DE3712862C2 - Einrichtung und Verfahren zur Diskriminierung von Teilchen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Diskriminierung von Teilchen mittels Lichtstreuung und stellt insbesondere ein Verfahren und ein Flußzytometergerät zur Diskriminierung von Teilchen auf der Grundlage unterschiedlicher Licht­ streuungs-Depolarisationseffekte, zur Verfügung

Zum Stand der Technik werden folgende Druckschriften angegeben:
Benson, M.C., et al., Cytometry, 5: 515-522 (1984).
Hoffman, R.A., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77: 4914-4917 (1980)
Hulst van de, H.D., Light Scattering by Small Particles, Dover Publications, Inc., New York, 1981.
Julius, M.H., et al., in Mammalian Cells: Probes and Problems (Richmond, C.R., et al., eds.), ERDA Symposium Series CONF-731007, Technical Information Center, Oak Ridge, Tennessee, 1975, p. 107-121.
Loken, M.R., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 254: 163-171 (1975).
Marston, P.L., J. Opt. Soc. Am. 73: 1816-1818 (1983).
Mullaney, P.F., et al., Biophys. J. 10: 764-772 (1970).
Salzman, G.C., et al., Acto. Cytol. 19: 374-377 (1975).
Terstappen, L.W.M.M., et al., Cytometry, 7: 178-183 (1986).
Terstappen, L.W.M.M., et al., J. Immunol. Methods, 95: 211-216 (1986).
Terstappen, L.W.M.M., et al., Cytometry, 6: 316-320 (1985).
Visser, J.W., et al., Blood Cells, 6: 391-407 (1980).
Weil, G.J., et al., Blood, 57: 1099-1104 (1981).

Verfahren zur Diskriminierung von Teilchen sind für unter­ schiedliche klinische Tests nützlich, beispielsweise zur Bestimmung der Anzahl und des Typs von Zellen in einer Blutprobe, zum Nachweis bakterieller oder viraler Teilchen in einer Probe von Körperflüssigkeiten, und zur Untersuchung von Zellenvolumina und -dichte, beispiels­ weise bei der Zählung von Spermien. Der Nachweis nicht zellularer Teilchen, beispielsweise Harnsäurekristallen in einer Urinprobe, ist ebenfalls in bestimmten klinischen Untersuchungen von Wert. Die Analyse von Kristallen und anderer Teilchen, die in Fluiden in Suspension vorliegen, ist ebenfalls für industrielle Anwendungen von Bedeutung.

Ein Verfahren, mit dem eine schnelle und wirksame Diskriminierung von Teilchen in einer Probe einer Suspension der Teilchen vorgenommen werden kann, ist die Flußzytometrie. Bei diesem Verfahren wird eine Suspension von Teilchen, typischer­ weise Zellen in einer Blutprobe, durch eine Flußkammer transportiert, in der die einzelnen Teilchen der Probe mit einem oder mehreren fokussierten Lichtstrahlen be­ leuchtet werden. Die Wechselwirkung des Lichtstrahls beziehungsweise der Lichtstrahlen mit den einzelnen durch die Kammer fließenden Teilchen wird durch eine oder mehrere Lichtdetektoren nachgewiesen. Üblicherweise sind die Detektoren zur Messung der Lichtabsorption oder Fluoreszenz­ emission, bei bestimmten Wellenlängen des Strahls oder der Emission, und/oder der Lichtstreuung in bestimmten Streuwinkeln ausgelegt. Daher kann jedes Teilchen, das durch die Flußkammer gelangt, bezüglich eines oder mehrerer Merkmale bezüglich seiner Absorption, Fluoreszenz, Licht­ streuung oder anderer optischer oder elektrischer Eigen­ schaften charakterisiert werden. Die eine Eigenschaft beziehungsweise mehrere Eigenschaften, die durch die Detektoren gemessen werden, erlauben eine Abbildung jedes Teilchens in einen Merkmalsraum, dessen Achsen die Lichtin­ tensitäten oder andere Eigenschaften sind, die durch die Detektoren gemessen werden. Im Idealfalle werden die unterschiedlichen Teilchen in der Probe in unterschiedliche und nicht-überlappende Bereiche des Merkmalraums abge­ bildet, wodurch jedes Teilchen auf der Grundlage seiner Abbildung in den Merkmalsraum analysiert werden kann. Eine derartige Analyse kann Zählen, Identifizieren, Quantifi­ zieren (bezüglich einer oder mehrerer physikalischer Eigenschaften) und/oder Sortieren der Teilchen umfassen.

Zwei allgemeine Arten von Lichtstreuexperimenten werden routinemäßig bei der Flußzytometrie gemacht. Messungen der Lichtintensität bei kleinen Winkeln (etwa 1,5°-13°, bezogen auf den einfallenden Lichtstrahl) , üblicherweise als Vorwärts oder Kleinwinkelstreuung bezeichnet, geben Information über die Zellgröße (Mullaney). Die Vorwärts­ streuung hängt ebenfalls stark von dem Unterschied in der Brechung zwischen Zellen und dem extrazellularen Medium ab, so daß beispielsweise Zellen mit beschädigten Membranen unterschieden werden können. Lichtintensitätsmes­ sungen bei einem Winkel von etwa 65° bis 115° in bezug auf das einfallende Licht werden üblicherweise als orthogo­ nale Lichtstreuung bezeichnet und diese stellt Information über die Größe und den Grad der Strukturierung der Teilchen zur Verfügung (Visser) . Beispielsweise haben die Erfinder und Mitarbeiter gezeigt, daß menschliche zytotoxische Lymphozyten offenbar unterschiedliche Struktureigenschaften aufweisen als reguläre und B-Lymphozyten, basierend auf den größeren orthogonalen Lichtstreuintensitäten der zytotoxischen Zellen (Terstappen). Ist die Breite des beleuchtenden Strahls kleiner als der Durchmesser der Teilchen, so gibt die Impulsform des Lichts in orthogonalen Streuwinkeln Information über die Länge und die Form der Zellen.

Gleichzeitige Lichtstreumessungen bei verschiedenen Winkeln oder in Kombination mit Absorptions- oder Fluoreszenz­ messungen sind für Flußzytometrieverfahren vorgeschlagen worden. Die gleichzeitige Messung der Vorwärts- und orthogonalen Lichtstreuung kann verwendet werden, um zytotoxische Lymphozyten von regulären und B-Lymphozyten zu unterscheiden, wie voranstehend angegeben (Terstappen), und zur Unter­ scheidung von Lymphozyten von anderen periphären Leukozyten­ zellen (Hoffman). Die Absorption des Lichts in Verbindung mit Lichtstreuung wird in der Flußzytometrie zur Unterschei­ dung zwischen Erythrozyten und Thrombozyten, und zwischen Lymphozyten, Monozyten, basophilen Granulozyten, eosi­ nophilen Granulozyten, und neutrophilen Granulozyten verwendet (Technicon Hemalo oder Hl-Systeme). Dieses Ver­ fahren erfordert jedoch eine Anfärbung der Zellen und ist daher verhältnismäßig komplex und kann dazu führen, daß die Zellen nach der Sortierung der Zellen nicht weiter ver­ wendet werden können.

Lichtstreumessungen in Verbindung mit zirkularem Dichroismus (CD) und optischer Drehdispersion (ORD) gestatten ebenfalls eine Diskriminierung von Teilchen in Suspensionen viraler Teilchen und Zellen. Untersuchungen des Effekts der Mie- (isotrope Teilchen-)streuung auf die CD- und ORD-Spektren von DNA in viralen Teilchen deuten an, daß Streumessungen zur Korrektur von ORD- und CD-Messungen in größeren biologischen Strukturen, beispielsweise Virusteilchen und -zellen, verwendet werden können, um eine Teilchendiskriminierung auf der Grundlage charakteristischer ORD- und CD-Eigenschaften zu gestatten. Differentielle Streuung rechts- und linkszirkular polarisierten Lichts ist zur Diskriminierung einer Anzahl unterschiedlicher Mikroorganismen gezeigt worden (Salzman). Das CIDS-Verfahren (circular intensity differential scattering) arbeitet wie CD, welches die differentielle Absorption links- und rechtszirkular polarisierten Lichts ausnutzt, nutzt jedoch die differentielle Streuung durch helixartige Strukturen, beispielsweise DNA, von rechts- und linkszirkular polari­ siertem Licht aus.

Aus der DE 35 31 969 A1 ist ein Verfahren zur Erfassung und Klassifizierung von Teilchen bekannt, bei dem eine Teilchensus­ pension, die unterschiedliche Teilchenarten enthält, durch eine optische Sensorzone geleitet wird, wo die Teilchen mit einem einfallenden Laserstrahl beleuchtet werden, wodurch von jedem Teilchen Streulicht erzeugt wird. Die Intensität des Streulichts wird in ausgewählten Winkeln gemessen. Da die Intensitätsvertei­ lungen des gemessenen Streulichts charakteristisch für eine der Teilchenarten ist und nicht mit der Intensitätsverteilung der anderen Teilchenarten überlappt, können so die verschiedenen Teilchenarten analysiert werden. Neben diesem Verfahren zeigt die DE 35 31 969 A1 auch eine Einrichtung zum Analysieren zumin­ dest zweier unterschiedlicher Teilchenarten, die eine optische Sensorzone, eine Vorrichtung zum Durchleiten einer Teilchensus­ pension durch die Zone, einen Laser zur Beleuchtung der sich in der Sensorzone befindenden Teilchen, einen Detektor zur Messung des von den Teilchen erzeugten Streulichts in einem ausgewählten Winkel, und eine Analyseeinrichtung zur Analyse der unterschied­ lichen Teilchenarten aufweist.

Die EP 0 135 984 A2 offenbart ein Verfahren zur Analyse unter­ schiedlicher Teilchenarten, bei dem ein Teilchenstrom durch eine optische Sensorzone geleitet und dort mit Laserlicht beleuchtet wird, wodurch Streulicht von jedem Teilchen erzeugt wird. Die für jede Teilchenart typische Verteilung des Streulichts wird unter ausgewählten Winkeln gemessen und die Teilchen werden auf der Basis der gemessenen Streulichtintensitäten in einem durch eine mathematische Transformation definierten Diskriminierungs­ raum analysiert. Zur Durchführung des Verfahrens wird eine Ein­ richtung verwendet, die eine Analyseeinrichtung aufweist, welche auf der Basis von Streulichtmeßdaten, die unter zwei ausgewähl­ ten Winkeln erfaßt wurden, die Analyse der Teilchen durchführt.

Aus der US 4 325 706 ist ein Verfahren zur Analyse unterschied­ licher Teilchenarten im Blut bekannt, bei dem ebenfalls eine Teilchensuspension in einem Kanal durch eine optische Sensorzone geleitet und dort mit einem Strahl kohärenten Laserlichts be­ leuchtet wird. Die Intensität des daraufhin durch die Teilchen erzeugten Streulichts wird in einem ausgewählten Winkel gemes­ sen, so daß die verschiedenen Teilchenarten auf der Basis der gemessenen Streulichtintensitäten analysiert werden können.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Lichtstreu­ verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die Arten von Teil­ chen erweitert, welche in einem Flußzytometersystem unterschie­ den werden können.

In vorteilhafter Weise stellt die Erfindung ein derartiges Ver­ fahren zur Unterscheidung von Teilchen zur Verfügung auf der Grundlage von Depolarisationsstrukturen, die charakteristisch für die unterschiedlichen Arten von Teilchen sind.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Verfahren zur Unter­ scheidung unterschiedlicher Arten von Granulozytenzellen zur Verfügung gestellt.

Weiterhin stellt die Erfindung in vorteilhafter Weise ein Gerät zur Diskriminierung von Teilchen auf der Grund­ lage differentieller Depolarisationslichtstreuung von Teilchen zur Verfügung.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist so ausgelegt, daß zwei oder mehr unterschiedliche Teilchenarten auf der Grundlage unterschiedlicher Depolarisationsstrukturcharak­ teristiken der Teilchenarten diskriminiert werden können. Zur Ausübung des Verfahrens wird eine Suspension von Teilchen, die die unterschiedlichen Teilchenarten erhält, durch eine optische Sensorzone geführt und die Teilchen in der Zone werden mit einem einfallenden Strahl linear polarisierten Lichts beleuchtet. Jedes beleuchtete, durch die Zone gelangendes Teilchen erzeugt depolarisiertes Streulicht, dessen Intensität bei einem auswählbaren Streuwinkel von der Depolarisationsstruktur des Teilchens abhängt. Die Intensität des depolarisierten Streulichts im ausgewählten Winkel liegt, innerhalb eines Intensitätsver­ teilungsbereichs, in einem geeigneten Diskriminierungsraum welcher a) charakteristisch für eine der Teilchenarten ist und b) im wesentlichen nicht mit der Intensitätsverteilung einer anderen Teilchenart oder anderer Teilchenarten in der Suspension überlappt. Die gemessene Intensität depolarisierten Streulichts im ausgewählten Winkel gestattet wenn sie im Diskriminierungsraum ausgewertet wird, die Diskriminierung der unterschiedlichen Teilchenarten in der Suspension. Allgemeiner gesprochen gestattet das Verfahren eine Analyse unterschiedlicher Teilchenarten, einschließlich Zählen, Diskriminieren, Quantifizieren physikalischer Eigenarten und/oder Sortieren der unterschied­ lichen Teilchenarten.

Falls die Teilchen auf der Grundlage der Depolarisation allein analysiert (beispielsweise unterschieden) werden können, kann der Merkmalsraum ein eindimensionaler Raum sein, der durch die Intensität des depolarisierten Lichts festgelegt ist, welches von den beleuchteten Teilchen gestreut wird, in dem ausgewählten Winkel. Im allgemeinen werden die Teilchen auf der Grundlage der Depolarisationsin­ tensität und zumindest einer anderen optischen oder elektrischen Antworteigenschaft analysiert, beispielsweise totale Lichtstreuung, Absorption, Fluoreszenz, CD oder ORD, deren mittlere Antwortwerte sich für die unterschiedlichen Teilchenarten unterscheiden. Hier ist der Diskriminierungs­ raum ein inkrementales Element, welches in einer Dimension durch Depolarisationsstreuintensität festgelegt wird, und in zumindest einer anderen Dimension durch eine inkremen­ tale Änderung eines anderen Parameters der Teilchenmessung, wie noch im einzelnen nachstehend erklärt wird.

Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung wird das Verfahren zur Analyse, insbesondere zur Unterscheidung, granulytischer Eosinophile und Neutrophile verwendet. Die Zelldiskriminierung wird in einem zweidimensionalen Merkmalsraum durchgeführt, welcher in einer Dimension durch orthogonale depolarisierte Lichtstreuung festgelegt ist und in einer zweiten Dimension durch das totale orthogonale Streulicht.

Die Erfindung umfaßt weiter eine Einrichtung zur Analyse zumindest zweier unterschiedlicher Teilchenarten auf der Grundlage unterschiedlicher Depolarisationsstruktur­ eigenschaften der verschiedenen Teilchenarten. Innerhalb einer Flußzelle in dem System wird eine optische Abtastzone festgelegt, in welcher in Suspension befindliche Teilchen durch einen polarisierten Lichtstrahl beleuchtet werden. Die Intensität depolarisierten Streulichts der Teilchen wird durch einen Detektor in einem ausgewählten Winkel gemessen, wodurch, in einem geeigneten Merkmalsraum, eine Teilchendiskriminierung auf der Grundlage unterschied­ licher Depolarisationsstruktur ermöglicht wird. Die Einrichtung umfaßt einen Analysator zur Aufzeichnung gemessener Zellen­ parameter und zur Analyse von Teilchen auf der Grundlage depolarisierter Streuintensität in einem geeigneten Diskrimi­ nierungsraum.

Die Erfindung wird nachstehend anhand zeichnerisch dargestellter Ausführungsbeispiele der Erfindung näher erläutert, aus welchen weitere Vorteile und Merkmale hervorgehen.

Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Flußzytometer-Lichtstreugeräts;

Fig. 2 einen durch depolarisierte Lichtstreuintensität festgelegten eindimensionalen Merkmalsraum und nicht überlappende Intensitätsverteilungen zweier unterschiedlicher Teilchen;

Fig. 3 einen zweidimensionalen Merkmalsraum, welcher entlang einer vertikalen Achse Depolarisations­ intensitäten darstellt, die für zwei unterschiedliche Teilchen gemessen wurden, und entlang einer horizontalen Achse totale Lichtstreuintensitäten;

Fig. 4 einen dreidimensionalen Merkmalsraum, welcher durch depolarisiertes Streulicht in einer Dimension, totales Streulicht in einer zweiten Dimension und absorbiertes Licht in der dritten Dimension festgelegt wird;

Fig. 5 ein Flußdiagramm eines gemäß der Erfindung zur Analyse von Teilchenarten verwendeten Algorithmus;

Fig. 6 eine Erläuterung orthogonaler Lichtstreuung von einem einzelnen Punkt im Ursprung O in der Figur, bei welcher die Ausbreitung von Streulicht durch Polarkoordinaten r, Θ und Φ geschrieben wird;

Fig. 7 einen einfallenden Lichtstrahl, der an zwei intrazellu­ laren Teilchen reflektiert wird und einen gestreuten Strahl ergibt, welcher sich entlang der negativen y-Achse ausbreitet und vollständig in z-Richtung polarisiert ist;

Fig. 8 eine Darstellung des Depolarisationsverhältnisses D(Δo)/D(15°), wobei D=(I_r/(I_r + I_l)) ist, gemessen als eine Funktion des Akzeptanzwinkels ΔΦ für Neutrophile (⚫) , Eosinophile (x), Lymphozyten (o) Monozyten () und Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 1,16 µm (Δ), wobei die gestrichelte Linie die theoretische Kurve für ideale Kugeln darstellt;

Fig. 9A bis 9C Darstellungen der flußzytometrischen Dichte totaler orthogonaler Lichtstreuung gegen depolarisierte orthogonale Lichtstreuung unter­ schiedlicher menschlicher Blutzellen.

I. Zytometergerät

Ein zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung ausge­ bildetes Zytometergerät ist in Fig. 1 gezeigt und mit der Bezugsziffer 10 bezeichnet. Ein Flußzytometer 12 in dem Gerät ist zur Messung der Depolarisationslichtstreuung von Probenteilchen ausgebildet, wie im einzelnen im Teil A dargestellt ist. Ein Analysator 14 in dem Gerät dient zur Analyse der Teilchen in der Probe auf der Grundlage einer oder mehrerer optischer Messungen, einschließlich Depolarisationsstreuung, wie in Teil B beschrieben ist. Wie dort erläutert ist kann die Analyse von Teilchen gemäß des Verfahrens das Zählen von Teilchen, Diskriminieren, Quantifizieren (physikalische Parameter), und/oder Sortieren umfassen.

A. Flußzytometer

Die grundlegende Hardware des Flußzytometers stellen eine Flußkammer 16 dar, durch welche Teilchen in einer Suspensionsprobe geschickt werden, eine Lichtquelle 18 zur Beleuchtung von sich durch die Flußzelle bewegenden Teilchen, und Fotodetektoren, beispielsweise Detektoren 20, 22 und 24 zur Messung optischer Antwortparameter der beleuchteten Zellen.

Die Lichtquelle 18 ist zur Beleuchtung der Teilchen in der Flußkammer mit einem fokussierten, linear polarisierten Lichtstrahl ausgebildet. Der Lichtstrahl, in der Figur durch die Bezugsziffer 26 gekennzeichnet, ist ein von einem konventionellen Laser 28 erzeugter Strahl kohärenten Lichts. Ein 3 Watt Argonionenlaser, abgestimmt auf 448 nm, oder ein 5 mW Helium- Neon-Laser sind hierfür geeignet. Der von dem Laser ausgehende Licht­ strahl wird auf den Strom der Zellen in der Flußzelle durch eine Linse 30 fokussiert, welche beim voranstehend angegebenen Argonlaser zwei zylindrische Linsen mit Brenn­ weiten von 200 und 20 mm umfaßt und im Falle des Helium- Neon-Lasers eine einzelne Kugellinse mit einer Brennweite von 70 mm ist. Wenngleich eine Quelle kohärenten Lichts (Laser) dargestellt ist, kann die Lichtquelle alternativ eine konventionelle Bogenlampe (inkohärent) sein, deren Strahl durch die Linse 30 fokussiert wird.

Der Lichtstrahl kann linear mittels eines im Handel erhältlichen Polarisationsfilters 32 polarisiert sein. Alternativ hierzu kann der Laser 28 so ausgelegt sein, daß er einen linear polarisierten Lichtstrahl abgibt, beispielsweise im Fall eines linear polarisierten Argonlasers. Für die Zwecke dieser Darstellung wird eine Orientierung des Polarisationsfilters angenommen, bei der linear polarisiertes Licht erzeugt wird, dessen elektrischer Feldvektor E parallel zur x-Achse in dem dargestellten x-y-z-Koordinatensystem liegt und wobei der Lichtstrahl entlang der z-Achse gerichtet ist und sich Teilchen durch die Flußzelle entlang der x-Achse bewegen. Der polarisierte elektrische Feldvektor ist daher zur Richtung des Teilchenflusses ausgerichtet. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß der Lichtstrahl in einen Winkelbereich innerhalb der x-z-Ebene gerichtet werden kann, typischerweise von etwa 10 bis 170 Grad bezüglich der x-Achse, und daß der elektrische Feldvektor in praktisch jeder Richtung in der x-y-Ebene polarisiert sein kann.

Wenn dies auch nicht in dieser Darstellung gezeigt ist, so kann doch das Zytometer 12 weitere Lichtquellen zur Bestimmung einer Vielzahl optischer Parameter zusätzlich zur Lichtstreuung umfassen, beispielsweise optische Absorption, Fluoreszenz, CD und ORD, ebenso wie eine unpolarisierte Lichtquelle oder eine in einer zweiten Richtung polarisierte Lichtquelle für Lichtstreumessungen.

Die Flußkammer 16 kann eine konventionelle geschlossene optische Zelle sein, beispielsweise eine Flußzelle aus Quarz mit einem quadratischen Flußkanal mit Abmessungen von 250 µm × 250 µm. Die Kammer ist so angeordnet, daß in einer flüssigen Suspension befindliche Teilchen über ein Injektionsrohr 34 in eine optische Sensorzone 36 in der die Messung der Lichtstreuung durchgeführt wird, und durch diese hindurch geführt werden.

Falls das Flußzytometer zum Sortieren von Zellen verwendet werden soll, kann die Flußkammer eine "Strahl-in-Licht"- ("jet-in-air"-) artige Zelle sein, welche einen Strahl von Suspensionströpfchen gerade stromabwärts der Abtastzone erzeugt. Hierfür ist eine konventionelle Strahl-in-Luft-Zelle geeignet, wie sie beim Sortieren von Zellen mittels Fluores­ zenzanregung verwendet wird und im Handel erhältlich ist. Alternativ hierzu kann das Sortieren von Zellen mit einem Flußkanal erfolgen, welcher einen Lochstein mit kleiner Öffnung zur Bildung von Tröpfchen aufweist. Das Zytometer kann zusätzlich eine Zellensortiervorrichtung 38 aufweisen, welche auf konventionelle Art betrieben wird, um ausgewählte Teilchen in ein Sammelrohr abzulenken, basierend auf den optischen Parametern der in der Sensorzone gemessenen Teilchen. Zusätzlich kann ein (nicht dargestellter) Abdeckstab vor dem Objektiv zum Nachweis orthogonalen Lichts angeordnet werden, um das von dem zylindrischen Stromfluß gestreute Laserlicht abzuschirmen. Typischerweise schirmt der Stab Licht in einem Winkel zwischen etwa 87° bis 93° bezüglich des einfallenden Lichts ab. Mit einem derartigen Abschirmstab wird der relative Beitrag der Kreuzdepolarisation (nachstehend genauer erläutert) zur totalen Depolarisation vergrößert. Das Flußsortiersystem mit Abdeckstab ist erfolgreich bei auf Depolarisationsdiskriminierung beruhender Sortierung von Zellen verwendet worden, wie nachstehend noch genauer beschrieben wird.

Ein wichtiges Merkmal der Erfindung besteht darin, daß das Zytometer zumindest einen optischen Detektor zum Nachweis der Intensität depolarisierten Lichts aufweist, welches durch die Teilchen der Sensorzone gestreut wird. Hierbei soll unter "depolarisiertem Streulicht" ein Licht verstanden werden, dessen elektrischer Feldvektor eine signifikante Vektorkomponente in der zum elektrischen Feldvektor des einfallenden Lichtstrahls normalen Ebene aufweist. In der dargestellten Anordnung, in welcher der Feldvektor des einfallenden Lichts entlang der x-Achse gerichtet ist, normal bezüglich der y-z-Ebene, enthält der Feldvektor des depolarisierten Streulichts eine signifi­ kante Komponente in der y-z-Ebene.

Die in der Figur dargestellte Ausführungsform der Erfindung ist so ausgebildet, daß orthogonales depolarisiertes Licht gemessen werden kann, also depolarisiertes Licht, welches in einen Winkel zwischen etwa 65° und 115° gestreut wird, vorzugsweise etwa 90°, bezüglich der Richtung des einfallenden Strahls, also entlang der y-Achse in Fig. 1 gestreutes Licht. Wie die Figur zeigt wird das totale orthogonale Streulicht durch eine Linse 42 gesammelt, welche den gestreuten Lichtstrahl kollimiert, wie durch die Bezugsziffer 44 in der Figur verdeutlicht wird. Hierfür ist ein konventionelles Mikroskopobjektiv geeignet.

Die dargestellte Ausführungsform ist ebenfalls zur Messung des totalen orthogonalen Streulichts ausgebildet, welches hier definiert ist als orthogonales Streulicht, welches sowohl die polarisierten als auch die depolarisierten elektrischen Feldvektoren aufweist, welche durch die Teilchenstreuung des polarisierten einfallenden Lichts erzeugt werden. Ein konventioneller Strahlteiler 46 im optischen Weg spaltet den Strahl 44 in zwei mit 48 und 50 bezeichnete Strahlen auf, die jeder aus totalem orthogonalen Streulicht bestehen. Der Strahl 48 wird durch einen Polarisa­ tor 52 geleitet, welcher entlang der x-Achse polarisiertes Streulicht ausfiltert und daher nur depolarisiertes Streulicht durchläßt, also Streulicht mit einer Vektorkomponente in der z-Richtung der Figur. Ein geeigneter Polarisator ist ein im Handel erhältliches Polarisationsfilter HN 7.

Die Intensität des gefilterten Strahls wird durch einen Detektor 20 gemessen, welcher vorzugsweise ein handelsüblicher Fotomultiplier ist. Der Fotomultiplier wird so eingestellt, daß er Licht aus einem Kegel um die y-Achse sammelt, dessen Lichtsammelwinkel ΔΦ im Bereich zwischen 3° bis 13° liegen kann, wie nachstehend noch genauer erläutert wird. Der Kegel des vom Detektor gesammelten Lichts kann durch eine (nicht dargestellte) Blende eingestellt werden, welche vor der Linse 42 angeordnet ist. Der von dem Detektor gemessene Spannungspegel ist Eingangsgröße für den Analysator 14, dessen Betriebsweise im Teil B beschrieben ist.

Die Intensität des Strahls 50, welcher aus totalem ortho­ gonalen Streulicht besteht, wird durch einen Detektor 22 gemessen, welcher vorzugsweise ein Fotomultiplier ist wie voranstehend beschrieben. Der Kegel des vom Detektor 22 gemessenen Lichts kann durch eine vor Linse 42 ange­ ordnete Blende eingestellt werden, wie oben angegeben. Das Spannungspegelsignal, welches von dem Detektor festge­ stellt wird, wird an den Analysator 14 gegeben. Es ist ersichtlich, daß andere Fotodetektoren, beispielsweise Fotodiodendetektoren, für einen oder beide Detektoren 20, 22 Verwendung finden können, falls die Intensität der orthogonalen Streulichtstrahlen ausreichend ist.

Das in der Figur dargestellte Zytometer ist ebenfalls zur Messung der Intensität des totalen Vorwärtsstreulichts ausgebildet, also des in einen Winkel innerhalb etwa 25° der Achse des einfallenden Lichts gestreute Licht, vorzugsweise innerhalb eines Kegels, welcher auf der Achse des einfallenden Lichts zentriert ist. Das Vorwärts­ streulicht wird durch eine Linse 54 kollimiert. Die Inten­ sität des Strahls wird durch einen Detektor 24 gemessen, welcher vorzugsweise eine handelsübliche Fotodiode ist. Der Kegel aufgefangenen Lichts, welcher durch eine (nicht dargestellte) Blende eingestellt werden kann, welche vor der Linse 54 angeordnet ist, liegt typisch zwischen etwa 2° bis 17°. Das Ausgangssignal des Detektors 24 wird dem Analysator 14 zugeführt.

Es wird darauf hingewiesen, daß die Minimalkonfiguration für den Detektor, die zur Messung depolarisierten Streulichts erforderlich ist, aus einem einzigen Fotodetektor besteht, beispielsweise Detektor 20, und einem Polarisationsfilter, welches nur depolarisieres Streulicht durchläßt. Weiterhin wird, obwohl das dargestellte Zytometer zur Messung orthogonalen depolarisierten Streulichts ausgebildet ist, darauf hinge­ wiesen, daß der Detektor 20 an jedem Punkt auf der Halbku­ gel angeordnet sein kann, welche durch die x-z-Ebene in der Figur begrenzt wird, unter der Voraussetzung, daß der Meßwinkel eine genügende Intensitätsdiskriminierung zwischen den unterschiedlichen untersuchten Teilchenarten bietet. Beispielsweise kann der Detektor in einem Winkel zwischen etwa 90° bis 180° (zur Messung der Depolarisation von rückgestreutem Licht) angeordnet werden, in der darge­ stellten orthogonalen Position, oder am Ort des Detektors 24 (zur Messung der Depolarisation vorwärts gestreuten Lichts).

Eine oder mehrere zusätzliche Detektoren, beispielsweise die Detektoren 22 und 24, stellen zusätzliche Merkmals­ information zur Verfügung, welche erforderlich sein kann, um eine auf der Grundlage unterschiedlicher Intensitäts­ verteilungen depolarisierten Streulichts basierende Diskrimi­ nierung unterschiedlicher Teilchenarten durchzuführen, wie nachstehend in Teil B erläutert wird. Wie bereits erwähnt geben die Detektoren 22 und 24 in der Ausführungsform der Erfindung, wie sie in der Figur dargestellt ist, Informationen über totales Streulicht in orthogonaler beziehungsweise Vorwärtsrichtung. Andere optische Detektoren, zusätzlich zu den oder an Stelle der Detektoren 22, 24, können Informationen über optische Parameter bezüglich (a) der Intensität depolarisierten Streulichts in einem zweiten Streuwinkel, (b) der Intensität depolarisierten oder totalen Streulichts in einem unterschiedlichen Kegelwinkel aufgefangenen Lichts, (c) Lichtabsorption, (d) Fluoreszenz­ emission, und (e) ORD- und CD-Parameter geben. Das Zytometer kann ebenfalls mit nichtoptischen Zellendetektoren aus­ gerüstet sein, beispielsweise Coulter-Effekt-Detektoren, zur Messung des Zellenvolumens über die Widerstands- oder Kapazitätscharakteristik der Teilchen in der Flußkammer.

B. Analysator

Der Analysator in dem Gerät zeichnet Informationen bezüglich der Signalantwort des Detektors oder mehrerer Detektoren auf und verarbeitet diese, um jedes Teilchen in der Suspension bezüglich des Teilchentyps zu analysieren. Im wesentlichen wird jeder zu untersuchende Teilchentyp zunächst bezüglich seines Wertebereichs in jeder Dimension charakterisiert, in einem ein- oder mehrdimensionalen Merkmalsraum. Zumindest eine Dimension in dem Merkmalsraum ist der Bereich von Intensitätswerten depolarisierten Streulichts, in einem ausgewählten Streuwinkel, welches von jedem der zu unter­ suchenden Teilchenarten erzeugt wird.

Im einfachsten Fall können die unterschiedlichen Teilchen in der Suspension allein auf der Grundlage der Depolari­ sationsstreuintensität unterschieden werden. Dieser Fall ist in Fig. 2 dargestellt, welche den Bereich der Intensität I_d depolarisierten Streulichts zeigt, welches in einem ausgewählten Winkel für Teilchen A und B in einer Teilchen­ suspension gemessen wurde. Die unterschiedlichen Depolarisations­ intensitäten der beiden Teilchen sind mit unterschiedlichen Depolarisationsstrukturen in den beiden Teilchen verbunden, welches zu unterschiedlichen Graden anisotroper Streuung der Teilchen führt, wie nachstehend noch genauer erläutert wird.

Jedes Teilchen hat, wie dargestellt ist, einen Intensitäts­ verteilungsbereich entlang der I_d-Achse, welcher charakteris­ tisch für jede Teilchenart ist, und im wesentlichen nicht mit der Intensitätsverteilung einer anderen Teilchenart überlappt.

In zahlreichen Fällen kann die Teilchenanalyse eine oder mehrere zusätzliche optische oder nichtoptische Antwortmessungen erfordern, um die Verteilung der Zellen in einem Multipa­ rameter-Merkmalsraum in getrennte, nicht überlappende Bereiche zu separieren. Ein Beispiel einer Teilchendiskrimi­ nierung, welche auf einem zweidimensionalen Merkmals­ raum (2-Parameter-Dichteabbildung) beruht, ist in Fig. 3 dargestellt. Hier überlappen die Depolarisationsintensitäts­ verteilungen der unterschiedlichen Arten A und B von Teilchen in gewissem Maße, wie dargestellt, auf der I_d-Achse, so daß Teilchen nicht eindeutig in den einen oder anderen Verteilungsbereich auf der Grundlage nur dieses Parameters abgebildet werden können. Die Überlappung wird "aufgelöst", wenn die Teilchen in Bereiche abgebildet werden, welche in einer Dimension durch Depolarisationsstreuintensität (I_d) und in der zweiten Dimension durch totale Streuin­ tensität (I_t) definiert sind, was zu zwei getrennten, nicht überlappenden Bereichen führt. Es ist zu beachten, daß die Teilchen nicht eindeutig auf der Grundlage totaler Streuintensität allein unterschieden werden können, da dieser Parameter eine beträchtliche Überlappung zwischen diesen beiden Teilchenarten gibt.

Allgemeiner gesprochen definiert der zweidimensionale Merkmalsraum eine Reihe von Flächenelementen, die parallel zur I_d-Achse verlaufen, beispielsweise Element 56, die durch ein Inkrement in totaler Streuintensität definiert sind. Innerhalb jedes derartigen Elements, welches hier auch als Diskriminierungsraum bezeichnet wird, können die zwei Teilchen auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Depolarisationsstreuintensitäten unterschieden werden. Dies bedeutet, daß innerhalb jedes Elements oder Diskrimi­ nierungsraums die Teilchen der Suspension eine Depolari­ sationsstreuintensität erzeugen, welche charakteristisch für eine der Teilchenarten ist und nicht mit der Verteilung eines Teilchens oder mehrerer Teilchen in der Suspension überlappt.

Man kann sich überlegen, daß der zur Definition eines geeigneten Merkmalsraums verwendete zweite Parameter so beschaffen sein muß, daß er die Abbildungen der zwei oder mehr Teilchenarten in unterschiedliche, nicht überlappende Bereiche des Merkmalsraums separiert. In dem vorliegenden Beispiel stellt die totale Lichtstreuung in denselben Winkel einen wirksamen zweiten Parameter dar, da für jede Teilchenart Teilchen mit einer höheren depolarisierten Streuintensität eine höhere totale Streuintensität haben. Für andere Teilchen kann es jedoch gewünscht oder notwendig sein, die "Auflösung" der überlappenden I_d-Intensitätsver­ teilungen mit anderen optischen oder nichtoptischen Para­ metern als der totalen Streuung in denselben Winkel zu bewerkstelligen.

Die Ausweitung des Teilchendiskriminierungsverfahrens auf drei Dimensionen ist in Fig. 4 dargestellt. Die unterschiedlichen Teilchen A und B sind hier durch ihre Abbildung in eine von zwei unterschiedlichen Volumenbereichen charakterisiert, welche durch die depolarisierte Streuinten­ sität (I_d) in einer Dimension, die totale Lichtstreuung (I_t) in einer zweiten Dimension und Lichtabsorption (A₀) in einer dritten Dimension der Teilchen definiert sind. Analog zu dem in Fig. 3 beschriebenen zweidimensionalen Fall definiert der dreidimensionale Merkmalsraum eine Reihe von Volumenelementen parallel zur I_d-Achse, beispiels­ weise Element 58, die durch Inkremente in der totalen Streuintensität und Absorption definiert sind. Innerhalb jedes derartigen Elements (dem Diskriminierungsraum) können die beiden Teilchen auf der Grundlage ihrer unter­ schiedlichen Depolarisationsstreuintensitäten unterschieden werden. Dies bedeutet, daß innerhalb jedes Elements die Suspensionsteilchen eine Depolarisationsstreuintensität erzeugen, welche charakteristisch für eine der Teilchenarten ist und nicht mit der Verteilung des anderen Teilchens überlappt.

Fig. 5 stellt ein Flußdiagramm eines vom Analysator 14 ausgeführten Algorithmus zur Analyse zweier Teilchen A und B auf der Grundlage ihrer Verteilungen in dem I_d/I_t/A₀- Merkmalsraum dar, der in Fig. 4 dargestellt ist. Es wird angenommen, daß die Verteilungsbereiche der drei Parameter vorher für jedes Teilchen festgelegt wurden, und daß diese Information in einem Speicher des Analysators in Form eines Feldes von Diskriminierungsraumelementen abgelegt ist, von denen jedes durch eine inkrementale Fläche ΔI_t × ΔA₀ und die zugehörigen Intensitätsverteilungen definiert sind, die charakteristisch für depolarisiertes Streulicht der verschiedenen Teilchen innerhalb dieses Elements sind.

Während jedes Teilchen durch die eine Sensorzone oder mehrere Sensorzonen in der Flußkammer gelangt, werden seine optischen Streu-/Absorptionsmerkmale durch die zugehörigen optischen oder nichtoptischen Detektoren in dem Zytometer gemessen, welche Antwortdaten in Form von Spannungssignalen an den Analysator geben. Der Analysa­ tor enthält einen (nicht dargestellten) Analog/Digital­ wandler (ADC) , der die Eingangsspannungssignale in digitale Werte für I_d, I_t und A₀ umwandelt. Die Werte für I_t und A₀ bilden ein geordnetes Paar, welches dann mit einem der Volumenelemente des Diskriminierungsraums identi­ fiziert wird, nämlich dadurch, daß es innerhalb der Fläche ΔI_t × ΔA₀ dieses Elements liegt. Ist einmal das zugehörige Volumenelement gefunden worden, so wird der gemessene Wert von I_d verglichen mit der Verteilung der I_d-Werte für das Teilchen A in diesem Volumenelement. Liegt der gemessene Wert innerhalb des Bereichs von I_d für das Teilchen A, so wird das Teilchen als ein A-Teilchen klassifi­ ziert und diese Information wird gespeichert und/oder an einen Zellensortierer in dem Zytometer gegeben, um Teilchen A und B zu trennen. Zusätzlich können die quantifi­ zierten Daten zeichnerisch in einer Dreiachsendarstellung wie in Fig. 4 wiedergegeben werden, um die Dichte der Zellen in dem Merkmalsraum darzustellen, und die Zellen können gezählt werden.

Liegt der Wert I_d des Teilchens nicht in dem A-Teilchenbe­ reich, in dem zugehörigen Diskriminierungsraum, sondern innerhalb des B-Bereichs, so wird das Teilchen derartig klassifiziert und diese Information wird ebenfalls gespeichert, an einen Sortierer gegeben und/oder dargestellt. Auf ähnliche Weise kann das Teilchen so klassifiziert werden, daß es weder zu A noch zu B gehört, und so analysiert werden (welches ein Speichern oder eine zeichnerische Darstellung der Teilchenart und/oder ein Zählen oder Sortieren der Teilchen umfassen kann). Nach der Teilchenana­ lyse wird der Analysator in einen Zustand zurückgeführt, um Parameterdaten von dem nächsten Teilchen zu verarbeiten, welches in der Sensorzone gesehen wird. Eine Änderung des Algorithmus zum Betrieb in einem Merkmalsraum mit von drei verschiedenen Dimensionen kann durchgeführt werden.

Der Analysator umfaßt den voranstehend genannten Analog/Di­ gitalwandler, einen Speicher zur Speicherung von Daten, und einen Mikroprozessor zum Auffinden eines zugehörigen Volumenelements des Diskriminierungsraums, basierend auf gemessenen Eingangswerten für I_t und A, sowie zur Klassifi­ zierung der Teilchenart, basierend auf den I_d-Werten inner­ halb des identifizierten Volumenelements. Der Mikroprozessor kann üblich aufgebaut sein und wird mit üblichen Programmier­ schritten zur Ausführung der voranstehend genannten Schritte zur Datenspeicherung und zur Klassifikation programmiert.

II. Betriebsweise

Dieser Abschnitt beschreibt die Theorie depolarisierter Lichtstreuung, wie sie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird zur Teilchendiskriminierung (Teil A) sowie exemplarische Zellendiskriminierungsverfahren und Ergebnisse (Teil B).

A. Theoretische Überlegungen

Fig. 6 erläutert die in Fig. 1 dargestellte optische Anordnung zur orthogonalen Lichtstreuung. Ein einfallender Laserstrahl bewegt sich entlang der z-Achse und ist linear polarisiert mit einem einfallenden elektrischen Feld E entlang der x-Achse. An dem Ursprung O unseres Koordi­ natensystems trifft der Laserstrahl sich entlang der x-Achse bewegende Teilchen des Flußzytometers. Die Richtung des gestreuten Lichts wird mit Polarkoordinaten r, Θ und Φ beschrieben. Die Amplituden des gestreuten Lichts, welches in der Θ und Φ-Richtung polarisiert ist, können jetzt beschrieben werden durch (van de Hulst):

E_Φ = (S₄ cosΦ-S₁sinΦ)f(E_Φ) (1)

E_Θ = (S₂ cosΦ-S₃sinΦ)f(E_Θ) (2)

wobei f ein komplexer Ausdruck für eine Kugelwelle ist, umgekehrt proportional zu r, der Entfernung zwischen dem Streuer und dem Detektor, und S₁, S₂, S₃ und S₄ die sogenannten Amplitudenfunktionen (van de Hulst) darstellen, welche von Φ, Θ und der Geometrie und dem physikalischen Aufbau des Streuers abhängen. Die meßbaren Lichtstreuin­ tensitäten I_Φ und I_Θ sind mit diesen Feldern verbunden über:

I_Φ = |E_Φ|² (3)

I_Θ = |E_Θ|² (4)

Die unter Verwendung idealer Polarisatoren, welche nur die x-polarisierten oder die z-polarisierten Felder durchlassen, gemessenen Lichtintensitäten sind als I₁ (parallel) und I_r (senkrecht) bezeichnet. I_r wird als depolarisierte Lichtstreuintensität bezeichnet und das Depolarisations­ verhältnis ist hier definiert als:

D = I_r/(I_r+I₁) (5)

Für das in die y-z-Ebene, das heißt orthogonal bezüglich der Polarisationsrichtung des einfallenden Lichts, Φ = 90°, gestreute Licht können I₁ und I_r in folgender Form geschrieben werden:

I₁ = |S₁ f (E_Φ)|²
I_r = |S₃ f (E_Θ)|² (6)

Während daher I₁ durch S₁ bestimmt ist, gibt die Messung der depolarisierten Lichtstreuintensität bei dieser Geo­ metrie Information über den Term S₃. Die Bedeutung dieses Terms wird kurz erläutert.

Für homogene Kugeln, kugelförmige Schalen und so weiter ist der Term S₂ gleich Null (von de Hulst) , S₃ wird bedeutsam für optisch anisotrope Teilchen (infolge ihrer Form und/oder Zusammensetzung) und für Teilchen, die Strukturen aufweisen, so daß Mehrfachstreuung bedeutsam wird. Ein einfaches, aber eindruckvolles Beispiel für das Letztere ist in Fig. 7 dargestellt. Hier enthält das beleuchtete Teilchen (Zelle) zwei intrazelluläre Kugeln, die auf der x-Achse angeordnet sind. Ein bestimmter einfallender Strahl, welcher sich entlang der z-Achse bewegt, wird entlang der x-Achse durch die erste Kugel und entlang der y-Achse durch die zweite Kugel reflektiert. Unter Anwendung der Reflexionsgesetze findet man, daß die Polarisation dieses Strahls sich so ändert, daß sie erst entlang der x-Achse, dann aber entlang der z-Achse verläuft. Dies zeigt, wie mehrfache Reflexionen zur Depolarisation führen und so zu dem Term S₃ bei tragen. Auf ähnliche Weise kann gezeigt werden, daß Mehrfachstreuung infolge von Beugung und Brechung ebenfalls zur Depolarisation führen kann. Mehrfach körniges oder anderes festes Material, welches Mehrfach­ streuung innerhalb eines Teilchens zur Folge haben kann, und andere Teilchenstrukturen, beispielsweise nicht kugelför­ mige Gestalt, welche zu anisotroper Lichtstreuung führen kann, werden zusammengenommen in diesem Zusammenhang als Depolarisationsstruktur bezeichnet.

Obwohl die Behandlung der voranstehenden Amplitudengleichungen in solchen Fällen einfacher ist, in denen ΔΦ gleich 0° oder 90° ist (Vorwärtsstreuung beziehungsweise orthogonale Streuung), wird aus Fig. 7 deutlich, daß Teilchendepola­ risationsstrukturen innerhalb einer Zelle depolarisiertes Streulicht in praktisch sämtlichen Streuwinkeln erzeugen. Beispielsweise könnte ein drittes intrazelluläres Teilchen in der in Fig. 7 dargestellten Zelle das sich entlang der y-Achse bewegende depolarisierte Licht weiter in Vorwärts- oder Rückwärtsstreurichtung reflektieren.

Typischerweise ist der optimale Meßwinkel für depolarisiertes Streulicht der Winkel, welcher die beste Diskriminierung zwischen den Teilchen in dem eindimensionalen (I_d) Merkmals­ feld gibt. Dies wiederum hängt von den relativen Amplituden­ funktionen der unterschiedlichen Teilchenarten ab. Unter diesen sind die wichtigsten S₃, der bei orthogonalen Streuwinkeln dominiert, und S₄, der bei Vorwärtsstreuung dominiert. Die relativen Beiträge dieser beiden Terme können auf einfache Weise durch Messungen der depolarisierten Lichtstreuung der unterschiedlichen Teilchen in Vorwärts­ richtung und orthogonal festgestellt werden.

Die auf der unterschiedlichen Depolarisationsstruktur basierende Diskriminierung zwischen Teilchen kann weiter durch Verringerung des Kegelwinkels ΔΦ vergrößert werden, bei welchem die Lichtintensität durch den Fotodetektor gemessen wird. Wie voranstehend angegeben sammelt ein optischer Detektor, beispielsweise ein Fotomultiplier, Licht aus einem Kegel um die Achse bei dem ausgewählten Meßwinkel. Im Falle orthogonaler depolarisierter Licht­ streuung bedeutet dies, daß Depolarisationseffekte nicht nur durch S₃ bewirkt werden (den einzigen Term bei 90°) sondern auch durch die anderen Amplitudenfunktionen S₁, S₂ und S₄. Diese zusätzliche Depolarisation rührt von der Geometrie der Meßanordnung her und wird als Kreuz de­ polarisation bezeichnet. Dieser Begriff steht in enger Beziehung zu dem Term "Apertur-Polarisation", welcher zur Beschreibung von Fluoreszenzpolarisationsexperimenten verwendet wird.

Der Beitrag der Kreuzpolarisation zu den bei 90° gemessenen Depolarisationseffekten kann durch Untersuchung der Abhängig­ keit des Depolarisationsverhältnisses vom Kegelwinkel Φ bestimmt werden. Dies läßt sich durch Anordnen einer rechtwinkligen Blende vor der Sammellinse (Linse 42 in Fig. 1) durchführen, wodurch die Winkel für das gesammelte Licht zwischen Φ = 90 ± ΔΘ begrenzt werden. Bei einer zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführten Untersuchung wurde die gemessene Depolarisationsintensität einer Vielzahl unterschiedlicher Zellen- und Teilchenarten als eine Funktion des Akzeptanzwinkels bestimmt. Unter bezug auf Fig. 8 waren die untersuchten Teilchen: Neutrophile (geschlossene Kreise), Eosinophile (Kreuze), Monozyten (offene Quadrate), Lymphozyten (offene Kreise), und Mikro­ kugeln aus Polystyrol mit einem mittleren Durchmesser von etwa 1,16 µm (offene Dreiecke). Die Intensität orthogonalen depolarisierten Streulichts wurde bei Kegelwinkeln ΔΦ von 2,5° und 14,5° gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Man erkennt, daß Kreuzpolarisationseffekte, wie sie durch die Abhängigkeit der Depolarisation vom Akzeptanzwinkel bestimmt werden, im wesentlichen in solchen Zellen fehlen, die eine reiche interne Körnchenstruktur aufweisen (eosinophile und neutrophile Granulozyten), sehr ausgeprägt bei kugel­ förmigen Teilchen (Mikrokugeln) sind, die vermutlich Licht isotrop streuen (S₃=S₄=0), und mittlere Werte für Monozyten und Lymphozyten annehmen, welche keine ausge­ prägte innere Körnchenstruktur aufweisen.

Die Abhängigkeit depolarisierter Streuintensität vom Kegelwinkel wurde ebenfalls bei mittleren Kegelwinkeln untersucht, und die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt. Die Kurven in der Figur sind sämtlich auf einen gemeinsamen Wert bei 14,5° normalisiert. Die gestrichelte Linie in der Figur ist die theoretische Abhängigkeit zweiter Ordnung, berechnet für ideale Kugeln. Die Ergebnisse stützen den allgemeinen voranstehend angegebenen Schluß, daß Zellen mit stark polarisierenden (beispielsweise körnchenartigen) Strukturen geringe Kreuzpolarisationseffekte zeigen, wogegen solche mit nur mäßigen Depolarisationsstrukturen Kreuzpolarisationseffekten unterliegen. Die Ergebnisse deuten an, daß Unterschiede in der Identitätsverteilung zwischen höher und mittelstark depolarisierenden Teilchen vergrößert werden können, indem orthogonale Intensitäts­ messungen bei einem geringen Kegelwinkel durchgeführt werden.

Falls man findet, daß die unterschiedlichen Teilchen in einer Suspension überlappende Verteilungsbereiche der depolarisierten Intensität sowohl bei orthogonalen als auch Lichtstreuwinkeln in Vorwärtsrichtung aufweisen, ebenso wie bei niedrigen Kegelwinkeln, werden ein oder mehrere zusätzliche Teilchenparameter zur Diskriminierung der Teilchen erforderlich. Die einfachsten Parameter sind Lichtstreumessungen, da diese keine zusätzlichen Lichtquellen und/oder Änderungen der Flußzelle erfordern. Eine allgemeine Art von Lichtstreumessungen ist depolari­ sierte Lichtstreuung bei einem zweiten Winkel. Dies kann sich als nützlich erweisen, wenn beispielsweise die zu unterscheidenden Teilchen unterschiedliche Werte für S₃ und S₄ aufweisen, so daß die Kombination von depolarisierten Streumessungen orthogonal und in Vorwärtsrichtung unter­ schiedliche Teilchenbereiche ergibt. Eine zweite Art von Streumessungen ist die des totalen Streulichts, welches entweder im selben Winkel wie das depolarisierte Streulicht gemessen wird oder in einem unterschiedlichen Winkel. Wie nachstehend noch eingehender ausgeführt wird, ergibt diese Methode eine gute Trennung der Merkmalsraumbereiche unterschiedlicher Arten von Granulozyten. Schließlich kann depolarisiertes Streulicht noch in unterschiedlichen Kegelwinkeln gesammelt werden.

B. Anwendungen

Aus dem Voranstehenden wird deutlich, daß das vorliegende Verfahren bei jeder Flußzytometeranwendung genutzt werden kann, bei welcher die zu unterscheidenden Teilchen unter­ schiedliche Depolarisationsstrukturen aufweisen. Eine wichtige Anwendung liegt in der Unterscheidung unterschied­ licher Arten von Blutzellen, die in einer Probe von Blutzellen oder einer zellularen Fraktion vorliegen. Die zu unter­ scheidenden Zellenarten können Fälle umfassen wie die Unterscheidung von Granulozyten von anderen Zellarten, Bestimmung unterschiedlicher Arten von Granulozyten, Unterscheidung von Lymphozyten gegenüber Monozyten, sowie Unterklassen bestimmter weißer Zellen.

Als Beispiel zur Diskriminierung von Zellen im Falle stark depolarisierender Zellen wurde das Verfahren zur Unterscheidung granulozytischer Eosinophile und Neutro­ phile verwendet. Menschliches Blut wurde durch Punktion der Venen gesunder Personen erhalten. Heparin wurde als Anticoagulationsmittel verwendet. Gereinigte Granulozyten wurden durch Dichtetrennung gemäß veröffentlichter Verfahren (Terstappen, 1985) erhalten. Zellensuspensionen wurden auf Konzentrationen von 1 × 10⁶/ml in phospatgepufferter Salzlösung (PBS) eingestellt, die 0,005% Natriumazid und 1% Rinderserumalbumin (BSA) aufwies. Die Messungen wurden am selben Tag durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

Flußzytometrische Experimente wurden mit dem voranstehend beschriebenen Flußzytometer ausgeführt, bei welchem der beleuchtende Laserstrahl auf 488 nm eingestellt wurde und die Streuung in einem quadratischen Flußkanal mit Abmessungen von 250 µm × 250 µm stattfand. Orthogonale depolarisierte und totale Lichtstreuintensitäten wurden mit der in Fig. 1 dargestellten Strahlteileranordnung gemessen. Die Ergebnisse sind als zweiparametrige Dichte­ abbildung aus Fig. 9A ersichtlich. Man erkennt, daß das Verfahren beide Zellenarten in unterschiedliche und nicht überlappende Merkmalsbereiche abbildet, wie in Fig. 3 beschrieben wurde.

Da die Intensität depolarisierten orthogonalen Streulichts nicht hoch ist, wurde die Möglichkeit untersucht, daß das gemessene depolarisierte Licht durch elastische Licht­ streuung und nicht durch Autofluoreszenz hervorgerufen wurde. Hierzu wurde ein 500 nm kurzwelliger Durchlaßfilter in die Nachweisoptik eingesetzt, die Ergebnisse wurden hierdurch nicht beeinflußt. Zusätzlich wurde die Beleuchtungs­ wellenlänge des Argonionenlasers von 488 auf 509 und 514 nm geändert und ein Helium-Neon-Laser mit 633 nm verwendet. In sämtlichen Fällen waren die erhaltenen Ergebnisse gleich.

Das Verfahren wurde ebenfalls zur Sortierung von Zellen verwendet, um die beiden Bevölkerungen von Granulozyten zu trennen. Hier wurde das Flußzytometer mit einem konventio­ nellen Sortierer ausgerüstet und der Analysator so ausgelegt, daß er auf der Grundlage schneller Zellendiskriminierung Signale an den Sortierer abgab. Die sortierten Unterpo­ pulationen von Granulozyten wurden lichtmikroskopisch untersucht, nachdem sie gemäß May-Gruenwald angefärbt worden waren. Die eine relativ hohe Depolarisation orthogonaler Lichtstreuung aufweisenden Zellen wurde identifiziert als eosinophile Granulozyten (99% Reinheit) während die andere Population aus neutrophilen Granulozyten bestand (99% Reinheit).

Als Beispiel für Zellendiskriminierung im Falle mittelstark depolarisierender Zellen wurde das Verfahren zur Diskri­ minierung von Lymphozyten und Monozyten eingesetzt. Heparini­ siertes Blut wurde erhalten wie voranstehen beschrieben. Zubereitungen menschlicher Leukozyten wurden erhalten, indem 190 ml lysierten Puffers (8,29 g/l NH₄Cl, 0,0037 g/l Na₂ EDTA, 1,00 g/l KHCO₃) 10 ml normalen Bluts zugegeben wurden und 20 Minuten lang bei 4°C inkubiert wurden. Die lysierten Blutsuspensionen wurden dreimal in PBS gewaschen. Die Zellensuspensionen wurden auf eine Konzen­ tration von 1 × 10⁶/ml in PBS eingestellt, welches 0,005% Natriumazid und 1% Pferdeserumalbumin (BSA) enthielt. Depolarisiertes und totales Streulicht wurden wie voran­ stehend angegeben gemessen. Die Ergebnisse sind als zwei­ parametrige Dichteabbildung in Fig. 9B dargestellt. Man erkennt, daß das erfindungsgemäße Verfahren die beiden Zellenarten in unterschiedliche und nicht überlappende Merkmalsbereiche abbildet. Die Dichteabbildung zeigt ebenfalls das Vorliegen einer kleinen Unterpopulation von Lymphozyten mit relativ großer Depolarisation.

Menschliche Erythrozyten wurden ebenfalls mit demselben Verfahren untersucht und die Ergebnisse sind in Fig. 9C dargestellt. Die Zellen zeigen eine geringfügige oder überhaupt keine auf der Depolarisationsstruktur basierende Heterogenität.

Eine Anzahl anderer Zellenarten und nichtzellulärer Teilchen kann ebenfalls mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unterschieden und/oder sortiert werden. Hierzu gehören Spermazellen, welche stark anisotrope Strukturen aufweisen, Bakterien auf der Grundlage anisotroper Form, und kristalline Teilchen, beispielsweise Harnsäurekristalle, basierend auf irregulärer Kristallform. Für jede dieser Teilchenarten können optimale Bedingungen für die Messung der Depolarisation festgelegt werden wie voranstehend angegeben, und falls erforderlich können zusätzliche optische und/oder nichtoptische Parameter ausgewählt werden, entsprechend dem bekannten Verhalten der Teilchenarten gegenüber verschiedenen optischen und/oder nichtoptischen Antwortcharakteristiken der Teilchen.

Aus dem Voranstehenden wird deutlich, wie die verschiedenen Ziele und Vorteile der Erfindung erreicht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erweitert die Arten von Teilchen, die unterschieden und/oder voneinander sortiert werden können, auf der Grundlage der unterschiedlichen Depolari­ sationsstruktur der Teilchen. In zahlreichen Fällen stellt die depolarisierte orthogonale Lichtstreuung einen äußerst kostengünstigen Parameter für bestehende Flußzytometer zur Verfügung, und diese einfache Zufügung gibt wertvolle Information, die nicht durch andere Maßnahmen erhältlich ist.

Als ein Beispiel ist die Fähigkeit zur Unterscheidung eosinophiler Granulozyten von neutrophilen Granulozyten von praktischer und theoretischer Bedeutung. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann nunmehr ein einfaches Flußzyto­ meter mit einem Laser niedriger Leistung zur Verfügung gestellt werden, welches weiße Blutkörperchen mit nicht angefärbten Zellen unterscheiden kann. Bislang mußten komplexe und instabile Färbetechniken angewendet oder die schwache Autofluoreszenz mit einem teuren Argonionenlaser (Weil) gemessen werden.

Claims (19)

1. Verfahren zur Analyse zumindest zweier unterschiedlicher Teilchenarten auf der Grundlage unterschiedlicher Depolarisa­ tionsstrukturcharakteristik der verschiedenen Teilchenarten, mit folgenden Schritten:

• - Leiten einer Teilchensuspension, die unterschiedliche Teil­ chenarten enthält, durch eine optische Sensorzone (36),
• - Beleuchten der Teilchen in der Zone mit einem einfallenden Strahl (26) linear polarisierten Lichts,
• - Erzeugen, durch die Beleuchtung, depolarisierten Streulichts von jedem Teilchen, dessen Intensität in einem auswählbaren Streuwinkel von der Depolarisationsstruktur des Teilchens ab­ hängt und innerhalb eines Intensitätsverteilungsbereiches in einem geeigneten Diskriminierungsraum liegt, welcher a) charak­ teristisch für eine der Teilchenarten ist und b) im wesentlichen nicht mit der Intensitätsverteilung der anderen Teilchenarten in der Suspension überlappt,
• - Messung der Intensität des depolarisierten Streulichts (44) von jedem Teilchen im ausgewählten Winkel, und
• - Analysierung verschiedener Teilchenarten in der Suspension, basierend auf der Intensität des gemessenen depolarisierten Streulichts in dem Diskriminierungsraum.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtung mit einem Strahl (26) kohärenten, linear po­ larisierten Lichts erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der ausgewählte Winkel orthogonal zum einfallenden Licht­ stahl (26) ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Diskriminierungsraum ein eindimensionaler Raum ist, wel­ cher durch die Intensität des depolarisierten Lichts festgelegt ist, welches durch die beleuchteten Teilchen gestreut und in dem ausgewählten Winkel gemessen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Diskriminierungsraum in einem zumindest zweidimensiona­ len Raum liegt, welcher in einer Dimension durch die Intensität des von den beleuchteten Teilchen gestreuten depolarisierten Lichts, gemessen in dem ausgewählten Winkel, und in einer zwei­ ten Dimension durch die Reaktion der Teilchen auf eine zweite Lichtmessung bestimmt ist, deren mittlere Antwortwerte sich für die unterschiedlichen Teilchenarten unterscheiden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Dimension durch die Intensität in einem weiteren ausgewählten Winkel gemessenen polarisierten Streulichts be­ stimmt ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Unterscheidung von Eosinophilen und Neutrophilen für den ausgewählten Winkel ein etwa rechter Winkel bezüglich der Rich­ tung des Lichtstrahls (26) gewählt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß für den weiteren ausgewählten Winkel ebenfalls ein etwa rechter Winkel bezüglich der Richtung des Lichtstrahls (26) ge­ wählt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Diskriminierungsraum in einem dreidimensionalen Raum liegt, welcher in einer Dimension durch die Intensität des von den beleuchteten Teilchen gestreuten depolarisierten Lichts be­ stimmt ist und in einer zweiten und in einer dritten Dimension durch die Intensität des von den beleuchteten Teilchen gestreu­ ten polarisierten Lichts, in Richtungen, welche etwa orthogonal beziehungsweise parallel zum einfallenden Lichtstrahl (26) lie­ gen.

10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Dimension durch die infolge wellenlängenspezifi­ scher Lichtabsorption beeinflußte Intensität von Licht in Vor­ wärtsrichtung gegeben ist, wobei die unterschiedlichen Teilchen verschiedene wellenlängenspezifische Extinktionskoeffizienten aufleisen.

11. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Dimension durch die in Vorwärtsrichtung gemessene Fluoreszenzpolarisation der Teilchen gegeben ist, wobei die Teilchen unterschiedliche Fluoreszenzpolarisationseigenschaften aufweisen.

12. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Dimension durch die in einem ausgewählten Emis­ sionswellenlängenbereich gemessene Emissionsintensität festge­ legt ist, wobei die Teilchen unterschiedliche Fluoreszenzeigen­ schaften in Gegenwart eines ausgewählten Fluoreszenzfarbstoffs aufweisen.

13. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Unterscheidung von Teilchen mit unterschiedlicher eige­ ner Depolarisation das depolarisierte Streulicht in einem rela­ tiv großen Akzeptanzwinkel um den ausgewählten Winkel herum ge­ messen wird und die zweite Dimension durch die Intensität depo­ larisierten Streulichts bestimmt ist, welche in einem relativ kleinen Akzeptanzwinkel gemessen wird.

14. Einrichtung (10) zum Analysieren zumindest zweier unter­ schiedlicher Teilchenarten auf der Grundlage unterschiedlicher Depolarisationsstrukturen, welche charakteristisch für die ver­ schiedenen Teilchenarten sind, mit

• - einer eine optische Sensorzone (36) festlegenden Vorrichtung,
• - einer Vorrichtung (16) zum Durchleiten einer Suspension der Teilchen durch die Zone (36),
• - einer Lichtquelle (28) zur Beleuchtung der Teilchen in der Zo­ ne mit einem einfallenden Strahl (26) linear polarisierten Lichts, um von jedem Teilchen depolarisiertes Streulicht zu er­ zeugen, dessen Intensität in einem ausgewählten Streuwinkel von der Depolarisationsstruktur des Teilchen abhängt und innerhalb eines Intensitätsverteilungsbereichs liegt, welcher in einem ge­ eigneten Diskriminierungsraum a) charakteristisch für eine der Teilchenarten ist und b) im wesentlichen nicht mit der Intensi­ tätsverteilung der anderen Teilchenarten in der Suspension über­ lappt,
• - einem Detektor (20), der zur Messung der Intensität des depo­ larisierten Streulichts von jedem Teilchen in dem ausgewählten Winkel ausgebildet ist, und
• - einer Analyseeinrichtung (14), mit der die unterschiedlichen Teilchenarten bestimmbar sind auf der Grundlage der gemessenen depolarisierten Lichtstreuintensität in dem Diskriminierungs­ raum.

15. Einrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein zweiter Detektor (22) vorgesehen ist, der für eine zwei­ te Lichtmessung ausgebildet ist, deren mittlere Antwortwerte sich für die unterschiedlichen Teilchenarten unterscheiden, und daß die Analyseeinrichtung (14) zur Analyse anhand eines Diskri­ minierungsraumes ausgebildet ist, der in einem zumindest zweidi­ mensionalen Raum liegt, welcher in einer Dimension durch die In­ tensität des von den beleuchteten Teilchen gestreuten depolari­ sierten Streulichts bestimmt ist, welches in dem ausgewählten Winkel gemessen wird, und in einer zweiten Dimension durch die Antwort der Teilchen auf die zweite Lichtmessung bestimmt ist.

16. Einrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Detektor (22) zur Messung polarisierten Streu­ lichts in einem Streuwinkel, welcher mit dem ausgewählten Winkel übereinstimmt, ausgebildet ist.

17. Einrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß zur Unterscheidung von Eosinophilen und Neutrophilen der De­ tektor (20) zur Messung depolarisierten Streulichts zum Empfang orthogonalen Streulichts angeordnet ist.

18. Einrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Detektor (22) ebenfalls zum Empfang orthogonalen Streulichts angeordnet ist.

19. Einrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine dritte Meßeinrichtung (24) vorgesehen ist, die zur Mes­ sung in Vorwärtsrichtung gestreuten polarisierten Lichts ausge­ bildet ist, und daß die Analyseeinrichtung (14) zur Analyse an­ hand eines Diskriminierungsraumes ausgebildet ist, der innerhalb eines dreidimensionalen Raumes liegt, welcher in einer Dimension durch die Intensität des von den beleuchteten Teilchen gestreu­ ten, depolarisierten Streulichts bestimmt ist und in einer zwei­ ten beziehungsweise dritten Dimension durch die Intensität des von den beleuchteten Teilchen gestreuten polarisierten Lichts in einer Richtung, welche etwa orthogonal beziehungsweise parallel zum einfallenden Lichtstrahl verläuft.