DE3717913A1 - Trockenes analytisches element fuer die enzymanalyse - Google Patents

Trockenes analytisches element fuer die enzymanalyse

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Description

Die Erfindung betrifft eine trockenes analytisches Element, welches für die Bestimmung bzw. Analyse der enzymatischen Aktivität in einer Flüssigkeit geeignet ist.
Es sind trockene analytische Elemente, insbesondere integrale mehrschichtige trockene analytische Elemente, bekannt und werden beispielsweise in der US-Patentschrift 39 92 158 und in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 1 643/81 beschrieben (der Ausdruck "OPI", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bedeutet "nichtgeprüfte veröffentlichte Anmeldung"). In Analytical Chemistry, Bd. 55, Nr. 4, 498A-514A (1983) wird beschrieben, daß ein integrales mehrschichtiges trockenes analytisches Element für die Analyse von Enzymen in Serum verwendet werden kann.
Das integrale mehrschichtige trockene analytische Element enthält im allgemeinen eine poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht mit einer Flüssigkeitsmeßfunktion als alleroberste Schicht. Wird eine Flüssigkeit in einer Menge V in der flüssigkeitsausbreitenden Schicht entwickelt, ist die entwickelte Fläche a proportional zu V (V = ka). Da die Menge an Flüssigkeit per Einheitsfläche durch die Proportionalitätskonstante k zwischen der Ausbreitungsfläche a und der Flüssigkeitsmenge V bestimmt wird, hängt die analytische Empfindlichkeit von dem Proportionalitätskonstante k ab. Wenn die Proportionalitätskonstante k geringer wird, wird die Menge an Flüssigkeit pro Einheitsfläche größer, so daß die enzymatische Aktivität pro Einheitsfläche höher wird und die Empfindlichkeit des analytischen Elements steigt.
Ein integrales mehrschichtiges trockenes analytisches Element, bei dem die poröse, die Flüssigkeit ausbreitende Schicht Fasern, die Wasser nicht absorbieren, enthält, wird in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 1 64 356/80 und 2 22 769/85 beschrieben. Wasser nicht absorbierende, lange Fasern, wie Polyester, Polyamide (beispielsweise Nylon) etc., halten wenig Wasser zurück, und wenn sie gewebt oder gestrickt oder gewirkt sind, ergeben sie eine einheitliche Ausbreitungsschicht und können daher in trockenen analytischen Elementen verwendet werden, bei denen ein Verfahren ausgenutzt wird, bei dem die Reaktionsgeschwindigkeit eine Rolle spielt. Jedoch besitzt eine poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht, die aus Fasern, die Wasser nicht absorbieren, besteht, eine große Proportionalitätskonstante k, so daß man keine hohe analytische Empfindlichkeit erhält.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein integrales mehrschichtiges trockenes analytisches Element für die Analyse enzymatischer Aktivitäten zur Verfügung zu stellen, wobei das Reaktionsgeschwindigkeitsverfahren ausgenutzt wird. Das trockene analytische Element soll eine hohe Empfindlichkeit und bevorzugt eine hohe Empfindlichkeit zusammen mit einer hohen Reproduzierbarkeit aufweisen.
Es wurde jetzt gefunden, daß die obige Aufgabe durch ein trockenes analytisches Element für die Enzymanalyse in einer Flüssigkeit gelöst werden kann, welches mindestens eine poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht umfaßt, die aus Fasern, welche Wasser nicht absorbieren, besteht, wobei die poröse, die Flüssigkeit ausbreitende Schicht ein Substrat für das zu analysierende Enzym und ein wasserlösliches Polymeres in einer Menge enthält, die ausreicht, die Ausbreitungsfläche um mindestens 20% zu verringern.
Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das oben beschriebene Polymere ein hydrophiles Polymeres, ausgewählt aus der Gruppe Homo- oder Copolymere, das eine Monomereneinheit der folgenden Formeln (I) oder (II) enthält, einem Copolymeren, welches diese Monomereneinheiten und eine andere copolymerisierbare Monomereneinheit enthält, und einem Cellulosederivat.
Die Formel (I) wird wie folgt dargestellt
worin R1 ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe bedeutet und R2 und R3 je ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Kohlenwasserstoffgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe bedeuten oder worin R2 und R3 zusammen einen Ring bilden.
Die Formel (II) wird wie folgt dargestellt
worin R4 die gleiche Bedeutung wie R1 besitzt und Q
worin q eine ganze Zahl von 2 bis 4 bedeutet, -NR5-CO-R6, worin R5 eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet und R6 ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, oder
bedeutet, worin Z1 eine Atomgruppierung bedeutet, welche einen Lactamring, einen Oxazolidonring oder einen Pyridonring ergibt.
In der Formel (I) enthält die durch R1 dargestellte Alkylgruppe bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome und besonders bevorzugt ist sie ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe.
Der durch R2 oder R3 dargestellte aliphatische Kohlenwasserstoffrest ist bevorzugt eine Alkyl- oder Cycloalkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Der aliphatische Kohlenwasserstoffrest kann mit einer Arylgruppe, beispielsweise einer Phenylgruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, beispielsweise einer Methoxygruppe, einem Halogenatom, beispielsweise einem Chloratom, einer Alkylamino- oder Dialkylaminogruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in dem Alkylmolekülteil davon, beispielsweise einer Dimethylaminogruppe, und durch ähnliche Gruppen substituiert sein. Wenn R2 oder R3 einen aroamtischen Kohlenwasserstoffrest bedeuten, enthält dieser bevorzugt 6 bis 7 Kohlenstoffatome. Der aromatische Kohlenwasserstoffrest kann durch eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, beispielsweise eine Methylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, beispielsweise eine Methoxygruppe, ein Halogenatom, beispielsweise ein Chloratom, eine Alkylamino- oder Dialkylaminogruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in dem Alkylmolekülteil davon, beispielsweise eine Dimethylaminogruppe, und durch ähnliche Gruppen substituiert sein. Wenn R2 oder R3 eine heterocyclische Gruppe bedeuten, kann diese beispielsweise ein 5- oder 6gliedriger Ring sein, welche mindestens ein Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatom enthält. Spezifische Beispiele von bevorzugten Gruppen für R2 oder R3 sind ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine Benzylgruppe, eine Hydroxyethylgruppe, eine Cyclohexylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Piperidinogruppe und eine Morpholinogruppe.
Die Gesamt-Kohlenstoffzahl, die in R2 und R3 vorhanden ist, beträgt bevorzugt bis zu 12 und besonders bevorzugt bis zu 6.
Das Polymere, welches die durch die Formel (I) dargestellte, sich wiederholende Einheit enthält, kann ein Homopolymeres mit der sich wiederholenden Einheit der Formel (I), ein Copolymeres, welches mindestens zwei sich wiederholende Einheiten der Formel (I) enthält, und ein Copolymeres, welches mindestens eine sich wiederholende Einheit der Formel (I) und eine andere Monomereneinheit, die sich von einer ungesättigten Verbindung, die durch Addition polymerisierbar ist, ableitet, sein.
Spezifische Beispiele für Monomere, welche die sich wiederholende Einheit der Formel (I) aufweisen, sind Acrylamid, N-Methylacrylamid, N-Ethylacrylamid, N-(n-Propyl)-acrylamid, N-Isopropylacrylamid, N-(n-Butyl)-acrylamid, N-(t-Butyl)- acrylamid, N-(n-Octyl)-acrylamid, N-(Isoamyl)-acrylamid, N-(t-Octyl)-acrylamid, N-Laurylacrylamid, N-Cyclohexylacrylamid, N-Benzylacrylamid, N-(β-Dimethylaminoethyl)- acrylamid, N-Phenylacrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-hydroxy- butylacrylamid), N,N-Dimethylmethacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, N,N-Dioctylacrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-oxobutyl)- acrylamid, N-Acryloylmorpholin, N-Methyl-N′-acryloylpiperazin, N-Ethyl-N′-acryloylpiperazin, N-Acryloylpiperidin, N-(β-Morpholinoethyl)-acrylamid, N-(3,5-Dimethylmorpholinoethyl)- acrylamid, Methacrylamid, N-Methylmethacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-(t-Butyl)-methacrylamid, N-(t-Octyl)- methacrylamid, N-Benzylmethacrylamid, N-Cyclohexylmethacrylamid, N-Phenylmethacrylamid, N,N-Dimethylmethacrylamid, N,N-Diethylmethacrylamid, N,N-Dipropylmethacrylamid, N-Methyl-N-phenylmethacrylamid, N-Methacryloyl-N′-methylpiperazin, N-Methacryloylpiperidin, 4-Methacryloyl-2,6-dimethylmorpholin, N-Methacryloyl-N′-ethylpiperazin etc.
Die durch Addition polymerisierbaren ungesättigten Verbindungen, welche mit den Monomeren, die die sich wiederholende Einheit der Formel (I) ergeben, verwendet werden können, sind Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Itaconsäure, Crotonsäure, Acrylester (beispielsweise Methylacrylat, Ethylacrylat, n-Propylacrylat, Isopropylacrylat, n-Butylacrylat, Octylacrylat, 2-Chlorethylacrylat, 2-Cyanoethylacrylat, N-(β-Dimethylaminoethyl)-acrylat, Benzylacrylat, Cyclohexylacrylat, Phenylacrylat etc.), Methacrylester (beispielsweise Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, n-Propylmethacrylat, Isopropylmethacrylat, n-Butylmethacrylat, Octylmethacrylat, Cyclohexylmethacrylat, Benzylmethacrylat, 3-Sulfopropylmethacrylat etc.), Allylverbindungen (beispielsweise Allylbutylether, Allylphenylether etc.), Vinylether (beispielsweise Methylvinylether, Butylvinylether, Octylvinylether, Methoxyethylvinylether, 2-Chlorethylvinylether, 2-Hydroxyethylvinylether, (2-Dimethylaminoethyl)- vinylether, Vinylphenylether, Vinyltollylether, Vinylchlorphenylether etc.), p-Vinylbenzoesäure, Vinylester (beispielsweise Methyl-p-vinylbenzoat, etc), heterocyclische Vinylverbindungen (beispielsweise Vinylpyridin, N-Vinylimidazol, N-Vinylcarbazol, N-Vinylpyrrolidon, N-Vinyloxazolidon etc.), Methylvinylketon, Phenylvinylketon, Styrol oder Derivate davon (beispielsweise Chlormethylstyrol, p-Methylstyrol etc.), Maleinsäureester (beispielsweise Ethylmaleat, Butylmaleat, Dibutylmaleat, Octylmaleat etc.), Fumarsäureester (beispielsweise Ethylfumarat, Dibutylfumarat, Octylfumarat etc.), Itaconsäureester (beispielsweise Methylitaconat, Ethylitaconat, Diethylitaconat etc.), Crotonamid, Crotonsäureester (beispielsweise Butylcrotonat, Glycerinmonocrotonat etc.), Methylsorbat, Olefine (beispielsweise Ethylen, Propylen, 1-Buten, Dicyclopentadien, 4-Methyl-1-hexen, 4,4-Dimethyl-1-penten etc.), halogenierte Olefine (beispielsweise Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Isopren etc.), ungesättigte Nitrile (beispielsweise Acrylnitril, Methacrylnitril etc.) und ähnliche Verbindungen. Diese Comonomeren können einzeln oder als Gemisch aus zwei oder mehreren verwendet werden.
In der Formel (II) kann, wenn Q -NR5-CO-R6 bedeutet, R5 eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und bevorzugt eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe bedeuten. R6 bedeutet ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und bevorzugt ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe.
Bevorzugt unter den sich wiederholenden Einheiten der Formel (II) sind solche, worin R4 ein Wasserstoffatom bedeutet und Q
bedeutet, worin R5 eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe bedeutet und R6 ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder Ethylgruppe bedeutet, oder
bedeutet, worin Z1 eine Atomgruppierung bedeutet, welche einen 5- oder 6gliedrigen Lactamring oder Oxazolidonring bildet.
Die am meisten bevorzugte Einheit unter diesen ist eine sich wiederholende Einheit, worin Q den Rest einer Pyrrolidongruppe oder den Rest einer Oxazolidongruppe bedeutet.
Das Polymere, welches sich wiederholende Einheiten der Formel (II) enthält, kann ein Homopolymeres oder ein Copolymeres sein, welches mindestens zwei sich wiederholende Einheiten der Formel (II) enthält, oder es kann ein Copolymeres sein, welches mindestens eine sich wiederholende Einheit der Formel (I) und eine weitere sich wiederholende Einheit enthält, die sich von ungesättigten Verbindungen, die durch Addition polymerisierbar sind, ableitet.
Monomere, welche die sich wiederholende Einheit der Formel (II) ergeben, werden durch die Formel (III)
dargestellt, worin R4 und Q die zuvor gegebenen Definitionen besitzen.
Spezifische Beispiele für Monomere, die durch die Formel (III) dargestellt werden, sind Vinylacetat, N-Vinylsuccinimid, N-Vinylglutaramid, N-Vinyladipimid, N-Methyl-N-methyl- N-vinylformamid, N-Methyl-N-vinylacetamid, N-Ethyl-N-vinylacetamid, N-Methyl-N-vinylpropionamid, N-Vinylpyrrolidon, N-Vinylpiperidon, N-Vinyl-ε-caprolactam, N-Vinyloxazolidon, N-Vinylmorpholin, N-Vinyl-2-pyridon etc. Bevorzugt unter diesen sind Vinylacetat, N-Vinylsuccinimid, N-Vinylglutarimid, N-Methyl-N-vinylacetamid, N-Ethyl-N-vinylacetamid, N-Vinylpyrrolidon, N-Vinylpiperidon und N-Vinyloxazolidon. Das darunter am meisten bevorzugte Monomere ist N-Vinylpyrrolidon.
Die durch Addition polymerisierbaren ungesättigten Verbindungen, die mit dem Monomeren der Formel (III) polymerisierbar sind, schließen die Monomeren ein, die die wiederkehrende Einheit der Formel (I) liefern und die damit copolymerisierbaren Monomeren ein. Bevorzugte Beispiele sind Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäureanhydrid, Acrylamid, N- Methylacrylamid, N,N-Dimethylacrylamid, N-Ethylacrylamid, N-(β-Hydroxyethyl)-acrylamid, Methacrylamid, N-Methylmethacrylamid und ähnliche Verbindungen. Vom Standpunkt der hydrophilen Eigenschaften des gebildeten Polymeren aus sind bevorzugte Comonomere unter diesen Acrylsäure, Methacrylsäure, 2-Hydroxyethylacrylat, 2-Methoxyethylacrylat, Sulfopropylacrylat, Acrylamid, Dimethylacrylamid, 2-Acryloylamino- 2-methylpropansulfonsäure, Hydroxyethylacrylamid, Methacrylamid, Methylvinylether, Natriumstyrolsulfonat, N-Vinyl-3,5-dimethyltriazol und Maleinsäureanhydrid.
Das Copolymerisationsverhältnis des Copolymeren, welches die sich wiederholende Einheit der Formeln (I) oder (II) aufweist, ist nicht besonders beschränkt, aber der Gehalt an sich wiederholender Einheit der Formeln (I) oder (II) in dem Copolymeren liegt bevorzugt im Bereich von 20 bis 100 Mol.-% und besonders bevorzugt im Bereich von 50 bis 100 Mol.-%.
Das Polymere, welches eine sich wiederholende Einheit der Formeln (I) oder (II) aufweist, kann nach den Verfahren synthetisiert werden, wie sie in den britischen Patentschriften 12 11 039 und 9 61 395, der japanischen Patentpublikation Nr. 29 195/72, den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 76 593/73, 92 022/73, 21 134/75 und 1 20 634/75, den US-Patentschriften 26 81 897, 32 27 672, 32 90 417, 32 62 919, 32 45 932 und 32 30 275, John C. Petropoulosu et al., Official Digest, Bd. 33, 719-736 (1961), Schunsuke Murahashi et al. (ed.), Gosei Kobunshi, Bd. 1, 246-290, ibid, Bd. 3, 1-108 etc. beschrieben werden. Die Polymerisation wird im allgemeinen bei einer Temperatur von 20 bis 180°C und bevorzugt von 40 bis 120°C unter Verwendung von 0,05 bis 5 Gew.-% eines Radikal-Polymerisationsinitiators, bezogen auf die Monomeren, durchgeführt. Die Initiatoren, die beispielsweise verwendet werden können, sind Azobisverbindungen, Peroxide, Hydroperoxide, Redox-Katalysatoren, wie Kaliumpersulfat, t-Butylperoctoat, Benzoylperoxid, Azobisisobutylonitril etc.
Typische Beispiele für Polymere mit einer sich wiederholenden Einheit der Formel (I) sind:
  • (1) Poly(N-ethylacrylamid),
    (2) Polyacrylamid,
    (3) Poly(N,N-dimethylacrylamid),
    (4) Polymethacrylamid,
    (5) Acrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (40 : 60, ausgedrückt als Mol),
    (6) N,N-Dimethylacrylamid/Methylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
    (7) Acrylamid/Butylacrylat-Copolymeres (60 : 40, ausgedrückt als Mol),
    (8) N-Acrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
    (9) N,N-Dimethylacrylamid/Maleinsäure-Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol),
    (10) Acrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (40 : 60, ausgedrückt als Mol),
    (11) Acrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
    (12) N-Methylacrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
    (13) N-Ethylacrylamid/Acrylsäure-Copolymeres (30 : 70, ausgedrückt als Mol),
    (14) N-Methylmethacrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
    (15) N,N-Dimethylmethacrylamid/Propylacrylat-Copolymeres (35 : 65, ausgedrückt als Mol),
    (16) N-Acryloylmorpholin/Ethylacrylat-Copolymeres (40 : 60, ausgedrückt als Mol),
    (17) Poly[N-(3-dimethylaminopropyl)acrylamid] und
    (18) Poly(N-methacryloylpiperazin).
Typische Beispiele für ein Polymeres, welche die sich wiederholende Einheit der Formel (II) enthält, sind:
  • (19) Poly(N-vinylpyrrolidon),
    (20) Poly(N-vinyloxazolidon),
    (21) Poly(N-vinylsuccinimid),
    (22) Poly(N-vinylglutarimid),
    (23) Poly(N-vinylpiperidon),
    (24) Poly(N-vinyl-ε-caprolactam),
    (25) Poly(N-methyl-N-vinylacetamid),
    (26) Poly(N-ethyl-N-vinylacetamid),
    (27) Vinylalkohol/N-Vinylpyrrolidon-Copolymeres (30 : 70, ausgedrückt als Mol),
    (28) N-Vinylpyrrolidon/Vinylacetat-Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol),
    (29) N-Vinylpyrrolidon/2-Hydroxyethylacrylat-Copolymeres (80 : 20, ausgedrückt als Mol),
    (30) N-Vinylpyrrolidon/Acrylsäure-Copolymeres (90 : 10, ausgedrückt als Mol),
    (31) N-Vinylpiperidon/2-Methoxyethylacrylat-Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol),
    (32) N-Vinylpiperidon/Methylvinylether-Copolymeres (90 : 10, ausgedrückt als Mol),
    (33) N-Vinyloxazolidon/Vinylalkohol-Copolymeres (65 : 35, ausgedrückt als Mol),
    (34) N-Vinyloxazolidon/Acrylsäure-Copolymeres (80 : 20, ausgedrückt als Mol),
    (35) N-Vinylpyrrolidon/N-Vinylpiperidon/Hydroxyethylacrylat- Copolymeres (40 : 30 : 30, ausgedrückt als Mol),
    (36) Vinylalkohol/Vinylacetat/N-Vinyl-2-pyridon-Copolymeres (70 : 25 : 5, ausgedrückt als Mol),
    (37) N-Vinylpyrrolidon/2-Hydroxyethylacrylat/Vinylacetat- Copolymeres (70 : 20 : 10) und
    (38) N-Vinylpyrrolidon/Vinylalkohol/Vinylpropionat/ Natriumstyrolsulfonat-Copolymeres (40 : 40 : 5 : 15, ausgedrückt als Mol).
Spezifische Beispiele für Copolymere, die eine sich wiederholende Einheit der Formel (II) und andere, durch Addition polymerisierbare ungesättigte Comonomere enthalten, sind:
  • (39) N-Vinylpyrrolidon/Acrylamid-Copolymeres (60 : 40, ausgedrückt als Mol),
    (40) N-Vinylpyrrolidon/2-Acryloylamino-2-methylpropansulfonsäure- Copolymeres (75 : 25, ausgedrückt als Mol),
    (41) N-Vinylpyrrolidon/2-Methacrylamid-Copolymeres (60 : 40, ausgedrückt als Mol),
    (42) N-Vinyloxazolidon/N-(2-Hydroxyethyl)-acrylamid- Copolymeres (60 : 40, ausgedrückt als Mol),
    (43) N-Vinyloxazolidon/N-(2-Hydroxyethyl)-acrylamid- Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol),
    (44) N-Vinylpyrrolidon/N-Vinylmorpholin/Acrylamid- Copolymeres (50 : 20 : 30, ausgedrückt als Mol),
    (45) N-Vinylsuccinimid/N-Vinyl-ε-caprolactam/Acrylamid- Copolymeres (40 : 20 : 40, ausgedrückt als Mol),
    (46) N-Vinyloxazolidon/Acrylamid/Acrylsäure-Copolymeres (60 : 20 : 20, ausgedrückt als Mol),
    (47) N-Vinylpyrrolidon/Acrylamid/Vinylacetat/Acrylsäure- Copolymeres (60 : 20 : 10 : 10, ausgedrückt als Mol) und
    (48) N-Vinylpyrrolidon/Dimethylacrylamid-Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol).
Die Polymeren, welche die sich wiederholenden Einheiten, die durch die Formeln (I) oder (II) dargestellt werden, enthalten, besitzen normalerweise ein Molekulargewicht von 2000 oder mehr und bevorzugt von 8000 bis 700 000.
Jedes der Polymeren mit den sich wiederholenden Einheiten, die durch die Formeln (I) oder (II) dargestellt werden, besitzt relativ hohe hydrophile Eigenschaften. Die Einarbeitung dieser Polymeren in eine Ausbreitungsschicht kann erfolgen, indem man das Polymere in Wasser oder in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel löst, die wäßrige oder organische Lösungsmittellösung auf die Ausbreitungsschicht durch Aufstreichen oder Eintauchen aufbringt und trocknet. Als organische Lösungsmittel kann man beispielsweise Methylacetat, Ethylacetat, Butylacetat, Methylisobutylketon, β-Ethoxyethylacetat, Methylcarbitol, Dioxan, Cyclohexan, Cyclohexanon, Dipropylenglykol, N,N- Dimethylformamid, Propanol, Isopropanol, Methanol, Butanol, sec-Butanol, Ethylenglykolmonomethylether, Ethylenglykolmonobutylether und ähnliche Verbindungen verwenden.
Diese Polymeren werden zu der Ausbreitungsschicht in einer Menge zugegeben, die ausreicht, um die Ausbreitungsfläche um mindestens 20% zu verringern. Eine solche Menge liegt bevorzugt im Bereich von 2 bis 15 g/m2.
Beispiele für Cellulosederivate, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind bevorzugt Hydroxyalkylcellulose mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen in dem Alkylmolekülteil davon, beispielsweise Hydroxypropylcellulose), ein gemischter Cellulosealkylether (beispielsweise Hydroxypropylmethylcellulose) und ähnliche Verbindungen.
Das zuvor erwähnte Cellulosederivat wird zu der Ausbreitungsschicht in einer Menge zurückgegeben, die ausreicht, die Ausbreitungsfläche um mindestens 20% zu verringern. Eine solche Menge liegt bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 15 g/m2 und besonders bevorzugt im Bereich von 0,7 bis 10 g/m2.
Das Substrat für ein Enzym ist ein solches, das irgendeine Wirkung des spezifischen Enzyms aufnimmt, z. B. Alanin für Alanin-Aminotransferase, Aspartat für Aspartat-Aminotransferase, γ-Glutamyl-p-nitroanilid für γ-Glutamyltransferase, Lactat für Lactat-Dehydrogenase, Pyrophosphat (ATP, ADP), Monophosphat und p-Nitrophenylphosphate für alkalische Phosphatase, Stärke für L-Amylase etc.
Die vorliegende Erfindung kann bei einer großen Vielzahl bekannter trockener analytischer Elemente verwendet werden und insbesondere bei Elementen, die einen festen Träger enthalten, der sowohl gegenüber dem Nachweisreagenssystem als auch der zu analysierenden Flüssigkeit permeabel ist. Die Elemente enthalten im allgemeinen einen Träger, eine Nachweisschicht und/oder eine reaktive Reagensschicht und eine poröse Flüssigkeitsausbreitungsschicht. Die Elemente können weiter eine Reflexionsschicht, eine Klebstoffschicht, eine Filterschicht, eine wasserabsorbierende Schicht, eine Unterschicht und andere bekannte Schichten enthalten. Beispiele solcher analytischer Elemente werden in den US-Patentschriften 39 92 158 und 40 42 335 und in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 1 64 356/80 beschrieben.
Wenn das erfindungsgemäße trockene analytische Element einen Träger enthält, sind praktische Ausführungsformen eines solchen Elements (1) eine Struktur, die einen Träger umfaßt, der darauf eine Nachweisschicht und weiter darauf eine eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht aufweist, (2) eine Struktur, die einen Träger mit darauf einer reaktiven Reagensschicht und weiter einer eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht darauf aufweist, (3) eine Struktur, die einen Träger und darauf einer Nachweisschicht, einer reaktiven Reagensschicht und einer eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht, in dieser Reihenfolge, aufweist und (4) eine Struktur, die einen Träger, darauf eine Nachweisschicht, eine zweite reaktive Reagensschicht, eine erste reaktive Reagensschicht und eine eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht, in dieser Reihenfolge, aufweist.
In den Strukturen (1) bis (4) können eine Lichtabschirmungsschicht und/oder eine Filterschicht zwischen der Nachweisschicht und der reaktiven Reagensschicht oder der eine Flüssigkeit ausbreitenden Schicht, zwischen der reaktiven Reagensschicht und der die Flüssigkeit ausbreitenden Schicht oder zwischen der zweiten reaktiven Reagensschicht und der ersten reaktiven Reagensschicht vorhanden sein.
Bei der vorliegenden Erfindung können das hydrophile Polymere, welches die sich wiederholenden Einheiten der Formeln (I) oder (II) enthält, und das Cellulosederivat nicht nur in die Flüssigkeitsausbreitungsschicht, sondern ebenfalls in andere Schichten, beispielsweise in einer Reagensschicht, eingearbeitet sein.
Es ist bevorzugt, daß jede der zuvor erwähnten Schichten und eine wasserabsorbierende Schicht auf einem Träger vorgesehen sind, der gegenüber Licht permeabel ist, jedoch gegenüber Wasser nicht permeabel ist, und der gegebenenfalls eine Unterschicht etc. aufweist.
Die wasserabsorbierende Schicht ist eine Schicht, welche gegenüber Wasser permeabel ist, die aber im wesentlichen für die Verbindung, die schließlich nachgewiesen werden soll, undurchlässig ist. Diese Schicht wird bevorzugt zwischen dem Träger und einer Nachweisschicht oder einer Reagensschicht in den Fällen vorgesehen, wo die Substanz, die schließlich nachgewiesen werden soll, eine kaum diffusionsfähige hochpolymere Substanz ist. Eine solche wasserabsorbierende Schicht enthält bevorzugt ein filmbildendes hydrophiles Polymeres, welches durch das absorbierte Wasser quillt.
Die Nachweisschicht ist eine Schicht, welche im wesentlichen für die Substanz, die schließlich nachgewiesen werden soll, permeabel ist und die kein reaktives Reagens enthält. Diese Schicht enthält ein hydrophiles Polymeres als Hauptbestandteil und gegebenenfalls ein oberflächenaktives Mittel (kationisch, amphoter oder nichtionisch), einen Härter, ein Puffermittel etc.
Das hydrophile Polymere, welches für die wasserabsorbierende Schicht oder Nachweisschicht verwendet werden kann, ist ein natürliches oder synthetisches hydrophiles Polymeres, welches normalerweise einen Quellgrad von etwa 1,5 bis etwa 20 und bevorzugt von etwa 2,5 bis etwa 15 aufweist, wenn es in Wasser absorbiert. Beispiele solcher hydrophiler Polymeren sind Gelatine (beispielsweise mit Säure verarbeitete bzw. behandelte Gelatine, entionisierte Gelatine etc.), ein Gelatinederivat (beispielsweise mit Phthalsäure oder einem ihrer Derivate umgesetzte Gelatine etc.), Agarose, Pluran, Pluranderivate, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon etc.
Eine geeignete Trockendicke der Nachweisschicht oder der wasserabsorbierenden Schicht liegt im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 µm und bevorzugt von etwa 3 bis etwa 30 µm.
Eine Klebstoffschicht kann gebildet werden, um die Ausbreitungsschicht an die Nachweisschicht oder die wasserabsorbierende Schicht entweder direkt oder über eine Lichtabschirmungsschicht, eine Filterschicht, eine reaktive Reagensschicht etc. anzuheften. Die Klebstoffschicht enthält vorzugsweise ein hydrophiles Polymeres, welches bei der Benetzung oder Quellung mit Wasser an der Ausbreitungsschicht haftet. Ein solches hydrophiles Polymeres kann eines von denen sein, die für die wasserabsorbierende Schicht oder für die Nachweisschicht aufgezählt wurden. Bevorzugt von diesen sind Gelatine, Gelatinederivate, Polyacrylamid und ähnliche. Die Klebstoffschicht besitzt üblicherweise eine Trockendicke von etwa 0,5 bis etwa 20 µm und bevorzugt von etwa 1 bis etwa 10 µm. Die Klebstoffschicht kann nicht nur auf der Nachweisschicht oder wasserabsorbierenden Schicht vorgesehen sein, sondern sie kann ebenfalls zwischen anderen benachbarten Schichten, beispielsweise zwischen einer reaktiven Reagensschicht, welche eine benachbarte Schicht ist, vorgesehen sein, um eine Haftung zwischen den Schichten sicherzustellen. Die Klebstoffschicht kann durch Beschichten einer wäßrigen Lösung, welche das zuvor erwähnte hydrophile Polymere und gegebenenfalls ein oberflächenaktives Mittel etc. enthält, auf der Nachweisschicht, der reaktiven Reagensschicht etc. nach irgendeinem gut bekannten Beschichtungsverfahren hergestellt werden.
Die reaktive Reagensschicht des erfindungsgemäßen trockenen analytischen Elements enthält ein reaktives Reagens, das eine erfaßbare Komponente, z. B. eine Substanz, die eine Farbe bildet oder verändert, eine fluoreszierende Substanz erzeugt, was z. B. durch Umsetzung mit einem Produkt geschehen kann, das durch eine Enzymreaktion mit einem Substrat gebildet wird und das erforderlichenfalls ein hydrophiles Polymeres, ein Puffermittel, lichtabschirmende feine Teilchen (entweder reflektierend oder absorbierend) und dergleichen enthalten kann.
Beispiele für hydrophile Polymere, welche in der reaktiven Reagensschicht verwendet werden können, sind Stärke, Cellulose, Agarose, Gelatine und ihre Derivate (beispielsweise die hydroxymethylierten Derivate, hydroxypropylierten Derivate etc.), Acrylamid-Polymere, Copolymere von Acrylamid und verschiedenen Vinylmonomeren, Polyvinylalkohol, Copolymere von Vinylpyrrolidon und verschiedenen Vinylmonomeren, Acrylat-Polymere, Copolymere von Acrylaten und verschiedenen Vinylmonomeren und ähnliche. Von diesen hydrophilen Polymeren sind Polyvinylalkohol, Vinylpyrrolidon-Polymere, Acrylamid-Polymere und Cellulosederivate bevorzugt.
Die Puffermittel, welche in der reaktiven Reagensschicht verwendet werden können, sind übliche, und Beispiele hierfür sind Carbonate, Borate, Phosphate, Good's-Puffermittel etc. Die Auswahl des Puffermittels, welches verwendet wird, kann entsprechend der Literaturstelle, beispielsweise Takeichi Horio et al., Tanpakushitsu Kiso no Kisojikkenho, Nankodo (1981), erfolgen.
Die Lichtabschirmungsschicht ist bevorzugt eine wasserpermeable Schicht, welche ein hydrophiles Polymeres als Bindemittel und darin dispergiert lichtreflektierende feine Teilchen enthält. Wenn in der Nachweisschicht eine nachweisbare Änderung erzeugt wird, wie eine Farbänderung, Farbentwicklung usw., wird diese durch Reflexionscolorimetrie von der Seite des Trägers, der Lichtdurchlässigkeitseigenschaften besitzt, gemessen, wobei die Lichtabschirmungsschicht, welche feine reflektierende Teilchen enthält, dazu dient, die Farbe eines wäßrigen Flüssigkeitsflecks, der aufgetragen wurde und in der Ausbreitungsschicht entwickelt wurde, abzuschirmen. Dieses wäre die rote Farbe des Hämoglobins bei der Analyse von Gesamtblut. Diese Schicht wirkt ebenfalls als Lichtreflexionsschicht oder als Hintergrundschicht. Beispiele für feine lichtreflektierende Teilchen, die in der Lichtabschirmungsschicht verwendet werden können, sind feine Pigmentteilchen, wie feine Titandioxidteilchen (des Rutiltyps, Anatastyps oder Brookit-Typs, feine Kristallkörner mit einer Korngröße von etwa 0,1 bis etwa 1,2 µm), feine Bariumsulfatteilchen, feine Aluminiumteilchen etc., wobei feine Titandioxidteilchen und feine Bariumsulfatteilchen bevorzugt sind.
Die oben beschriebenen feinen Lichtabschirmungsteilchen können ebenfalls in der reaktiven Reagensschicht oder in der Ausbreitungsschicht verwendet werden.
Das hydrophile Polymere, das als Bindemittel in der Lichtabschirmungsschicht verwendet wird, kann beispielsweise eines von denen sein, wie sie für die Nachweisschicht aufgezählt wurden, und zusätzlich kann man schwach hydrophile regenerierte Cellulose, Celluloseacetat und ähnliche Verbindungen verwenden. Unter diesen sind Gelatine, Gelatinederivate und Polyacrylamid bevorzugt. Von diesen können Gelatine und Gelatinederivate an sich bekannte Gelatinehärter enthalten.
Die oben beschriebene Lichtabschirmungsschicht kann hergestellt werden, indem man eine wäßrige Dispersion, die die feinen Lichtabschirmungsteilchen und das hydrophile Polymere enthält, auf die Nachweisschicht, die reaktive Reagensschicht oder eine ähnliche Schicht in an sich bekannter Weise aufträgt und anschließend trocknet.
Als Fasern, welche Wasser nicht absorbieren, können in der erfindungsgemäßen Ausbreitungsschicht Polyesterfasern, wie Polyethylenterephthalat, Polyamidfasern, wie Nylon, Acrylfasern, Polyethylenfasern, Polypropylenfasern, Celluloseacetatfasern und ihre Gemische verwendet werden. Die Ausbreitungsschicht kann aus irgendeinem nichtgewebten bzw. nichtgewirkten Flächengebilde bzw. Textilmaterial aus gewebtem bzw. gewirktem Textilmaterial und gestricktem bzw. gewirktem Textilmaterial bzw. Flächengebilden, die aus diesen Fasern hergestellt worden sind, bestehen. Das Flächengebilde oder Textilmaterial, welches verwendet wird, wird bevorzugt einer Entwachsungsstufe unterworfen, wie einem Waschen mit Wasser, damit im wesentlichen die Fette und Öle, die an ihm, bedingt durch die Herstellung der Garne oder des gewebten oder gestrickten bzw. gewirkten Textilmaterials, haften, entfernt werden. Erfindungsgemäß wird ein hydrophiles Polymeres, ausgewählt unter den Polymeren, welche die sich wiederholenden Einheiten der Formeln (I) oder (II) enthalten, und den Cellulosederivaten, in die Hohlräume bzw. Leerstellen der faserhaltigen Ausbreitungsschicht in Form eines Gels eingearbeitet.
Das trockene analytische Element für die Analyse enzymatischer Aktivitäten gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt eine hohe analytische Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit. Diese Effekte sind insbesondere in analytischen Elementen mit einer Ausbreitungsschicht ausgeprägt, die ein selbstentwickelbares Substrat enthält, welches eine gefärbte Substanz bei der enzymatischen Reaktion freisetzt, wie bei einem Element für die Analyse der GGT-Aktivität unter Verwendung von γ-Glutamyl-p-nitroanilid, bei der Analyse der Amylaseaktivität unter Verwendung von p-Nitrophenyloligosaccharid, bei der Analyse der ALP-Aktivität unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat und bei ähnlichen Analysen. Das analytische erfindungsgemäße Element ist ebenfalls in Analysesystemen mit anderen Substraten, wie bei der Analyse von ALT, AST, LDH etc., unter Verwendung von Alanin, Asparaginsäure, α-Ketoglutarsäure, Milchsäure etc. als Substrat nützlich.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In diesen Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, alle Prozentgehalte durch das Gewicht ausgedrückt.
Beispiel 1
Eine wäßrige Lösung mit der Zusammensetzung (a-i), die im folgenden angegeben wird, wird auf einen 180 µm dicken farblosen transparenten und glatten Polyethylenterephthalat- Film, der eine Gelatineunterschicht aufweist, bis zu einer Trockendicke von 7 µm aufgetragen. Anschließend wird unter Bildung einer Nachweisschicht getrocknet.
Zusammensetzung (a-i):
Gelatine 300 g Oberflächenaktives Mittel 10G
(oberflächenaktives Mittel, hergestellt von der Olin Corp.;
p-Nonylphenoxypolyglycidol; Polymerisationsgrad: etwa 10)   5 g 15%ige Latexlösung von
Poly-co(styrol-N-methylmorpholinium- methylstyrol-divinylbenzol)
(55 : 43 : 2, ausgedrückt als Mol) 280 g Wasser2150 g Wäßrige verdünnte Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts fürpH = 7,0
Eine wäßrige Lösung mit der folgenden Zusammensetzung (b-i) wird dann auf die so gebildete Gelatineschicht bis zu einer Trockendicke von 5 µm aufgetragen und unter Bildung einer reaktiven Reagensschicht getrocknet.
Zusammensetzung (b-i):
Gelatine    200 g Oberflächenaktives Mittel 10G      5 g α-Glucosidase3 500 000 IU Wasser   2600 g Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-WertspH = 7,0
Eine wäßrige Lösung mit der Zusammensetzung (c-i), die im folgenden angegeben ist, wird weiterhin darauf bis zu einer Trockendicke bis zu 3 µm aufgetragen und dann wird unter Bildung einer Lichtabschirmungsschicht getrocknet.
Zusammensetzung (c-i):
Gelatine 30 g Oberflächenaktives Mittel 10G  4 g Titanoxid (Anatastyp) 20 g Wasser950 g Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-WertspH = 7,0
Die Lichtabschirmungsschicht hatte eine spiegelnde Dichte von etwa 1,3 (vgl. The Theory of the Photographic Process (Third Edition), S. 421, veröffentlicht von der The Macmilian Company).
Danach werden etwa 30 g/m2 Wasser einheitlich auf die Lichtabschirmungsschicht zur Quellung der Schicht aufgetragen und dann wird ein gestricktes bzw. gewirktes Polyester- Flächengebilde (40 Gauge) unter geringem Druck darauf laminiert und anschließend wird getrocknet. Eine wäßrige Lösung mit der Zusammensetzung (d-i), die im folgenden angegeben ist, wird einheitlich auf das Flächengebilde in einer Menge von 150 ml/m2 aufgetragen und dann wird zur Entfernung des Lösungsmittels unter Bildung einer Ausbreitungsschicht getrocknet. Man erhält so ein integrales mehrschichtiges analytisches Element für die Analyse von Amylase.
Zusammensetzung (d-i):
p-Nitrophenyl-α-D-maltopentaosid  34 g Wasser1600 g Kaliumphosphat  60 g Polyvinylpyrrolidon (durchschnittliches Molekulargewicht: 100 000) 140 g Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-WertspH = 7,3
10 µl von jeweils im Handel erhältlichem Kontrollserum (Kontrollserum I) und einem Kontrollserum mit Amylaseaktivität, welche durch Zugabe von humaner Speichelamylase variiert wurde (Kontrollserum II), wurden in einem Flecken auf das entstehende analytische Element aufgetragen. Das Element wurde bei 37°C stehengelassen und die Reflexionsdichte des Elements wurde jede Minute zwischen 3 bis 6 min vom Beginn des Stehenlassens bei einer Wellenlänge von 400 nm geprüft. Die Amylasekonzentration der Kontrollsera I und II werden aus der Änderung in der Reflexionsdichte unter Verwendung einer zuvor hergestellten Eichkurve bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.
KontrollserumErfindungsgemäß
I 72 U/l II238 U/l
Beispiel 2
Es wurde der gleiche Polyethylenterephthalat-Film wie in Beispiel 1 verwendet. Er wurde mit einer wäßrigen Lösung der Zusammensetzung (a-ii) beschichtet. Dann wurde eine wäßrige Lösung der Zusammensetzung (b-ii) aufgetragen. Beide Zusammensetzungen sind im folgenden angegeben. Die Auftragung erfolgte in einer Trockendicke von 10 µm bzw. 3 µm. Nach jedem Auftragen wurde getrocknet.
Zusammensetzung (a-ii):
Gelatine (alkalibehandelte entionisierte Gelatine) 100 g Oberflächenaktives Mittel 10G   5 g 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamido)- ethan   1,5 g Wasser1000 g Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-WertspH = 7,0
Zusammensetzung (b-ii):
Gelatine 120 g Oberflächenaktives Mittel (Nonylphenoxypolyglycidol)  13 g Wasser2600 g Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-WertspH = 7,0
Danach wurde die Gelatineschicht mit 30 g/m2 einer 0,4%igen wäßrigen Lösung von Nonylphenoxypolyglycidol gequollen, ein 230 µm dickes gestricktes bzw. gewirktes Polyester- Flächengebilde (36 Gauge, 50 Denier) wurde darauf unter geringem Druck laminiert und anschließend wurde getrocknet.
Getrennt wurden vier Arten einer wäßrigen Lösung (c-ii) hergestellt, indem man eine Lösung von 22,8 g γ-Glutamyl- p-nitroanilid in 10 ml 2 N Chlorwasserstoffsäure und 10 ml Ethanol in einer homogenen Lösung der folgenden Zusammensetzung dispergierte und dann den pH-Wert mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 8,3 einstellte.
Tris(hydroxyethyl)aminomethan 30,3 g Gylcylglycin  6,5 g Cetyltrimethylammoniumbromid  5 g Oberflächenaktives Mittel (Nonylphenoxypolyglycidol)  0,8 g Wasser200 g Polyacrylamid (Viskosität: 2500 cps bei 25°C)angegeben in Tabelle II
Die entstehende wäßrige Lösung (c-ii) wird einheitlich auf ein Flächengebilde in einer Menge von 120 ml/m2 aufgetragen und unter Herstellung integraler mehrschichtiger analytischer Elemente A, B, C und D getrocknet.
Jedes der Elemente wurde zu einem 15 × 15 mm2-Quadrat geschnitten und an einem Kunststoffrahmen befestigt, wie es in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 63 452/62 beschrieben wird. Man erhält einen Objektträger für die GGT- Analyse.
10 µl von 7%igem humanem Serum Albumin (HSA), die 197, 382 oder 889 IU/l GGT enthalten, werden auf einem Flecken auf den entsprechenden Objektträger aufgetragen. Der Objektträger wurde in einem geschlossenen Behälter bei 37°C stehengelassen und die optische Reflexionsdichte wurde bei 410 nm nach 2 und 5 min gemessen und die Änderung ist in der folgenden Tabelle II angegeben.
Tabelle II
10 µl einer 0,83 mM Lösung von Rot Nr. 106 (Nahrungsmittelfarbstoff) werden auf das Element aufgetragen, und das Element wird bei 37°C stehengelassen. Die Ausbreitungsfläche auf der Ausbreitungsschicht nach 6 min Stehenlassen ist in der folgenden Tabelle III angegeben.
ProbeEntwickelte Fläche (cm2)
  A  1,50   B  1,34   C  1,18   D  1,90
Beispiel 3
Es wurde wie im Beispiel 2 verfahren, um ein trockenes analytisches Element zur Bestimmung von GGT herzustellen, jedoch mit der Ausnahme, daß der aus der Lösung (a-ii) hergestellte getrocknete Film eine Dicke von 15 µm hatte, daß die Wassermenge in der Lösung (b-ii) 2900 g betrug, daß 2,5 g Polyacrylamid in die Lösung (c-ii) anstelle des oberflächenaktives Mittels eingearbeitet wurden und daß eine Lösung (d-ii) mit folgender Formulierung zusätzlich nach dem Aufschichten der Lösung (c-ii) in einer Menge von 112 ml/m2 aufgeschichtet wurde.
Zusammensetzung (d-ii):
Hydroxyethylcellulose100 ml TiO2  5 g
10 µl von 7%igem Human-Serum-Albumin (HSA), enthaltend 1900 IU/l GGT, wurden als Fleck auf das resultierende analytische Element aufgebracht. Das Element wurde in einem geschlossenen Behälter bei 37°C stehengelassen und die reflektierende optische Dichte wurde bei 400 nm 2 und 5 min nach dem Beginn des Stehenlassens gemessen. Die Veränderung zwischen den zwei Dichten wurde als 0,223 festgestellt.
Vergleichsbeispiel
Wie im Beispiel 3 wurde ein trockenes analytisches Element für die GGT-Bestimmung hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß aus der Zusammensetzung (c-ii) das Polyacrylamid weggelassen wurde.
10 µl HSA, enthaltend 1900 IU/l GGT, wurden als Fleck auf das resultierende analytische Element aufgebracht. Das System wurde bei 37°C in einem geschlossenen Behälter gehalten. 2 min und 5 min nach dem Beginn des Stehenlassens wurde die Veränderung der optischen Dichte gemessen. Sie wurde als 0,164 festgestellt.
Beispiel 4
Ein 180 µm dicker transparenter Polyethylenterephthalat- Film wurde einer Behandlung unterworfen, um seine Oberfläche hydrophil zu machen. Auf die hydrophile Oberfläche des Films wurde eine Beschichtungslösung mit folgender Zusammensetzung aufgeschichtet und getrocknet, um eine Farbentwicklungsschicht mit einer Trockendicke von 10 µm zu bilden.
Zusammensetzung:
Gelatine100 g Wasser900 g Nitroblau-Tetrazolium (3,3′-(3,3′-Dimethoxy-4,4′-
biphenylen)-bis[2-(p-nitro- phenyl)-5-phenyl-tetrazolium- chlorid])  6 g
Nachdem die Farbentwicklungsschicht mit etwa 30 g/m2 Wasser befeuchtet worden war, wurde ein gewebter Stoff, bestehend aus einem versponnenen Polyethylenterephthalat-Garn (36 Gauge, 50 Denier), unter Druck aufgebracht, um eine Ausbreitungsschicht zu bilden.
Auf die Ausbreitungsschicht wurde eine Beschichtungslösung mit folgender Zusammensetzung zu einer Bedeckung von 120 ml/m2 aufgeschichtet und getrocknet.
Zusammensetzung:
Wasser180 g Imidazol  4 g Dinatriumcreatinphosphat  6 g Adenosin-Diphosphat  2,4 g Adenosin-5′-phosphat  4 g Dinatrium-ethylendiamintetraacetat  1,6 g Magnesiumacetat  4 g Glucose  2 g NAD  2 g N-Acetylcystein  0,6 g Diadenosin-pentaphosphat 80 mg Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase30000 U Hexokinase40000 U Diaphorase30000 U Ascorbinsäure-Oxidase30000 U Polyacrylamid (20%ige wäßrige Lösung, durchschnittliches
Molekulargewicht: 37 000)200 g
10 µl 70%iges HSA (37°C), enthaltend 0, 149, 383, 656 oder 1560 IU/l von CPK (Creatin-Kinase), wurden als Fleck auf die Ausbreitungsschicht des so hergestellten analytischen Elements aufgebracht. Das System wurde auf einer thermostatierten Platte mit 37°C stehengelassen, wobei das Verdampfen von Wasser in genügender Weise verhindert wurde. Nach 2 und 5 min wurden die reflektierenden optischen Dichten bei 540 nm gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IV
Beispiel 5
Ein 180 µm dicker transparenter Polyethylenterephthalat- Film wurde einer Behandlung unterworfen, um seine Oberfläche hydrophil zu machen. Auf die hydrophile Oberfläche des Films wurde eine Beschichtungslösung mit folgender Zusammensetzung aufgeschichtet und getrocknet, um eine Farbentwicklungsschicht mit einer Trockendicke von etwa 10 µm zu bilden.
Zusammensetzung:
Gelatine100 g Wasser900 g Oberflächenaktives Mittel
(Octylphenylpolyglycidol)  4 g Nitroblau-Tetrazolium  6 g Bisvinylsulfon (2,7%ige Lösung 74 g in Wasser : Aceton = 1 : 1, auf das Volumen bezogen) (pH = 6,5)
Nach dem Befeuchten der Farbentwicklungsschicht mit etwa 30 g/m2 Wasser wurde ein gewirkter Stoff, bestehend aus versponnenem Polyethylenterephthalat-Garn (36 Gauge, 50 Denier), unter Druck darauf aufgebracht, um eine Ausbreitungsschicht zu bilden.
Auf die Ausbreitungsschicht wurde eine Substratlösung mit folgender Zusammensetzung zu einer Bedeckung von 110 ml/m2 aufgeschichtet und getrocknet, um ein integrales vielschichtiges analytisches Element zur Bestimmung von CPK zu bilden.
Zusammensetzung:
Wasser180 g Imidazol  4 g Dinatriumcreatinphosphat  6 g Adenosin-diphosphat  2,4 g Adenosin-5′-phosphat  4 g Dinatrium-ethylendiamintetraacetat  1,6 g Magnesiumacetat  4 g Glucose  2 g NAD  2 g N-Acetylcystein  0,6 g Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase14000 U Hexokinase14000 U Diaphorase14000 U Oberflächenaktives Mittel
(Triton X-100; p-t-Octylphenoxypolyethoxyethanol;
Polymerisationsgrad: etwa 10)  3 g Acrylamid/Vinylpyrrolidon-Copolymeres
(Molverhältnis: 50 : 50,100 ml/100 ml 15%ige wäßrige Lösung)der obigen Zusammensetzung
10 µl 7%iges HSA, enthaltend 10 oder 950 IU/l (37°C), wurden auf die Ausbreitungsschicht fleckförmig aufgebracht. Das System wurde auf einer thermostatierten Platte bei 37°C stehengelassen, wobei das Verdampfen von Wasser in genügendem Maße verhindert wurde. Die reflektierenden optischen Dichten wurden bei 510 nm nach 2 und 5 min gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt. Die optische Dichte des analytischen Elements vor der Aufbringung der CPK enthaltenden Lösung war 0,43.
Tabelle V
Beispiel 6
Der gleiche Polyethylenterephthalat-Film, wie in Beispiel 1 verwendet, wurde mit einer wäßrigen Lösung mit der Zusammensetzung (a-iii) und sodann mit einer wäßrigen Lösung mit der Zusammensetzung (b-iii) beschichtet. Beide Zusammensetzungen werden nachstehend angegeben. Die Aufbringung erfolgte zu einer Trockendicke von 10 µm bzw. 3 µm und jeweils anschließendem Trocknen.
Zusammensetzung (a-iii):
Gelatine (alkalibehandelte deionisierte Gelatine) 100 g Oberflächenaktives Mittel 10G   5 g 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamido)-ethan   1,5 g Wasser1000 g Wäßrige verdünnte Natriumhydroxidlösung zur EinstellungpH = 7,0
Zusammensetzung (b-iii):
Gelatine 120 g Oberflächenaktives Mittel (Nonylphenoxypolyglycidol)  13 g Wasser2600 g Wäßrige verdünnte Natriumhydroxidlösung zur EinstellungpH = 7,0
Nachdem die Gelatineschicht mit 30 g/m2 einer 0,4%igen wäßrigen Lösung von Nonylphenoxypolyglycidol aufgequollen war, wurde darauf unter geringem Druck ein 230 µm dicker gewirkter Polyester-Stoff (36 Gauge, 50 Denier) auflaminiert. Danach wurde getrocknet.
Es wurden gesondert vier Arten einer wäßrigen Lösung (c-iii) hergestellt, indem eine Lösung von 2,28 g γ-Glutamyl-p- nitroanilid in 10 ml 2 N Chlorwasserstoffsäure und 10 ml Ethanol in homogener Lösung mit folgender Zusammensetzung dispergiert wurden. Der pH-Wert wurde mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 8,3 eingestellt.
Zusammensetzung (c-iii):
Tris(hydroxyethyl)aminomethan 30,3 g Glycylglycin  6,5 g Cetyltrimethylammoniumbromid  5 g Oberflächenaktives Mittel (Nonylphenoxypolyglycidol)  0,8 g Wasser200 g Hydroxypropylmethylcellulosegemäß Tabelle IV
Die resultierende wäßrige Lösung (c-iii) wurde gleichförmig auf den Stoff in einer Menge von 100 ml/m2 aufgeschichtet und getrocknet, um integrale vielschichtige analytische Elemente E, F, G und H zur Bestimmung der GGT-Aktivität herzustellen.
Ein Streifen für die GGT-Analyse wurde unter Verwendung der einzelnen analytischen Elemente E bis H in der gleichen Weise wie im Beispiel 2 hergestellt.
10 µl 7%iges HSA, enthaltend 172 oder 1110 IU/l GGT, wurden fleckförmig auf den resultierenden Streifen aufgebracht. Der Streifen wurde in einem geschlossenen Behälter bei 37°C stehengelassen und die reflektierende optische Dichte wurde bei 640 nm nach 2 und 5 min gemessen. Ihre Veränderung ist in Tabelle VI-1 angegeben.
Tabelle VI-1
Die entwickelte Fläche auf jedem der GGT-Analyseelemente wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI-2 zusammengestellt.
ProbeEntwickelte Fläche (cm2)
  E  2,30   F  1,61   G  1,27   H  1,10

Claims (10)

1. Trockenes analytisches Element für die Analyse einer enzymatischen Aktivität in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Träger und darauf mindestens eine poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht, die aus Fasern, welche Wasser nicht absorbieren, besteht, umfaßt, wobei die poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht ein Substrat für das zu analysierende Element und ein hydrophiles Polymeres in einer Menge enthält, die ausreicht, die Ausbreitungsfläche um mindestens 20% zu verringern.
2. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Polymere ausgewählt wird aus der Gruppe eines Polymeren, welches eine sich wiederholende Einheit der Formel (I) enthält, worin R1 ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe bedeutet und R2 und R3 je ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Kohlenwasserstoffgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe bedeuten oder worin R2 und R3 zusammen einen Ring bilden,
einem Polymeren, welches eine sich wiederholende Einheit der Formel (II) enthält, worin R4 ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe bedeutet und Q worin q eine ganze Zahl von 2 bis 4 bedeutet,
-NR5-CO-R6, worin R5 eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R6 ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder bedeutet, worin Z1 eine Atomgruppierung bedeutet, welche einen Lactamring, einen Oxazolidonring oder einen Pyridonring bildet,
und einem Cellulosederivat.
3. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R1 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet und R2 und R3 je ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine Benzylgruppe, eine Hydroxyethylgruppe, eine Cyclohexylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Piperidinogruppe oder eine Morpholinogruppe bedeuten, wobei die Gesamt-Kohlenstoffzahl in R2 und R3 bis zu einschließlich 12 beträgt.
4. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R4 ein Wasserstoffatom bedeutet und Q bedeutet, worin R5 eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe und R6 ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe bedeuten, oder bedeutet, worin Z1 eine Atomgruppierung bedeutet, welche einen 5- oder 6gliedrigen Lactamring oder einen Oxazolidonring bildet.
5. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Q den Rest einer Pyrrolidongruppe oder den Rest einer Oxazolidongruppe bedeutet.
6. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymere, welches die sich wiederholende Einheit der Formeln (I) oder (II) enthält, mindestens 20 Mol-% der sich wiederholenden Einheit der Formeln (I) oder (II) enthält.
7. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymere, welches die sich wiederholende Einheit der Formeln (I) oder (II) enthält, in einer Menge von 2 bis 15 g/m2 der flüssigkeitsausbreitenden Schicht vorhanden ist.
8. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Cellulosederivat Hydroxypropylcellulose oder Hydroxypropylmethylcellulose ist.
9. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Cellulosederivat in einer Menge von 0,5 bis 15 g/m2, bezogen auf die flüssigkeitsausbreitende Schicht, vorhanden ist.
10. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Cellulosederivat in einer Menge von 0,7 bis 10 g/m2, bezogen auf die flüssigkeitsausbreitende Schicht, vorhanden ist.
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