DE3912046B4 - Method of labeling a component of an aqueous liquid and luminescent photostable reaction product - Google Patents

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Abstract

Verfahren zum Markieren einer Komponente einer wäßrigen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet , daß man
(a) zu der die genannte Komponente enthaltenden Flüssigkeit einen Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe Cyanin, Merocyanin und Styryl-Farbstoffe, der an einen aromatischen Kern angeheftet mindestens eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe enthält, zusetzt, wobei der genannte Farbstoff mit der genannten Komponente reaktiv ist, und
(b) den Farbstoff mit der genannten Komponente umsetzt, so daß der Farbstoff die genannte Komponente markiert.Method for marking a component of an aqueous liquid, characterized in that
(a) a luminescent dye from the group consisting of cyanine, merocyanine and styryl dyes, which contains at least one sulfonic acid or sulfonate group attached to an aromatic nucleus, is added to the liquid containing said component, said dye being reactive with said component is and
(b) reacting the dye with said component so that the dye marks said component.

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Description

Cyanin-Farbstoffe und damit verwandte Polymethin-Farbstoffe mit lichtabsorbierenden Eigenschaften sind bereits in photographischen Filmen verwendet worden. Obgleich solche Farbstoffe lichtabsorbierende Eigenschaften erfordern, benötigen sie keine Lumineszenz-(Fluoreszenz- oder Phosphoreszen-)Eigenschaften. Cyanin-Farbstoffe mit Lumineszenz-Eigenschaften haben bislang eine nur sehr eingeschränkte Verwertung erfahren. Eine solche Verwendung ist beispielsweise die Markierung der Sulfhydrylgruppe von Proteinen. In einem Bericht, Salama, G., Waggoner, A.S. und Abramson J., wird unter dem Titel "Sulfhydrylreagens-Farbstoffe lösen die rasche Freisetzung von Ca2+ aus Sarcoplasmin-Reticulum-Bläschen (SR)" aus Biophysical Journal, 47, 456a (1985), festgestellt, daß Cyanin-Chromophore mit einer Iodacetylgruppe zur Bildung von kovalenten Bindungen mit Sulfhydrylgruppen auf dem Sarcoplasmin-Reticulum-Protein bei einem pH-Wert von 6,7, um die Ca2+-Freisetzung auszulösen, verwendet wurden. In dem Bericht heißt es auch, daß Fluoreszenz-Farbstoffe dazu verwendet wurden, um diese Proteine zu markieren und zu isolieren.Cyanine dyes and related polymethine dyes with light absorbing properties have been used in photographic films. Although such dyes require light-absorbing properties, they do not require luminescence (fluorescence or phosphorescence) properties. Cyanine dyes with luminescence properties have so far only been used to a very limited extent. One such use is the labeling of the sulfhydryl group of proteins. In a report, Salama, G., Waggoner, AS and Abramson J., entitled "Sulfhydryl reagent dyes trigger the rapid release of Ca 2+ from sarcoplasmin reticulum vesicles (SR)" from Biophysical Journal, 47, 456a (1985), found that cyanine chromophores with an iodoacetyl group were used to form covalent bonds with sulfhydryl groups on the sarcoplasmin reticulum protein at pH 6.7 to induce Ca 2+ release. The report also states that fluorescent dyes have been used to label and isolate these proteins.

In einem Bericht von Waggoner, A.S., Jenkins, P.L., Carpenter, J.P. und Gupta, R. mit dem Titel "Kinetik von Konformationsveränderungen in einem Bereich des Rhodopsin-Moleküls, von der Retinyliden-Bindungsstelle entfernt" in Biophysical Journal, 33, 292a (1981), stellen die. Autoren fest, daß die Sulfhydrylgruppe auf dem F1-Bereich von Vieh-Rhodopsin mit einem Cyanin-Farbstoff mit einer Absorption bei 660 nm kovalent markiert worden ist. Auch gemäß diesem Bericht werden Cyanin-Farbstoffe zum spezifischen Markieren der Sulfhydrylgruppe eines Proteins verwendet. Die Verwendung von Fluores zenz-Farbstoffen wird jedoch in diesem Bericht nicht beschrieben.In a report by Waggoner, A.S., Jenkins, P.L., Carpenter, J.P. and Gupta, R., entitled "Kinetics of Conformational Changes in a region of the rhodopsin molecule, from the retinylidene binding site removed "in Biophysical Journal, 33, 292a (1981), provide the. Authors noted that the sulfhydryl group on the F1 range of cattle rhodopsin with a cyanine dye has been covalently labeled with an absorption at 660 nm. Also according to this Report cyanine dyes for specific labeling of the sulfhydryl group of a protein used. The use of fluorescent dyes however, is not described in this report.

Ein Artikel mit der überschrift "Internationaler Workshop über die Anwendung von Fluoreszenz-Photobleichungstechniken auf Probleme der Zellbiologie" von Jacobson K., Elson E., Koppel D., Webb W. in Fed. Proc. 42:72–79 (1983), berichtet über einen Artikel, der von A. Waggoner eingereicht wurde.An article entitled "International Workshop on the Application of fluorescence photobleaching techniques to problems of cell biology "by Jacobson K., Elson E., Koppel D., Webb W. in Fed. Proc. 42: 72-79 (1983), reports about an article submitted by A. Waggoner.

Dieser bezieht sich auf Fluoreszenz-Sonden vom Cyanintyp, die an Proteine konjugiert werden können und die im tieferen Rotbereich des Spektrums angeregt werden können.This refers to fluorescence probes of the cyanine type, which can be conjugated to proteins and that can be excited in the lower red region of the spectrum.

In den obengenannten drei Berichten werden als einzige Cyanin-Sonden nur solche erwähnt, die sich kovalent spezifisch an die Sulfhydrylgruppe eines Proteins anheften. Die einzige speziell genannte Cyaninverbindung ist eine solche, die eine Iodacetylgruppe aufweist, welche Gruppe bewirkt, daß der Cyanin-Farbstoff gegenüber der Sulfhydrylgruppe kovalent reaktiv wird. In keinem der obenangegebenen Berichte wird die kovalente Reaktion eines Cyanin-Farbstoffs mit irgendeinem anderen Material als einem Protein oder mit irgendeiner anderen Gruppe auf einem Protein als einer Sulfhydrylgruppe beschrieben.In the above three reports are the only cyanine probes only mentioned those which are covalently specific to the sulfhydryl group of a protein to pin. The only cyanine compound specifically mentioned is one those that have an iodoacetyl group which group causes that the Cyanine dye opposite the sulfhydryl group becomes covalently reactive. None of the above The covalent reaction of a cyanine dye with is reported any material other than a protein or with any described another group on a protein as a sulfhydryl group.

Viele Nicht-Proteinmaterialien haben jedoch keine Sulfhydrylgruppen, und viele Proteine weisen keine genügende Anzahl von Sulfhydrylgruppen auf, um diese Gruppen für die Zwecke der Fluoreszenz-Sondierung geeignet zu machen. Dazu kommt noch, daß Sulfhydrylgruppen (-SHSH-) leicht zu Disulfiden (-S-S-) in Gegenwart von Luft oxidiert werden und daher für die kovalente Anheftung an eine Fluoreszenz-Sonde nicht mehr verfügbar werden.Have many non-protein materials however, no sulfhydryl groups, and many proteins do not have enough numbers of sulfhydryl groups to make these groups suitable for the purposes of fluorescence probing close. Add to that the sulfhydryl groups (-SHSH-) easily oxidized to disulfides (-S-S-) in the presence of air and therefore for covalent attachment to a fluorescent probe no longer becomes available.

Erfindungsgemäß wurden nun Cyanin- und damit verwandte Polymethin-Farbstoffe entwickelt, die Substituentengruppen.besitzen, die unter geeigneten Reaktionsbedingungen nicht nur mit Sulfhydrylgruppen, sondern auch mit Amin-(-NH2-) und Hydroxy-(-OH-)Gruppen oder anderen Gruppen, wie Aldehyd-(-CHO-)Gruppen, auf Proteinen und anderen Materialien kovalent reaktiv sind, um eine Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-Erfassung dieser Materialien zu ermöglichen. Durch die Erfindung werden erhebliche Vorteile gegenüber der Verwendung der Iodacetyl-Cyanin-Farbstoffe nach dem Stand der Technik und ihrer spezifischen Reaktivität mit Sulfhydrylgruppen realisiert. Amin- und Hydroxygruppen herrschen in Proteinen und anderen Materialien stärker vor als Sulfhydrylgruppen, und sie sind stabiler.According to the invention, cyanine and related polymethine dyes have now been developed which have substituent groups which, under suitable reaction conditions, not only with sulfhydryl groups but also with amine (- NH 2 -) and hydroxy ((OH)) groups or other groups , such as aldehyde (- CHO) groups, are covalently reactive on proteins and other materials to enable fluorescence and phosphorescence detection of these materials. The invention realizes considerable advantages over the use of the iodoacetyl-cyanine dyes according to the prior art and their specific reactivity with sulfhydryl groups. Amine and hydroxy groups are more prevalent in proteins and other materials than sulfhydryl groups, and they are more stable.

Wenn daher Fluoreszenz-Cyanin-Farbstoffe zur Erfassung des Vorhandenseins von bestimmten Proteinen verwendet werden, wird ein stärkeres Fluoreszenz- oder Phosphoreszenz-Lichtintensitätssignal abgegeben, weil eine größere Anzahl von Farbstoffmolekülen an das zu sondierende Protein angeheftet werden kann. Weiterhin werden Amin- und Hydroxygruppen leichter an Komponenten, die markiert werden sollen, wie Polymerteilchen, die von Natur aus weder Sulfhydryl-, Amin- oder Hydroxygruppen enthalten, angeheftet.Therefore, if fluorescent cyanine dyes used to detect the presence of certain proteins become a stronger one Fluorescence or phosphorescence light intensity signal emitted because of a larger number of dye molecules can be attached to the protein to be probed. Farther amine and hydroxy groups are easier on components that are labeled like polymer particles that by nature have neither sulfhydryl, Contain amine or hydroxy groups attached.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem Lumineszenz-Cyanin-Farbstoffe, die eine Gruppe enthalten, die mit Amingruppen oder Hydroxygruppen oder anderen reaktionsfähigen Gruppen kovalent reaktiv sind, dazu verwendet werden, um Proteine oder andere Materialien mit einer Amin- oder Hydroxygruppe oder einer anderen Gruppe, die dazu imstande ist, sich mit dem Farbstoff in einem Gemisch umzusetzen, verwendet, so daß das Vorhandensein und das Ausmaß des markierten Proteins oder des anderen Materials erfaßt werden kann, nachdem die markierten Komponenten durch chromatographische Methoden abgetrennt worden sind. Nach den obenangegebenen Druckschriften wurde offenbar die Sulfhydrylgruppe speziell deswegen für die kovalente Reaktion ausgewählt, weil sich auf einem Proteinmolekül so wenige dieser Gruppen befinden und weil in manchen Fällen die Sulfhydrylgruppe in der Funktion des Proteins eine signifikante Rolle spielt. Die Autoren konnten daher annehmen, daß der spezielle Ort einer Sulfhydrylgruppe auf einer Proteinstruktur festgestellt werden kann. Gemäß diesen Druckschriften wurde der für die Sulfhydrylgruppe spezifische Farbstoff auch als Sonde verwendet, um Strukturveränderungen in einem speziellen Protein zu erfassen oder zu erzeugen. Um eine Veränderung der Lichtabsorption durch den Farbstoff oder das durch die Farbstoffbindung freigesetzte Calciumion zu interpretieren, war es erforderlich, zu wissen, wo die Sonde gebunden ist.The invention also relates to a method in which luminescent cyanine dyes containing a group which are covalently reactive with amine groups or hydroxyl groups or other reactive groups are used to produce proteins or other materials with an amine or hydroxyl group or one another group capable of reacting with the dye in a mixture, so that the presence and extent of the labeled protein or other material can be determined after the labeled components have been separated by chromatographic methods. According to the publications cited above, the sulfhydryl group was apparently selected specifically for the covalent reaction because there are so few of these groups on a protein molecule and because in some cases the sulfhydryl group plays a significant role in the function of the protein. The authors could therefore assume that the specific location of a sulfhydryl group on a protein structure can be determined. According to these publications, the dye specific for the sulfhydryl group also used as a probe to detect or create structural changes in a particular protein. In order to interpret a change in light absorption by the dye or the calcium ion released by the dye binding, it was necessary to know where the probe is bound.

Da auf den meisten Proteinmolekülen so wenige Sulfhydrylgruppen sind, können diese Gruppen nicht genügend zahlreich sein, um eine angemessene Gesamtlumineszenz für Erfassungsuntersuchungen zu ergeben. Demgegenüber sind Amin- und Hydroxygruppen signifikant zahlreicher, und sie sind auf einem Proteinmolekül weit dispergiert, wodurch es ermöglicht wird, daß eine Fluoreszenz-Sonde an vielfache Stellen auf dem Molekül angefügt wird, wodurch eine Interpretation der Lichtabsorptions- und Fluoreszenzveränderungen durch Erleichterung der Erfassung des Proteins ausgeschlossen wird.Because there are so few on most protein molecules Are sulfhydryl groups, can these groups are not enough be numerous to provide adequate total luminescence for enrollment exams to surrender. In contrast, amine and hydroxy groups are significantly more numerous, and they are on a protein molecule widely dispersed, which makes it possible is that a Fluorescence probe is attached to multiple locations on the molecule, thereby interpreting the light absorption and fluorescence changes Facilitating the detection of the protein is excluded.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Markierung mit Lumineszenz-Polymethin-Cyanin- und verwandten Polymethin-Farbstoffen, wie Merocyanin- und Styryl-Farbstoffen, von Proteinen und anderen Materialien mit Einschluß von Nucleinsäuren, DNA, Arzneimitteln, Toxinen, Blutzellen, mikrobiellen Materialien, Teilchen, Kunststoff- oder Glasoberflächen, Polymermembranen etc. an einer Amin- oder Hydroxystelle auf den genannten Materiali.en. Die Farbstoffe sind vorteilhafterweise in einem wäßrigen oder einem anderen Medium, in dem das markierte Material enthalten ist, löslich. Die vorliegende Erfindung betrifft ein zweistufiges Markierungsverfahren zusätzlich zu einem einstufigen Markierungsverfahren. Bei dem zweistufigen Markierungsverfahren kann eine primäre Komponente, wie ein Antikörper, an Stellen darauf mit Einschluß von Amin-, Hydroxy-, Aldehyd- oder Sulfhydrylstellen, markiert werden, und die markierte Komponente wird als Sonde für die sekundäre Komponente, wie ein Antigen, für das der Antikörper spezifisch ist, verwendet.The present invention relates to labeling with luminescent polymethine-cyanine and related Polymethine dyes, such as merocyanine and styryl dyes, of proteins and other materials including nucleic acids, DNA, Drugs, toxins, blood cells, microbial materials, particles, plastic or glass surfaces, Polymer membranes etc. at an amine or hydroxy site on the mentioned materials. The dyes are advantageously in an aqueous or another medium in which the marked material is contained, soluble. The present invention relates to a two-stage marking method additionally to a one-step marking process. With the two-stage Labeling methods can indicate a primary component, such as an antibody Place on it with the inclusion of Amine, hydroxy, aldehyde or sulfhydryl sites are marked, and the labeled component is used as a probe for the secondary component, like an antigen, for that of the antibody is specific.

Gemäß dem oben diskutierten Stand der Technik wurde die Spezifizität der Stelle der Anheftung durch eine Cyanin-Sonde dadurch erhalten, daß eine Sonde verwendet wurde, die gegenüber einer Sulfhydrylgruppe kovalent reaktiv ist. Gemäß dem erfindungsgemäßen zweistufigen Verfahren können Cyanin- und damit verwandte Sonden in einer ersten Stufe mit Amin-, Aldehyd-, Sulfhydryl-, Hydroxy- oder anderen Gruppen auf einer ersten Komponente, wie einem Antikörper, umgesetzt werden, worauf der Antikörper die gewünschte Spezifizität in einer zweiten Komponente, wie einem Antigen, in einer zweiten oder Anfärbungsstufe erhalten kann, wobei die Spezifizität durch die Antigenstelle der Anheftung an den Antikörper bestimmt wird.According to the state discussed above technology became specificity the site of attachment by a cyanine probe that a Probe was used opposite a sulfhydryl group is covalently reactive. According to the two-stage according to the invention Procedure can Cyanine and related probes in a first stage with amine, Aldehyde, sulfhydryl, hydroxy or other groups on a first Component, like an antibody, are implemented, whereupon the antibody has the desired specificity in a second component, such as an antigen, in a second or staining step can be obtained, the specificity by the antigen site of Attachment to the antibody is determined.

Die Erfindung richtet sich weiterhin auf monoklonale Antikörper und andere Komponenten, die mit diesen Lumineszenz-Cyanin-Verbindungen markiert sind und die dazu imstande sind, Sonden für Antigene zu sein. Wenn das Target eine Zelltype ist, dann kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, die Menge der markierten Antikörper zu messen, die an die genannte Zelltype angeheftet ist. Die Messung kann in der Weise erfolgen, daß man die relative Helligkeit oder Abschwächung der Lumineszenz der Zellen erfaßt.The invention is also directed for monoclonal antibodies and other components using these luminescent cyanine compounds are labeled and capable of being probes for antigens. If the target is a cell type, then the present invention can used to increase the amount of labeled antibodies measure that is attached to the named cell type. The measurement can be done in such a way that the relative brightness or attenuation of the luminescence of the cells detected.

Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, die Konzentration eines bestimmten Proteins oder einer anderen Komponente in einem System zu bestimmen. Wenn die Anzahl der reaktiven Gruppen auf einem Protein, das mit einer Sonde umgesetzt werden kann, bekannt ist, dann ist die Fluoreszenz pro Molekül bekannt, und die Konzentration dieser Moleküle in dem System kann anhand der Gesamt-Lumineszenzintensität des Systems ermittelt werden.The present invention can do this be used, the concentration of a particular protein or to determine another component in a system. If the Number of reactive groups on a protein that is probed can be implemented, is known, then the fluorescence is pro Molecule known and the concentration of these molecules in the system can be determined the total luminescence intensity of the system can be determined.

Das Verfahren kann dazu angewendet werden, um eine Vielzahl von Proteinen oder anderen Materialien in einem System quantitativ zu bestimmen, indem man alle eines Gemisches von Proteinen in dem System markiert und sodann die markierten Proteine durch irgendwelche Maßnahmen, wie chromatographische Maßnahmen, abtrennt. Die Menge der abgetrennten Proteine, die 1umineszieren, kann bestimmt werden. In chromatographischen Erfassungssystemen kann der Ort des Farbstoffs auf dem markierten Material ermittelt werden.The method can be used for this to be a variety of proteins or other materials to quantify in a system by taking all of a mixture of proteins labeled in the system and then the labeled proteins by any measures like chromatographic measures, separates. The amount of separated proteins that 1uminesce can be determined. In chromatographic acquisition systems the location of the dye on the marked material can be determined.

Die Erfindung kann auch dazu verwendet werden, um die Anzahl von verschiedenen Zellen, die mit einem Antikörper etikettiert sind, zu bestimmen. Diese Bestimmung kann in der Weise erfolgen, daß man eine Vielzahl von Typen der Zellen in einem System etikettiert und sodann die etikettierten Zellen außerhalb des Systems abtrennt. Auch können die etikettierten Zellen von nichtetikettierten Zellen außerhalb des Systems abgetrennt werden.The invention can also be used for this to the number of different cells labeled with an antibody are to be determined. This determination can be made in the way that he labeled and labeled in a system a variety of types of cells then separate the labeled cells outside the system. Can too the labeled cells from unlabeled cells outside from the system.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Multiparameter-Verfahren, bei dem eine Vielzahl von Lumineszenz-Cyanin- oder verwandten Farbstoffen verwendet wird, die jeweils an eine Vielzahl von verschiedenen primären Komponenten, wie Antikörpern, angeheftet sind, wobei jeder Farbstoff für eine unterschiedliche sekundäre Komponente, wie ein Antigen, spezifisch ist, um jeden einer Vielzahl der genannten Antigene in einem Gemisch von Antigenen zu identifizieren. Gemäß dieser Ausführungsform wird jeder der genannten Antikörper gesondert mit einem Farbstoff mit verschiedener Lichtabsorption und verschiedenen Lumineszenzwellenlängen-Eigenschaften als der Farbstoff, der zur Markierung der anderen Sonden verwendet wird, markiert. Sodann werden alle markierten Antikörper zu einem zu analysierenden biologischen Präparat gegeben, das sekundäre Komponenten, wie Antigene, enthält, welche jeweils durch bestimmte markierte Antikörper angefärbt werden können. Irgendwelche nichtumgesetzten Farbstoffmaterialien können aus dem Präparat beispielsweise durch Auswaschen entfernt werden, wenn sie die Analyse stören. Das biologische Präparat wird sodann einer Vielzahl von Anregungswellenlängen ausgesetzt, wobei jede verwendete Anregungswellenlänge die Anregungswellenlänge eines bestimmten konjugierten Farbstoffs ist. Ein Lumineszenz-Mikroskop oder ein anderes Lumineszenz-Erfassungssystem, wie ein Fließ-Cytometer oder ein Fluoreszenz-Spektrophotometer, das Filter oder Monochrometer zur Auswahl der Strahlen der Anregungswellenlänge und zur Auswahl der Wellenlängen der Lumineszenz aufweist, wird dazu verwendet, um die Intensität der Strahlen der Emissionswellenlänge, die der Anregungswellenlänge entspricht, zu bestimmen. Die Intensität der Lumineszenz bei Wellenlängen, die der Emissionswellenlänge eines bestimmten konjugierten Farbstoffs entspricht, zeigt die Menge des Antigens an, die an den Antikörper gebunden ist, an den der Farbstoff angefügt ist. In bestimmten Fällen kann eine einzige Wellenlänge der Anregung dazu verwendet werden, um Lumineszenz von zwei oder mehreren Materialien in einem Gemisch zu erregen, wobei jede Fluoreszenz bei einer verschiedenen Wellenlänge und die Menge jeder markierten Art dadurch gemessen werden kann, daß man ihre individuelle Fluoreszenzintensität bei der jeweiligen Fluoreszenzwellenlänge erfaßt. Gewünschtenfalls kann eine Lichtabsorptions-Erfassungsmethode angewendet werden. Das erfindungsgemäße Zweistufen-Verfahren kann auf ein beliebiges System angewendet werden, bei dem ein mit einem Farbstoff konjugiertes primäres Material und dem Farbstoff ge- oder Lichtabsorptions-Erfassungssystem verwendet wird, um das Vorhandensein eines anderen Materials zu erfassen, auf das das Konjugat aus dem primären Material in dem Farbstoff gerichtet ist. So kann beispielsweise der Farbstoff an ein Fragment von DNA oder RNA konjugiert sein, um ein mit Farbstoff konjugiertes DNA- oder RNA-Fragment zu bilden, das sodann auf einen Hauptstrang von DNA oder RNA gerichtet wird, zu dem das Stück komplementär ist. Das gleiche Testverfahren kann dazu verwendet werden, um das Vorhandensein von irgendeinem komplementären Hauptstrang von DNA zu erfassen.Another embodiment of the present invention includes a multi-parameter method using a variety of luminescent cyanine or related dyes each attached to a variety of different primary components, such as antibodies, each dye for a different secondary Component, such as an antigen, is specific to identify any of a variety of said antigens in a mixture of antigens. According to this embodiment, each of the said antibodies is separately labeled with a dye with different light absorption and different luminescence wavelength properties than the dye which is used to label the other probes. Then all labeled antibodies are added to a biological preparation to be analyzed, which contains secondary components, such as antigens, which can be stained by specific labeled antibodies. Any unreacted dye materials can be removed from the preparation, for example by washing, if they interfere with the analysis. The biological preparation is then exposed to a variety of excitation wavelengths, each excitation wavelength used being the excitation wavelength of a particular conjugated dye. A lumines zenz microscope or other luminescence detection system, such as a flow cytometer or a fluorescence spectrophotometer, which has filters or monochrometers for selecting the beams of the excitation wavelength and for selecting the wavelengths of the luminescence is used to determine the intensity of the beams of the Determine emission wavelength that corresponds to the excitation wavelength. The intensity of the luminescence at wavelengths corresponding to the emission wavelength of a particular conjugated dye indicates the amount of antigen bound to the antibody to which the dye is attached. In certain cases, a single wavelength of excitation can be used to excite luminescence from two or more materials in a mixture, each fluorescence at a different wavelength and the amount of each labeled species can be measured by looking at their individual fluorescence intensity the respective fluorescence wavelength. If desired, a light absorption detection method can be used. The two-step method of the present invention can be applied to any system in which a primary material conjugated with a dye and the dye or light absorption detection system is used to detect the presence of another material on which the conjugate from the primary is used Material in which the dye is directed. For example, the dye can be conjugated to a fragment of DNA or RNA to form a dye-conjugated DNA or RNA fragment which is then directed to a major strand of DNA or RNA to which the piece is complementary. The same test procedure can be used to detect the presence of any complementary major strand of DNA.

Die erfindungsgemäß verwendeten Cyanin- und damit verwandten Farbstoffe sind besonders gut für die Analyse eines Gemisches von Komponenten geeignet, bei dem Farbstoffe einer Vielzahl von Anregungs- und Emissionswellenlängen erforderlich sind, weil spezielle Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe synthetisiert werden können, die einen weiten Bereich von Anregungs- und Emissionswellenlängen haben. Spezielle Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe mit spezifischen Anregungs- und Emissionswellenlängen können synthetisiert werden, indem die Anzahl der Methingruppen variiert wird oder indem die Cyanin-Ringstrukturen modifiziert werden. Auf diese Weise ist es möglich, Farbstoffe mit besonderen Anregungswellenlängen zu synthetisieren, um einer besonderen Anregungs-Lichtquelle, wie einem Laser, zum Beispiel einem HeNe-Laser oder einem Diodenlaser, zu entsprechen.The cyanine and thus used according to the invention related dyes are particularly good for analyzing a mixture suitable for components in which a large number of dyes Excitation and emission wavelengths are necessary because of special cyanine and related dyes can be synthesized that have a wide range of excitation and emission wavelengths. Special cyanine and related dyes with specific Excitation and emission wavelengths can can be synthesized by varying the number of methine groups or by modifying the cyanine ring structures. On this way it is possible to use dyes with special excitation wavelengths to synthesize to a special excitation light source, such as a laser, for example a HeNe laser or a diode laser, correspond to.

Die Erfindung betrifft die kovalente Reaktion von hochlumineszenten und hochlichtabsorbierenden Cyanin- und damit verwandten Farbstoffmolekülen unter Reaktionsbedingungen mit Amin-, Hydroxy-, Aldehyd-, Sulfhydryl- oder anderen Gruppen auf Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren, derivatisierten Nucleinsäuren, Lipiden, bestimmten anderen biologischen Molekülen, biologischen Zellen sowie nichtbiologischen Materialien, beispielsweise löslichen Polymeren, Polymerteilchen, Polymeroberflächen, Polymermembranen, Glasoberflächen und anderen Teilchen und Oberflächen. Da die Lumineszenz hochempfindliche optische Techniken umfast, kann die Anwesenheit dieser Farbstoff-"Etiketten" erfaßt und selbst dann quantitativ bestimmt werden, wenn das "Etikett" nur in sehr geringen Mengen vorhanden ist. Somit können die Farbstoffmarkierungs-Reagentien dazu verwendet werden, die Menge eines Materials, das markiert worden ist, zu messen. Die am besten geeigneten Farbstoffe sind hoch lichtabsorbierend (ε = 70.000 bis 250.000 l/mol-cm oder höher) und sehr lumineszent, und sie haben Quantenausbeuten von mindestens 5% bis 80% oder mehr. Die qualitativen Eigenschaften betreffen die Farbstoffe selbst und Farbstoffe, die an ein markiertes Material konjugiert sind.The invention relates to the covalent Reaction of highly luminescent and highly light-absorbing cyanine and related dye molecules under reaction conditions with amine, hydroxy, aldehyde, sulfhydryl or other groups on proteins, peptides, carbohydrates, nucleic acids, derivatized nucleic acids, lipids, certain other biological molecules, biological cells as well non-biological materials, for example soluble polymers, polymer particles, Polymer surfaces, Polymer membranes, glass surfaces and other particles and surfaces. Since luminescence includes highly sensitive optical techniques, the presence of these dye "labels" is detected and even then quantified if the "label" is only in very small Amounts are available. So you can The dye-labeling reagents are used to measure the amount of a material that has been marked. The best suitable dyes are highly light-absorbing (ε = 70,000 up to 250,000 l / mol-cm or higher) and very luminescent, and they have quantum yields of at least 5% to 80% or more. The qualitative properties concern the Dyes themselves and dyes attached to a marked material are conjugated.

Eine wichtige Anwendung für diese Farbmarkierungs-Reagentien ist die Herstellung von lumineszierenden monoklonalen Antikörpern. Monoklonale Antikörper sind Proteinmoleküle, die sich sehr eng und sehr spezifisch an bestimmte chemische Stellen oder "Marker" auf Zelloberflächen oder innerhalb von Zellen binden. Diese Antikörper besitzen daher eine enorme Forschungseignung und klinische Eignung zur Identifizierung von bestimmten Zelltypen (zum Beispiel HLA-Klassifizierung, T-Zell-Subsets, Bakterien- und Virenklassifizierung etc.) und erkrankte Zellen. In der Vergangenheit ist die Menge des an eine Zelle gebundenen Antikörpers dadurch quantitativ bestimmt worden, daß man den Antikörper auf verschiedene Weise markiert hat. Das Markieren ist mit einer radioaktiven Markierung (Radioimmuno-Assay), einem Enzym (ELISA-Techniken) oder einem Fluoreszenz-Farbstoff (gewöhnlich Fluorescenn, Rhodamin, Texasrot ® oder Phycoerythrin) bewerkstelligt worden. Die meisten Hersteller und Anwender von klinischen Antikörper-Reagentien möchten von den mit der Verwendung von radioaktiven Tracern inhärenten Problemen wegkommen, so daß die Lumineszenz als eine der vielversprechendsten Alternativen angesehen wird. Tatsächlich liefern nunmehr viele Firmen mit Fluorescein, Texasrot ®, Rhodamin und Phycoerythrin markierte monoklonale Antikörper.An important application for these color labeling reagents is the production of luminescent monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies are protein molecules that bind very closely and very specifically to certain chemical sites or "markers" on cell surfaces or within cells. These antibodies therefore have enormous research and clinical suitability for the identification of certain cell types (for example HLA classification, T cell subsets, bacterial and virus classification etc.) and diseased cells. In the past, the amount of antibody bound to a cell has been quantified by labeling the antibody in various ways. The marking has been accomplished with a radioactive label (radioimmunoassay), an enzyme (ELISA techniques) or a fluorescent dye (usually Fluorescenn, rhodamine, Texas Red ®, or phycoerythrin). Most manufacturers and users of clinical antibody reagents want to get away from the problems inherent in the use of radioactive tracers, so that luminescence is considered one of the most promising alternatives. In fact, many companies now supply monoclonal antibodies labeled with fluorescein, Texasrot ® , rhodamine and phycoerythrin.

In den letzten Jahren ist die optische/elektronische Instrumentierung für die Erfassung von fluoreszierenden Antikörpern auf Zellen komplizierter geworden. So kann beispielsweise die Fließ-Cytometrie dazu verwendet werden, um die Menge von fluoreszierendem Antikörper auf individuellen Zellen mit einer Rate von bis zu 5.000 Zellen pro Sekunde zu bestimmen. Auch mikroskopische und Lösungs-Fluoreszenztechniken haben Fortschritte erzielt. Diese Instrumente können eine Fluoreszenz bei vielen Wellenlängen des UV-, sichtbaren und nahen IR-Bereichs des Spektrums erregen. Doch können die meisten der derzeit verfügbaren, verwendbaren Fluoreszenz-Markierungs-Reagentien nur im 400- bis 580-nm-Bereich des Spektrums angeregt werden. Die Ausnahmen sind einige der Pigmente vom Phycobiliprotein-Typ, die aus Meeresorganismen isoliert worden sind und die kovalent an Proteine angeheftet werden können. Diese können bei etwas niedrigeren Wellenlängen angeregt werden. Es gibt daher ein großes Spektralfenster im Bereich von 580 bis ungefähr 900 nm, wo es notwendig ist, daß neue Markierungs-Reagentien zur Markierung von biologischen und nichtbiologischen Materialien verfügbar werden, wobei die Analyse mit der derzeit verfügbaren Instrumentierung durchgeführt werden soll. Neue Reagentien, die in diesem Spektralbereich anregbar sind, würden es ermöglichen, Multifarb-Lumineszenzanalysen von Markern auf Zellen durchzuführen, da Antikörper mit verschiedenen Spezifizitäten jeweils mit einem verschieden gefärbten Fluoreszenz-Farbstoff markiert werden könnten. Somit könnte das Vorhandensein von mehreren Markern gleichzeitig für jede analysierte Zelle bestimmt werden.In recent years, optical / electronic instrumentation for the detection of fluorescent antibodies on cells has become more complicated. For example, flow cytometry can be used to determine the amount of fluorescent antibody on individual cells at a rate of up to 5,000 cells per second. Microscopic and solution fluorescence techniques have also made progress. These instruments can excite fluorescence at many wavelengths in the UV, visible and near IR range of the spectrum. However, most of the currently available usable fluorescent labeling reagents can only be excited in the 400 to 580 nm range of the spectrum. The exceptions are some of the phycobiliprotein-type pigments that have been isolated from marine organisms and that can be covalently attached to proteins. These can be excited at somewhat lower wavelengths. There is therefore a large spectral window in the range from 580 to about 900 nm where it is necessary that new labeling reagents for labeling biological and non-biological materials become available, the analysis being carried out with the instrumentation currently available. New reagents that can be excited in this spectral range would make it possible to carry out multi-color luminescence analyzes of markers on cells, since antibodies with different specificities could each be labeled with a differently colored fluorescent dye. Thus the presence of multiple markers could be determined simultaneously for each cell analyzed.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von lumineszierenden (fluoreszierenden oder phosphoreszierenden) Cyanin-, Merocyanin- und Styryl-Farbstoffen, die an biologische und nichtbiologische Materialien kovalent angeknüpft werden können. Merocyanin- und Styryl-Farbstoffe werden für die Zwecke dieser Erfindung als mit Cyanin-Farbstoffen verwandt angesehen. Die neuen Markierungs-Reagentien selbst, jedoch insbesondere dann, wenn sie mit einer markierten Komponente konjugiert sind, können durch Licht von ersten definierten Wellenlängen, zum Beispiel durch Licht in Wellenlängenbereichen des Spektrums von 450 bis 900 nm, angeregt werden. Die Hintergrund-Fluoreszenz von Zellen erfolgt im allgemeinen bei einer niedrigeren Wellenlänge. Daher werden sich die Markierungs-Reagentien gegenüber der Hintergrund-Fluoreszenz unterscheiden. Von besonderem Interesse sind die Derivate, die Licht bei 633 nm absorbieren, da sie durch billige, intensive, stabile und langlebige HeNe-Laserquellen angeregt werden können. Licht von zweiten definierten Wellenlängen, das durch die markierte Komponente fluoresziert oder phosphoresziert wird, kann sodann erfaßt werden. Das fluoreszierte oder phosphoreszierte Licht hat im allgemeinen eine größere Wellenlänge als das Anregungslicht. In der Erfassungsstufe kann ein Lumineszenz-Mikroskop verwendet werden, das einen Filter zur Absorption von Streulicht der Anregungswellenlänge und zum Durchgang der Wellenlänge hat, die der Lumineszenz entspricht, die der jeweiligen Farbstoffmarkierung entspricht, die mit der Probe verwendet wird. Ein derartiges optisches Mikroskop ist zum Beispiel in der US-PS 4 621 911 beschrieben.The invention also relates to the use of luminescent (fluorescent or phosphorescent) cyanine, merocyanine and styryl dyes which can be covalently linked to biological and non-biological materials. Merocyanine and styryl dyes are considered related to cyanine dyes for the purposes of this invention. The new labeling reagents themselves, but especially if they are conjugated with a labeled component, can be excited by light of the first defined wavelengths, for example by light in wavelength ranges of the spectrum from 450 to 900 nm. Background fluorescence from cells generally occurs at a lower wavelength. Therefore, the labeling reagents will differ from the background fluorescence. The derivatives that absorb light at 633 nm are of particular interest because they can be excited by cheap, intense, stable and long-life HeNe laser sources. Light of second defined wavelengths, which is fluorescent or phosphorescent by the labeled component, can then be detected. The fluorescent or phosphorescent light generally has a longer wavelength than the excitation light. In the detection stage, a luminescence microscope can be used that has a filter for absorbing stray light of the excitation wavelength and for passing the wavelength that corresponds to the luminescence that corresponds to the particular dye label that is used with the sample. Such an optical microscope is for example in the U.S. Patent 4,621,911 described.

Nicht alle Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe sind lumineszierend. Jedoch schließen die erfindungsgemäß verwendeten Farbstoffe solche Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe ein, die lumineszierend sind. Sie sind relativ photostabil, und viele sind in der Reaktionslösung, vorzugsweise einer wäßrigen Lösung, löslich. Die konjugierten Farbstoffe selbst, jedoch insbesondere, wenn sie mit einer markierten Komponente konjugiert sind, haben molare Extinktionskoeffizieten (ε) von mindestens 50.000 und vorzugsweise mindestens 100.000 Liter pro mol-cm. Der Extinktionskoeffizient ist ein Maß der Fähigkeit der Moleküle, Licht zu absorbieren. Die erfindungsgemäßen konjugierten Farbstoffe haben Quantenausbeuten von mindestens 2% und vorzugsweise mindestens 10%. Dazu absorbieren und emittieren die erfindungsgemäßen konjugierten Farbstoffe Licht im Spektralbereich von 400 bis 900 nm und vorzugsweise im Spektralbereich von 600 bis 900 nm.Not all cyanine and related Dyes are luminescent. However, those used in the present invention include Dyes include such cyanine and related dyes that are luminescent. They are relatively photostable, and many are in the reaction solution, preferably an aqueous solution, soluble. The conjugated dyes themselves, but especially when using of a labeled component have molar extinction coefficients (ε) from at least 50,000 and preferably at least 100,000 liters per mol-cm. The extinction coefficient is a measure of the ability of the molecules to light to absorb. The conjugated dyes according to the invention have quantum yields of at least 2% and preferably at least 10%. For this purpose, the conjugates according to the invention absorb and emit Dyes light in the spectral range from 400 to 900 nm and preferably in the spectral range from 600 to 900 nm.

Arylsulfonierte FarbstoffeArylsulfonierte dyes

Es wurde nun gefunden, daß die hierin beschriebenen Arylsulfonat- oder Arylsulfonsäure-Farbstoffe ihrer Natur nach stärker fluoreszierend sind und verbesserte Photostabilitäts- und Wasserlöslichkeitseigenschaften haben als ähnliche Farbstoffe ohne Arylsulfonat- oder Arylsulfonsäuregruppen. Die hierin verwendeten Bezeichnungen Arylsulfonat oder Arylsulfon säure sollen Arylsulfonsäuregruppen oder Arylsulfonatgruppen bezeichnen, wobei die genannten Gruppen an aromatische Ringstrukturen angefügt sind, mit Einschluß einer einzigen aromatischen Ringstruktur oder einer kondensierten Ringstruktur, beispielsweise einer Naphthalinstruktur. Die einzige aromatische Ringstruktur oder die kondensierte aromatische Ringstruktur kann in Polymethin-, Cyanin-, Merocyanin- oder Styryl-Farbstoffen vorhanden sein.It has now been found that the herein described arylsulfonate or arylsulfonic acid dyes of their nature after stronger are fluorescent and have improved photostability and water solubility properties have as similar Dyes without aryl sulfonate or aryl sulfonic acid groups. The used here Designations aryl sulfonate or aryl sulfonic acid are said to be aryl sulfonic acid groups or arylsulfonate groups, the groups mentioned are attached to aromatic ring structures, including a single one aromatic ring structure or a condensed ring structure, for example a naphthalene structure. The only aromatic Ring structure or the condensed aromatic ring structure can present in polymethine, cyanine, merocyanine or styryl dyes his.

Viele Farbstoffe mit planaren Molekularstrukturen mit Einschluß von üblichen Cyanin-Farbstoffen neigen dazu, in wäßriger Lösung Dimere und Aggregate höherer Ordnung zu bilden, und zwar insbesondere dann, wenn gleichfalls anorganische Salze vorhanden sind, wie es beispielsweise in gepufferten Lösungen und physiologischer Kochsalzlösung der Fall ist. Diese Aggregate haben gewöhnlich Absorptionsbanden, die zu der kurzen Wellenlängenseite der Monomerabsorption verschoben sind, und sie sind im allgemeinen sehr schwach fluoreszierende Arten. Die Tendenz der Cyanin-Farbstoffe, in wäßriger Lösung leicht Aggregate zu bilden, ist insbesondere in der Photographie gut bekannt (West, W., und Pierce S., J. Phys. Chem., 69:2894 (1965); Sturmer, D.M., Spec. Top in Heterocyclic Chemistry, 30 (1974)).Many dyes with planar molecular structures including the usual Cyanine dyes tend to have dimers and higher order aggregates in aqueous solution to form, especially when also inorganic Salts are present, such as in buffered and physiological solutions Saline the case is. These aggregates usually have absorption bands that to the short wavelength side of monomer absorption are shifted and they are in general very weakly fluorescent species. The tendency of cyanine dyes easily in aqueous solution Forming aggregates is particularly well known in photography (West, W., and Pierce S., J. Phys. Chem., 69: 2894 (1965); Sturmer, D.M., Spec. Top in Heterocyclic Chemistry, 30 (1974)).

Viele Farbstoffmoleküle und insbesondere Cyanin-Farbstoffmoleküle neigen dazu, in wäßriger Lösung Aggregate zu bilden. Es ist gefunden worden, daß die Arylsulfonat-Farbstoffe eine minimale Neigung haben, diese Aggregate zu bilden. Bei Verwendung zur Bildung von fluoreszierenden Markierungs-Reagentien haben die Arylsulfonat-Farbstoffe eine verminderte Neigung, Aggregate zu bilden, wenn sie mit hohen Oberflächendichten an Proteine oder andere Moleküle, wie Antikörper, gebunden werden. Die Tendenz eines bestimmten Farbstoffmoleküls, Aggregate in einer Salzlösung (zum Beispiel 150mM Natrium chlorid-Lösung) zu bilden, kann als Maß der Neigung des gleichen Farbstoffmoleküls zur Bildung von Aggregaten auf der Oberfläche von Proteinen genommen werden. Für Farbstoffmoleküle wird es daher angestrebt, daß sie eine minimale Neigung haben, in wäßrigen Salzlösungen Aggregate zu bilden. Die Werte der 2 zeigen, daß ein bestimmter arylsulfonierter Farbstoff selbst bei hohen Konzentrationen in wäßriger Salzlösung nur eine niedrige Neigung hat, Aggregate zu bilden.Many dye molecules, and especially cyanine dye molecules, tend to form aggregates in aqueous solution. The aryl sulfonate dyes have been found to have a minimal tendency to form these aggregates. When used to form fluorescent labeling reagents, the aryl sulfonate dyes have a reduced tendency to form aggregates when bound to proteins or other molecules such as antibodies with high surface densities. The tendency of a particular dye molecule to form aggregates in a saline solution (e.g. 150 mM sodium chloride solution) can be measured as a measure of the tendency of the same dye molecule to form aggregates on the surface of Proteins are taken. It is therefore desirable for dye molecules to have a minimal tendency to form aggregates in aqueous salt solutions. The values of the 2 show that a particular arylsulfonated dye has only a low tendency to form aggregates even at high concentrations in aqueous saline.

Die 1 zeigt das Monomer-Absorptionsspektrum und das Dimer-Absorptionsspektrum eines typischen Cyanin-Farbstoffs, gelöst in einem wäßrigen Puffer. Der zur Erzeugung dieser Spektren verwendete Farbstoff, N,N'-Di-sulfobutyl-indodicarbocyanin, weist keine Arylsulfonatgruppen auf und bildet selbst bei Konzentrationen im submillimolaren Bereich leicht Dimere. Das Dimer-Spektrum wurde aus den Spektren des Farbstoffs bei verschiedenen Konzentrationen errechnet (vgl. die Methode von West und Pearce, 1965). Bei einer 3mM-Konzentration in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung waren die Absorptionen der Monomer- und Dimerbanden etwa gleich.The 1 shows the monomer absorption spectrum and the dimer absorption spectrum of a typical cyanine dye, dissolved in an aqueous buffer. The dye used to generate these spectra, N, N'-disulfobutylindodicarbocyanine, has no arylsulfonate groups and easily forms dimers even at concentrations in the submillimolar range. The dimer spectrum was calculated from the spectra of the dye at various concentrations (cf. West and Pearce's method, 1965). At a 3 mM concentration in a phosphate-buffered saline solution, the absorptions of the monomer and dimer bands were approximately the same.

Das Spektrum des verbesserten Sulfoindodicarbocyanins, N,N'-Diethyl-indodicarbocyanin-5,5'-disulfonsäure, ist in Figur 2 gezeigt. Dieser Farbstoff zeigte bei Konzentrationen bis zu 10mM kein Anzeichen einer Aggregation in der Kochsalzlösung.The spectrum of the improved sulfoindodicarbocyanine, N, N'-diethyl-indodicarbocyanine-5,5'-disulfonic acid shown in Figure 2. This dye showed at concentrations up to 10mM no sign of aggregation in the saline solution.

Üblicherweise wird die Wirksamkeit, mit der sich ein bestimmter reaktiver Farbstoff an ein Protein, beispielsweise einen Antikörper, kuppelt, unter definierten-Reaktionsbedingungen bestimmt. Der getestete Farbstoff war der Bis-N-hydroxysuccinimidester von N,N'-Di-carboxypentyl-indodicarbocyanin-5,5'-disulfonsäure. Die 3 zeigt, daß dieser aktive Sulfo cyanin-Farbstoff-Ester sich wirksam mit Schaf-Immunoglobulin in einem Carbonat-Puffer bei einem pH-Wert von 9,2 umsetzt, wodurch kovalent markierte Antikörpermoleküle gebildet werden, die ein Molverhältnis von Farbstoff zu Antikörper im Bereich von weniger als 1 bis mehr als 20, je nach den relativen Farbstoff- und Antikörperkonzentrationen, in der Reaktionslösung haben. Die Neigung der linearen kleinsten Quadrate der Werte zeigen, daß unter diesen Bedingungen die Markierungswirksamkeit dieses Farbstoffs etwa 80% ist. Bei ähnlichen Untersuchungen setzte sich Fluorescein-isothiocyanat (FITC) mit einer Wirksamkeit von etwa 20% um.The effectiveness with which a certain reactive dye couples to a protein, for example an antibody, is usually determined under defined reaction conditions. The dye tested was the bis-N-hydroxysuccinimide ester of N, N'-di-carboxypentyl-indodicarbocyanine-5,5'-disulfonic acid. The 3 shows that this active sulfocyanine dye ester reacts effectively with sheep immunoglobulin in a carbonate buffer at pH 9.2, thereby forming covalently labeled antibody molecules that have a molar ratio of dye to antibody in the range of have less than 1 to more than 20, depending on the relative dye and antibody concentrations, in the reaction solution. The slope of the linear least squares of the values shows that under these conditions the labeling efficiency of this dye is about 80%. In similar studies, fluorescein isothiocyanate (FITC) reacted with an effectiveness of about 20%.

Die Reaktivität des aktiven Esters des neuen Sulfoindodicarbocyanin-Farbstoffs wurde dadurch untersucht, daß Schaf-Immunoglobulin (IgG) markiert wurde. Das Protein (4 mg/ml) wurde in 0,1m Carbonat-Puffer (pH=9,2) aufgelöst. Aliquote Teile des reaktiven Farbstoffs, gelöst in wasserfreiem Dimethylformamid, wurden zu den Proteinproben gegeben, um die ursprünglichen Molverhältnisse Farbstoff:Protein zu ergeben. Nach 30 Minuten wurde das Protein von dem unkonjugierten Farbstoff durch Gel-Permeationschromatographie (Sephadex G-50) abgetrennt. Die resultierenden Molverhältnisse Farbstoff:Protein wurden spektrophotometrisch bestimmt, und sie sind in 3 dargestellt.The reactivity of the active ester of the new sulfoindodicarbocyanine dye was examined by labeling sheep immunoglobulin (IgG). The protein (4 mg / ml) was dissolved in 0.1m carbonate buffer (pH = 9.2). Aliquots of the reactive dye, dissolved in anhydrous dimethylformamide, were added to the protein samples to give the original dye: protein molar ratios. After 30 minutes, the protein was separated from the unconjugated dye by gel permeation chromatography (Sephadex G-50). The resulting dye: protein molar ratios were determined spectrophotometrically and are shown in 3 shown.

Bei niedrigen Verhältnissen von Farbstoff zu Protein zeigen die Absorptionsspektren der markierten Proteine Banden, die eng den Spektren des freien monomeren Farbstoffs entsprechen. Bei Antikörpermolekülen, die stark markiert worden sind (hohe Verhältnisse Farbstoff:Protein) oder die mit Farbstoffen mit großer Neigung zur Aggregation in wäßrigen Lösungen markiert worden sind, wird oft festgestellt, daß sie neue Absorptionspeaks haben, die bei kürzeren Wellenlängen erscheinen als die Absorptionsbanden des monomeren Farbstoffs in wäßriger Lösung. Die Wellenlänge des neuen Absorptionspeaks fällt häufig in einen Bereich, der für das Dimer-Absorptionsspektrum des Farbstoffs charakteristisch ist (vgl. 1).At low dye to protein ratios, the absorption spectra of the labeled proteins show bands that closely correspond to the spectra of the free monomeric dye. Antibody molecules that have been strongly labeled (high dye: protein ratios) or that have been labeled with dyes with a high tendency to aggregate in aqueous solutions are often found to have new absorption peaks that appear at shorter wavelengths than the absorption bands of the monomeric dye in aqueous solution. The wavelength of the new absorption peak often falls in a range which is characteristic of the dimer absorption spectrum of the dye (cf. 1 ).

Stärker markierte Antikörper haben höhere Verhältnisse von kurzen zu langen Wellenlängen-Absorptionspeaks. Dieser kürzere Wellenlängen-Absorptionspeak kann in 4 bei ungefähr 590 nm gesehen werden. Der längere Wellenlängenpeak (bei 645 nm) in 4 ist auf monomere Farbstoffmoleküle zurückzuführen, die an den Antikörper gebunden sind. Das Markierungs-Reagens, das verwendet wurde, um das Antikörper-Absorptionsspektrum in 4 herzustellen (der Bis-N-hydroxysuccinimidester von N,N'-Di-sulfobutyl-indodicarbocyanin-5,5'-essigsäure) besitzt keine Arylsulfonatgruppen und bildet leicht in wäßrigen Salzlösungen und auf Antikörpern, mit denen er umgesetzt worden ist, Dimere. Von entscheidender Bedeutung ist es, daß die Fluoreszenz-Anregungsspektren dieser Antikörper zeigen, daß die Anregung der markierten Antikörper beim kurzen Wellenlängenpeak nicht proportional so viel Fluoreszenz erzeugt wie es bei einer Anregung beim längeren Wellenlängenpeak der Fall ist. Diese Beobachtung steht in Übereinstimmung mit der Idee, daß der kürzere Wellenlängen-Absorptionspeak auf die Bildung von nichtfluoreszierenden Dimeren und Aggregaten auf den Antikörpermolekülen zurückzuführen ist.More strongly labeled antibodies have higher ratios of short to long wavelength absorption peaks. This shorter wavelength absorption peak can be in 4 can be seen at about 590 nm. The longer wavelength peak (at 645 nm) in 4 is due to monomeric dye molecules bound to the antibody. The labeling reagent that was used to measure the antibody absorption spectrum in 4 to produce (the bis-N-hydroxysuccinimide ester of N, N'-disulfobutylindodicarbocyanin-5,5'-acetic acid) has no aryl sulfonate groups and easily forms dimers in aqueous salt solutions and on antibodies with which it has been reacted. It is of crucial importance that the fluorescence excitation spectra of these antibodies show that the excitation of the labeled antibodies at the short wavelength peak does not generate as much fluorescence as when the excitation at the longer wavelength peak. This observation is consistent with the idea that the shorter wavelength absorption peak is due to the formation of non-fluorescent dimers and aggregates on the antibody molecules.

Es wurde gefunden, daß das zum Erhalt der Werte der 3 verwendete Markierungs-Reagens, bestehend aus einem Arylsulfonat-Cyanin-Farbstoff, auf den Antikörpermolekülen nicht ohne weiteres aggregiert. Dies ergibt sich aus dem erheblich kleineren Absorptionspeak bei. Wellenlängen, bei denen charakteristscherweise Dimere absorbieren (vgl. 5). Dies ist deswegen von Wichtigkeit, weil Antikörper und andere Proteine, die mit diesen "nichtaggregierenden" Markierungs-Reagentien markiert worden sind, stärker fluoreszierende markier te Proteine ergeben sollten. Tatsächlich ergeben die Arylsulfocyanine selbst dann glänzend fluoreszierende Antikörper, wenn das mittlere Verhältnis Farbstoff pro Antikörper relativ hoch ist (vgl. 6).It has been found that this is to obtain the values of the 3 used labeling reagent, consisting of an arylsulfonate-cyanine dye, does not readily aggregate on the antibody molecules. This results from the significantly smaller absorption peak at. Wavelengths at which dimers characteristically absorb (cf. 5 ). This is important because antibodies and other proteins that have been labeled with these "non-aggregating" labeling reagents should result in more fluorescent labeled proteins. In fact, the arylsulfocyanines produce glossy fluorescent antibodies even if the average dye per antibody ratio is relatively high (cf. 6 ).

Schaf-Immunoglobulin (IgG), das mit einem Carboxyindodicarbocyanin-Farbstoff markiert worden ist, ist in 4 gezeigt. Die 5 zeigt das Protein, das mit dem neuen Sulfiindodicarbocyanin-Farbstoff konjugiert worden ist. Die Anwesenheit von erhöhtem Dimeren (vgl. 1) in der erstgenannten Probe ist offensichtlich. Obgleich das Molverhältnis Farbstoff:Protein bei beiden Präparaten ungefähr gleich war, war das in 5 dargestellte Protein erheblich stärker fluoreszierend als die in 4 gezeigte Probe.Sheep immunoglobulin (IgG) labeled with a carboxyindodicarbocyanine dye is shown in 4 shown. The 5 shows the protein conjugated to the new sulfiindodicarbocyanine dye. The presence of increased dimers (cf. 1 ) is evident in the former sample Lich. Although the molar ratio of dye: protein was approximately the same for both preparations, it was in 5 shown protein fluoresces considerably more than that in 4 shown sample.

Um glänzende bzw. hell fluoreszierende Antikörper oder andere Proteine, die mit Fluoreszenz-Farbstoffen markiert worden sind, zu erhalten, ist es von Wichtigkeit, daß die mittlere Quantenausbeute pro Farbstoffmolekül auf dem Protein so hoch wie möglich ist. Es ist allgemein festgestellt worden, daß, wenn die Oberflächendichte der Farbstoffmoleküle auf dem Protein zunimmt (d.h., wenn das Verhältnis von Farbstoff zu Protein zunimmt), dann die mittlere Quantenausbeute der Farbstoffe vermindert wird. Dieser Effekt ist manchmal dem Auslöschen zugeschrieben worden, das als Ergebnis einer Farbstoff-Farbstoff-Wechselwirkung auf der Oberfläche von stärker markierten Proteinen stattfindet. Die Bildung von nichtfluoreszierenden Dimeren auf Proteinoberflächen kann mit Sicherheit zu diesem Auslöschen beitragen. Die 6 zeigt, daß die mittlere Quantenausbeute eines Arylsulfocyanin-Farbstoffs langsam abnimmt, wenn das Farbstoff/Protein-Verhältnis zunimmt (Kurve mit Diamantensymbolen). Demgegenüber zeigt die Kurve mit den runden Symbolen, daß eine sehr rasche Abnahme der mittleren Quantenausbeute für das Konjugat eines Nicht-Arylsulfocyanin-Farbstoffs (N,N'-Di-sulfobutyl-indodicarbocyanin-5-isothiocyanat) stattfindet, wenn das Farbstoff/Protein-Verhältnis zunimmt. Daher ergibt der in Figur 6 gezeigte Sulfocyanin-Farbstoff stärker glänzend fluoreszierende Antikörper als der andere Farbstoff, und zwar insbesondere im Markierungsbereich von 1 bis 10 Farbstoffmolekülen pro Antikörpermolekül.In order to obtain shiny or brightly fluorescent antibodies or other proteins which have been labeled with fluorescent dyes, it is important that the mean quantum yield per dye molecule on the protein is as high as possible. It has generally been found that as the surface density of the dye molecules on the protein increases (ie, when the ratio of dye to protein increases), then the mean quantum yield of the dyes is reduced. This effect has sometimes been attributed to the extinction that occurs as a result of a dye-dye interaction on the surface of more labeled proteins. The formation of non-fluorescent dimers on protein surfaces can certainly contribute to this quenching. The 6 shows that the mean quantum yield of an arylsulfocyanine dye slowly decreases as the dye / protein ratio increases (curve with diamond symbols). In contrast, the curve with the round symbols shows that a very rapid decrease in the mean quantum yield for the conjugate of a non-arylsulfocyanine dye (N, N'-disulfobutylindodicarbocyanine-5-isothiocyanate) takes place when the dye / protein Ratio increases. Therefore, the sulfocyanine dye shown in FIG. 6 produces more brightly fluorescent antibodies than the other dye, in particular in the labeling range of 1 to 10 dye molecules per antibody molecule.

Die mittlere Fluoreszenz-Quantenausbeute der einzelnen Farbstoffmoleküle auf den markierten Proteinen ist ein Maß des von diesen Biomolekülen erhältlichen Fluoreszenzsignals. Werte von Schaf-Immunoglobulin (IgG), das mit dem neuen Sulfoindodicarbocyanin-Farbstoff in phosphatgepufferter Kochsalzlösung markiert worden war, sind in der Kurve mit Diamantensymbolen der 6 gezeigt. Die Kurve mit runden Symbolen der 6 zeigt Proteine, die mit einem reaktivere Indodicarbocyanin-isothiocyanat-Farbstoff zum Vergleich markiert worden sind. In 6 stellen die Quantenausbeuten bei einem Verhältnis Farbstoff/Protein von Null die Werte für die Methylamin-Addukte der reaktiven Farbstoffe (freier Farbstoff) im Puffer dar.The mean fluorescence quantum yield of the individual dye molecules on the labeled proteins is a measure of the fluorescence signal available from these biomolecules. Values of sheep immunoglobulin (IgG) labeled with the new sulfoindodicarbocyanine dye in phosphate buffered saline are shown in the curve with the diamond symbols 6 shown. The curve with round symbols of the 6 shows proteins that have been labeled with a more reactive indodicarbocyanine isothiocyanate dye for comparison. In 6 the quantum yields with a dye / protein ratio of zero represent the values for the methylamine adducts of the reactive dyes (free dye) in the buffer.

Hintergrund-VerfahrenBackground method

Lumineszenz-Sonden sind wertvolle Reagentien für die Analyse und Trennung von Molekülen und Zellen und für die Erfassung und quantitative Bestimmung von anderen Materialien. Eine sehr kleine Anzahl von lumineszierenden Molekülen kann unter optimalen Umständen erfaßt werden. Barak und Webb sehen weniger als 50 Fluoreszenz-Lipid-Analoge im Zusammenhang mit der LDL-Rezeption von Zellen unter Verwendung einer SIT-Kamera, J. Cell. Biol: 90:595–605 (1981). Die Fließ-Cytometrie kann dazu verwendet werden, um weniger als 10.000 Fluoresceinmoleküle zu erfassen, die mit Teilchen oder bestimmten Zellen assoziiert sind (Muirhead, Horan und Poste, Bio/Technology 3:337–356 (1985)). Einige spezielle Beispiele für die Anwendung von Fluoreszenz-Sonden sind (1) die Identifizierung und Trennung von Subpopulationen von Zellen in einem Gemisch von Zellen durch die Techniken der Fluoreszenz-Fließ-Cytometrie, der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung und der Fluoreszertz-Mikroskopie; (2) die Bestimmung der Konzentration einer Substanz, die sich an eine zweite Art bindet (zum Beispiel Antigen-Antikörper-Reaktionen), bei der Technik des Fluoreszenz-Immunoassays; (3) die Lokalisierung von Substanzen in Gelen und anderen unlöslichen Trägern durch die Techniken der Fluoreszenz-Anfärbung. Diese Techniken werden von Herzenberg et al., "Cellular Immunology", 3. Auflage, Kapitel 22; Blackwell Scientific Publications, 1978 (Fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren); und von Goldman, "Fluorescence Antibody Methods", Academic Press, New York, 1968 (Fluoreszenz-Mikroskopie und Fluoreszenz-Anfärbung); und in "Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences", herausgegeben von Taylor et al., Alan Liss Inc., 1986, beschrieben.Luminescence probes are valuable Reagents for the analysis and separation of molecules and cells and for detection and quantitative determination of other materials. A very small one The number of luminescent molecules can be detected under optimal circumstances. Barak and Webb see fewer than 50 fluorescence lipid analogs in the Connection with the LDL reception of cells using a SIT camera, J. Cell. Biol: 90: 595-605 (1981). Flow cytometry can be used to detect less than 10,000 fluorescein molecules associated with particles or certain cells (Muirhead, Horan and Poste, Bio / Technology 3: 337-356 (1985)). Some special ones examples for the use of fluorescent probes are (1) the identification and separation of subpopulations of cells in a mixture of Cells activated by the techniques of fluorescence flow cytometry, the fluorescence Cell sorting and fluorescence microscopy; (2) the determination the concentration of a substance that binds to a second species (for example antigen-antibody reactions), in the technique of fluorescence immunoassay; (3) the localization of substances in gels and other insoluble carriers by the techniques of Fluorescence staining. These techniques are described by Herzenberg et al., "Cellular Immunology", 3rd edition, chapter 22; Blackwell Scientific Publications, 1978 (Fluorescence Activated Cell Sorting); and by Goldman, "Fluorescence Antibody Methods ", Academic Press, New York, 1968 (fluorescence microscopy and fluorescence staining); and in "Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences ", edited by Taylor et al., Alan Liss Inc., 1986.

Bei der Verwendung von Fluoreszenzmitteln für die obigen Zwecke bestehen hinsichtlich der Wahl des Fluoreszenzmitteln viele Beschränkungen. Eine Beschränkung besteht in den Absorptions- und Emissionseigenschaften des Fluoreszenzmittels, da viele Liganden, Rezeptoren und Materialien in der Testprobe, zum Beispiel Blut, Urin, Cerebrospinal-Flüssigkeit, fluoreszieren und die genaue Bestimmung der Fluoreszenz der fluoreszierenden Probe stören. Diese Erscheinung wird als Autofluoreszenz oder Hintergrund-Fluoreszenz bezeichnet. Ein weiterer Gesichtspunkt ist die Fähigkeit des Fluoreszenzmitteln, mit Liganden und Rezeptoren und anderen biologischen und nichtbiologischen Materialien zu konjugieren, und der Effekt einer solchen Konjugation auf das Fluoreszenzmittel. In vielen Situationen kann die Konjugierung an ein anderes Molekül zu einer wesentlichen Veränderung der Fluoreszenz- Eigenschaften des Fluoreszenzmittels führen und in manchen Fällen sogar die Quantenleistung des Fluoreszenzmittels wesentlich zerstören oder vermindern. Es ist auch möglich, daß die Konjugierung mit dem Fluoreszenzmittel die Funktion des zu markierenden Moleküls inaktiviert. Eine dritte Erwägung liegt in der Quantenleistung des Fluoreszenzmittels, die für eine empfindliche Erfassung hoch sein sollte. Eine vierte Erwägung ist die Lichtabsorptionsfähigkeit oder der Extinktionskoeffizient des Fluoreszenzmittels, der so groß wie möglich sein sollte. Von Wichtigkeit ist auch, ob sich die Fluoreszenzmoleküle miteinander umsetzen, wenn sie sich in enger Nähe befinden, was zu einem Selbstauslöschen führen würde. Eine weitere Befürchtung geht dahin, ob eine nichtspezifische Bindung des Fluoreszenzmittels an andere Verbindungen oder Behälterwände entweder selbst oder in Verbindung mit der Verbindung, an die das Fluoreszenzmittel konjugiert wird, erfolgt.When using fluorescent agents for the above purposes, there are many restrictions on the choice of fluorescent agent. One limitation is the absorption and emission properties of the fluorescent agent, since many ligands, receptors and materials in the test sample, for example blood, urine, cerebrospinal fluid, fluoresce and interfere with the precise determination of the fluorescence of the fluorescent sample. This phenomenon is called autofluorescence or background fluorescence. Another aspect is the ability of the fluorescent to conjugate to ligands and receptors and other biological and non-biological materials, and the effect of such conjugation on the fluorescent. In many situations, conjugation to another molecule can result in a significant change in the fluorescent properties of the fluorescent agent and, in some cases, even significantly destroy or reduce the quantum performance of the fluorescent agent. It is also possible that the conjugation with the fluorescent agent inactivates the function of the molecule to be labeled. A third consideration is the quantum power of the fluorescent agent, which should be high for sensitive detection. A fourth consideration is the light absorption capacity or the extinction coefficient of the fluorescent agent, which should be as large as possible. It is also important whether the fluorescent molecules react with one another when they are in close proximity, which would lead to self-extinguishing. Another fear is whether non-specific binding of the fluorescent agent will occur other connections or container walls are made either by themselves or in connection with the connection to which the fluorescent agent is conjugated.

Die Anwendbarkeit und der Wert der obenbeschriebenen Methoden sind eng an die Verfügbarkeit von geeigneten fluoreszierenden Verbindungen gekoppelt. Insbesondere besteht ein Bedarf an fluoreszierenden Substanzen, die in dem längeren Wellenlängenbereich des sichtbaren Bereichs (Gelb bis nahes Infrarot) emittieren, da die Anregung dieser Chromophoren weniger Autofluoreszenz und auch vielfache Chromophoren ergibt, die bei verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren, die gleichzeitig analysiert werden können, wenn die gesamten sichtbaren und die nahen Znfrarotbereiche des Spektrums verwendet werden können. Fluorescein, eine weit verwendete fluoreszierende Verbindung, ist eine geeignete Emissionsverbindung im grünen Bereich, obgleich bei bestimmten Immunoassays und Zellanalysensystemen die Hintergrund-Autofluoreszenz, welche durch Anregung bei Fluorescein-Absorptionswellenlängen erzeugt wird, die Empfindlichkeit der Erfassung beschränkt. Jedoch hat sich das herkömmliche rotfluoreszierende Markierungsmittel Rhodamin als weniger wirksam als Fluorescein erwiesen. Texasrot® ist ein geeignetes Markierungsmittel, das bei 578 nm angeregt werden kann und maximal bei 610 nm fluoresziert.The applicability and value of the methods described above are closely linked to the availability of suitable fluorescent compounds. In particular, there is a need for fluorescent substances that emit in the longer wavelength range of the visible range (yellow to near infrared) because the excitation of these chromophores results in less autofluorescence and also multiple chromophores that fluoresce at different wavelengths that can be analyzed simultaneously if the entire visible and the near infrared regions of the spectrum can be used. Fluorescein, a widely used fluorescent compound, is a suitable emission compound in the green range, although in certain immunoassays and cell analysis systems the background autofluorescence generated by excitation at fluorescein absorption wavelengths limits the sensitivity of the detection. However, the conventional red fluorescent label, rhodamine, has been found to be less effective than fluorescein. Texasrot ® is a suitable marker that can be excited at 578 nm and fluoresces at a maximum of 610 nm.

Phycobiliproteine haben einen wichtigen Beitrag wegen ihres hohen Extinktionskoeffizienten und der hohen Quantenausbeute gemacht. Diese Chromophor enthaltenden Proteine können kovalent an viele Proteine gebunden werden, und sie werden in Fluoreszenz-Antikörper-Assays in der Mikroskopie und der Fließ-Cytometrie verwendet. Die Phycobiliproteine haben jedoch folgende Nachteile: (1) die Protein-Markierungsverfahrensweise ist relativ komplex; (2) die Protein-Markierungsleistung ist gewöhnlich nicht hoch (typischerweise ein Mittel von 0,5 Phycobiliprotein-Moleküle pro Protein); (3) das Phycobiliprotein ist ein Naturprodukt, und seine Herstellung und Reinigung ist komplex; (4) die Phycobiliproteine sind teuer; (5) es sind keine Phycobiliproteine als Markierungs-Reagentien verfügbar, die weiter zum roten Bereich des Spektrums als Allophycocyanin fluoreszieren, welches maximal bei 680 nm fluoresziert; (6) die Phycobiliproteine sind chemisch relativ instabil; (7) sie sind leicht einer Photobleichung unterworfen; (8) die Phycobiliproteine sind große Proteine mit Molekulargewichten im Bereich von 33.000 bis 240.000, und sie sind größer als viele Materialien, die markiert werden sollen, wie Metabolite, Arzneimittel, Hormone, derivatisierte Nucleotide und viele Proteine mit Einschluß von Antikörpern. Der letztgenannte Nachteil ist von besonderer Wichtigkeit, da Antikörper, Avidin, DNA-Hybridisierungs-Sonden, Hormone und kleine Moleküle, die mit den großen Phycobiliproteinen markiert sind, nicht dazu imstande sein können, sich an ihre Targets wegen sterischer Begrenzungen zu binden, die durch die Größe des konjugierten Komplexes auferlegt werden. Die Bindungsrate von Konjugaten an Targets ist gegen über niedermolekularen Konjugaten langsam.Phycobiliproteins have an important one Contribution because of their high extinction coefficient and the high Quantum yield made. These chromophore-containing proteins can covalently bound to many proteins and they are used in fluorescent antibody assays in microscopy and flow cytometry used. However, the phycobiliproteins have the following disadvantages: (1) the protein labeling procedure is relatively complex; (2) protein labeling performance is usually not high (typically one Average of 0.5 phycobiliprotein molecules per protein); (3) the phycobiliprotein is a natural product and its production and cleaning is complex; (4) the phycobiliproteins are expensive; (5) they are not phycobiliproteins as labeling reagents available, which fluoresce to the red part of the spectrum as allophycocyanin, which fluoresces at a maximum of 680 nm; (6) the phycobiliproteins are relatively unstable chemically; (7) They are easily photo bleached subject; (8) the phycobiliproteins are large proteins with molecular weights in the range of 33,000 to 240,000 and they are larger than many materials to be labeled, such as metabolites, drugs, Hormones, derivatized nucleotides and many proteins including antibodies. The the latter disadvantage is of particular importance since antibodies, avidin, DNA hybridization probes, hormones and small molecules that with the big ones Phycobiliproteins are labeled, may not be able to to bind to their targets because of steric constraints caused by the size of the conjugate Complex to be imposed. The binding rate of conjugates to targets is against low molecular weight conjugates slowly.

Durch andere Techniken, wie Histologie, Cytologie, Immunoassays, würden auch erhebliche Vorteile durch die Verwendung eines Fluoreszenzmittels mit hoher Quanteneffizienz, Absorptions- und Emissionseigenschaften bei längeren Wellenlängen und mit einfacher Durchführung der Konjugierung, die von einer nichtspezifischen Interferenz im wesentlichen frei sind, erfahren.Through other techniques, like histology, Cytology, immunoassays, would also significant benefits from using a fluorescent agent with high quantum efficiency, absorption and emission properties at longer wavelengths and with simple implementation of conjugation caused by non-specific interference in the are essentially free, experienced.

Gemäß der Erfindung werden reaktive fluoreszierende arylsulfonierte Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe mit relativ großen EXtinktionskoeffizienten und hohen Quantenausbeuten zum Zwecke der Erfassung und quantitativen Bestimmung von markierten Komponenten verwendet.According to the invention, reactive fluorescent arylsulfonated cyanine and related dyes with relatively large ones Extinction coefficients and high quantum yields for the purpose of Acquisition and quantitative determination of marked components used.

Fluoreszierende Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe können zur Markierung von biologischen Materialien, wie Antikörpern, Antigenen, Avidin, Streptavidin, Proteinen, Peptiden, derivatisierten Nucleotiden, Kohlenhydraten, Lipiden, biologischen Zellen, Bakterien, Viren, Blutzellen, Gewebezellen, Hormonen, Lymphokinen, biologischen Spurenmolekülen, Toxinen und Arzneimitteln, verwendet werden. Fluoreszenz-Farbstoffe können auch zur Markierung von nichtbiologischen Materialien, wie löslichen Polymeren und polymeren und Glasteilchen, Arzneimitteln, Leitern, Halbleitern, Glas- und Polymeroberflächen, Polymermembranen und anderen festen Teilchen, verwendet werden. Die zu markierende Komponente kann auch in einem Gemisch mit anderen Materialien vorliegen. Das Gemisch, in dem die Markierungsreaktion stattfindet, kann ein flüssiges Gemisch, insbesondere ein wäßriges Gemisch, sein. Die Erfassungsstufe kann mit dem Gemisch in flüssigem oder trockenem Zustand, beispielsweise einem Objektträger, durchgeführt werden.Fluorescent cyanine and thus related dyes can for marking biological materials, such as antibodies, antigens, Avidin, streptavidin, proteins, peptides, derivatized nucleotides, carbohydrates, Lipids, biological cells, bacteria, viruses, blood cells, tissue cells, Hormones, lymphokines, biological trace molecules, toxins and drugs, be used. Fluorescent dyes can also be used to label non-biological materials such as soluble polymers and polymers and Glass particles, drugs, conductors, semiconductors, glass and polymer surfaces, polymer membranes and other solid particles. The one to be marked Component can also be in a mixture with other materials. The mixture in which the labeling reaction takes place can be liquid mixture, especially an aqueous mixture, his. The detection level can be with the mixture in liquid or dry state, for example a slide.

Erfindungsgemäß ist es erforderlich, daß Cyanin-Farbstoffe durch die Einarbeitung einer reaktiven Gruppe in das Cyaninmolekül modifiziert werden. Diese reaktive Gruppe heftet sich kovalent an ein Ziel- bzw. Targetmolekül, vorzugsweise an eine Amin- oder Hydroxystelle, und in manchen Fällen an eine Sulfhydryl- oder Aldehydstelle. Die Erfindung verwendet auch die Modifizierung oder Verwendung von Cyanin- und damit verwandten Farbstoffstrukturen, um ihre Löslichkeit in der Testflüssigkeit zu erhöhen, um (1) ihre Handhabung bei. Markierungsreaktionen leichter zu machen, (2) die Aggregation des Farbstoffs auf der Oberfläche der zu markierenden Proteine zu verhindern helfen und (3) die nichtspezifische Bindung von markierten Materialien an biologische Materialien und an Oberflächen und die Assayvorrichtung zu verhindern helfen.According to the invention it is necessary that cyanine dyes modified by the incorporation of a reactive group into the cyanine molecule become. This reactive group attaches covalently to a target or target molecule, preferably at an amine or hydroxy site, and in some cases a sulfhydryl or aldehyde site. The invention also uses the modification or use of cyanine and related Dye structures to their solubility in the test liquid to increase to (1) handle them. To make marking reactions easier, (2) the aggregation of the dye on the surface of the to prevent proteins to be labeled and (3) the non-specific Binding of labeled materials to biological materials and on surfaces and help prevent the assay device.

Die Cyanin- und die damit verwandten Farbstoffe bieten einen wichtigen Vorteil über derzeit verfügbare fluoreszierende Markierungs-Reagentien. Zum ersten sind Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe synthetisiert worden, die in einem Bereich des Spektrums von 400 bis nahezu 1100 nm absorbieren und emittieren. Somit können reaktive Derivate dieser Farbstoffe für Assays hergestellt werden, die eine gleichzeitige Messung einer Anzahl von markierten Materialien erfordern. Die Vielfarben-(oder Multiparameter-)analyse dieser Art kann im Interesse der Einfachheit, der Kostenwirksamkeit oder zur Bestimmung von Verhältnissen von verschiedenen markierten Arten auf jedem Teilchen in einem komplexen Gemisch von Teilchen zweckmäßig sein (zum Beispiel der Verhältnisse von Antigen-Markern auf individuellen Blutzellen in einem komplexen Gemisch durch Multiparameter-Fließ-Cytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie). Zum zweiten absorbieren und fluoreszieren viele Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe stark. Zum dritten sind viele Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe relativ photostabil, und sie bleichen nicht ohne weiteres im Fluoreszenz-Mikroskop. Zum vierten können Cyanin- und damit verwandte Derivate hergestellt werden, die einfache und wirksame Kupplungs-Reagentien sind. Zum fünften sind viele Strukturen und synthetische Verfahrensweisen verfügbar, und die Klasse der Farbstoffe ist vielfältig. Es können daher viele Strukturmodifikationen durchgeführt werden, um die Reagentien mehr oder weniger wasserlöslich zu machen. Ihre Ladung kann verändert werden, so daß sie das Molekül nicht stören, an das sie angefügt sind, wodurch die nichtspezi fische Bindung reduziert werden kann. Zum sechsten sind im Gegensatz zu den Phycobiliprotei.nen die Cyanin-Farbstoffe relativ klein (Molekulargewicht = 1000), so daß sie nicht nennenswerterweise mit der Fähigkeit des markierten Moleküls sterisch interferieren, ihre Bindungsstelle rasch zu erreichen oder ihre Funktion auszuüben.The cyanine and related Dyes offer an important advantage over currently available fluorescent Labeling reagents. First, are cyanine and related Dyes have been synthesized across a range of the spectrum absorb and emit from 400 to almost 1100 nm. Thus, reactive Derivatives of these dyes for Assays are made that require simultaneous measurementsolution one Require number of marked materials. The multicolor (or Multiparameter) analysis of this type can, in the interest of simplicity, cost effectiveness or to determine conditions of different labeled species on each particle in a complex Mixture of particles may be appropriate (for Example of relationships of antigen markers on individual blood cells in a complex Mixture by multi-parameter flow cytometry or fluorescence microscopy). Secondly, many cyanines absorb and fluoresce and thus related dyes strong. Third, there are many cyanines and therefore related dyes are relatively photostable and they do not bleach easily in the fluorescence microscope. Fourth, cyanine and related derivatives are made that are simple and effective coupling reagents. Fifth, there are many structures and synthetic procedures available, and the class of dyes is diverse. It can therefore many structural modifications are made to the reagents more or less water soluble close. Your cargo can change be so that they the molecule do not bother, to which it is attached are what the nonspec fish bond can be reduced. The sixth are in contrast to the Phycobiliprotei.nen the cyanine dyes are relatively small (molecular weight = 1000), see above that she not significantly steric with the ability of the labeled molecule interfere to quickly reach their binding site or their Function.

Somit bringen Cyanin-Farbstoff-Markierungsmittel viele potentielle Vorteile mit sich. Diese Farbstoffe können dazu verwendet werden, um ein oder mehrere Komponenten in einer Flüssigkeit, insbesondere einer wäßrigen Flüssigkeit, selektiv zu markieren. Die markierten Komponenten können sodann durch optische oder Lumineszenzmethoden erfaßt werden. Alternativ kann die markierte Komponente dazu verwendet werden, um eine zweite Komponente anzufärben, für die sie eine starke Affinität besitzt. Die Anwesenheit der zweiten Komponente wird sodann durch optische oder Lumineszenzmethoden festgestellt. In diesem Fall wird der Farbstoff mit einer Amin-, Hydroxy-, Aldehyd- oder Sulfhydrylgruppe auf der markierten Komponente umgesetzt. So kann beispielsweise die markierte Komponente ein Antikörper sein, und die angefärbte Komponente, für die sie eine starke Affinität hat, kann eine biologische Zelle, ein Antigen oder ein Hapten oder eine biologische Zelle oder ein Teilchen, das das genannte Antigen oder Hapten enthält, sein. Gemäß einem weiteren Beispiel ist die markierte Komponente Avidin, und die angefärbte Komponente kann ein biotinyliertes Material sein. Auch können Lectine, die mit Polymethin-Cyanin-Farbstoffen konjugiert sind, dazu verwendet werden, um spezielle Kohlenhydratgruppen zu erfassen und quantitativ zu bestimmen. Weiterhin können Lumineszenz-Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe an Fragmente von DNA oder RNA angeheftet werden. Die markierten Fragmente von DNA oder RNA können als Fluoreszenz-Hybridisierungssonden verwendet werden, um das Vorhandensein und die Menge von spezifischen komplementären Nucleotid-Sequenzen in Proben, die DNA oder RNA enthalten, zu identifizieren. Auch kann der Farbstoff an ein Hormon oder an einen Liganden (zum Beispiel ein Hormon, ein Protein, ein Peptid, ein Lymphokin, einen Metaboliten); angefügt werden, das bzw. der danach an einen Rezeptor angefügt wird.Thus bring cyanine dye markers many potential benefits with it. These dyes can do this used to contain one or more components in a liquid, especially an aqueous liquid, to selectively mark. The marked components can then can be detected by optical or luminescence methods. Alternatively, you can the highlighted component can be used to create a second component to color, for the they have a strong affinity has. The presence of the second component is then confirmed by optical or luminescence methods determined. In this case the dye with an amine, hydroxy, aldehyde or sulfhydryl group implemented on the marked component. For example the labeled component is an antibody and the stained component, for them a strong affinity has a biological cell, an antigen or a hapten or a biological cell or particle called antigen or contains hapten, his. According to one Another example is the marked component Avidin, and the colored component can be a biotinylated material. Lectins containing polymethine cyanine dyes can also be used are conjugated to be used to form special carbohydrate groups to be recorded and quantified. Furthermore, luminescence cyanine and related dyes attached to fragments of DNA or RNA become. The labeled fragments of DNA or RNA can be used as Fluorescence hybridization probes are used to determine the presence and the amount of specific complementary nucleotide sequences in Identify samples that contain DNA or RNA. Can too the dye to a hormone or to a ligand (e.g. a Hormone, a protein, a peptide, a lymphokine, a metabolite); added which is then attached to a receptor.

Für andere Zwecke in Patentschriften beschriebene reaktive Cyanin-FarbstoffeFor other purposes in patents described reactive cyanine dyes

Gemäß den US-PSen 4 337 063 (Miraha et al.), 4 404 289 , 4 405 711 und 4 414 325 (Masuda et al.) ist eine Vielzahl von Cyanin-Farbstoffen synthetisiert worden, die aktive N-Hydroxysuccinimidester-Gruppen enthalten. Diese Patente zeigen, daß diese Reagentien als photographische Sensibilisatoren verwendet werden können. Die möglichen Fluoreszenz-Eigenschaften dieser Reagentien sind in den Patenten nicht genannt. Tatsächlich sind auch für diese Prozesse keine Fluoreszenz-Eigenschaften erforderlich. Die meisten der in diesen Patentschriften genannten Farbstoffe sind nur schwach fluoreszierend, und sie sind nicht besonders photostabil. Weiterhin sind ihre Löslichkeitseigenschaften für viele Anwendungszwecke nicht optimal, die eine Fluoreszenzerfassung von markierten Materialien beinhalten würden.According to the U.S. Patent 4,337,063 (Miraha et al.), 4 404 289 . 4 405 711 and 4,414,325 (Masuda et al.) A variety of cyanine dyes have been synthesized which contain active N-hydroxysuccinimide ester groups. These patents show that these reagents can be used as photographic sensitizers. The potential fluorescence properties of these reagents are not mentioned in the patents. In fact, no fluorescence properties are required for these processes either. Most of the dyes mentioned in these patents are only weakly fluorescent and they are not particularly photostable. Furthermore, their solubility properties are not optimal for many applications that would involve fluorescence detection of labeled materials.

In der GB-PS 1 529 202 (Exekiel et al.) werden zahlreiche Cyanin-Farbstoffderivate beschrieben, die als kovalent reagierende Moleküle verwendet werden. Die in diesen Reagentien verwendete reaktive Gruppe ist eine Azingruppe, zu der Mono- und Dichlortriazingruppen gehören. Diese Druckschrift bezieht sich auf die Entwicklung und die Verwendung dieser Reagentien als Sensibilisatoren für photographische Filme. Für dieses Verfahren ist keine Fluoreszenz erforderlich, und die meisten der darin beschriebenen Reagentien sind nicht fluoreszierend. Schließlich bezieht sich diese Druckschrift nicht auf die Entwicklung und Verwendung von reaktiven Cyanin-Farbstoffen zum Zwecke der Erfassung und quantitativen Bestimmung von markierten Materialien.In the GB-PS 1 529 202 (Exekiel et al.) Numerous cyanine dye derivatives are described which are used as covalently reacting molecules. The reactive group used in these reagents is an azine group, which includes mono- and dichlorotriazine groups. This document relates to the development and use of these reagents as sensitizers for photographic films. No fluorescence is required for this procedure and most of the reagents described therein are not fluorescent. Finally, this document does not refer to the development and use of reactive cyanine dyes for the purpose of the detection and quantitative determination of labeled materials.

Die vorliegende Erfindung betrifft Methoden zum kovalenten Anheften von lumineszierenden Cyanin- und cyaninartigen Farbstoffen an biologische Materialien, nichtbiologische Materialien und Makromoleküle und Teilchen, damit diese Materialien lumineszierend markiert werden. Auf diese Weise kann das markierte Material durch Lumineszenz-Erfassungsmethoden erfaßt und/oder quantitativ bestimmt werden.The present invention relates to Methods for covalently attaching luminescent cyanine and cyanine-like dyes on biological materials, non-biological Materials and macromolecules and particles for these materials to be luminescent labeled. In this way, the marked material can be obtained by luminescence detection methods detected and / or determined quantitatively.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erfassung einer Komponente in einer Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet. ist, daß man zu der genannten Flüssigkeit einen Farbstoff zusetzt, der aus der Gruppe bestehend aus Cyanin-, Merocyanin- und Styryl-Farbstoffen ausgewählt ist und der in der Flüssigkeit löslich ist und einen Substituenten enthält, damit er mit Amin- und Hydroxygruppen und möglicherweise mit Aldehyd- und Sulfhydrylgruppen auf der genannten Komponente kovalent reaktiv wird, so daß die genannte Komponente markiert wird. Die markierte Komponente wird sodann durch Lumineszenz- oder Lichtabsorptionsmethoden erfaßt und/oder quantitativ bestimmt. Wenn die markierte Komponente ein Antikörper, ein DNA-Fragment, ein Hormon, ein Lymphokin oder ein Arzneimittel ist, dann kann die markierte Komponente dazu verwendet werden, um das Vorhandensein einer zweiten Komponente, an die es gebunden wird, zu identifizieren, worauf die zweite Komponente erfaßt und/oder quantitativ bestimmt werden kann.The invention relates to a method for detecting a component in a liquid, which is characterized in that. is that a dye is added to the liquid mentioned, which is selected from the group consisting of cyanine, merocyanine and styryl dyes and which is soluble in the liquid and contains a substituent so that it becomes covalently reactive with amine and hydroxyl groups and possibly with aldehyde and sulfhydryl groups on said component so that said component is labeled. The labeled component is then detected by luminescence or light absorption methods and / or determined quantitatively. If the labeled component is an antibody, a DNA fragment, a hormone, a lymphokine, or a drug, then the labeled component can be used to identify the presence of a second component to which it is bound, followed by the second Component can be detected and / or determined quantitatively.

Jede beliebige Lumineszenz- oder Lichtabsorptions-Erfassungsstufe kann angewendet werden. So kann beispielsweise die Erfassungsstufe eine optische Erfassungsstufe sein, bei der die Flüssigkeit mit Licht von ersten definierten Wellenlängen bestrahlt wird. Licht mit zweiten definierten Wellenlängen, das durch die markierte Komponente fluoresziert oder phosphoresziert wird, wird hierauf erfaßt. Die Erfassung kann auch durch optische Lichtabsorption erfolgen. So kann beispielsweise die Erfassungsstufe in der Weise durchgeführt werden, daß man Licht mit ersten definierten Wellenlängen durch die Flüssigkeit leitet und sodann die Wellenlänge des Lichts, das durch die Flüssigkeit hindurchgelassen wird, bestimmt.Any luminescent or Light absorption detection level can be applied. So can for example the detection level is an optical detection level be at which the liquid is irradiated with light of the first defined wavelengths. light with second defined wavelengths, that fluoresces or phosphoresces through the labeled component is recorded thereon. The detection can also be done by optical light absorption. For example, the detection level can be carried out in such a way that he Light with first defined wavelengths through the liquid conducts and then the wavelength of light through the liquid is let through.

Gewünschtenfalls kann die Erfassungsstufe auch eine chemische Analyse umfassen, um chemisch eine Anheftung des Cyanins oder eines verwandten Chromophors an die Komponente zu erfassen.If desired, the registration level also include chemical analysis to chemically attach of the cyanine or a related chromophore to the component capture.

Die Grundstrukturen der Cyanin-, Merocyanin- und Styryl-Farbstoffe, die modifiziert werden können, um kovalente Markierungs-Reagentien zu erzeugen, sind nachfolgend gezeigt:

Figure 00280001
The basic structures of the cyanine, merocyanine, and styryl dyes that can be modified to generate covalent labeling reagents are shown below:
Figure 00280001

Spezifischere Beispiele von Polymethin-Cyanin-Farbstoffen sind wie folgt:

Figure 00290001
Figure 00300001

X und Y aus der Gruppe, O, S und
Figure 00310001
ausgewählt;
Z ist aus der Gruppe O und S ausgewählt und
m ist eine ganze Zahl, die aus der Gruppe bestehend aus 1, 2, 3 und 4 ausgewählt ist.More specific examples of polymethine cyanine dyes are as follows:
Figure 00290001
Figure 00300001

X and Y from the group, O, S and
Figure 00310001
selected;
Z is selected from the groups O and S and
m is an integer selected from the group consisting of 1, 2, 3 and 4.

In den obigen Formeln bestimmt die Anzahl der Methingruppen zum Teil die Anregungsfarbe. Die cyclischen Azinstrukturen können auch zum Teil die Anregungsfarbe bestimmen. Oftmals tragen höhere Wert von m zu einer gesteigerten Lumineszenz und Absorption bei. Bei Werten von m oberhalb 4 wird die Verbindung instabil. Eine weitere Lumineszenz kann durch Modifikationen der Ringstrukturen verliehen werden. Wenn m = 2, dann ist die Anregungswellenlänge etwa 650 nm, und die Verbindung ist sehr stark fluoreszierend. Maximale Emissionswellenlängen sind im allgemeinen 15 bis 100 nm höher als die maximalen Anregungswellenlängen.In the above formulas, the number of methine groups partly determines the excitation color. The cyclic azine structures can also determine the excitation color in part. Often higher values of m contribute to increased luminescence and absorption. At values of m above 4, the connection becomes unstable. A further luminescence can be given by modifications of the ring structures. If m = 2, the excitation wavelength is about 650 nm and the compound is very strongly fluorescent rend. Maximum emission wavelengths are generally 15 to 100 nm higher than the maximum excitation wavelengths.

Mindestens einer, vorzugsweise nur einer, und möglicherweise zwei oder mehr der genannten Gruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6, und R7 in jedem Molekül ist bzw. sind eine reaktive Gruppe zur Anheftung des Farbstoffs an die markierte Komponente. Für bestimmte Reagentien kann mindestens eine der Gruppen R1 R2, R3, R4, R5, R6 und R7 auf jedem Molekül auch eine Gruppe sein, die die Löslichkeit des Chromophors erhöht oder die Selektivität der Markierung der markierten Komponente beeinträchtigt oder die Position der Markierung der markierten Komponente durch den Farbstoff beeinträchtigt.At least one, preferably only one, and possibly two or more of the groups R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , and R 7 in each molecule is or are a reactive group for attaching the dye to the selected component. For certain reagents, at least one of the groups R 1 R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 on each molecule can also be a group which increases the solubility of the chromophore or impairs the selectivity of the labeling of the labeled component or the position of the marking of the marked component is impaired by the dye.

In den genannten Formeln umfaßt mindestens eine der genannten Gruppen R8, R9 (wenn vorhanden) und R10 (wenn vorhanden) mindestens eine Sulfonatgruppe. Die Bezeichnung Sulfonat soll Sulfonsäure einschließen, da die Sulfonatgruppe nur eine ionisierte Sulfonsäure darstellt.In the formulas mentioned, at least one of the groups R 8 , R 9 (if present) and R 10 (if present) comprises at least one sulfonate group. The term sulfonate is intended to include sulfonic acid since the sulfonate group is only an ionized sulfonic acid.

Reaktive Gruppen, die direkt oder indirekt an den Chromophor angefügt werden können, um die Gruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 zu bilden, können reaktive Gruppierungen einschließen, beispielsweise Gruppen, die Isothiocyanat, Isocyanat, Monochlortriazin, Dichlortriazin, Mono- oder Dihalogen-substituiertes Pyridin, Mono- oder Dihalogen-substituiertes Diazin, Maleimid, Aziridin, Sulfonylhalogenid, Säurehalogenid, Hydroxysuccinimi.dester, Hydroxysulfosuccinimidester, Imidoester, Hydrazin, Azidonitrophenyl, Azid, 3-(2-Pyridyldithio)-proprionamid, Glyoxal und Aldehyd enthalten.Reactive groups which can be attached directly or indirectly to the chromophore to form the groups R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 can include reactive groups, for example groups containing isothiocyanate , Isocyanate, monochlorotriazine, dichlorotriazine, mono- or dihalogen-substituted pyridine, mono- or dihalogen-substituted diazine, maleimide, aziridine, sulfonyl halide, acid halide, hydroxysuccinimide ester, hydroxysulfosuccinimide ester, imido ester, hydrazine, 2-azididitrophene Pyridyldithio) propionamide, glyoxal and aldehyde included.

Spezielle Beispiele für die Gruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7, die besonders gut für Markierungskomponenten mit verfügbaren Amino-, Hydroxy- und Sulfhydrylgruppen geeignet sind, sind die folgenden Gruppen:

Figure 00320001
Figure 00330001
wobei mindestens eines von Q oder W eine Austrittsgruppe, wie I, Br, Cl, ist:
Figure 00330002
The following groups are specific examples of the groups R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 , which are particularly suitable for labeling components with available amino, hydroxyl and sulfhydryl groups:
Figure 00320001
Figure 00330001
where at least one of Q or W is a leaving group such as I, Br, Cl:
Figure 00330002

Spezielle Beispiele von Gruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7, die besonders gut zum Markieren von Komponenten mit verfügbaren Sulfhydrylgruppen geeignet sind und die in einem Zweistufen-Verfahren zur Markierung von Antikörpern verwendet werden können, sind die folgenden Gruppen:

Figure 00330003
worin Q eine Austrittsgruppe, wie I oder Br, ist:
Figure 00340001
worin n 0 oder eine ganze Zahl ist.Specific examples of groups R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 which are particularly well suited for labeling components with available sulfhydryl groups and which are used in a two-step method for labeling antibodies are the following groups:
Figure 00330003
where Q is a leaving group such as I or Br:
Figure 00340001
where n is 0 or an integer.

Spezielle Beispiele für die Gruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7, die besonders gut zum Markieren von Komponenten durch 1ichtaktiviertes Vernetzungsverknüpfen geeignet sind, sind die folgenden Gruppen:

Figure 00340002
The following groups are specific examples of the groups R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 , which are particularly suitable for marking components by means of non-activated crosslinking:
Figure 00340002

Zum Zwecke der Erhöhung der Wasserlöslichkeit oder der Verminderung einer unerwünschten nichtspezifischen Bindung der markierten Komponente an ungeeignete Komponenten in der Probe oder zur Verminderung von Reaktionen zwischen zwei oder mehreren reaktiven Chromophoren auf der markierten Komponente, was zum Auslöschen der Fluoreszenz führen könnte, können die Gruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 aus den gut bekannten polaren und elektrisch geladenen chemischen Gruppen ausgewählt werden. Beispiele hierfür sind -E-F, wobei F Hydroxy, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, substituiertes Amino oder quaternäres Amino ist und wobei E eine Abstandsgruppe, wie -(CH2)n- ist, wobei n 0, 1, 2, 3 oder 4 ist. Geeignete Beispiele sind zum Beispiel Alkylsulfonat, -(CH2)3SO3 ⊖ und (CH'2)4-SO3 ⊖.For the purpose of increasing water solubility or reducing undesired nonspecific binding of the labeled component to unsuitable components in the sample or for reducing reactions between two or more reactive chromophores on the labeled component, which could lead to the extinction of the fluorescence, the groups R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 can be selected from the well known polar and electrically charged chemical groups. Examples include -EF, where F is hydroxy, sulfonate, sulfate, carboxylate, substituted amino or quaternary amino and where E is a spacer group such as - (CH 2 ) n -, where n is 0, 1, 2, 3 or 4 , Suitable examples are, for example, alkyl sulfonate , - (CH 2 ) 3 SO 3 ⊖ and (CH ' 2 ) 4 -SO 3 ⊖ .

Die Polymethinkette der Lumineszenz-Farbstoffe gemäß der Erfindung kann auch eine oder mehrere cyclische chemische Gruppen enthalten, die Brücken zwischen zwei oder mehreren der Kohlenstoffatome der Polymethinkette bilden. Diese Brücken könnten dazu dienen, die chemische oder die Photostabilität des Farbstoffs zu erhöhen, und sie könnten dazu verwendet werden, die Absorptions- und Emissionswellenlängen des Farbstoffes zu verändern oder seinen Extinktionskoeffizienten oder seine Quantenausbeute zu verändern. Verbesserte Löslichkeitseigenschaften könnten durch diese Modifizierung erhalten werden.The polymethine chain of luminescent dyes according to the invention can also contain one or more cyclic chemical groups, the bridges between two or more of the carbon atoms of the polymethine chain form. These bridges could serve the chemical or the photostability of the dye to increase and they could to be used, the absorption and emission wavelengths of the dye to change or its extinction coefficient or its quantum yield to change. improved solubility could can be obtained by this modification.

Erfindungsgemäß kann die markierte Komponente aus folgenden Substanzen ausgewählt werden: Antikörpern, Proteinen, Peptiden, Enzymsubstraten, Hormonen, Lymphokinen, Metaboliten, Rezeptoren, Antigenen, Haptenen, Lectinen, Avidin, Streptavidin, Toxinen, Kohlenhydraten, Oligosacchariden, Polysacchariden, Nucleinsäuren, Deoxynucleinsäuren, derivatisierten Nucleinsäuren, derivatisierten Deoxynucleinsäuren, DNA-Fragmenten, RNA-Fragmenten, derivatisierten DNA-Fragmenten, derivatisierten RNA-Fragmenten, natürlichen Arzneimitteln, Virusteilchen, Bakterienteilchen, Viruskomponenten, Hefekomponenten, Blutzellen, Blutzellkomponenten, biologischen Zellen, nichtzellulären Blutkomponenten, Bakterien, bakteriellen Komponenten, natürlichen und synthetischen Lipidbläschen, synthetischen Arzneimitteln, Giften, umweltverschmutzenden Stoffen, Polymeren, Polymerteilchen, Glasteilchen, Glasoberflächen, Kunststoffteilchen, Kunststoffoberflächen, Polymermembranen, Leitern und Halbleitern.According to the invention, the marked component selected from the following substances will: antibodies, Proteins, peptides, enzyme substrates, hormones, lymphokines, metabolites, Receptors, antigens, haptens, lectins, avidin, streptavidin, Toxins, carbohydrates, oligosaccharides, polysaccharides, nucleic acids, deoxynucleic acids, derivatized nucleic acids, derivatized deoxynucleic acids, DNA fragments, RNA fragments, derivatized DNA fragments, derivatized RNA fragments, natural Drugs, virus particles, bacterial particles, virus components, Yeast components, blood cells, blood cell components, biological cells, non-cellular Blood components, bacteria, bacterial components, natural and synthetic lipid vesicles, synthetic drugs, poisons, polluting substances, Polymers, polymer particles, glass particles, glass surfaces, plastic particles, Plastic surfaces, Polymer membranes, conductors and semiconductors.

Ein Cyanin oder ein damit verwandter Chromophor kann auch hergestellt werden, der, wenn er mit einer Komponente umgesetzt wird, Licht bei 633 nm absorbieren kann. In der Erfassungsstufe kann ein Helium-Neon-Laser verwendet werden, der Licht bei dieser Wellenlänge des Spektrums emittiert. Auch kann ein Cyanin- oder damit verwandter Farbstoff hergestellt werden, der, wenn er mit einer Komponente umgesetzt wird, Licht maximal zwischen 700 nm und 900 nm absorbieren kann. In diesem Fall kann in der Erfassungsstufe eine Laserdiode verwendet werden, die Licht in diesem Bereich des Spektrums emittiert.A cyanine or a related one Chromophore can also be produced when used with a Component is implemented, can absorb light at 633 nm. In at the detection level, a helium-neon laser can be used the light at that wavelength of the spectrum emitted. Can also be a cyanine or related Dye can be made when used with a component is implemented, absorb maximum light between 700 nm and 900 nm can. In this case, a laser diode can be used in the detection stage be used that emits light in this area of the spectrum.

Selektivitätselectivity

Die obenangegebenen reaktiven Gruppen sind relativ spezifisch für die Markierung bestimmter funktioneller Gruppen auf Proteinen und anderen biologischen oder nichtbiologischen Molekülen, Makromolekülen, Oberflächen oder Teilchen, vorausgesetzt, daß geeignete Reaktionsbedingungen mit Einschluß von geeigneten pH-Bedingungen angewendet werden.The reactive groups given above are relatively specific to the labeling of certain functional groups on proteins and other biological or nonbiological molecules, macromolecules, surfaces or Particles, provided that appropriate Reaction conditions including suitable pH conditions be applied.

Eigenschaften der reaktiven Cyanin-, Merocyanin- und Styryl-Farbstoffe und ihrer ProdukteProperties of reactive Cyanine, merocyanine and styryl dyes and their products

Die Spektraleigenschaften der erfindungsgemäßen Farbstoffe werden durch die hierin beschriebene Funktionalisierung nicht nennenswert verändert. Die Spektraleigenschaften der markierten Proteine und der anderen Verbindungen sind gleichfalls nicht sehr verschieden von denjenigen des Grund-Farbstoffmoleküls, das nicht an ein Protein oder ein anderes Material konjugiert worden ist. Die hierin beschriebenen Farbstoffe haben, allein oder an ein markiertes Material konjugiert , im allgemeinen große Extinktionskoeffizienten (ε = 100.000 bis 250.000), hohe Quantenausbeuten so hoch wie 0,4 in bestimmten Fällen, und sie absorbieren und emittieren Licht im Spektralbereich von 400 bis 900 nm. Somit sind sie von besonderem Wert als Markierungs-Reagentien für die Lumineszenz-Erfassung.The spectral properties of the dyes according to the invention are: not significant due to the functionalization described here changed. The spectral properties of the labeled proteins and the others Connections are also not very different from those of the basic dye molecule that has not been conjugated to a protein or other material is. The dyes described herein have, alone or on one labeled material conjugated, generally large extinction coefficients (ε = 100,000 up to 250,000), high quantum yields as high as 0.4 in certain cases and they absorb and emit light in the spectral range of 400 to 900 nm. Thus, they are of particular value as labeling reagents for the Luminescence detection.

Optische ErfassungsmethodenOptical detection methods

Zur Erfassung bzw. Bestimmung einer markierten oder gefärbten Komponente kann jede beliebige Methode angewendet werden.To record or determine a marked or colored Component can use any method.

Die Erfassungsmethode kann eine Lichtquelle verwenden, die das Gemisch, welches das markierte Material enthält, mit Licht mit ersten definierten Wellenlängen bestrahlt. Bekannte Vorrichtungen werden verwendet, die Licht mit zweiten Wellenlängen erfassen, welches Licht durch das Gemisch hindurchgelassen worden ist oder das durch das Gemisch fluoresziert oder luminesziert wird. Solche Erfassungsvorrichtungen sind beispielsweise Fluoreszenz-Spektrometer, Absorptions-Spektrophotometer, Fluoreszenz-Mikroskope, Lichtdurchlässigkeits-Mikroskope und Fließ-Cytometer, optische Fasersensoren und Immunoassay-Instrumente.The detection method can be a light source use the mixture containing the marked material with Illuminated light with the first defined wavelengths. Known devices are used to capture light with second wavelengths which light has been passed through the mixture or that through the Mixture is fluorescent or luminescent. Such detection devices are, for example, fluorescence spectrometers, absorption spectrophotometers, Fluorescence microscopes, light transmission microscopes and flow cytometers, optical fiber sensors and immunoassay instruments.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch chemische Analysenmethoden verwendet werden, um die Anheftung des Farbstoffs an die markierte Komponente oder die markierten Komponenten zu erfassen. Beispiele für chemische Analysenmetho den sind die Infrarot-Spektrometrie, die NMR-Spektrometrie, die Absorptions-Spektrometrie, die Fluoreszenz-Spektrometrie, die Massen-Spektrometrie und die Chromatographie.In the method according to the invention can Chemical analysis methods are also used to attach of the dye to the labeled component or components capture. examples for Chemical analysis methods are infrared spectrometry NMR spectrometry, absorption spectrometry, fluorescence spectrometry, mass spectrometry and chromatography.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.The invention is illustrated in the examples explained.

Beispiel 1example 1

Effekt des pH-Werts auf die Konjugierung von Sulfoindodicarbocyanin mit ProteinEffect of pH on the conjugation of sulfoindodicarbocyanine with protein

Proben von Schaf-γ-Globulin (4 mg/ml) in 0,1m Carbonat-Puffern (pH=8,5, 8,9 und 9,4) wurden bei Raumtemperatur mit einem 10fachen molaren Überschuß des folgenden aktiven Sulfoindodicarbo-cyaninesters (m=2) vermischt.Samples of sheep γ-globulin (4 mg / ml) in 0.1m Carbonate buffers (pH = 8.5, 8.9 and 9.4) were at room temperature with a 10-fold molar excess of the following active sulfoindodicarbo-cyanine ester (m = 2) mixed.

Figure 00380001
Figure 00380001

Zu geeigneten Zeitpunkten, die sich von 5 Sekunden bis 30 Minuten erstreckten, wurden Proteinproben von nichtkovalent angeheftetem Farbstoff durch Gel-Permeationschromatographie auf Sephadex ® G-50 abgetrennt. Die maximale Markierung des Proteins erfolgte nach 10 Minuten und ergab End-Molverhält nisse von Farbstoff/Protein von 5,8, 6,4 und 8,2 für die Proben, die bei pH-Werten von 8,5, 8,9 bzw. 9,4 inkubiert worden waren. Die Zeiten, die erforderlich waren, um ein Farbstoff/Protein-Verhältnis von 5 und Quantenausbeuten der Produkte bei den verschiedenen pH-Werten zu ergeben, sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:At appropriate times, which ranged from 5 seconds to 30 minutes, protein samples were separated from non-covalently attached thereto a dye by gel permeation chromatography on Sephadex ® G-fiftieth The maximum labeling of the protein occurred after 10 minutes and resulted in final dye / protein molar ratios of 5.8, 6.4 and 8.2 for the samples at pH 8.5, 8.9 and 9.4 had been incubated. The times required to give a dye / protein ratio of 5 and quantum yields of the products at the different pH values are shown in the following table:

Figure 00390001
Figure 00390001

Diese Werte zeigen, daß die Protein-Markierung mit diesem Farbstoff bei einem pH-Wert von 9,4 besser ist als bei einem pH-Wert von unterhalb 9. In dem Puffer mit höherem pH-Wert war die Konjugierungsreaktion sehr rasch, doch war die Markierungswirksamkeit ausgezeichnet, und das Produkt war stärker fluoreszierend. Der Wert der Quantenausbeute gibt die mittlere Quantenausbeute pro Farbstoffmolekül auf dem markierten Protein wieder.These values show that the protein labeling with this dye at a pH of 9.4 bes is higher than at pH below 9. In the higher pH buffer, the conjugation reaction was very fast, but the labeling efficiency was excellent and the product was more fluorescent. The value of the quantum yield reflects the mean quantum yield per dye molecule on the labeled protein.

Beispiel 2Example 2

Konjugation des aktiven Sulfoindocarbocyaninesters mit ProteinConjugation of the active Sulfoindocarbocyanine esters with protein

Schaf-γ-Globulin (1 mg/ml), gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4, wurde mit 0,1m Natriumcarbonat auf einen pH-Wert von 9,4 eingestellt. Ein Cyanin-Farbstoff-Markierungsmittel (Struktur in Beispiel 1, m=1) wurde zu alquoten Teilen dieser Proteinlösung zugegeben, um verschiedene Molverhältnisse von Farbstoff/Protei_n zu ergeben. Nach 30minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Gemische durch Gel-Permeationschromatographie auf Sephadex ® G-50 unter Elution mit PBS aufgetrennt. Das Molverhältnis der Farbstoffe, die kovalent an die Proteine in den Produkten angeheftet worden waren, war 1,2, 3,5, 5,4, 6,7 und 11,2 für Anfangsverhältnisse von Farbstoff/Protein von 3, 6, 12, 24 bzw. 30.Sheep γ-globulin (1 mg / ml), dissolved in phosphate-buffered saline (PBS) with a pH of 7.4, was adjusted to a pH of 9.4 with 0.1 M sodium carbonate. A cyanine dye marker (structure in Example 1, m = 1) was added to aliquots of this protein solution to give different dye / protein mole ratios. After 30 minutes incubation at room temperature, the mixtures by gel permeation chromatography on Sephadex ® G-50 were separated by eluting with PBS. The molar ratio of the dyes covalently attached to the proteins in the products was 1.2, 3.5, 5.4, 6.7 and 11.2 for initial dye / protein ratios of 3, 6, 12, 24 or 30.

Beispiel 3Example 3

Markierung von AECM-Dextran mit einem SulfoindodicarbocyaninLabeling of AECM dextran with a sulfoindodicarbocyanine

N-Aminoethyl-carboxamidomethyl-(AECM )Dextran mit einem Mittelwert von 16 Aminogruppen pro Dextranmolekül wurde aus Dextran mit einem mittleren MW von 70.000 synthetisiert (Inman, J.K., J. Immunol. 114: 704–709 (1975)). Ein Teil des AECM-Dextrans (1 mg/250 μl), gelöst in 0,1m Carbonat-Puffer, mit einem. pH-Wert von 9,4 wurde zu 0,2 mg des aktiven Sulfoindodicarbocyaninesters (Struktur in Beispiel 1, m=2) gegeben, wobei ein Farbstoff/Protein-Molverhältnis von 10 erhalten wurde. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Dextran wurde sodann von nichtkonjugiertem Farbstoff durch Sephadex ® G-50-Gel-Permeationschromatographie unter Verwendung von Ammoniumacetat (50mM) als Elutions-Puffer abgetrennt. Ein Durchschnitt von 2,2 Farbstoffmolekülen war kovalent an jedes Dextranmolekül gebunden.N-Aminoethyl-carboxamidomethyl- (AECM) dextran with an average of 16 amino groups per dextran molecule was synthesized from dextran with an average MW of 70,000 (Inman, JK, J. Immunol. 114: 704-709 (1975)). Part of the AECM-Dextran (1 mg / 250 μl), dissolved in 0.1m carbonate buffer, with a. pH of 9.4 was added to 0.2 mg of the active sulfoindodicarbocyanine ester (structure in Example 1, m = 2), whereby a dye / protein molar ratio of 10 was obtained. The mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The dextran was then separated from unconjugated dye by Sephadex ® G-50 gel permeation chromatography using ammonium acetate (50 mM) as an elution buffer. An average of 2.2 dye molecules were covalently attached to each dextran molecule.

Beispiel 4Example 4

Markierung eines spezifischen Antikörpers mit aktivem SulfoindodicarbocyaninesterMarking a specific antibody with active sulfoindodicarbocyanine ester

Gegen Murin IgG spezifisches Schaf-γ-Globulin (1 mg/ml) in 0,1m Carbonat-Puffer (pH=9,4) wurde mit dem aktiven Sulfoindodicarbocyaninester (Struktur in Beispiel 1, m=2) mit einem Verhältnis von 8 Farbstoffmolekülen pro Proteinmolekül vermischt. Nach 30minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurde das Markierungsgemisch durch Gelfiltration auf Sephadex® G-50, das mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH=7,4) ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgetrennt. Das gewonnene Protein enthielt einen Mittelwert von 4,5 Farbstoffmolekülen, die kovalent an jedes Proteinmolekül angeheftet waren.Sheep γ-globulin (1 mg / ml) specific for murine IgG in 0.1m carbonate buffer (pH = 9.4) was used with the active sulfoindodicarbocyanine ester (structure in Example 1, m = 2) with a ratio of 8 dye molecules mixed per protein molecule. After 30 minutes of incubation at room temperature, the labeling mixture by gel filtration on Sephadex ® G-50 which had been equilibrated with phosphate buffered saline (pH = 7.4) was separated. The protein obtained contained an average of 4.5 dye molecules covalently attached to each protein molecule.

Beispiel 5Example 5

Anfärbung und mikroskopische Sichtbarmachung von Human-Lymphozyten mit Sulfoindodicarbocyanin-Farbstoff, der an Schaf-Anti-Maus-IgG-Antikörper kunjugiert warStaining and microscopic visualization of human lymphocytes with sulfoindodicarbocyanine dye that conjugates to sheep anti-mouse IgG antibody was

Frisch isolierte periphere Blutlymphozyten wurden bei 0°C 30 Minuten lang mit Maus-Anti-β2-Mikroglobulin (0,25 μg /106 Zellen) behandelt. Die Zellen wurden zweimal mit DMEM-Puffer gewaschen und sodann mit dem mit Sulfoindodicarbocyanin markierten Schaf-Anti-Maus-IgG-Antikörper (1 μg/106 Zellen) behandelt. Nach 30minütiger Inkubierung bei 0°C wurde überschüssiger Antikörper durch Zentrifugieren der Zellen entfernt, und die Zellen wurden erneut zweimal mit DMEM-Puffer gewaschen. Aliquote Teile der Zellen wurden auf Objektträgern zur Analyse durch Fluoreszenz-Mikroskopie befestigt. Unter dem Mikroskop wurden die Lymphozyten auf dem Objektträger mit Licht mit 610 bis 630 nm bestrahlt, und die Fluoreszenz bei 650 bis 700 nm wurde mit einer rotempfindlichen verstärkten COHU-Fernsehkamera erfaßt, welche an einen Bilddigitalisierer und einen Fernsehmonitor angeschlossen war. Die nach dieser Methode angefärbten Zellen zeigten unter dem Mikroskop eine Fluoreszenz. In einem Kontrollexperiment wurde die Verwendung des primären Maus-Anti-β2-Mikroglobuli.n-ßntikörpers weggelassen, doch wurde die Färbung und die Analyse sonst wie oben beschrieben durchgeführt. Die Kontrollprobe zeigte unter dem Mikroskop keine Fluoreszenz, was darauf hinweist, daß der mit Sulfoindocyanin markierte Schaf-Anti-Maus-Antikörper keine signifikante nichtspezifische Bindung an Lymphozyten ergibt.Freshly isolated peripheral blood lymphocytes were treated with mouse anti-β2-microglobulin (0.25 μg / 10 6 cells) at 0 ° C. for 30 minutes. The cells were washed twice with DMEM buffer and then treated with the sulfoindodicarbocyanine-labeled sheep anti-mouse IgG antibody (1 μg / 10 6 cells). After incubation at 0 ° C for 30 minutes, excess antibody was removed by centrifuging the cells and the cells were washed again twice with DMEM buffer. Aliquots of the cells were attached to slides for analysis by fluorescence microscopy. Under the microscope, the lymphocytes on the slide were irradiated with light at 610 to 630 nm, and the fluorescence at 650 to 700 nm was recorded with a red-sensitive amplified COHU television camera, which was connected to an image digitizer and a television monitor. The cells stained by this method showed fluorescence under the microscope. In a control experiment, the use of the mouse primary anti-β2 microglobule.n antibody was omitted, but the staining and analysis were otherwise performed as described above. The control sample showed no fluorescence under the microscope, indicating that the sheep anti-mouse antibody labeled with sulfoindocyanine had no significant non-specific binding to lymphocytes.

Claims (41)

Verfahren zum Markieren einer Komponente einer wäßrigen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet , daß man (a) zu der die genannte Komponente enthaltenden Flüssigkeit einen Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe Cyanin, Merocyanin und Styryl-Farbstoffe, der an einen aromatischen Kern angeheftet mindestens eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe enthält, zusetzt, wobei der genannte Farbstoff mit der genannten Komponente reaktiv ist, und (b) den Farbstoff mit der genannten Komponente umsetzt, so daß der Farbstoff die genannte Komponente markiert.A method for marking a component of an aqueous liquid, characterized in that (a) a luminescent dye from the group consisting of cyanine, merocyanine and styryl dyes, which is attached to an aromatic nucleus or at least one sulfonic acid or Contains sulfonate group, wherein said dye is reactive with said component, and (b) reacting the dye with said component so that the dye marks said component. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff mehr als eine Sulfonsäure-oder Sulfonatgruppe enthält.A method according to claim 1, characterized in that the Dye more than one sulfonic acid or sulfonate group contains. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff einen Substituenten enthält, um ihn mit einer Amin-, Aldehyd-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppe auf der genannten Komponente kovalent reaktiv zu machen, und daß sich der genannte Farbstoff mit einer oder mehreren der genannten Gruppen umsetzt.A method according to claim 1, characterized in that the called dye contains a substituent to it with an amine, Aldehyde, sulfhydryl or To make the hydroxy group on the component mentioned covalently reactive, and that itself said dye with one or more of the groups mentioned implements. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfonsäure-oder Sulfonatgruppe die Farbstoff/Farbstoff-Wechselwirkungen vermindert, die ein Auslöschen der Fluoreszenz induzieren.A method according to claim 1, characterized in that the Sulfonic acid or Sulfonate group reduces the dye / dye interactions, which is an obliteration of fluorescence. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente aus der Gruppe Antikörper, Proteine, Peptide, Enzymsubstrate, Hormone, Lympokine, Metabolite , Rezeptoren, Antigene, Häptene, Lectine, Toxine, Kohlenhydrate, Oligosaccharide, Polysaccharide, Nucleotide, derivatisierte Nucleotide, Nucleinsäuren, Deoxynucleinsäuren, derivatisierte Nucleinsäuren, derivatisierte Deoxynucleinsäuren, DNA-Fragmente, RNA-Fragmente, derivatisierte DNA-Fragmente, derivatisierte RNA-Fragmente, natürliche Arzneimittel, Virusteilchen, Viruskomponenten, Hefekomponenten, Blutzellen, Blutzellkomponenten, biologische Zellen, nichtzelluläre Blutkomponenten, Bakterien, Bakterienkomponenten, natürliche und synthetische Lipid-Bläschen, synthetische Arzneimittel und natürliche Arz neimittel, Gifte, umweltverschmutzende Stoffe, Polymeren, Polymerteilchen, Glasteilchen, Glasoberflächen, Kunststoffteilchen, Kunststoffoberflächen, Polymermembranen, Leiter und Halbleiter ausgewählt ist.A method according to claim 1, characterized in that the Component from the group antibodies, proteins, Peptides, enzyme substrates, hormones, lympokines, metabolites, receptors, Antigens, Häptene, Lectins, toxins, carbohydrates, oligosaccharides, polysaccharides, Nucleotides, derivatized nucleotides, nucleic acids, deoxynucleic acids, derivatized nucleic acids, derivatized deoxynucleic acids, DNA fragments, RNA fragments, derivatized DNA fragments, derivatized RNA fragments, natural Medicines, virus particles, virus components, yeast components, Blood cells, blood cell components, biological cells, non-cellular blood components, Bacteria, bacterial components, natural and synthetic lipid vesicles, synthetic Medicinal and natural Medicinal products, poisons, polluting substances, polymers, polymer particles, Glass particles, glass surfaces, Plastic particles, plastic surfaces, polymer membranes, conductors and semiconductors selected is. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufe der optischen Erfassung der genannten markierten Komponente einschließt.A method according to claim 1, characterized in that it the level of optical detection of the marked component mentioned includes. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Erfassungsstufe die Bestrahlung der markierten Komponente mit Licht und die anschließende Erfassung des Lichts, das durch die genannte markierte Komponente fluoresziert wird, umfaßt.A method according to claim 6, characterized in that the said detection level is the irradiation of the marked component with light and the subsequent Detection of light by the marked component is fluoresced. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Erfassungsstufe die Lichterregung mit einem Laser einschließt.A method according to claim 6, characterized in that the called detection level includes light excitation with a laser. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in der genannten Erfassungsstufe die Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet wird.A method according to claim 6, characterized in that in fluorescence microscopy is used for the detection stage mentioned becomes. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in der genannten Erfassungsstufe die Fließ-Cytometrie verwendet wird.A method according to claim 6, characterized in that in flow cytometry is used. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erfaßte Komponente quantitativ bestimmt wird.A method according to claim 6, characterized in that the named recorded Component is determined quantitatively. Verfahren zum Markieren einer Komponente in einer wäßrigen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) zu der die genannte Komponente enthaltenden Flüssigkeit einen Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe Polymethin-Farbstoffe auf Sulfoindolenin-Grundlage und Naphthosulfoindolenin-Grundlage, der mindestens eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe angeheftet an einen oder mehrere Ringe eines heterocyclischen Kerns enthält, zusetzt, wobei der genannte Farbstoff gegenüber der genannten Komponente reaktiv ist; (b) den genannten Farbstoff mit der genannten Komponente umsetzt, so daß der genannte Farbstoff die genannte Komponente markiert; und daß man (c) die genannte markierte Komponente durch optische Methoden erfaßt.A method for marking a component in an aqueous liquid, characterized in that (a) a luminescent dye from the group consisting of polymethine dyes based on sulfoindolenine and naphthosulfoindolenine, the at least one sulfonic acid or Contains sulfonate group attached to one or more rings of a heterocyclic nucleus, wherein said dye is reactive with said component; (b) reacting said dye with said component so that said dye marks said component; and that (c) said labeled component is detected by optical methods. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff mehr als eine Sulfonsäure-oder Sulfonatgruppe enthält.A method according to claim 12, characterized in that the called dye contains more than one sulfonic acid or sulfonate group. Verfahren zum Markieren einer ersten Komponente und Verwendung der markierten ersten Komponente zur Bindung mit einer zweiten Komponente, um eine markierte zweite Komponente zu bilden, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) zu einer wäßrigen Flüssigkeit, die die genannte erste Komponente enthält, einen Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe Cyanin, Merocyanin und Styryl-Farbstoffe, der mindestens eine an einen aromatischen Kern angefügte Sulfonsäure-oder Sulfonatgruppe enthält, zusetzt, wobei der Farbstoff gegenüber der ersten Komponente reaktiv ist; (b) den genannten Farbstoff mit der genannten ersten Komponente umsetzt, so daß der genannte Farbstoff durch Lumineszenz die genannte erste Komponente markiert, wodurch eine markierte erste Komponente erhalten wird; (c) die genannte markierte erste Komponente an die genannte zweite Komponente anbindet, um eine markierte zweite Komponente zu bilden; und daß man (d) die genannte markierte zweite Komponente durch eine optische Methode erfaßt.Method for marking a first component and using the labeled first component for binding with a second component to add a highlighted second component form, characterized in that one (a) to an aqueous liquid, which contains said first component, a luminescent dye the group of cyanine, merocyanine and styryl dyes, the least contains a sulfonic acid or sulfonate group attached to an aromatic nucleus, with the dye opposite the first component is reactive; (b) the dye mentioned with said first component, so that said Dye marked by luminescence said first component, whereby a labeled first component is obtained; (C) said marked first component to said second component binds to form a marked second component; and that one (D) the said marked second component by an optical method detected. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff mehr als eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe enthält.A method according to claim 14, characterized in that the said dye contains more than one sulfonic acid or sulfonate group. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Komponente ein Antikörper ist und daß die zweite Komponente eine Substanz aus der Gruppe Antigene, Haptene, biologische Zellen, Viren und Teilchen, die ein Antigen und ein Hapten tragen, ist.A method according to claim 14, characterized in that the first component is an antibody is and that the second component a substance from the group antigens, haptens, biological cells, viruses and particles that have an antigen and a Wearing hapten is. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente ein Lectin ist und daß die genannte zweite Komponente eine Substanz aus der Gruppe Kohlenhydrate, makromolekulare Stoffe, die ein Kohlenhydrat tragen, und Zellen, die ein Kohlenhydrat tragen, ist.A method according to claim 14, characterized in that the said first component is a lectin and that said second component a substance from the group of carbohydrates, macromolecular substances, that carry a carbohydrate and cells that carry a carbohydrate is. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente Avidin oder Streptavidin ist und daß die genannte zweite Komponente ein biotinyliertes Material ist.A method according to claim 14, characterized in that the said first component is avidin or streptavidin and that said second component is a biotinylated material. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente ein DNA-Fragment ist und daß die genannte zweite Komponente ein komplementärer Strang von DNA oder RNA ist.A method according to claim 14, characterized in that the said first component is a DNA fragment and that said second component a complementary Strand of DNA or RNA. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente ein RNA-Fragment ist und daß die genannte zweite Komponente ein komplementärer Strang von DNA oder RNA ist.A method according to claim 14, characterized in that the said first component is an RNA fragment and that said second component a complementary Strand of DNA or RNA. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente ein Ligand aus der Gruppe Hormone, Proteine, Peptide, Lymphokine und Metabolite ist und daß die genannte zweite Komponente ein Rezeptor ist.A method according to claim 14, characterized in that the said first component is a ligand from the group hormones, proteins, Peptides, lymphokines and metabolites is and that said second component is a receptor. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente ein Polymerteilchen ist, das eine Substanz aus der Gruppe Antikörper, Nucleinsäure-Fragmente, Arzneimittel, Toxine, Hormone, Metabolite, biologische Zellen, Bakterien, Virusteilchen, Antigene und Haptene enthält und daß die genannte zweite Komponente ein entsprechendes Antigen, eine komplementäre Nucleinsäure-Sequenz, ein Antikörper oder ein Rezeptor ist.A method according to claim 14, characterized in that the said first component is a polymer particle that is a substance from the group antibodies, Nucleic acid fragments, Medicinal products, toxins, hormones, metabolites, biological cells, bacteria, Contains virus particles, antigens and haptens and that said second component a corresponding antigen, a complementary nucleic acid sequence, an antibody or is a receptor. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte zweite Komponente ein Antikörper ist.A method according to claim 14, characterized in that the said second component is an antibody. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente eine Substanz aus der Gruppe Antigene, Haptene oder Zellen, die ein Antigen oder Hapten enthalten, und Teilchen, die ein Antigen oder Hapten enthalten, ist und daß die genannte zweite Komponente ein Antikörper ist.A method according to claim 14, characterized in that the said first component is a substance from the group antigens, Haptens or cells containing an antigen or hapten, and Particle that contains an antigen or hapten is and that said second component is an antibody is. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff sich mit einer Amin-, Hydroxy- oder Sulfhydrylgruppe auf der ersten Komponente umsetzt.A method according to claim 14, characterized in that the called dye with an amine, hydroxy or sulfhydryl group implemented on the first component. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sich der genannte Farbstoff mit einer Aldehydgruppe auf der genannten ersten Komponente umsetzt.A method according to claim 14, characterized in that itself said dye with an aldehyde group on said implemented first component. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff ein Cyanin-Farbstoff ist und sich mit einer Amin- oder Hydroxygruppe auf der genannten ersten Komponente umsetzt.A method according to claim 14, characterized in that the called dye a cyanine dye is and with an amine or hydroxy group on the above implemented first component. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff ein Cyanin-Farbstoff ist und sich mit einer Aldehyd- oder Sulfhydrylgruppe auf der genannten ersten Komponente umsetzt.A method according to claim 14, characterized in that the called dye a cyanine dye is and with an aldehyde or sulfhydryl group on the above implemented first component. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte zweite Komponente aus der Gruppe Blutzellen, Gewebezellen, Bakterien, Viren, Chromosomen, DNA, RNA, Toxine , Arzneimittel, Hormone und Polymerteilchen ausgewählt ist.A method according to claim 14, characterized in that the named second component from the group blood cells, tissue cells, Bacteria, viruses, chromosomes, DNA, RNA, toxins, medicines, Hormones and polymer particles is selected. Lumineszenzphotostabiles Reaktionsprodukt aus einer Komponente, die eine Amin-, Aldehyd-, Sulfhydryl- oder Hydroxylgruppe enthält und einen in Wasser löslichen Farbstoff aus der Gruppe Polymethin-Farbstoffe auf Sulfoindolenin-Grundlage und Naphthosulfoindolenin-Grundlage, der mindestens einen Substituenten enthält, um ihn gegenüber der genannten Amin-, Aldehyd-, Sulfhydryl- oder Hydroxylgruppe auf der genannten Komponente kovalent reaktiv zu machen, wobei die individuellen Farbstoff-Moleküle auf dem genannten Reaktionsprodukt einen mittleren molaren Extinktionskoeffizienten von mindestens 50.000 1 pro mol-cm, eine mittlere Quantenausbeute von mindestens 2% haben und Licht maximal im 400- bis 850 nm-Bereich absorbieren und emittieren, wenn sich die markierte Komponente in einer wäßrigen Umgebung befindet.Luminescence photostable reaction product from a Component which is an amine, aldehyde, sulfhydryl or hydroxyl group contains and a water soluble one Dye from the group of polymethine dyes based on sulfoindolenine and naphthosulfoindolenine base having at least one substituent contains to face him the amine, aldehyde, sulfhydryl or hydroxyl group mentioned to make the component mentioned covalently reactive, the individual Dye molecules an average molar extinction coefficient on the reaction product mentioned of at least 50,000 1 per mol-cm, an average quantum yield of at least 2% and maximum light in the 400 to 850 nm range absorb and emit when the marked component is in an aqueous environment located. Reaktionsprodukt nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Komponente ein Antikörper ist.Reaction product according to claim 30, characterized in that the called component an antibody is. Reaktionsprodukt nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Komponente aus der Gruppe Proteine, Peptide, Arzneimittel, Toxine, Metabolite, Lymphokine, Kohlenhydrate, Lipide, Blutzellen, Bakterienteilchen, Virenteilchen, Antigene, Haptene, Polymerteilchen, Glasoberflächen und Polymeroberflächen ausgewählt ist.Reaction product according to claim 30, characterized in that the named component from the group proteins, peptides, drugs, Toxins, metabolites, lymphokines, carbohydrates, lipids, blood cells, bacterial particles, Virus particles, antigens, haptens, polymer particles, glass surfaces and polymer surfaces selected is. Reaktionsprodukt nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Komponente ein DNA- oder RNA-Fragment ist.Reaction product according to claim 30, characterized in that the said component is a DNA or RNA fragment. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff aus der Gruppe:
Figure 00510001
ausgewählt ist, wobei X und Y aus der Gruppe O, S und ausgewählt sind; m eine ganze Zahl aus der Gruppe 1, 2, 3 und 4 ist; mindestens eine der genannten Gruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe Isothiocyanat, Isocyanat, Monochlortriazin, Dichlortriazin, Mono- oder Dihalogen-substituiertes Pyridin, Mono- oder Dihalogen-substituiertes Diacin, Maleimid, Aziridin, Sulfonylhalogenid, Säurehalogenid, Hydroxysuccinimidester, Hydroxysulfosuccinimidester, Imidoester, Hydrazin, Azidonitrophenyl, Azid, 3-(2-Pyridyl-dithio)-propionamid, Glyoxal und Aldehyd enthält; und wobei mindestens eine der genannten Gruppen R8 und R9 mindestens eine Arylsulfonyl- oder Arylsulfonat-Gruppierung enthält.A method according to claim 1, characterized in that said dye from the group:
Figure 00510001
is selected, with X and Y from the group O , S and are selected; m is an integer from group 1, 2, 3 and 4; at least one of said groups R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 at least one group from the group isothiocyanate, isocyanate, monochlorotriazine, dichlorotriazine, mono- or dihalogen-substituted pyridine, mono- or Dihalogen substituted diacin, maleimide, aziridine, sulfonyl halide, acid halide, hydroxysuccinimide ester, hydroxysulfosuccinimide ester, imido ester, hydrazine, azidonitrophenyl, azide, 3- (2-pyridyl-dithio) propionamide, glyoxal and aldehyde; and wherein at least one of said groups R 8 and R 9 contains at least one arylsulfonyl or arylsulfonate grouping. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe:
Figure 00520001
Figure 00530001
enthält, wobei mindestens eines von Q oder W aus der Gruppe Cl, Br, und I ausgewählt ist und wobei n den Wert Null hat oder eine beliebige ganze Zahl ist.A method according to claim 34, characterized in that at least one of the groups R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 at least one group from the group:
Figure 00520001
Figure 00530001
contains, wherein at least one of Q or W is selected from the group Cl, Br, and I and wherein n is zero or any integer. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der genannten Gruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe:
Figure 00530002
enthält.A method according to claim 34, characterized in that at least one of said groups R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 at least one group from the group:
Figure 00530002
contains. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der genannten Gruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 auch mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe Hydroxy, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat und substituierte Amin- oder quaternäre Amingruppen enthält.A method according to claim 34, characterized in that at least one of said groups R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 also substituted at least one group from the group hydroxy, sulfonate, sulfate, carboxylate and Contains amine or quaternary amine groups. Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein mit einem Sulfocyanin-Farbstoff markiertes Material mit einem oder mehreren weiteren fluoreszierenden Materialien, die alle Licht signifikant bei einer einzigen Erregungswellenlänge absorbieren, jedoch bei verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren, vermischt und sodann alle der genannten fluoreszierenden Materialien, mit einer einzigen Wellenlänge von Licht anregt und sodann die Menge von jedem der genannten fluoreszierenden Materialien quantitativ bestimmt, indem man ihre individuellen Fluoreszenzsignale bei ihren verschiedenen Fluoreszenz-Wellenlängen erfaßt.Process, characterized in that one material labeled with a sulfocyanine dye with an or several other fluorescent materials, all light significant absorb at a single excitation wavelength, but at different wavelengths fluoresce, mixed and then all of the above fluorescent Materials, excited with a single wavelength of light and then the amount of each of the fluorescent materials mentioned quantitatively determined by taking their individual fluorescence signals at their different fluorescence wavelengths detected. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß das mit dem Sulfocyanin-Farbstoff markierte Material ein Antikörper oder eine DNA-Hybridisierungssonde ist.A method according to claim 38, characterized in that this material labeled with the sulfocyanine dye is an antibody or is a DNA hybridization probe. Verwendung eines Lumineszenz-Farbstoffs aus der Gruppe Cyanin-, Merocyanin- und Styryl-Farbstoffe, der an einen aromatischen Kern angeheftet mindestens eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe enthält als Reagens zur Herstellung einer lumineszierend markierten Komponente.Use of a luminescent dye from the Group of cyanine, merocyanine and styryl dyes attached to one aromatic nucleus attached at least one sulfonic acid or Contains sulfonate group as a reagent for the production of a luminescent labeled component. Verwendung einer lumineszierend markierten Komponente, erhalten gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29 und 34 bis 39, als ein Analyse- oder Nachweisreagens.Use of a luminescent labeled component, obtained according to the procedure according to one of the claims 1 to 29 and 34 to 39, as an analysis or detection reagent.
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