DE3717913C2 - Trockenes analytisches Element für die Enzymanalyse - Google Patents

Trockenes analytisches Element für die Enzymanalyse

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Description

Die Erfindung betrifft ein trockenes analytisches Element, welches für die Bestimmung bzw. Analyse der enzymatischen Aktivität in einer Flüssigkeit geeignet ist.
Es sind trockene analytische Elemente, insbesondere inte­ grale mehrschichtige trockene analytische Elemente, bekannt und werden beispielsweise in der US-Patentschrift 3 992 158 und in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 1643/81 beschrieben (der Ausdruck "OPI", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bedeutet "nichtgeprüfte veröffent­ lichte Anmeldung"). In Analytical Chemistry, Bd. 55, Nr. 4, 498A-514A (1983) wird beschrieben, daß ein integrales mehr­ schichtiges trockenes analytisches Element für die Analyse von Enzymen in Serum verwendet werden kann.
Das integrale mehrschichtige trockene analytische Element enthält im allgemeinen eine poröse, eine Flüssigkeit aus­ breitende Schicht mit einer Flüssigkeitsmeßfunktion als alleroberste Schicht. Wird eine Flüssigkeit in einer Menge V in der flüssigkeitsausbreitenden Schicht entwickelt, ist die entwickelte Fläche a proportional zu V (V = ka). Da die Menge an Flüssigkeit per Einheitsfläche durch die Proportio­ nalitätskonstante k zwischen der Ausbreitungsfläche a und der Flüssigkeitsmenge V bestimmt wird, hängt die analytische Empfindlichkeit von dem Proportionalitätskonstante k ab. Wenn die Proportionalitätskonstante k geringer wird, wird die Men­ ge an Flüssigkeit pro Einheitsfläche größer, so daß die enzymatische Aktivität pro Einheitsfläche höher wird und die Empfindlichkeit des analytischen Elements steigt.
Ein integrales mehrschichtiges trockenes analytisches Ele­ ment, bei dem die poröse, die Flüssigkeit ausbreitende Schicht Fasern, die Wasser nicht absorbieren, enthält, wird in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 164356/80 und 222769/85 beschrieben. Wasser nicht absorbierende, lange Fasern, wie Polyester, Polyamide (beispielsweise Nylon) etc., halten wenig Wasser zurück, und wenn sie gewebt oder gestrickt oder gewirkt sind, ergeben sie eine einheitliche Ausbreitungsschicht und können daher in trockenen analyti­ schen Elementen verwendet werden, bei denen ein Verfahren ausgenutzt wird, bei dem die Reaktionsgeschwindigkeit eine Rolle spielt. Jedoch besitzt eine poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht, die aus Fasern, die Wasser nicht ab­ sorbieren, besteht, eine große Proportionalitätskonstante k, so daß man keine hohe analytische Empfindlichkeit er­ hält.
Die US-A-4 258 001 betrifft ein analytisches Element, des­ sen Ausbreitungsschicht ein wasserundurchlässiges Polyme­ res, welches in Wasser auch nicht quellbar ist, aufweist (vgl. Spalte 10, Zeilen 17-21 und Spalte 11, Zeilen 4-6 des Dokuments).
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein integrales mehrschichtiges trockenes analytisches Element für die Analyse enzymatischer Aktivitäten zur Verfügung zu stellen, wobei das Reaktionsgeschwindigkeitsverfahren ausgenutzt wird. Das trockene analytische Element soll ei­ ne hohe Empfindlichkeit und bevorzugt eine hohe Empfind­ lichkeit zusammen mit einer hohen Reproduzierbarkeit auf­ weisen.
Es wurde jetzt gefunden, daß die obige Aufgabe durch ein trockenes analytisches Element für die Analyse einer enzy­ matischen Aktivität in einer Flüssigkeit gelöst werden kann, welches einen Träger und darauf mindestens eine porö­ se, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht, die aus Fasern, welche Wasser nicht absorbieren, besteht, umfaßt, wobei
die poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht ein Substrat für das zu analysierende Enzym und ein wasserlösliches hydrophiles Polymeres in einer Menge enthält, die ausreicht, die Ausbreitungsfläche um mindestens 20% zu verringern, wobei
das wasserlösliche hydrophile Polymere ausgewählt wird aus der Gruppe eines Polymeren, welches eine sich wiederholende Einheit der Formel (I)
enthält, worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe bedeutet, und R² und R³ je ein Wasserstoffatom,
eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Kohlenwasserstoffgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe
bedeuten, oder worin R² und R³ zusammen einen Ring bilden, und einem Polymeren, welches eine sich wiederholende Einheit der Formel (II)
enthält, worin R⁴ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe bedeutet und Q
worin q eine ganze Zahl von 2 bis 4 bedeutet,
-NR⁵-CO-R⁶, worin R⁵ eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R⁶ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder
bedeutet, worin Z¹ eine Atomgruppierung bedeutet, welche einen Lactamring, einen Oxazolidonring oder einen Pyridonring bildet.
In der Formel (I) enthält die durch R¹ dargestellte Alkyl­ gruppe bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome und besonders be­ vorzugt ist sie ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe.
Der durch R² oder R³ dargestellte aliphatische Kohlenwasser­ stoffrest ist bevorzugt eine Alkyl- oder Cycloalkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Der aliphatische Kohlenwas­ serstoffrest kann mit einer Arylgruppe, beispielsweise ei­ ner Phenylgruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, beispielsweise einer Methoxy­ gruppe, einem Halogenatom, beispielsweise einem Chloratom, einer Alkylamino- oder Dialkylaminogruppe mit 1 bis 4 Koh­ lenstoffatomen in dem Alkylmolekülteil davon, beispielswei­ se einer Dimethylaminogruppe, und durch ähnliche Gruppen substituiert sein. Wenn R² oder R³ einen aromatischen Koh­ lenwasserstoffrest bedeuten, enthält dieser bevorzugt 6 bis 7 Kohlenstoffatome. Der aromatische Kohlenwasserstoffrest kann durch eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, beispielsweise eine Methylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, beispielsweise eine Methoxygruppe, ein Halogenatom, beispielsweise ein Chloratom, eine Alkylamino- oder Dialkylaminogruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in dem Alkylmolekülteil davon, beispielsweise eine Dimethylaminogruppe, und durch ähnliche Gruppen substituiert sein. Wenn R² oder R³ eine heterocycli­ sche Gruppe bedeuten, kann diese beispielsweise ein 5- oder 6gliedriger Ring sein, welche mindestens ein Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatom enthält. Spezifische Beispie­ le von bevorzugten Gruppen für R² oder R³ sind ein Wasser­ stoffatom, eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine Ben­ zylgruppe, eine Hydroxyethylgruppe, eine Cyclohexylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Piperidinogruppe und eine Morpho­ linogruppe.
Die Gesamt-Kohlenstoffzahl, die in R² und R³ vorhanden ist, beträgt bevorzugt bis zu 12 und besonders bevorzugt bis zu 6.
Das Polymere, welches die durch die Formel (I) dargestellte, sich wiederholende Einheit enthält, kann ein Homopolymeres mit der sich wiederholenden Einheit der Formel (I), ein Co­ polymeres, welches mindestens zwei sich wiederholende Ein­ heiten der Formel (I) enthält, und ein Copolymeres, welches mindestens eine sich wiederholende Einheit der Formel (I) und eine andere Monomereneinheit, die sich von einer unge­ sättigten Verbindung, die durch Addition polymerisierbar ist, ableitet, sein.
Spezifische Beispiele für Monomere, welche die sich wieder­ holende Einheit der Formel (I) aufweisen, sind Acrylamid, N-Methylacrylamid, N-Ethylacrylamid, N-(n-Propyl)-acrylamid, N-Isopropylacrylamid, N-(n-Butyl)-acrylamid, N-(t-Butyl)- acrylamid, N-(n-Octyl)-acrylamid, N-(Isoamyl)-acrylamid, N-(t-Octyl)-acrylamid, N-Laurylacrylamid, N-Cyclo­ hexylacrylamid, N-Benzylacrylamid, N-(β-Dimethylaminoethyl)- acrylamid, N-Phenylacrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-hydroxy­ butylacrylamid), N,N-Dimethylmethacrylamid, N,N-Diethyl­ acrylamid, N,N-Dioctylacrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-oxobutyl)- acrylamid, N-Acryloylmorpholin, N-Methyl-N′-acryloylpipera­ zin, N-Ethyl-N′-acryloylpiperazin, N-Acryloylpiperidin, N-(β-Morpholinoethyl)-acrylamid, N-(3,5-Difflethylmorpholino­ ethyl)-acrylamid, Methacrylamid, N-Methylmethacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-(t-Butyl)-methacrylamid, N-(t-Octyl)- methacrylamid, N-Benzylmethacrylamid, N-Cyclohexylmetha­ crylamid, N-Phenylmethacrylamid, N,N-Dimethylmethacrylamid, N,N-Diethylmethacrylamid, N,N-Dipropylmethacrylamid, N-Methyl-N-phenylmethacrylamid, N-Methacryloyl-N′-methyl­ piperazin, N-Methacryloylpiperidin, 4-Methacryloyl-2,6-di­ methylmorpholin, N-Methacryloyl-N′-ethylpiperazin etc.
Die durch Addition polymerisierbaren ungesättigten Verbin­ dungen, welche mit den Monomeren, die die sich wiederholen­ de Einheit der Formel (I) ergeben, verwendet werden können, sind Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Itaconsäure, Crotonsäure, Acrylester (beispielsweise Methyl­ acrylat, Ethylacrylat, n-Propylacrylat, Isopropylacrylat, n-Butylacrylat, Octylacrylat, 2-Chlorethylacrylat, 2-Cyano­ ethylacrylat, N-(β-Dimethylaminoethyl)-acrylat, Benzyl­ acrylat, Cyclohexylacrylat, Phenylacrylat etc.), Methacryl­ ester (beispielsweise Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, n-Propylmethacrylat, Isopropylmethacrylat, n-Butylmetha­ crylat, Octylmethacrylat, Cyclohexylmethacrylat, Benzyl­ methacrylat, 3-Sulfopropylmethacrylat etc.), Allylverbindun­ gen (beispielsweise Allylbutylether, Allylphenylether etc.), Vinylether (beispielsweise Methylvinylether, Butylvinyl­ ether, Octylvinylether, Methoxyethylvinylether, 2-Chlorethyl­ vinylether, 2-Hydroxyethylvinylether, (2-Dimethylamino­ ethyl)-vinylether, Vinylphenylether, Vinyltollylether, Vi­ nylchlorphenylether etc.), p-Vinylbenzoesäure, Vinylester (beispielsweise Methyl-p-vinylbenzoat, etc.), heterocycli­ sche Vinylverbindungen (beispielsweise Vinylpyridin, N-Vi­ nylimidazol, N-Vinylcarbazol, N-Vinylpyrrolidon, N-Vinyl­ oxazolidon etc.), Methylvinylketon, Phenylvinylketon, Styrol oder Derivate davon (beispielsweise Chlormethyl­ styrol, p-Methylstyrol etc.), Maleinsäureester (beispiels­ weise Ethylmaleat, Butylmaleat, Dibutylmaleat, Octylmaleat etc.), Fumarsäureester (beispielsweise Ethylfumarat, Di­ butylfumarat, Octylfumarat etc.), Itaconsäureester (bei­ spielsweise Methylitaconat, Ethylitaconat, Diethylitaconat etc.), Crotonamid, Crotonsäureester (beispielsweise Butyl­ crotonat, Glycerinmonocrotonat etc.), Methylsorbat, Ole­ fine (beispielsweise Ethylen, Propylen, 1-Buten, Dicyclo­ pentadien, 4-Methyl-1-hexen, 4,4-Dimethyl-1-penten etc.), halogenierte Olefine (beispielsweise Vinylchlorid, Vinyli­ denchlorid, Isopren etc.), ungesättigte Nitrile (beispiels­ weise Acrylnitril, Methacrylnitril etc.) und ähnliche Ver­ bindungen. Diese Comonomeren können einzeln oder als Ge­ misch aus zwei oder mehreren verwendet werden.
In der Formel (II) kann, wenn Q -NR⁵-CO-R⁶ bedeutet, R⁵ eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und bevor­ zugt eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe bedeuten. R⁶ bedeutet ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und bevorzugt ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe.
Bevorzugt unter den sich wiederholenden Einheiten der For­ mel (II) sind solche, worin R⁴ ein Wasserstoffatom bedeutet und Q
bedeutet, worin R⁵ eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe bedeutet und R⁶ ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder Ethylgruppe bedeutet, oder
bedeutet, worin Z¹ eine Atomgruppierung bedeutet, welche einen 5- oder 6gliedrigen Lactamring oder Oxazolidonring bildet.
Die am meisten bevorzugte Einheit unter diesen ist eine sich wiederholende Einheit, worin Q den Rest einer Pyrroli­ dongruppe oder den Rest einer Oxazolidongruppe bedeutet.
Das Polymere, welches sich wiederholende Einheiten der For­ mel (II) enthält, kann ein Homopolymeres oder ein Copolyme­ res sein, welches mindestens zwei sich wiederholende Ein­ heiten der Formel (II) enthält, oder es kann ein Copolyme­ res sein, welches mindestens eine sich wiederholende Ein­ heit der Formel (I) und eine weitere sich wiederholende Einheit enthält, die sich von ungesättigten Verbindungen, die durch Addition polymerisierbar sind, ableitet.
Monomere, welche die sich wiederholende Einheit der Formel (II) ergeben, werden durch die Formel (III)
dargestellt, worin R⁴ und Q die zuvor gegebenen Definitio­ nen besitzen.
Spezifische Beispiele für Monomere, die durch die Formel (III) dargestellt werden, sind Vinylacetat, N-Vinylsuccin­ imid, N-Vinylglutaramid, N-Vinyladipimid, N-Methyl-N-methyl- N-vinylformamid, N-Methyl-N-vinylacetamid, N-Ethyl-N-vinyl­ acetamid, N-Methyl-N-vinylpropionamid, N-Vinylpyrrolidon, N-Vinylpiperidon, N-Vinyl-ε-caprolactam, N-Vinyloxazolidon, N-Vinylmorpholin, N-Vinyl-2-pyridon etc. Bevorzugt unter diesen sind Vinylacetat, N-Vinylsuccinimid, N-Vinylglutar­ imid, N-Methyl-N-vinylacetamid, N-Ethyl-N-vinylacetamid, N-Vinylpyrrolidon, N-Vinylpiperidon und N-Vinyloxazolidon. Das darunter am meisten bevorzugte Monomere ist N-Vinyl­ pyrrolidon.
Die durch Addition polymerisierbaren ungesättigten Verbin­ dungen, die mit dem Monomeren der Formel (III) polymerisier­ bar sind, schließen die Monomeren ein, die die wiederkehren­ de Einheit der Formel (I) liefern und die damit copolymeri­ sierbaren Monomeren ein. Bevorzugte Beispiele sind Acryl­ säure, Methacrylsäure, Maleinsäureanhydrid, Acrylamid, N- Methylacrylamid, N,N-Dimethylacrylamid, N-Ethylacrylamid, N-(β-Hydroxyethyl)-acrylamid, Methacrylamid, N-Methylmeth­ acrylamid und ähnliche Verbindungen. Vom Standpunkt der hydrophilen Eigenschaften des gebildeten Polymeren aus sind bevorzugte Comonomere unter diesen Acrylsäure, Methacryl­ säure, 2-Hydroxyethylacrylat, 2-Methoxyethylacrylat, Sulfo­ propylacrylat, Acrylamid, Dimethylacrylamid, 2-Acryloyl­ amino-2-methylpropansulfonsäure, Hydroxyethylacrylamid, Meth­ acrylamid, Methylvinylether, Natriumstyrolsulfonat, N-Vinyl-3,5-di­ methyltriazol und Maleinsäureanhydrid.
Das Copolymerisationsverhältnis des Copolymeren, welches die sich wiederholende Einheit der Formeln (I) oder (II) aufweist, ist nicht besonders beschränkt, aber der Gehalt an sich wie­ derholender Einheit der Formeln (I) oder (II) in dem Copoly­ meren liegt bevorzugt im Bereich von 20 bis 100 Mol.-% und besonders bevorzugt im Bereich von 50 bis 100 Mol.-%.
Das Polymere, welches eine sich wiederholende Einheit der Formeln (I) oder (II) aufweist, kann nach den Verfahren synthetisiert werden, wie sie in den britischen Patent­ schriften 1 211 039 und 961 395, der japanischen Patent­ publikation Nr. 29195/72, den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 76593/73, 92022/73, 21134/75 und 120634/75, den US-Patentschriften 2 681 897, 3 227 672, 3 290 417, 3 262 919, 3 245 932 und 3 230 275, John C. Petropoulosu et al., Official Digest, Bd. 33, 719-736 (1961), Shunsuke Murahashi et al. (ed.), Gosei Kobunshi, Bd. 1, 246-290, ibid, Bd. 3, 1-108 etc. beschrieben werden. Die Polymeri­ sation wird im allgemeinen bei einer Temperatur von 20 bis 180°C und bevorzugt von 40 bis 120°C unter Verwendung von 0,05 bis 5 Gew.-% eines Radikal-Polymerisationsinitiators, bezogen auf die Monomeren, durchgeführt. Die Initiatoren, die beispielsweise verwendet werden können, sind Azobis­ verbindungen, Peroxide, Hydroperoxide, Redox-Katalysatoren, wie Kaliumpersulfat, t-Butylperoctoat, Benzoylperoxid, Azobis­ isobutylonitril etc.
Typische Beispiele für Polymere mit einer sich wiederholen­ den Einheit der Formel (I) sind:
  • (1) Poly(N-ethylacrylamid),
  • (2) Polyacrylamid,
  • (3) Poly(N,N-dimethylacrylamid),
  • (4) Polymethacrylamid,
  • (5) Acrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (40 : 60, ausgedrückt als Mol),
  • (6) N-N-Dimethylacrylamid/Methylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
  • (7) Acrylamid/Butylacrylat-Copolymeres (60 : 40, ausgedrückt als Mol),
  • (8) N-Acrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausge­ drückt als Mol),
  • (9) N-N-Dimethylacrylamid/Maleinsäure-Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol),
  • (10) Acrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (40 : 60, ausgedrückt als Mol)
  • (11) Acrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
  • (12) N-Methylacrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
  • (13) N-Ethylacrylamid/Acrylsäure-Copolymeres (30 : 70, aus­ gedrückt als Mol),
  • (14) N-Methylmethacrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
  • (15) N-N-Dimethylmethacrylamid/Propylacrylat-Copolymeres (35 : 65, ausgedrückt als Mol),
  • (16) N-Acryloylmorpholin/Ethylacrylat-Copolymeres (40 : 60, ausgedrückt als Mol),
  • (17) Poly[N-(3-dimethylaminopropyl)acrylamid] und
  • (18) Poly(N-methacryloylpiperazin).
Typische Beispiele für ein Polymeres, welche die sich wie­ derholende Einheit der Formel (II) enthält, sind:
  • (19) Poly(N-vinylpyrrolidon),
  • (20) Poly(N-vinyloxazolidon),
  • (21) Poly(N-vinylsuccinimid),
  • (22) Poly(N-vinylglutarimid),
  • (23) Poly(N-vinylpiperidon),
  • (24) Poly(N-vinyl-ε-caprolactam),
  • (25) Poly(N-methyl-N-vinylacetamid),
  • (26) Poly(N-ethyl-N-vinylacetamid),
  • (27) Vinylalkohol/N-Vinylpyrrolidon-Copolymeres (30 : 70, ausgedrückt als Mol),
  • (28) N-Vinylpyrrolidon/Vinylacetat-Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol),
  • (29) N-Vinylpyrrolidon/2-Hydroxyethylacrylat-Copolymeres (80 : 20, ausgedrückt als Mol),
  • (30) N-Vinylpyrrolidon/Acrylsäure-Copolymeres (90 : 10, ausgedrückt als Mol),
  • (31) N-Vinylpiperidon/2-Methoxyethylacrylat-Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol),
  • (32) N-Vinylpiperidon/Methylvinylether-Copolymeres (90 : 10, ausgedrückt als Mol),
  • (33) N-Vinyloxazolidon/Vinylalkohol-Copolymeres (65 : 35, ausgedrückt als Mol),
  • (34) N-Vinyloxazolidon/Acrylsäure-Copolymeres (80 : 20, ausgedrückt als Mol),
  • (35) N-Vinylpyrrolidon/N-Vinylpiperidon/Hydroxyethyl­ acrylat-Copolymeres (40 : 30 : 30, ausgedrückt als Mol),
  • (36) Vinylalkohol/Vinylacetat/N-Vinyl-2-pyridon-Copoly­ meres (70 : 25 : 5, ausgedrückt als Mol),
  • (37) N-Vinylpyrrolidon/2-Hydroxyethylacrylat/Vinylacetat Copolymeres (70 : 20 : 10) und
  • (38) N-Vinylpyrrolidon/Vinylalkohol/Vinylpropionat/ Natriumstyrolsulfonat-Copolymeres (40 : 40 : 5 : 15, ausge­ drückt als Mol).
Spezifische Beispiele für Copolymere, die eine sich wieder­ holende Einheit der Formel (II) und andere, durch Addition polymerisierbare ungesättigte Comonomere enthalten, sind:
  • (39) N-Vinylpyrrolidon/Acrylamid-Copolymeres (60 : 40, ausgedrückt als Mol),
  • (40) N-Vinylpyrrolidon/2-Acryloylamino-2-methylpropan­ sulfonsäure-Copolymeres (75 : 25, ausgedrückt als Mol),
  • (41) N-Vinylpyrrolidon/2-Methacrylamid-Copolymeres (60 : 40, ausgedrückt als Mol),
  • (42) N-Vinyloxazolidon/N-(2-Hydroxyethyl)-acrylamid- Copolymeres (60 : 40, ausgedrückt als Mol),
  • (43) N-Vinyloxazolidon/N-(2-Hydroxyethyl)-acrylamid- Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol),
  • (44) N-Vinylpyrrolidon/N-Vinylmorpholin/Acrylamid- Copolymeres (50 : 20 : 30, ausgedrückt als Mol),
  • (45) N-Vinylsuccinimid/N-Vinyl-ε-caprolactam/Acrylamid- Copolymeres (40 : 20 : 40, ausgedrückt als Mol),
  • (46) N-Vinyloxazolidon/Acrylamid/Acrylsäure-Copolymeres (60 : 20 : 20, ausgedrückt als Mol),
  • (47) N-Vinylpyrrolidon/Acrylamid/Vinylacetat/Acrylsäure- Copolymeres (60 : 20 : 10 : 10, ausgedrückt als Mol) und
  • (48) N-Vinylpyrrolidon/Dimethylacrylamid-Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol).
Die Polymeren, welche die sich wiederholenden Einheiten, die durch die Formeln (I) oder (II) dargestellt werden, ent­ halten, besitzen normalerweise ein Molekulargewicht von 2000 oder mehr und bevorzugt von 8000 bis 700.000.
Jedes der Polymeren mit den sich wiederholenden Einheiten, die durch die Formeln (I) oder (II) dargestellt werden, besitzt relativ hohe hydrophile Eigenschaften. Die Einar­ beitung dieser Polymeren in eine Ausbreitungsschicht kann erfolgen, indem man das Polymere in Wasser oder in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel löst, die wäßrige oder organische Lösungsmittellösung auf die Aus­ breitungsschicht durch Aufstreichen oder Eintauchen auf­ bringt und trocknet. Als organische Lösungsmittel kann man beispielsweise Methylacetat, Ethylacetat, Butylacetat, Methylisobutylketon, β-Ethoxyethylacetat, Methylcarbitol, Dioxan, Cyclohexan, Cyclohexanon, Dipropylenglykol, N,N- Dimethylformamid, Propanol, Isopropanol, Methanol, Butanol, sec-Butanol, Ethylenglykolmonomethylether, Ethylenglykol­ monobutylether und ähnliche Verbindungen verwenden.
Diese Polymeren werden zu der Ausbreitungsschicht in einer Menge zugegeben, die ausreicht, um die Ausbreitungsfläche um mindestens 20% zu verringern. Eine solche Menge liegt bevorzugt im Bereich von 2 bis 15 g/m².
Das Substrat für ein Enzym ist ein solches, das irgendeine Wirkung des spezifischen Enzyms aufnimmt, z. B. Alanin für Alanin-Aminotransferase, Aspartat für Aspartat-Aminotrans­ ferase, γ-Glutamyl-p-nitroanilid für γ-Glutamyltransferase, Lactat für Lactat-Dehydrogenase, Pyrophosphat (ATP, ADP), Monophosphat und p-Nitrophenylphosphate für alkalische Phos­ phatase, Stärke für L-Amylase etc.
Die vorliegende Erfindung kann bei einer großen Vielzahl bekannter trockener analytischer Elemente verwendet werden und insbesondere bei Elementen, die einen festen Träger ent­ halten, der sowohl gegenüber dem Nachweisreagenssystem als auch der zu analysierenden Flüssigkeit permeabel ist. Die Elemente enthalten im allgemeinen einen Träger, eine Nach­ weisschicht und/oder eine reaktive Reagensschicht und eine poröse Flüssigkeitsausbreitungsschicht. Die Elemente kön­ nen weiter eine Reflexionsschicht, eine Klebstoffschicht, eine Filterschicht, eine wasserabsorbierende Schicht, eine Unterschicht und andere bekannte Schichten enthalten. Bei­ spiele solcher analytischer Elemente werden in den US-Pa­ tentschriften 3 992 158 und 4 042 335 und in der japani­ schen Patentanmeldung (OPI) Nr. 164356/80 beschrieben.
Wenn das erfindungsgemäße trockene analytische Element ei­ nen Träger enthält, sind praktische Ausführungsformen eines solchen Elements (1) eine Struktur, die einen Träger umfaßt, der darauf eine Nachweisschicht und weiter darauf eine eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht aufweist, (2) eine Struktur, die einen Träger mit darauf einer reaktiven Reagensschicht und weiter einer eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht darauf aufweist, (3) eine Struktur, die einen Träger und darauf einer Nachweisschicht, einer reaktiven Reagensschicht und einer eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht, in dieser Rei­ henfolge, aufweist und (4) eine Struktur, die einen Träger, darauf eine Nachweisschicht, eine zweite reaktive Reagens­ schicht, eine erste reaktive Reagensschicht und eine eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht, in dieser Reihenfolge, aufweist.
In den Strukturen (1) bis (4) können eine Lichtabschirmungs­ schicht und/oder eine Filterschicht zwischen der Nachweis­ schicht und der reaktiven Reagensschicht oder der eine Flüssigkeit ausbreitenden Schicht, zwischen der reaktiven Reagensschicht und der die Flüssigkeit ausbreitenden Schicht oder zwischen der zweiten reaktiven Reagensschicht und der ersten reaktiven Reagensschicht vorhanden sein.
Bei der vorliegenden Erfindung können das hydrophile Poly­ mere, welches die sich wiederholenden Einheiten der Formeln (I) oder (II) enthält, nicht nur in die Flüssigkeitsausbreitungsschicht, sondern ebenfalls in andere Schichten, beispielsweise in einer Reagensschicht, eingearbeitet sein.
Es ist bevorzugt, daß jede der zuvor erwähnten Schichten und eine wasserabsorbierende Schicht auf einem Träger vor­ gesehen sind, der gegenüber Licht permeabel ist, jedoch ge­ genüber Wasser nicht permeabel ist, und der gegebenenfalls eine Unterschicht etc. aufweist.
Die wasserabsorbierende Schicht ist eine Schicht, welche gegenüber Wasser permeabel ist, die aber im wesentlichen für die Verbindung, die schließlich nachgewiesen werden soll, undurchlässig ist. Diese Schicht wird bevorzugt zwischen dem Träger und einer Nachweisschicht oder einer Reagens­ schicht in den Fällen vorgesehen, wo die Substanz, die schließlich nachgewiesen werden soll, eine kaum diffusions­ fähige hochpolymere Substanz ist. Eine solche wasserabsor­ bierende Schicht enthält bevorzugt ein filmbildendes hydro­ philes Polymeres, welches durch das absorbierte Wasser quillt.
Die Nachweisschicht ist eine Schicht, welche im wesentlichen für die Substanz, die schließlich nachgewiesen werden soll, permeabel ist und die kein reaktives Reagens enthält. Diese Schicht enthält ein hydrophiles Polymeres als Hauptbestand­ teil und gegebenenfalls ein oberflächenaktives Mittel (kationisch, amphoter oder nichtionisch), einen Härter, ein Puffermittel etc.
Das hydrophile Polymere, welches für die wasserabsorbierende Schicht oder Nachweisschicht verwendet werden kann, ist ein natürliches oder synthetisches hydrophiles Polymeres, welches normalerweise einen Quellgrad von etwa 1,5 bis etwa 20 und bevorzugt von etwa 2,5 bis etwa 15 aufweist, wenn es in Wasser absorbiert. Beispiele solcher hydrophiler Polyme­ ren sind Gelatine (beispielsweise mit Säure verarbeitete bzw. behandelte Gelatine, entionisierte Gelatine etc.), ein Gelatinederivat (beispielsweise mit Phthalsäure oder einem ihrer Derivate umgesetzte Gelatine etc.), Agarose, Pluran, Pluranderivate, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Polyvinyl­ pyrrolidon etc.
Eine geeignete Trockendicke der Nachweisschicht oder der wasserabsorbierenden Schicht liegt im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 µm und bevorzugt von etwa 3 bis etwa 30 µm.
Eine Klebstoffschicht kann gebildet werden, um die Ausbrei­ tungsschicht an die Nachweisschicht oder die wasserabsor­ bierende Schicht entweder direkt oder über eine Lichtab­ schirmungsschicht, eine Filterschicht, eine reaktive Rea­ gensschicht etc. anzuheften. Die Klebstoffschicht enthält vorzugsweise ein hydrophiles Polymeres, welches bei der Be­ netzung oder Quellung mit Wasser an der Ausbreitungsschicht haftet. Ein solches hydrophiles Polymeres kann eines von denen sein, die für die wasserabsorbierende Schicht oder für die Nachweisschicht aufgezählt wurden. Bevorzugt von diesen sind Gelatine, Gelatinederivate, Polyacrylamid und ähnliche. Die Klebstoffschicht besitzt üblicherweise eine Trockendicke von etwa 0,5 bis etwa 20 µm und bevorzugt von etwa 1 bis etwa 10 µm. Die Klebstoffschicht kann nicht nur auf der Nachweisschicht oder wasserabsorbierenden Schicht vorgesehen sein, sondern sie kann ebenfalls zwischen ande­ ren benachbarten Schichten, beispielsweise zwischen einer reaktiven Reagensschicht, welche eine benachbarte Schicht ist, vorgesehen sein, um eine Haftung zwischen den Schich­ ten sicherzustellen. Die Klebstoffschicht kann durch Be­ schichten einer wäßrigen Lösung, welche das zuvor erwähnte hydrophile Polymere und gegebenenfalls ein oberflächenak­ tives Mittel etc. enthält, auf der Nachweisschicht, der reaktiven Reagensschicht etc. nach irgendeinem gut bekann­ ten Beschichtungsverfahren hergestellt werden.
Die reaktive Reagensschicht des erfindungsgemäßen trockenen analytischen Elements enthält ein reaktives Reagens, das eine erfaßbare Komponente, z. B. eine Substanz, die eine Farbe bildet oder verändert, eine fluoreszierende Substanz erzeugt, was z. B. durch Umsetzung mit einem Produkt ge­ schehen kann, das durch eine Enzymreaktion mit einem Sub­ strat gebildet wird und das erforderlichenfalls ein hydrophiles Polymeres, ein Puffermittel, lichtabschirmende feine Teilchen (entweder reflektierend oder absorbierend) und dergleichen enthalten kann.
Beispiele für hydrophile Polymere, welche in der reaktiven Reagensschicht verwendet werden können, sind Stärke, Cellu­ lose, Agarose, Gelatine und ihre Derivate (beispielsweise die hydroxymethylierten Derivate, hydroxypropylierten Deri­ vate etc.), Acrylamid-Polymere, Copolymere von Acrylamid und verschiedenen Vinylmonomeren, Polyvinylalkohol, Copoly­ mere von Vinylpyrrolidon und verschiedenen Vinylmonomeren, Acrylat-Polymere, Copolymere von Acrylaten und verschiede­ nen Vinylmonomeren und ähnliche. Von diesen hydrophilen Polymeren sind Polyvinylalkohol, Vinylpyrrolidon-Polymere, Acrylamid-Polymere und Cellulosederivate bevorzugt.
Die Puffermittel, welche in der reaktiven Reagensschicht verwendet werden können, sind übliche, und Beispiele hier­ für sind Carbonate, Borate, Phosphate, Good′s-Puffermittel etc. Die Auswahl des Puffermittels, welches verwendet wird, kann entsprechend der Literaturstelle, beispielsweise Takeichi Horio et al., Tanpakushitsu Kiso no Kisojikkenho, Nankodo (1981), erfolgen.
Die Lichtabschirmungsschicht ist bevorzugt eine wasserpermeab­ le Schicht, welche ein hydrophiles Polymeres als Bindemit­ tel und darin dispergiert lichtreflektierende feine Teil­ chen enthält. Wenn in der Nachweisschicht eine nachweis­ bare Änderung erzeugt wird, wie eine Farbänderung, Farbent­ wicklung usw., wird diese durch Reflexionscolorimetrie von der Seite des Trägers, der Lichtdurchlässigkeitseigenschaf­ ten besitzt, gemessen, wobei die Lichtabschirmungsschicht, welche feine reflektierende Teilchen enthält, dazu dient, die Farbe eines wäßrigen Flüssigkeitsflecks, der aufgetra­ gen wurde und in der Ausbreitungsschicht entwickelt wurde, abzuschirmen. Dieses wäre die rote Farbe des Hämoglobins bei der Analyse von Gesamtblut. Diese Schicht wirkt ebenfalls als Lichtreflexionsschicht oder als Hintergrundschicht. Beispiele für feine lichtreflektierende Teilchen, die in der Lichtabschirmungsschicht verwendet werden können, sind feine Pigmentteilchen, wie feine Titandioxidteilchen (des Rutiltyps, Anatastyps oder Brookit-Typs, feine Kristallkör­ ner mit einer Korngröße von etwa 0,1 bis etwa 1,2 µm), feine Bariumsulfatteilchen, feine Aluminiumteilchen etc., wobei feine Titandioxidteilchen und feine Bariumsulfatteilchen bevorzugt sind.
Die oben beschriebenen feinen Lichtabschirmungsteilchen kön­ nen ebenfalls in der reaktiven Reagensschicht oder in der Ausbreitungsschicht verwendet werden.
Das hydrophile Polymere, das als Bindemittel in der Lichtab­ schirmungsschicht verwendet wird, kann beispielsweise eines von denen sein, wie sie für die Nachweisschicht aufgezählt wurden, und zusätzlich kann man schwach hydrophile regene­ rierte Cellulose, Celluloseacetat und ähnliche Verbindungen verwenden. Unter diesen sind Gelatine, Gelatinederivate und Polyacrylamid bevorzugt. Von diesen können Gelatine und Gelatinederivate an sich bekannte Gelatinehärter enthalten.
Die oben beschriebene Lichtabschirmungsschicht kann herge­ stellt werden, indem man eine wäßrige Dispersion, die die feinen Lichtabschirmungsteilchen und das hydrophile Polymere enthält, auf die Nachweisschicht, die reaktive Reagens­ schicht oder eine ähnliche Schicht in an sich bekannter Wei­ se aufträgt und anschließend trocknet.
Als Fasern, welche Wasser nicht absorbieren, können in der erfindungsgemäßen Ausbreitungsschicht Polyesterfasern, wie Polyethylenterephthalat, Polyamidfasern, wie Nylon, Acryl­ fasern, Polyethylenfasern, Polypropylenfasern, Cellulose­ acetatfasern und ihre Gemische verwendet werden. Die Aus­ breitungsschicht kann aus irgendeinem nichtgewebten bzw. nichtgewirkten Flächengebilde bzw. Textilmaterial aus ge­ webtem bzw. gewirktem Textilmaterial und gestricktem bzw. gewirktem Textilmaterial bzw. Flächengebilden, die aus die­ sen Fasern hergestellt worden sind, bestehen. Das Flächen­ gebilde oder Textilmaterial, welches verwendet wird, wird bevorzugt einer Entwachsungsstufe unterworfen, wie einem Waschen mit Wasser, damit im wesentlichen die Fette und Öle, die an ihm, bedingt durch die Herstellung der Garne oder des gewebten oder gestrickten bzw. gewirkten Textilmaterials, haften, entfernt werden. Erfindungsgemäß wird ein hydrophi­ les Polymeres, ausgewählt unter den Polymeren, welche die sich wiederholenden Einheiten der Formeln (I) oder (II) ent­ halten, in die Hohlräume bzw. Leerstellen der faserhaltigen Ausbreitungsschicht in Form eines Gels eingearbeitet.
Das trockene analytische Element für die Analyse enzymati­ scher Aktivitäten gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt eine hohe analytische Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit. Diese Effekte sind insbesondere in analytischen Elementen mit einer Ausbreitungsschicht ausgeprägt, die ein selbstentwickelbares Substrat enthält, welches eine gefärb­ te Substanz bei der enzymatischen Reaktion freisetzt, wie bei einem Element für die Analyse der GGT-Aktivität unter Verwendung von γ-Glutamyl-p-nitroanilid, bei der Analyse der Amylaseaktivität unter Verwendung von p-Nitrophenyloligo­ saccharid, bei der Analyse der ALP-Aktivität unter Verwen­ dung von p-Nitrophenylphosphat und bei ähnlichen Analysen. Das analytische erfindungsgemäße Element ist ebenfalls in Analysesystemen mit anderen Substraten, wie bei der Analy­ se von ALT, AST, LDH etc., unter Verwendung von Alanin, Asparaginsäure, α-Ketoglutarsäure, Milchsäure etc. als Sub­ strat nützlich.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In diesen Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, alle Prozent­ gehalte durch das Gewicht ausgedrückt.
Beispiel 1
Eine wäßrige Lösung mit der Zusammensetzung (a-i), die im folgenden angegeben wird, wird auf einen 180 µm dicken farb­ losen transparenten und glatten Polyethylenterephthalat- Film, der eine Gelatineunterschicht aufweist, bis zu einer Trockendicke von 7 µm aufgetragen. Anschließend wird unter Bildung einer Nachweisschicht getrocknet.
Zusammensetzung (a-i)
Gelatine|300 g
Oberflächenaktives Mittel 10G (oberflächenaktives Mittel, hergestellt von der Olin Corp.; p-Nonylphenoxypolyglycidol; Polymerisationsgrad: etwa 10) 5 g
15%ige Latexlösung von Poly-co(styrol-N-methylmorpholinium-methylstyrol-divinylbenzol) (55 : 43 : 2, ausgedrückt als Mol) 280 g
Wasser 2150 g
Wäßrige verdünnte Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts für pH=7,0
Eine wäßrige Lösung mit der folgenden Zusammensetzung (b-i) wird dann auf die so gebildete Gelatineschicht bis zu einer Trockendicke von 5 µm aufgetragen und unter Bildung einer reaktiven Reagensschicht getrocknet.
Zusammensetzung (b-i)
Gelatine|200 g
Oberflächenaktives Mittel 10G 5 g
α-Glucosidase 3.500.000 IU
Wasser 2600 g
Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts pH=7,0
Eine wäßrige Lösung mit der Zusammensetzung (c-i), die im folgenden angegeben ist, wird weiterhin darauf bis zu einer Trockendicke bis zu 3 µm aufgetragen und dann wird unter Bildung einer Lichtabschirmungsschicht getrocknet.
Zusammensetzung (c-i)
Gelatine|30 g
Oberflächenaktives Mittel 10G 4 g
Titanoxid (Anatastyp) 20 g
Wasser 950 g
Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts pH=7,0
Die Lichtabschirmungsschicht hatte eine spiegelnde Dichte von etwa 1,3 (vgl. The Theory of the Photographic Process (Third Edition), S. 421, veröffentlicht von der The Mac­ milian Company).
Danach werden etwa 30 g/m² Wasser einheitlich auf die Licht­ abschirmungsschicht zur Quellung der Schicht aufgetragen und dann wird ein gestricktes bzw. gewirktes Polyester- Flächengebilde (40 Gauge) unter geringem Druck darauf lami­ niert und anschließend wird getrocknet. Eine wäßrige Lösung mit der Zusammensetzung (d-i), die im folgenden angegeben ist, wird einheitlich auf das Flächengebilde in einer Menge von 150 ml/m² aufgetragen und dann wird zur Entfernung des Lösungsmittels unter Bildung einer Ausbreitungsschicht ge­ trocknet. Man erhält so ein integrales mehrschichtiges ana­ lytisches Element für die Analyse von Amylase.
Zusammensetzung (d-i)
p-Nitrophenyl-α-D-maltopentaosid|34 g
Wasser 1600 g
Kaliumphosphat 60 g
Polyvinylpyrrolidon (durchschnittliches Molekulargewicht: 100 000) 140 g
Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts pH=7,3
10 µl von jeweils im Handel erhältlichem Kontrollserum (Kon­ trollserum I) und einem Kontrollserum mit Amylaseaktivität, welche durch Zugabe von humaner Speichelamylase variiert wurde (Kontrollserum II) , wurden in einem Flecken auf das entstehende analytische Element aufgetragen. Das Element wurde bei 37°C stehengelassen und die Reflexionsdichte des Elements wurde jede Minute zwischen 3 bis 6 min vom Beginn des Stehenlassens bei einer Wellenlänge von 400 nm geprüft. Die Amylasekonzentration der Kontrollsera I und II werden aus der Änderung in der Reflexionsdichte unter Verwendung einer zuvor hergestellten Eichkurve bestimmt. Die erhalte­ nen Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.
Kontrollserum
Erfindungsgemäß
I|72 U/l
II 238 U/l
Beispiel 2
Es wurde der gleiche Polyethylenterephthalat-Film wie in Beispiel 1 verwendet. Er wurde mit einer wäßrigen Lösung der Zusammensetzung (a-ii) beschichtet. Dann wurde eine wäß­ rige Lösung der Zusammensetzung (b-ii) aufgetragen. Beide Zusammensetzungen sind im folgenden angegeben. Die Auftra­ gung erfolgte in einer Trockendicke von 10 µm bzw. 3 µm. Nach jedem Auftragen wurde getrocknet.
Zusammensetzung (a-ii)
Gelatine (alkalibehandelte entionisierte Gelatine)|100 g
Oberflächenaktives Mittel 10G 5 g
1,2-Bis(vinylsulfonylacetamido)-ethan 1,5 g
Wasser 1000 g
Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts pH=7,0
Zusammensetzung (b-ii)
Gelatine|120 g
Oberflächenaktives Mittel (Nonylphenoxypolyglycidol) 13 g
Wasser 2600 g
Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts pH=7,0
Danach wurde die Gelatineschicht mit 30 g/m² einer 0,4%igen wäßrigen Lösung von Nonylphenoxypolyglycidol gequollen, ein 230 µm dickes gestricktes bzw. gewirktes Polyester- Flächengebilde (36 Gauge, 50 Denier) wurde darauf unter ge­ ringem Druck laminiert und anschließend wurde getrocknet.
Getrennt wurden vier Arten einer wäßrigen Lösung (c-ii) hergestellt, indem man eine Lösung von 22,8 g γ-Glutamyl- p-nitroanilid in 10 ml 2N Chlorwasserstoffsäure und 10 ml Ethanol in einer homogenen Lösung der folgenden Zusammen­ setzung dispergierte und dann den pH-Wert mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 8,3 einstellte.
Tris(hydroxyethyl)aminomethan|30,3 g
Gylcylglycin 6,5 g
Cetyltrimethylammoniumbromid 5 g
Oberflächenaktives Mittel (Nonylphenoxypolyglycidol) 0,8 g
Wasser 200 g
Polyacrylamid (Viskosität: 2500 cps bei 25°C) angegeben in Tabelle II
Die entstehende wäßrige Lösung (c-ii) wird einheitlich auf ein Flächengebilde in einer Menge von 120 ml/m² aufgetragen und unter Herstellung integraler mehrschichtiger analyti­ scher Elemente A, B, C und D getrocknet.
Jedes der Elemente wurde zu einem 15 × 15 mm²-Quadrat ge­ schnitten und an einem Kunststoffrahmen befestigt, wie es in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 63452/62 be­ schrieben wird. Man erhält einen Objektträger für die GGT- Analyse.
10 µl von 7%igem humanem Serum Albumin (HSA), die 197, 382 oder 889 IU/l GGT enthalten, werden auf einem Flecken auf den entsprechenden Objektträger aufgetragen. Der Objekt­ träger wurde in einem geschlossenen Behälter bei 37°C stehengelassen und die optische Reflexionsdichte wurde bei 410 nm nach 2 und 5 min gemessen und die Änderung ist in der folgenden Tabelle II angegeben.
Tabelle II
10 µl einer 0,83 mM Lösung von Rot Nr. 106 (Nahrungsmittel­ farbstoff) werden auf das Element aufgetragen, und das Ele­ ment wird bei 37°C stehengelassen. Die Ausbreitungsfläche auf der Ausbreitungsschicht nach 6 min Stehenlassen ist in der folgenden Tabelle III angegeben.
Probe
Entwickelte Fläche
(cm²)
A
1,50
B 1,34
C 1,18
D 1,90
Beispiel 3
Es wurde wie im Beispiel 2 verfahren, um ein trockenes ana­ lytisches Element zur Bestimmung von GGT herzustellen, je­ doch mit der Ausnahme, daß der aus der Lösung (a-ii) her­ gestellte getrocknete Film eine Dicke von 15 µm hatte, daß die Wassermenge in der Lösung (b-ii) 2900 g betrug, daß 2,5 g Polyacrylamid in die Lösung (c-ii) anstelle des oberflächenaktives Mittels eingearbeitet wurden und daß eine Lösung (d-ii) mit folgender Formulierung zusätzlich nach dem Aufschichten der Lösung (c-ii) in einer Menge von 112 ml/m² aufgeschichtet wurde.
Zusammensetzung (d-ii)
Hydroxyethylcellulose 100 ml
TiO₂ 5 g.
10 µl von 7%igem Human-Serum-Albumin (HSA), enthaltend 1900 IU/l GGT, wurden als Fleck auf das resultierende ana­ lytische Element aufgebracht. Das Element wurde in einem geschlossenen Behälter bei 37°C stehengelassen und die re­ flektierende optische Dichte wurde bei 400 nm 2 und 5 min nach dem Beginn des Stehenlassens gemessen. Die Veränderung zwischen den zwei Dichten wurde als 0,223 festgestellt.
Vergleichsbeispiel
Wie im Beispiel 3 wurde ein trockenes analytisches Element für die GGT-Bestimmung hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß aus der Zusammensetzung (c-ii) das Polyacrylamid wegge­ lassen wurde.
10 µl HSA, enthaltend 1900 IU/l GGT, wurden als Fleck auf das resultierende analytische Element aufgebracht. Das System wurde bei 37°C in einem geschlossenen Behälter ge­ halten. 2 min und 5 min nach dem Beginn des Stehenlassens wurde die Veränderung der optischen Dichte gegessen. Sie wurde als 0,164 festgestellt.
Beispiel 4
Ein 180 µm dicker transparenter Polyethylenterephthalat- Film wurde einer Behandlung unterworfen, um seine Oberfläche hydrophil zu machen. Auf die hydrophile Oberfläche des Films wurde eine Beschichtungslösung mit folgender Zusammenset­ zung aufgeschichtet und getrocknet, um eine Farbentwick­ lungsschicht mit einer Trockendicke von 10 µm zu bilden.
Zusammensetzung
Gelatine|100 g
Wasser 900 g
Nitroblau-Tetrazolium (3,3′-(3,3′-Dimethoxy-4,4′-biphenylen)-bis[2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazoliumchlorid]) 6 g
Nachdem die Farbentwicklungsschicht mit etwa 30 g/m² Wasser befeuchtet worden war, wurde ein gewebter Stoff, bestehend aus einem versponnenen Polyethylenterephthalat-Garn (36 Gau­ ge, 50 Denier), unter Druck aufgebracht, um eine Ausbrei­ tungsschicht zu bilden.
Auf die Ausbreitungsschicht wurde eine Beschichtungslösung mit folgender Zusammensetzung zu einer Bedeckung von 120 ml/m² aufgeschichtet und getrocknet.
Wasser|180 g
Imidazol 4 g
Dinatriumcreatinphosphat 6 g
Adenosin-diphosphat 2,4 g
Adenosin-5′-phosphat 4 g
Dinatrium-ethylendiamintetraacetat 1,6 g
Magnesiumacetat 4 g
Glucose 2 g
NAD 2 g
N-Acetylcystein 0,6 g
Diadenosin-pentaphosphat 80 mg
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase 30 000 U
Hexokinase 40 000 U
Diaphorase 30 000 U
Ascorbinsäure-Oxidase 30 000 U
Polyacrylamid (20%ige wäßrige Lösung, durchschnittliches Molekulargewicht: 37 000) 200 g
10 µl 70%iges HSA (37°C), enthaltend 0, 149, 383, 656 oder 1560 IU/l von CPK (Creatin-Kinase), wurden als Fleck auf die Ausbreitungsschicht des so hergestellten analytischen Elements aufgebracht. Das System wurde auf einer thermosta­ tierten Platte mit 37°C stehengelassen, wobei das Verdampfen von Wasser in genügender Weise verhindert wurde. Nach 2 und 5 min wurden die reflektierenden optischen Dichten bei 540 nm gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IV
Beispiel 5
Ein 180 µm dicker transparenter Polyethylenterephthalat- Film wurde einer Behandlung unterworfen, um seine Oberfläche hydrophil zu machen. Auf die hydrophile Oberfläche des Films wurde eine Beschichtungslösung mit folgender Zusammensetzung aufgeschichtet und getrocknet, um eine Farbentwicklungs­ schicht mit einer Trockendicke von etwa 10 µm zu bilden.
Zusammensetzung
Gelatine|100 g
Wasser 900 g
Oberflächenaktives Mittel (Octylphenylpolyglycidol) 4 g
Nitroblau-Tetrazolium 6 g
Bisvinylsulfon (2,7%ige Lösung 74 g
in Wasser : Aceton = 1 : 1, auf das Volumen bezogen) (pH=6,5)
Nach dem Befeuchten der Farbentwicklungsschicht mit etwa 30 g/m² Wasser wurde ein gewirkter Stoff, bestehend aus versponnenem Polyethylenterephthalat-Garn (36 Gauge, 50 Denier), unter Druck darauf aufgebracht, um eine Aus­ breitungsschicht zu bilden.
Auf die Ausbreitungsschicht wurde eine Substratlösung mit folgender Zusammensetzung zu einer Bedeckung von 110 ml/m² aufgeschichtet und getrocknet, um ein integrales vielschich­ tiges analytisches Element zur Bestimmung von CPK zu bil­ den.
Zusammensetzung
Wasser|180 g
Dinatriumcreatinphosphat 4 g
Dinatriumcreatinphosphat 6 g
Adenosin-diphosphat 2,4 g
Adenosin-5′-phosphat 4 g
Dinatrium-ethylendiamintetraacetat 1,6 g
Magnesiumacetat 4 g
Glucose 2 g
NAD 2 g
N-Acetylcystein 0,6 g
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase 14 000 U
Hexokinase 14 000 U
Diaphorase 14 000 U
Oberflächenaktives Mittel (Triton X-100; p-t-Octylphenoxypolyethoxyethanol; Polymerisationsgrad: etwa 10) 3 g
Acrylamid/Vinylpyrrolidon-Copolymeres (Molverhältnis: 50 : 50, 15%ige wäßrige Lösung) 100 ml/100 ml der obigen Zusammensetzung
10 µl 7%iges HSA, enthaltend 10 oder 950 IU/l (37°C), wur­ den auf die Ausbreitungsschicht fleckförmig aufgebracht.
Das System wurde auf einer thermostatierten Platte bei 37°C stehengelassen, wobei das Verdampfen von Wasser in ge­ nügendem Maße verhindert wurde. Die reflektierenden opti­ schen Dichten wurden bei 510 nm nach 2 und 5 min gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammenge­ stellt. Die optische Dichte des analytischen Elements vor der Aufbringung der CPK enthaltenden Lösung war 0,43.
TABELLE V
Beispiel 6
Der gleiche Polyethylenterephthalat-Film, wie in Beispiel 1 verwendet, wurde mit einer wäßrigen Lösung mit der Zusam­ mensetzung (a-iii) und sodann mit einer wäßrigen Lösung mit der Zusammensetzung (b-iii) beschichtet. Beide Zusam­ mensetzungen werden nachstehend angegeben. Die Aufbringung erfolgte zu einer Trockendicke von 10 µm bzw. 3 µm und jeweils anschließendem Trocknen.
Zusammensetzung (a-iii)
Gelatine (alkalibehandelte deionisierte Gelatine)|100 g
Oberflächenaktives Mittel 10G 5 g
1,2-Bis(vinylsulfonylacetamido)-ethan 1,5 g
Wasser 1000 g
Wäßrige verdünnte Natriumhydroxidlösung zur Einstellung pH=7,0
Zusammensetzung (b-iii)
Gelatine|120 g
Oberflächenaktives Mittel (Nonylphenoxypolyglycidol) 13 g
Wasser 2600 g
Wäßrige verdünnte Natriumhydroxidlösung zur Einstellung pH=7,0
Nachdem die Gelatineschicht mit 30 g/m² einer 0,4%igen wäß­ rigen Lösung von Nonylphenoxypolyglycidol aufgequollen war, wurde darauf unter geringem Druck ein 230 µm dicker gewirk­ ter Polyester-Stoff (36 Gauge, 50 Denier) auflaminiert. Danach wurde getrocknet.
Es wurden gesondert vier Arten einer wäßrigen Lösung (c-iii) hergestellt, indem eine Lösung von 2,28 g γ-Glutamyl-p-nitro­ anilid in 10 ml 2N Chlorwasserstoffsäure und 10 ml Ethanol in homogener Lösung mit folgender Zusammensetzung dispergiert wurden. Der pH-Wert wurde mit verdünnter Chlor­ wasserstoffsäure auf 8,3 eingestellt.
Zusammensetzung (c-iii)
Tris(hydroxyethyl)aminomethan|30,3 g
Glycylglycin 6,5 g
Cetyltrimethylammoniumbromid 5 g
Oberflächenaktives Mittel (Nonylphenoxypolyglycidol) 0,8 g
Wasser 200 g
Hydroxypropylmethylcellulose gemäß Tabelle IV
Die resultierende wäßrige Lösung (c-iii) wurde gleichförmig auf den Stoff in einer Menge von 100 ml/m² aufgeschichtet und getrocknet, um integrale vielschichtige analytische Elemente E, F, G und H zur Bestimmung der GGT-Aktivität herzustellen.
Ein Streifen für die GGT-Analyse wurde unter Verwendung der einzelnen analytischen Elemente E bis H in der gleichen Weise wie im Beispiel 2 hergestellt.
10 µl 7%iges HSA, enthaltend 172 oder 1110 IU/l GGT, wur­ den fleckförmig auf den resultierenden Streifen aufgebracht. Der Streifen wurde in einem geschlossenen Behälter bei 37°C stehengelassen und die reflektierende optische Dichte wurde bei 640 nm nach 2 und 5 min gemessen. Ihre Verände­ rung ist in Tabelle VI-1 angegeben.
Tabelle VI-1
Die entwickelte Fläche auf jedem der GGT-Analyseelemente wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI-2 zusammengestellt.
Probe
Entwickelte Fläche
(cm²)
E
2,30
F 1,61
G 1,27
H 1,10

Claims (6)

1. Trockenes analytisches Element für die Analyse einer enzymatischen Aktivität in einer Flüssigkeit, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es einen Träger und darauf minde­ stens eine poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht, die aus Fasern, welche Wasser nicht absorbieren, besteht, umfaßt, wobei die poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht ein Substrat für das zu analysierende Enzym und ein wasserlösliches hydrophiles Polymeres in einer Menge enthält, die ausreicht, die Ausbreitungsfläche um mindestens 20% zu verringern, wobei
das wasserlösliche hydrophile Polymere ausgewählt wird aus der Gruppe eines Polymeren, welches eine sich wiederholende Einheit der Formel (I) enthält, worin R¹ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrig­ alkylgruppe bedeutet, und R² und R³ je ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Koh­ lenwasserstoffgruppe, eine substituierte oder unsubsti­ tuierte aromatische Kohlenwasserstoffgruppe oder eine sub­ stituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe bedeuten, oder worin R² und R³ zusammen einen Ring bilden, und einem Polymeren, welches eine sich wiederholende Ein­ heit der Formel (II) enthält, worin R⁴ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrig­ alkylgruppe bedeutet und Q worin q eine ganze Zahl von 2 bis 4 bedeutet,
-NR⁵-CO-R⁶, worin R⁵ eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlen­ stoffatomen und R⁶ ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl­ gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder bedeutet, worin Z¹ eine Atomgruppierung bedeu­ tet, welche einen Lactamring, einen Oxazolidonring oder einen Pyridonring bildet.
2. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 1, da­ durch gekennzeichnet, daß R¹ ein Wasser­ stoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet und R² und R³ je ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe, eine Ethylgrup­ pe, eine Benzylgruppe, eine Hydroxyethylgruppe, eine Cyclo­ hexylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Piperidinogruppe oder eine Morpholinogruppe bedeuten, wobei die Gesamt-Kohlen­ stoffzahl in R² und R³ bis zu einschließlich 12 beträgt.
3. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 1, da durch gekennzeichnet, daß R⁴ ein Wasser­ stoffatom bedeutet und Q bedeutet, worin R⁵ eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe und R⁶ ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe bedeuten, oder bedeutet, worin Z¹ eine Atomgruppierung bedeutet, welche einen 5- oder 6gliedrigen Lactamring oder einen Oxazolidon­ ring bildet.
4. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 3, da­ durch gekennzeichnet, daß Q den Rest einer Pyrrolidongruppe oder den Rest einer Oxazolidongruppe be­ deutet.
5. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 1, da­ durch gekennzeichnet, daß das Polymere, welches die sich wiederholende Einheit der Formeln (I) oder (II) enthält, mindestens 20 Mol-% der sich wiederho­ lenden Einheit der Formeln (I) oder (II) enthält.
6. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 1, da­ durch gekennzeichnet, daß das Polymere, welches die sich wiederholende Einheit der Formeln (I) oder (II) enthält, in einer Menge von 2 bis 15 g/m² der flüssigkeitsausbreitenden Schicht vorhanden ist.
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