikörper auch andere Antikörper derselben Globulinklasse gebunden werden.

Eine Möglichkeit zur Bestimmung von antigen wirksamen Substan zen besteht darin, ein zu bestimmendes Antigen mit einem mar kierten Antikörper umzusetzen, den überschüssigen markierten Antikörper mit in fester Phase vorliegendem Antigen abzufangen und danach in einem weiteren Schritt die flüssige Phase mit einem in fester Phase vorliegenden zweiten Antikörper zu kon taktieren. Ein derartiges Verfahren ist beispielsweise bekannt aus DE 34 33 652 Al. Nachteil dieses Verfahren ist es, daß für jede Bestimmung andere Festphasen verwendet werden müssen, da die Festphasen jeweils nur das entsprechende spezifische Anti gen bzw. den entsprechenden spezifischen Antikörper tragen. Ein weiterer Nachteil ist es, daß bei einem derartigen Verfahren immer zwei Waschschritte benötigt werden. Eine weitere Möglich keit zur Bestimmung von antigen wirksamen Substanzen besteht darin, aus einem sensibilisierten unlöslichen Träger, auf den ein erstes Antikörperreagenz gebunden ist, und einem Antigen einen zusammengesetzten Träger zu bilden, der in einem weiteren Schritt mit einem markierten, zweiten Antikörperreagenz umge setzt wird. Ein derartiges Verfahren ist beispielsweise in der DE 36 05 695 A1 beschrieben. Nachteil dieser Methode ist es, daß zwei Waschschritte notwendig sind und damit ein solches Verfahren nicht auf Analysatoren übertragen werden kann, bei denen nur ein einziger Waschschritt durchführbar ist.

Eine weitere Variante besteht darin, eine Festphase mit dem spezifischen Antigen des zu bestimmenden Antikörpers zu be schichten, anschließend diese Festphase mit der Probelösung umzusetzen und danach in einem weiteren Schritt eine spezifisch bindefähige Substanz, die eine Markierung trägt, zuzusetzen. Derartige Verfahren sind beispielsweise bekannt aus EP-A 168 689 und EP-A 160 900. Nachteil dieser Verfahren ist es zum einen, daß für jede Bestimmung eine andere Festphase verwendet werden muß, da die Festphase jeweils das spezifische Antigen trägt. Ein weiterer Nachteil ist es, daß die Umsetzung des Antikörpers mit dem Antigen heterogen erfolgt. Da rüberhinaus sind für Verfahren dieser Art immer zwei Schritte notwendig. Damit sind aber solche Verfahren nicht übertragbar auf Analysatoren, bei denen nur ein einziger Waschschritt durchführbar ist.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Bestimmung von Antikörper zu schaffen, das einstufig und mit nur einem einzigen Waschschritt durchgeführt werden kann und somit automatisierbar ist. Darüberhi naus war es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, bei dem eine feste Phase für viele verschie dene Tests verwendet werden kann.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Be stimmung eines Antikörpers durch Inkubation mit drei verschiedenen Rezeptoren R₁, R₂ und R₃, von denen R₁ und R₃ in flüssiger Phase vorliegen und mit dem Anti körper bindefähig sind, R₂ an eine feste Phase gebunden vorliegt und mit R₁ bindefähig ist und R₃ eine Markie rung trägt, Trennung der festen von der flüssigen Phase und Messung der Markierung in der festen Phase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als R₁ ein Konjugat aus einer vom zu bestimmenden Antikörper spezifisch erkannten Substanz und einem Reaktionspartner eines spezifischen Bindungssystems, als R₃ ein Konjugat aus einer vom zu bestimmenden Antikörper spezifisch erkannten Substanz und einer Markierung und als R₂ den anderen Bindungspartner des spezifischen Bindungssystems ver wendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf dem Prinzip, daß zwei lösliche Bindungskomponenten, von denen die eine ein Konjugat aus einer Substanz, die mindestens ein für den zu bestimmenden Antikörper spezifisches Epitop trägt, wie z. B. ein Antigen, Antigenfragment, Anti-idiotyp-Antikörper oder Hapten mit einem Partner eines spezifischen Bindungssystems und die andere ein Konjugat aus einer Substanz, die mindestens ein für den zu bestimmenden Antikörper spezifisches Epitop trägt, wie z. B. ein Antigen, Antigenfragment, Anti-idiotyp- Antikörper oder Hapten und einer Markierung ist, um die mindestens zwei spezifisch bindefähigen Paratope des zu bestimmenden Antikörpers konkurrieren. Dabei entstehen im Falle von bivalenten Antikörpern (z. B. IgG) sta tistisch die folgenden Reaktionsprodukte: etwa 50% Antikörper, der sowohl R₁ als auch R₃ gebunden hat, zu etwa 25% Antikörper, der an beiden Paratopen R₁ gebun den hat und zu 25% Antikörper, der an beiden Paratopen R₃ gebunden hat. Nur die ersten beiden Reaktionsprodukte können an der Festphase gebunden werden, da sie einen Reaktionspartner des spezifischen Bindungssystemes tragen. Das Reaktionsprodukt, bei dem an beiden Para topen R₃ gebunden ist, wird ausgewaschen. Da der Anti körper, der an beiden Paratopen jeweils R₁ trägt, keine Markierung hat, geht er in die Messung nicht ein. Die Konzentrationsbestimmung des Antikörpers erfolgt daher allein über die Antikörpermoleküle, die an einem Paratop R₁ und am anderen Paratop R₃ gebunden haben. Da sich diese statistische Verteilung immer einstellt, ist eine Auswertung über das gebundene markierte Konjugat möglich und mit Hilfe einer Eichkurve kann dann die Konzen tration des Antikörpers in der Probe bestimmt werden.

Überraschenderweise ist es somit erfindungsgemäß möglich, Antikörper mit sehr hoher Genauigkeit und in einem einfachen Verfahren zu bestimmen. Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren wird nicht durch hohe Konzentrationen von nicht zu bestimmenden Antikörpern gestört. Besonderer Vorteil des Verfahrens ist die Schnelligkeit und Einfachheit des Testablaufs.

Da jeder der Rezeptoren und auch der zu bestimmende Antikörper jeweils nur spezifisch mit dem für ihn bestimmten Reaktionspartner reagieren kann, ist es mög lich, alle Rezeptoren und die Probe zusammen zu inku bieren und das Verfahren einstufig durchzuführen. Dies erfordert dann auch nur einen einzigen Waschschritt nach der Inkubation. Selbstverständlich ist es auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren in zwei Stufen durchzuführen. In diesem Fall wird zweckmäßig die Probe zunächst mit den Rezeptoren R₁ und R₃ inkubiert und an schließend der aus R₁, R₃ und zu bestimmendem Antikör per entstandene Komplex zu dem festphasengebundenen R₂ gegeben. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt jedoch in der einstufigen Verfahrens weise, da es dadurch möglich ist, das Verfahren zu automatisieren.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden drei verschiedene Rezeptoren R₁, R₂ und R₃ verwendet. Die Rezeptoren R₁ und R₃ liegen jeweils in flüssiger Phase und vorzugsweise in gleicher Konzentra tion vor. Sie bestehen jeweils aus einer Substanz, die ein für den zu bestimmenden Antikörper spezifisches Epitop trägt. Diese Substanz ist jeweils ein Konjugat aus zwei Teilen, wobei der eine Teil das Epitop trägt und beispielsweise ein Antigen, ein Antigenfragment ein Anti-idiotyp-Antikörper oder ein Hapten ist. Die in den Rezeptoren R₁ und R₃ enthaltenen antikörperspezifischen Substanzen können identisch oder verschieden sein. Der andere Teil des Konjugates ist bei R₁ ein Reaktionspartner eines spezifischen Bindungssystemes. Unter einem spezi fischen Bindungssystem werden hier zwei Partner verstan den, die spezifisch miteinander reagieren können. Das Bindungsvermögen kann dabei auf einer immunologischen Reaktion oder aber auf einer anderen spezifischen Reaktion beruhen.

Bevorzugt wird als spezifisches Bindungssystem eine Kombination von Biotin und Avidin; Biotin und Strept avidin; Biotin und Antibiotin; Hapten und Antihapten; Fcγ-Fragment eines Antikörpers und Antikörper gegen dieses Fcγ-Fragment oder Kohlehydrat und Lectin verwen det. Einer der Reaktionspartner dieses spezifisch bin defähigen Paares ist dann Teil des Konjugates, das den Rezeptor R₁ bildet.

Der andere Reaktionspartner ist der Rezeptor R₂, der in fester Phase vorliegt. Die Bindung von R₂ an ein unlösliches Trägermaterial kann nach den üblichen, dem Fachmann bekannten Methoden zur Fixierung von Bindungspartnern, vorzugsweise biologischer Bindungssysteme, an feste Trägersubstanzen vorgenommen werden. Sowohl eine kovalente als auch eine adsorptive Bindung ist geeignet. Bevorzugt wird jedoch, wegen der hierbei erzielbaren höheren Ausbeute und der vereinfachten Arbeitsweise, eine lediglich adsorptive Bindung, beispielsweise an Kunst stoff. Als feste Phase besonders geeignet sind Reagenz gläschen oder Mikrotiterplatten aus Polystyrol und ähnlichen Kunststoffen, die adsorptiv an der Innenober fläche mit R₂ beschichtet sind. Weiterhin geeignet sind auch teilchenförmige Substanzen, z. B. Molekularsiebma terialien, Glaskörperchen, Kunststoffschläuche und dergleichen. Besonders bevorzugt wird als Träger der festen Phase ein poröser, schichtförmiger Träger wie Papier verwendet. Als R₂ wird an der festen Phase der Reaktionspartner des spezifischen Bindungssystems fixiert.

Der Rezeptor R₃ trägt außer dem Antigen, Antigenfragment oder Hapten als anderen Teil des Konjugates eine Markierung. Bevorzugt wird als Markierung ein Enzym, eine fluoreszie rende, chemilumineszierende oder radioaktive Substanz verwendet. Verfahren zur Markierung von Antigenen, Antigenfragmenten oder Haptenen sind dem Fachmann bekannt, z. B. aus Clin. Chim. Acta 81 (1977) 1 bis 40, und bedürfen hier keiner weiteren Erläuterung. Die Markierung kann in an sich bekannter Weise bestimmt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsge mäßen Verfahrens werden die Rezeptoren R₁ und R₃ sowie die den zu bestimmenden Antikörper enthaltende Probe inkubiert. Dabei reagieren R₁ und R₃ mit statistischer Wahrscheinlichkeit mit den Paratopen des zu bestimmen den Antikörpers. Diese Reagenzmischung wird anschließend in Kontakt mit der den Rezeptor R₂ tragenden Festphase gebracht.

Der in R₁ enthaltene Reaktionspartner des spezifischen Bindungssystemes reagiert mit R₂. Nach der Inkubation wird eine Phasentrennung der festen von der flüssigen Phase durchgeführt, beispielsweise durch Absaugen. Nach Waschen der festen Phase kann dann die Messung der Markierung vorgenommen werden und stellt ein Maß für die Menge an zu bestimmendem Antikörper dar. Erfolgt die Markierung mit einem Enzym, genügt es, einfach die Aktivität des Markierungsenzyms in der hierfür allgemein bekannten Weise zu messen. Als Markierungsenzym wird besonders bevorzugt Peroxidase oder β-Galactosidase verwendet.

Falls die Markierung nicht mit einem Enzym sondern mit einer radioaktiven Substanz, einem Isotop, einer fluo reszierenden oder chemilumineszierenden Substanz erfolgt, so wird auch hier die Bestimmung nach einer dem Fachmann wohlbekannten Methoden vorgenommen.

Wird das Verfahren in einem Zentrifugalanalysator durchgeführt, so ist es bevorzugt, daß die Probe zuerst über einen Träger zentrifugiert wird, auf dem die beiden Rezeptoren R₁ und R₃ ablösbar vorliegen. Hierbei werden die Rezeptoren R₁ und R₃ gelöst.

Durch entsprechend zeitlich gestaltete Haltephasen wird die Ablösung der Rezeptoren R₁ und R₃ und deren Kom plexbildung mit dem in der Probe enthaltenen, zu be stimmenden Antikörper bewirkt.

Im nächsten Schritt wird das gebildete Reaktionsgemisch auf die feste Phase gebracht, wo dann die endgültige Reaktion abläuft.

Ebenso ist es auch möglich, die Rezeptoren R₁ und R₃ und die Probe ohne Haltephase für die Komplexbildung direkt auf die feste Phase mit dem Rezeptor R₂ zu bringen. Da die Reaktion zwischen den Rezeptoren R₁ und R₃ und dem zu bestimmenden Antikörper homogen ist, läuft sie viel schneller ab als die Reaktion zwischen R₁ und R₂ an der heterogenen Phasengrenze. Diese Reak tionsführung führt daher zu Ergebnissen, die sich nicht wesentlich von denen unterscheiden, die man in der Reaktionsführung mit Haltephase erhält.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden alle drei Rezepto ren sowie die den zu bestimmenden Antikörper enthalten de Probe inkubiert. Dabei reagieren R₁ und R₃ mit statistischer Wahrscheinlichkeit mit den Paratopen des zu bestimmenden Antikörpers. Der in R₁ enthaltene Reaktionspartner des spezifischen Bindungssystemes reagiert mit R₂. Wie zuvor beschrieben, läuft auch hier die homogene Reaktion zwischen R₁, R₃ und zu bestimmen dem Antikörper wesentlich schneller ab als die hetero gene Reaktion zwischen R₁ und R₂ und wird daher nicht behindert. Nach der Inkubation wird eine Phasentrennung der festen von der flüssigen Phase durchgeführt, bei spielsweise durch Absaugen. Nach Waschen der festen Phase kann dann die Messung der Markierung vorgenommen werden und stellt ein Maß für die Menge an zu bestim mendem Antikörper dar.

In einer weiteren Ausführungsform ist es auch möglich, zuerst die Probe mit der festen Phase in Kontakt zu bringen und dann das Reaktionsgemisch aus den Rezep toren R₁ und R₃ zuzugeben. Dieses Verfahren ist be sonders vorteilhaft für Analysenautomaten, die Probe und Reagenz nicht gleichzeitig dosieren können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Bestimmung eines Antikörpers, das dadurch gekenn zeichnet ist, daß es zwei verschiedene lösliche, mit dem Antikörper bindefähige Rezeptoren R₁ und R₃, von denen R₁ einen Reaktionspartner eines spezifischen Bindungssystems und R₃ eine Markierung trägt und außer dem einen Rezeptor R₂, der in fester Phase vorliegt und mit dem Rezeptor R₁ bindefähig ist, enthält, wobei der unlösliche Rezeptor R₂ und der lösliche Rezeptor R₁ physikalisch getrennt voneinander vorliegen.

Da der Rezeptor R₃ weder mit R₁ noch mit R₂ reagiert, ist seine Einbringung in das Reagenz unkritisch. Zweck mäßig werden jedoch R₁ und R₃ zusammen in einem Reagenz aufbewahrt.

Dabei sind R₁ und R₃ gemeinsam in einem flüssigen oder lyophilisierten Reagenz enthalten. R₂ liegt davon ge trennt, an ein unlösliches Trägermaterial gebunden, vor.

In einer weiteren Ausführungsform können die Rezeptoren R₁ und R₃ löslich und Rezeptor R₂ unlöslich und getrennt von R₁ in einem festen Trägermaterial enthalten sein. Als Trägermaterial sind die unter den bei der Erfindung auftretenden Bedingungen inerten Materialien, welche R₂ durch chemische oder physikalische Bindung zu fixieren vermögen, geeignet. Derartige Materialien sind dem Fachmann in großer Zahl bekannt. Bevorzugt ist ein saugfähiges, quellfähiges oder lösliches filmbildendes Trägermaterial, z. B. ein für Teststreifen bekanntes Trägermaterial wie Papier oder ähnliche Vliesmaterialien.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:

Beispiel 1 Herstellung von Reagenzlösungen 1) Herstellung eines HBsAg-Maus-IgG-Konjugates (Rezeptor-1)

1a Limitierte Reduktion von HBsAg (Hepatitis B-Oberflächen-Antigen)
5 mg HBsAg (Herstellung nach J. Virol. Meth. 11, 225-230 (1985)) in 5 ml 10 mM Na-Acetat- Puffer, pH 4,5 werden ad 50 mM Dithiothreit gebracht und 30 Minuten bei 25°C gehalten.

1b Entsalzung des Reaktionsansatzes
Der Reaktionsansatz wird über eine Sephadex G-25 Säule (⌀ 16 mm, Packhöhe 15 cm) in 10 mM Na-Acetat-Puffer pH 4,5 mit einer Flußrate von 40 ml/h chromatographiert und fraktio niert. Die Fraktionen mit Absorptionen bei 280 nm (E < 0,3) werden gepoolt und 24 Stunden gegen 30 mM K-Phosphatpuffer pH 7,1 dialysiert (3×1 l Dialyseflüssigkeit)

1c Modifizierung von IgG (Maus-normal-IgG, M-n IgG, Hersteller Calbiochem GmbH, Frankfurt).
Zu einer Lösung von 10 mg M-nIgG in 1 ml 30 mM K-Phosphatpuffer pH 7,1 werden 10 µl einer Lösung von Maleinaminohexanoyl-N-hydroxy succinimid-ester (MHS) in Dimethylsulfoxid (14,3 mg MHS/1 ml Dimethylsulfoxid) gegeben und 1 Stunde bei 25°C reagieren lassen.

1d Entsalzung des Modifizierungsansatzes
Der Ansatz aus 1c wird über 10 ml Sephadex G 25 in 30 mM K-Phosphat-Puffer pH 7,1 chro matographiert und fraktioniert (Flußrate 40 ml/h). Die Fraktionen des Proteinpeaks mit der höchsten Proteinkonzentration werden gepoolt. Diese enthalten den M-nIgG-MH modi fizierten Antikörper.

1e Konjugationsansatz
Zu 2 mg reduziertem HBsAg aus 1b in 4 ml 30 mM K-Phosphatpuffer pH 7,1 werden 10 mg M-n-IgG-MH in 1,6 ml 10 mM K-Phosphatpuffer pH 7,1 gegeben. Nach Mischen läßt man 1 Stunde bei 25°C reagieren. Die Reaktion wird beendet durch Zugabe von Cystem ad 1 mM, man läßt 30 Minuten bei 25°C reagieren, gibt dann Jodacetamid ad 5 mM zu und läßt 30 Minuten bei 25°C reagieren. Anschließend wird auf eine Konzentration von 15 mg/ml konzentriert.

1f Chromatographische Trennung des Konjugatan satzes
Der Ansatz wird nach Konzentrieren auf 0,8 ml auf Superose 6 prep (Pharmacia) (ca. 80 ml) aufgetragen und mit einer linearen Fließrate von 5 cm/h chromatographiert (10 mM K-Phosphat puffer pH 7,5; 0,2% Sacchorose; 0,1% Azid). Die Fraktionen im Ausschluß sind das geeig nete Produkt.

2) Schaf-anti-Maus-Fcγ (Rezeptor-2)

2a Schaf-anti-Maus-Fcγ-Antiserum wird wie folgt aufgereinigt:
Ein diesen Antikörper enthaltendes Serum wird ad 1,8 M mit Ammoniumsulfat versetzt. Das Präzipitat wird in 15 mM Na-Phosphatpuffer pH 7,0 enthaltend 50 mM Na-Chlorid aufgenom men. Die so erhaltene Lösung wird einer Pas sage über DEAE-Zellulose unterworfen.

2b Immunsorptive Aufreinigung
Das Schaf-anti-Maus-Fcγ-Reagenz aus 2a wird in PBS-Puffer pH 7,5 im Verlauf von 2 Stunden über Sepherosil-gebundenes Maus-IgG geleitet (ca. 1 ml M-IgG-Sepherosil pro 50 mg Reagenz- Protein). Nach Auswaschen des nicht gebundenen Proteins wird der spezifisch gebundene Anteil mit 1 M Propionsäure eluiert. Das Produkt wird dialysiert und lyophilisiert.

3) Herstellung eines HBsAg-βGal-Konjugates (Rezeptor-3)

3a, b) Limitierte Reduktion und Entsalzung von HBsAg analog zu 1a, b)

3c) Modifizierung der β-Galactosidase (β-Gal)
Zu einer Lösung von 10 mg βGal in 1 ml 30 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,1 werden 50 µl Bis- Maleimido-Methyl-Ether (BMME) (47 mg BMME/ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid) gegeben, gemischt und eine Stunde bei Raumtemperatur reagieren gelassen.

3d) Entsalzung der modifizierten βGal
Der Reaktionsansatz aus 3c) wird auf 4°C ab gekühlt und bei dieser Temperatur über 10 ml Sephadex G-25 in 30 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,1 bei einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/h chromatographiert und fraktioniert. Die Fraktionen mit dem höchsten Proteingehalt werden gepoolt (Proteinkonzentration 6 mg/ml): β-Gal-BMME.

3e) Konjugatansatz
Zu 2 mg reduziertem HBsAg aus 3b) in 4 ml 30 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,1 werden 10 mg βGal-BMME in 1,6 ml des gleichen Puffers gegeben und nach Mischen 1 Stunde reagieren gelassen.
Die Reaktion wird durch Zugabe von Cystein ad 1 mM beendet. Nach 30 Minuten bei 25°C wird Iodacetamid ad 5 mM zugegeben und ebenfalls 30 Minuten reagieren gelassen. Anschließend wird der Ansatz auf 15 mg/ml konzentriert.

3f) Chromatographische Auftrennung des Reaktions ansatzes
Der Ansatz nach 3e) wird auf eine 80 ml Superose 6 prep-Säule aufgetragen und mit einer Flußrate von 5 cm/h chromatographiert (Puffer: 10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5, 0,2% Saccharose, 0,1% Azid). Die Fraktionen im Ausschluß stellen das ge eignete Produkt dar.

Beispiel 2 Bestimmung von Anti-HBs A) Herstellung von Substratpuffer

70 mmol/l HEPES/NaOH pH 7,0
154 mmol/l Natriumchlorid
3 g/l Rinderserumalbumin
5 mmol/l Chlorphenolrot-β-D-galactosid (herge stellt nach DE 33 45 748)
2 g/l Tween 20 (nichtionogenes Detergenz)

B) Herstellung von Reagenzträgern 1) Reagenzträger 1

40 µl einer Lösung, die pro Liter
100 mmol Natriumphosphat pH 7,3 (37°C),
2 mmol Magnesiumchlorid,
9 g Natriumchlorid,
5 g Rinderserumalbumin,
10 mg HBsAg-IgG (Rezeptor-1-Lösung)
250 U HBsAg-β-Galactosidase-Konjugat (Rezeptor-3-Lösung; die Aktivität wird bestimmt mit ortho-Nitrophenyl-β-Galac tosid bei 37°C)
enthält, wird auf ein Vlies aufgetropft, das aus kommerziellem Polyesterpapier besteht. Anschließend wird bei Raumtemperatur getrocknet.

2) Reagenzträger 2

Auf ein Zellulose-Vlies werden nach dem Brom cyan-Aktivierungsverfahren (DE-OS 17 68 512) Schaf-Antikörper gegen den Fcγ-Teil von Maus- Antikörpern (Rezeptor-2-Lösung) fixiert, wo bei pro g Fasermaterial 10 µg Antikörper zur Fixierung angeboten werden. Durch Waschen wird ungekoppelter Antikörper entfernt und das Vlies schonend bei Raumtemperatur ge trocknet.

Die Bestimmung mit Hilfe dieser beiden Reagenzträger 1 und 2 erfolgt mit der in der DE-A1 3 425 008 be schriebenen Vorrichtung zur Durchführung analytischer Bestimmungen (vgl. dort Fig. 1).

Diese lehrt ein Rotoreinsatzelement für Zentrifugalana lysenautomaten, bestehend aus einem Formkörper, der eine Probenauftragskammer, die mit einer Mehrzahl von Reagenzfeldern in Verbindung steht, die jeweils ein mit einem bestimmten Reagenz imprägniertes saugfähiges Trägermaterial enthalten, wenigstens eine Mischventil kammer und eine Meßkammer aufweist, die zusammen einen Probenflüssigkeitstransportweg bilden, der von radial innen nach radial außen führt, wenn das Einsatzelement auf dem Rotor befestigt ist und weiter wenigstens eine weitere Kammer für die Aufnahme einer Flüssigkeit und einen Transportweg, der von dieser Kammer zur Meßführung führt und mit dem Probenflüssigkeitstransportweg minde stens teilweise identisch ist, aufweist. Dabei führt der Probenflüssigkeitstransportweg von einer Probenauf tragskammer (P) über eine mit saugfähigem Material gefüllte, Puffer enthaltende Kammer (a), eine Kammer (c) und eine zwischen den Kammern (a) und (c) angeord nete erste Ventilkammer (Vk1) zu einer zweiten Ventil kammer (Vk2) und von dieser über die Kammer (d) und über eine Auffangkammer (AK) zur Meßkammer (K). Zur Aufnahme einer weiteren Flüssigkeit ist eine als Pum penkammer ausgebildete Substratkammer (PK) vorgesehen, welche über eine aus Dosierkammer (DK) und Kapillare (Kap) bestehende Dosiereinrichtung und eine Überlauf kammer (ÜK) mit der zweiten Ventilkammer (Vk2) verbun den ist. Fig. 1 der DE-A1 34 25 008 zeigt schematisch das verwendete Rotoreinsatzelement.

Reagenzträger 1 wird auf Feld c des Rotoreinsatzele ments plaziert und Reagenzträger 2 auf Feld d. Dabei werden 40 µl Probe durch eine Öffnung am oberen Rand direkt auf das Feld a pipettiert. 270 µl Substratlösung werden in Kammer PK pipettiert. Durch ein geeignetes Zentrifugations-Programm, bei dem hohe Drehzahlen mit Stillstand abwechseln, werden dann Probe und Substrat lösung in Richtung Trennmatrix und Küvette gefördert.

Dabei werden im Verlauf des Programms die Rezeptoren 1 und 3 durch die Probenflüssigkeit vom Feld c eluiert und die homogene Mischung anschließend zur Reaktion gebracht. Auf Feld d werden die gebildeten Komplexe (Rezeptor-1:Analyt:Rezeptor-3) an den Rezeptor 2 ge bunden.

Die Substratlösung wird durch die Dosierkammer DK in Portionen geteilt, von denen die ersten zum Auswaschen von überschüssigem, nicht komplexiertem Konjugat dienen.

Unter diesen Bedingungen werden folgende Resultate er halten:

Tabelle 1

Anti-HBsAg

Die Proben wurden jeweils 5fach bestimmt. Die Messungen wurden bei einer Schichtdicke von 0,3 cm bei 576 nm gegen 700 nm durchgeführt und auf eine Schichtdicke von d = 1 cm umgerechnet.

Beispiel 3

Mikrotiterplatten (MTPs) werden pro Vertiefung mit je 250 µl einer Lösung von immunsorptiv aufgereinigtem Rezeptor 2 (Schaf-Anti-Maus-Fcγ-Antikörper) in der Kon zentration von 10 µg/ml in Beschichtungspuffer (20 mM Carbonatpuffer, pH 9,6) über Nacht bei Raumtemperatur (RT) beschichtet. Im Anschluß werden unspezifische Bindungsstellen durch eine einstündige Nachinkubation bei Raumtemperatur mit 300 µl Nachbeschichtungspuffer (50 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl, 1% Rinderserumal bumin (RSA), 1 g/l Tween 20, pH 7,5) abgesättigt. Nach Waschen mit 300 µl Waschpuffer (100 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,5 g/l Schaf-normal-IgG, 0,5 mM Mg-L- Aspartat, 2 g/l Tween 20, pH 7,25) pro Vertiefung werden 150 µl Probe und 50 µl einer Reagenzlösung, enthaltend Rezeptor 3 aus Beispiel 1 (HBsAg-βGal-Konju gat, 0,1 U/ml, Messung der Aktivität mit o-Nitrophenyl- β-D-Galaktosid bei 37°C) und Rezeptor 1 aus Beispiel 1 (HBsAg-Maus-IgG-Konjugat, 5 µg/ml) in Waschpuffer zuge geben, geschüttelt und anschließend für 3 Stunden inkubiert. Anschließend werden die Vertiefungen ausge saugt und dreimal mit je 300 µl Waschpuffer gewaschen. Danach wird 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 250 µl Substratlösung (5 mM Chlorphenolrot-β-D-Galaktosid, 70 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 g/l RSA, 2 g/l Tween 20, pH 7,3) inkubiert und anschließend mittels eines handels üblichen MTP-Meßgeräts bei 570 nm mit bichromatischer Korrektur bei 630 nm gemessen.

Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse eines typischen Versuchs (Messungen jeweils mit n=4).

Tabelle 2

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung eines Antikörpers durch Inkubation mit drei verschiedenen Rezeptoren R₁, R₂ und R₃, von denen R₁ und R₃ in flüssiger Phase vorliegen und mit dem Antikörper bindefähig sind, R₂ an eine feste Phase gebunden vorliegt und mit R₁ bindefähig ist und R₃ eine Markierung trägt, Trennung der festen von der flüssigen Phase und Messung der Markierung in der festen Phase, dadurch gekennzeichnet, daß man als R₁ ein Konjugat aus einer vom zu bestimmenden Antikörper spezifisch erkannten Substanz und einem Reaktionspartner eines spezi fischen Bindungssystems, als R₃ ein Konjugat aus einer vom zu bestimmenden Antikörper spezifisch erkannten Substanz und einer Markierung und als R₂ den anderen Bindungspartner des spezifischen Bindungssystems verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als spezi fisches Bindungssystem Biotin/Avidin; Biotin/Strept avidin; Biotin/Antibiotin; Hapten/Antihapten; Fcγ-Fragment eines Antikörpers/Antikörper gegen dieses Fcγ-Fragment; Kohlehydrat/Lectin verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor R₃ mit einem Enzym, einer fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder radioaktiven Substanz markiert ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man alle drei Rezeptoren gleichzeitig zusetzt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rezeptoren R₁ und R₃ mit der Probe vorinkubiert und anschließend mit R₂ inkubiert.

6. Reagenz zur Bestimmung eines Antikörpers nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zwei verschiedene lösliche, mit dem Anti körper bindefähige Rezeptoren R₁ und R₃, von denen R₁ einen Reaktionspartner eines spezifischen Bin dungssystems und R₃ eine Markierung trägt, und außerdem einen Rezeptor R₂, der in fester Phase vorliegt und mit dem Rezeptor R₁ bindefähig ist, enthält, wobei der unlösliche Rezeptor R₂ und der lösliche Rezeptor R₁ physikalisch getrennt voneinan der vorliegen.

7. Reagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezep tor R₂ bzw. der Rezeptor R₁ physikalisch getrennt voneinander jeweils auf einem Trägermaterial imprägniert vorliegen.