DE4011428A1 - Bio-catalyst substrate concn. determn. - based on potentiometric and amperometric cell with bio-tensions - Google Patents
Bio-catalyst substrate concn. determn. - based on potentiometric and amperometric cell with bio-tensionsInfo
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- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
Abstract
Description
Die Erfindung betrifft eine Meßvorrichtung und ein Verfahren zur automatischen Konzentrationsbestimmung von Substraten biokatalytischer Reaktionen. Die Erfindung wird ein gesetzt zur quantitativen Bestimmung solcher Substrate, die in Chemie, Biochemie, Biotechnologie, Pharmazie, Medizin und Umweltschutz Bedeutung besitzen.The invention relates to a measuring device and a method for the automatic determination of the concentration of substrates biocatalytic reactions. The invention becomes a set for the quantitative determination of such substrates, those in chemistry, biochemistry, biotechnology, pharmacy, Medicine and environmental protection are important.
Analysenverfahren zur quantitativen Bestimmung chemischer Substanzen unter Verwendung von biologisch aktiven Verbin dungen als Analysereagenz sind aus der modernen Analytik nicht mehr wegzudenken. Von herausragender Bedeutung sind dabei Enzyme und in neuerer Zeit auch höher integrierte Systeme, wie z. B. Mikroorganismen. Als Reagentien in löslichen Analysensystemen werden diese Biokatalysatoren bzw. Biokatalysatorsysteme schon seit vielen Jahren ange wendet. Dabei zeigt sich aber, daß in vielen Fällen Enzyme und Mikroorganismen trotz ihrer unbestreitbaren Vorteile, wie hoher Spezifität, in löslichen Analysen systemen wegen ihrer nur einmaligen Verwendbarkeit viel zu teure Reagentien sind, um eine breite und umfangreiche Anwendung zu finden. Deshalb wird auch seit vielen Jahren nach Analysenmethoden und Vorrichtungen gesucht, bei denen die teuren Biokatalysatoren mehrfach eingesetzt werden können. In den Biosensorsystemen hat man mit Sicherheit Vorrichtungen entwickelt, bei denen diese Forderungen erfüllt sind ("Biosensors: Fundamentals and Applications" Oxford Univ. Press, 1987, Ed. by A. P. F. Turner, I. Karube and G. S. Wilson).Analytical method for the quantitative determination of chemical Substances using biologically active verb as analytical reagent are from modern analytics indispensable. Are of paramount importance thereby enzymes and more recently also more integrated Systems such as B. microorganisms. As reagents in These biocatalysts become soluble analysis systems or biocatalyst systems for many years turns. But it turns out that in many cases Enzymes and microorganisms despite their undeniable Advantages, such as high specificity, in soluble analyzes systems because of their one-time usability too expensive reagents are to be a wide and extensive To find application. That is why it has been around for many years searched for analytical methods and devices in which the expensive biocatalysts are used several times can. In the biosensor systems you definitely have Devices developed in which these requirements are fulfilled ("Biosensors: Fundamentals and Applications" Oxford Univ. Press, 1987, Ed. by A. P. F. Turner, I. Karube and G. S. Wilson).
Gegenwärtig besitzen unter den Biosensoren die Enzym elektroden die größte Bedeutung. In Enzymelektroden, bei denen die Biokatalysatorkomponente Enzym immobilisiert und damit wiederverwendbar ist, sind die Vorteile der elektrochemischen Transduktoren, wie hohe Sensitivität und schnelle Meßwertbereitstellung, mit den Vorteilen der Enzyme, wie hohe Spezifität, miteinander verbunden. Diese aufgeführten Vorteile von Enzymelektroden erklären auch ihren Entwicklungsvorsprung unter den Biosensortypen, was auch in der Bereitstellung kommerzieller Geräte auf der Basis von Enzymelektroden zum Ausdruck kommt (F. W. Scheller et al., Biosensors 2 (1985) 135-160). Insbesondere kom merzielle Vorrichtungen mit Enzymelektroden, die auf dem amperometrischen Meßprinzip beruhen, besitzen einen hohen Entwicklungsstand und werden in klinischen Einrichtungen und Biotechnologiezentren eingesetzt.Currently, among the biosensors have the enzyme electrodes are of the greatest importance. In enzyme electrodes, at which immobilize the biocatalyst component enzyme and thus reusable are the advantages of electrochemical transducers, such as high sensitivity and fast provision of measured values, with the advantages of Enzymes, such as high specificity, linked together. These Advantages of enzyme electrodes listed also explain their lead in development among biosensor types what also in the provision of commercial equipment at the Base of enzyme electrodes is expressed (F. W. Scheller et al., Biosensors 2 (1985) 135-160). Especially com Mercial devices with enzyme electrodes, which on the amperometric measurement principle, have a high State of development and are in clinical facilities and Biotechnology centers used.
Unter den potentiometrischen Enzymelektroden mit immobili sierten Enzymen, die ionenselektive Elektroden als elektro chemische Transduktoren nutzen, sind jedoch bisher ledig lich solche auf der Basis der teuren, gassensitiven Elek troden kommerziell erhältlich (F. W. Scheller et al., Bio sensors 1 (1985) 135-160). Potentiometrische Enzymsensoren mit pH-Elektroden oder pH-sensitiven, ionenselektiven Feldeffekttransistoren als elektrochemische Transduktor elemente dagegen haben bisher lediglich als grundlegende Neuentwicklung bzw. Labormuster Bedeutung erlangt, weil die auf der Basis dieser elektrochemischen Transduktoren entwickelten Enzymsensoren erhebliche Nachteile haben (Kirstein et al., Biosensors 1 (1985) 117-130), wie wechselnde Sensitivitäten beim Vermessen gepufferter Analyt lösungen oder unerwünschte Einflußnahme der Ionenaktivität, insbesondere aber der Wasserstoffionenaktivität auf das Meßergebnis. Diese Einflußnahme sich ständig verändern der Analytlösungsparameter, wie pH-Wert oder Pufferkapazi tät erlauben keine exakte Bestimmung der Analytkonzentra tion. Diese Probleme erklären auch das Fehlen von geeig neten Vorrichtungen und Geräten potentiometrischer Enzym sensoren mit pH-Elektroden und pH-ISFET's als Transducer elemente zur quantitativen, schnellen und effektiven Kon zentrationsbestimmung der von erheblicher analytischer Be deutung und im wesentlichen nur mit diesen Enzymsensortypen quantitativ zu bestimmenden chemischen Verbindungen, wie Harnstoff, Penicillin, Kreatinin, Lysin, Glutamat, Acetylcholin und Glutamin in biologischen Lösungen, wie z. B. Blut, Serum, Urin, Milch oder Fermentationslösungen. Aber auch die bei potentiometrischen Enzymsensorsystemen, bei denen lösliche Enzyme verwendet werden, vorgeschlagenen Lösungen sind auf potentiometrische Enzymsensorsysteme mit immobilisierten Enzymen nicht anwendbar. Sie beseitigen lediglich den Einfluß unterschiedlicher pH-Werte der Analyt lösungen. Darüber hinaus erfordern sie einen erheblichen Geräteaufwand zur Dosierung exakter Mengen von Meß-, Analyt- und Enzymlösungen, wobei letztere nach jedem Meßvorgang wie bei den bisherigen traditionellen Analytbestimmungsmethoden mit löslichen Enzymen auch verworfen werden (M. Ripamonti, A. Mosca, E. Rovida et al., Clin. Chem. 1984, 30, 556- 559).Among the potentiometric enzyme electrodes with immobili enzymes, the ion-selective electrodes as electro use chemical transducers, but have so far been single Lich based on the expensive, gas sensitive electronics trodes commercially available (F. W. Scheller et al., Bio sensors 1 (1985) 135-160). Potentiometric enzyme sensors with pH electrodes or pH-sensitive, ion-selective Field effect transistors as electrochemical transducers elements, on the other hand, have so far only been considered basic New development or laboratory sample gains importance because based on these electrochemical transducers developed enzyme sensors have considerable disadvantages (Kirstein et al., Biosensors 1 (1985) 117-130), such as changing sensitivities when measuring buffered analyte solutions or unwanted influence of ion activity, but especially the hydrogen ion activity the measurement result. This influence is constantly changing the analyte solution parameters, such as pH or buffer capacity do not allow an exact determination of the analyte concentration tion. These problems also explain the lack of suitable Devices and devices potentiometric enzyme sensors with pH electrodes and pH ISFETs as transducers elements for quantitative, fast and effective con determination of the concentration of significant analytical Be interpretation and essentially only with these enzyme sensor types chemical compounds to be determined quantitatively, such as urea, penicillin, creatinine, lysine, glutamate, Acetylcholine and glutamine in biological solutions, such as e.g. B. blood, serum, urine, milk or fermentation solutions. But also with potentiometric enzyme sensor systems, where soluble enzymes are used, proposed Solutions are available on potentiometric enzyme sensor systems immobilized enzymes not applicable. Eliminate them only the influence of different pH values of the analyte solutions. They also require a significant amount Equipment expenditure for dosing exact amounts of measuring, analyte and enzyme solutions, the latter like after each measurement with the previous traditional analyte determination methods can also be discarded with soluble enzymes (M. Ripamonti, A. Mosca, E. Rovida et al., Clin. Chem. 1984, 30, 556- 559).
Potentiometrische Biosensorsysteme mit immobilisierten Bio katalysatoren, wie sie in der Literatur beschrieben sind (R. B. Kobos in: Ion-selektive Electrodes in Anal. Chem., Plenum Press, New York and London, 1980, 1-84, Ed. by H. Freiser oder DD-WP 2 53 425 5) arbeiten auch lediglich nur in Meß- und Probenlösungen mit einheitlichen und vergleich baren Eigenschaften zuverlässig und richtig bzw. vernach lässigen, wie im Falle des genannten Patentes, die die Meßergebnisse verfälschenden Einflüsse unterschiedlicher Pufferkapazitäten der Meßproben oder die unterschiedlichen Ansprechverhalten der elektrochemischen Transduktoren in diesen Zweielektrodensystemen.Potentiometric biosensor systems with immobilized bio catalysts as described in the literature (R. B. Kobos in: Ion-selective electrodes in Anal. Chem., Plenum Press, New York and London, 1980, 1-84, Ed. by H. Freiser or DD-WP 2 53 425 5) only work in measurement and sample solutions with uniform and comparative reliable and correct or negligible properties casual, as in the case of the said patent, which the Measuring results falsifying influences of different Buffer capacities of the test samples or the different Response behavior of the electrochemical transducers in these two-electrode systems.
Die als erhebliche Nachteile auftretenden Einflüsse von Störsubstanzen auf ein Meßergebnis traten aber nicht nur bei Biosensorsystemen auf, die auf dem potentiometrischen Meßprinzip beruhen. Man findet sie auch bei den weit ver breiteten und erhebliche Bedeutung besitzenden amperome trischen Biosensorsystemen. Diese Störeinflüsse auf das Meßergebnis bei amperometrischen Biosensorsystemen können bis zu einem gewissen Grade durch Immobilisierung zusätz licher Anti-Interferenzschichten beseitigt werden, weil diese den Zutritt der Störsubstanzen bis zur die gewünschte biokatalytischen Reaktion katalysierenden Biokatalysator schicht bzw. bis zum elektrochemischen Transduktor verhindern (R. Rennsberg, F. Schubert, F. Scheller, TIBS, 1986, 11, 216-220). Diese Vorgehensweise hat aber auch Nachteile, da zum einen schwierig herstellbare Multi enzymmembranen verwendet werden müssen und zum anderen die abschirmende Wirkung der Anti-Interferenzschichten nur für vergleichsweise geringe Konzentrationen der Stör substanzen wirksam sind. Diese Ausschlußkonzentrationen liegen z. B. bei Fermentationslösungen weit unter den Störsubstanzkonzentrationen, so daß die Anti-Interferenz schichten wegen der Überlastung bei hohen Störsubstanz konzentrationen schnell unwirksam werden. The influences of Interfering substances on a measurement result did not only occur in biosensor systems based on the potentiometric Measuring principle. You can also find them in the far ver widespread and significant importance amperome trical biosensor systems. This interference on the Measurement result with amperometric biosensor systems can to a certain extent through immobilization additional anti-interference layers can be eliminated because these the access of the interfering substances up to the desired one biocatalytic reaction catalyzing biocatalyst layer or up to the electrochemical transducer prevent (R. Rennsberg, F. Schubert, F. Scheller, TIBS, 1986, 11, 216-220). But this procedure also has Disadvantages, because on the one hand difficult to produce multi enzyme membranes must be used and the other shielding effect of the anti-interference layers only for comparatively low concentrations of the sturgeon substances are effective. These exclusion concentrations lie z. B. in fermentation solutions far below Interfering substance concentrations so that the anti-interference layers due to overload with high interfering substance concentrations quickly become ineffective.
Das Ziel der Erfindung ist es, eine Meßvorrichtung und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Biokatalysator substraten zu entwickeln, wobei eine Verringerung manueller Arbeit wie Messen, Steuern und Auswerten bei gleichzeitiger Verbesserung von Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Schnellig keit angestrebt wird.The aim of the invention is a measuring device and a Method for the quantitative determination of biocatalyst to develop substrates, reducing manual Work like measuring, controlling and evaluating at the same time Improve accuracy, reliability and speed is striven for.
Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Entwicklung einer automatisch arbeitenden Meßapparatur mit Biosensoren und eines Verfahrens zur Bestimmung von Biokatalysatorsubstraten, mit der eine Verringerung der manuellen Arbeiten und eine effektive Bestimmung gewährleistet sind.The object of the invention is to develop a automatically working measuring apparatus with biosensors and a method for determining biocatalyst substrates, with a reduction in manual work and an effective determination is guaranteed.
Die erfindungsgemäße Meßvorrichtung besteht aus einem kalibrierten, mittels eines programmierbaren Rechnersystems gesteuerten Meßsystem, das über einen Analog-Digital-Wandler mit einer Steuer- und Auswerteeinheit verbunden ist, einer Dateneingabeeinheit zu seiner Bedienung sowie einem Dokumentiergerät.The measuring device according to the invention consists of a calibrated using a programmable computer system controlled measuring system using an analog-to-digital converter is connected to a control and evaluation unit, a data entry unit for its operation and one Documenting device.
Das Meßsystem enthält als wesentlichen Bestandteil ein Bio sensorsystem. Das Biosensorsystem ist in einer thermosta tierbaren Durchflußmeßzelle angeordnet und über seine elek trischen Leitungen und über den Analog-Digital-Wandler mit der Steuer- und Auswerteeinheit verbunden. Die Durch flußmeßzelle ist so konstruiert, daß in sie für einen Meßvorgang über eine Meßzuflußleitung mit durch die Steuer- und Auswerteeinheit steuerbarem Ventil die Meßlösung mit Hilfe einer Dosierpumpe aus einem Vorratsbehälter dosiert wird. Die Meßlösung wird durch einen Rührer gleichmäßig durchmischt. Die Meßlösung ist auf eine Pufferkonzentration von 2 mol/l bis 10-5 mol/l mit einem pH-Wert in der Nähe des pH-Optimums des jeweils immobilisierten Biokatalysators eingestellt. Nach einem Meßvorgang wird die Meßlösung mit Hilfe einer Absaugvorrichtung über eine Meßzellenab flußleitung mit durch die Steuer- und Auswerteeinheit steuerbarem, geöffnetem Ventil entfernt. Das Biosensor system enthält erfindungsgemäß mindestens drei elektro chemische Sensoren. Dabei dient der Analog-Digital-Wandler der Umwandlung der anfallenden Signale in die durch das Rechnersystem nur verarbeitbaren digitalen Signale. Ein Sensor ist in jedem Falle ein mit mindestens einem Biokatalysator beschichteter, elektrochemischer Sensor. The measuring system contains a bio sensor system as an essential component. The biosensor system is arranged in a flow cell which can be thermostated and is connected to the control and evaluation unit via its electrical lines and via the analog-digital converter. The flow measuring cell is constructed in such a way that the measuring solution is metered from it from a storage container with the aid of a metering pump for a measuring process via a measuring inflow line with a valve that can be controlled by the control and evaluation unit. The measuring solution is mixed evenly by a stirrer. The measuring solution is adjusted to a buffer concentration of 2 mol / l to 10 -5 mol / l with a pH value close to the optimum pH of the immobilized biocatalyst. After a measuring process, the measuring solution is removed with the aid of a suction device via a measuring cell flow line with an open valve which can be controlled by the control and evaluation unit. According to the invention, the biosensor system contains at least three electrochemical sensors. The analog-digital converter is used to convert the resulting signals into the digital signals that can only be processed by the computer system. In any case, a sensor is an electrochemical sensor coated with at least one biocatalyst.
Mit einem Biokatalysator beschichtet bedeutet, daß Enzyme, Mikroorganismen, tierische, pflanzliche oder humane Zellen, Zellorganellen und andere biokatalytisch aktive Materialien, z. B. mit diesen Biokatalysatoren modifizierte Antikörper, Antigene, Haptene, Hormone oder Gemische der genannten Bio katalysatoren, auf den sensitiven Oberflächen des Sensors immobilisiert sind. Der zweite Sensor ist ebenfalls ein mit mindestens einem Biokatalysator beschichteter, elektro chemischer Sensor, er kann aber auch ein unbeschichteter, elektrochemischer Sensor sein, er muß aber von der gleichen Art wie der erste Sensor sein. Liegt dieser zweite Sensor jedoch in beschichteter Form vor, so ist auf der sensitiven Oberfläche dieses elektrochemischen Sensors mindestens ein Biokatalysator immobilisiert, der eine oder mehrere Störsubstanzen für den ersten Sensor umsetzt und damit bestimmen kann. Der dritte elektrochemische Sensor dient als Referenzsensor gegenüber den beiden anderen Sensoren. Er muß nicht in jedem Falle als dritter Sensor sichtbar im Biosensorsystem enthalten sein, da auch solche elektro chemischen Transduktoren für die Entwicklung des Biosensor systems verwendet werden können, deren integraler und oft unsichtbarer Bestandteil dieser Referenzsensor ist. Sein Vorhandensein ist jedoch für das Funktionieren des Biosensorsystems eine unabdingbare Voraussetzung. Die elektrochemischen Transduktoren für die Sensoren können unterschiedlichster Art sein, so daß verschiedenartigste, durch die biokatalytische Reaktion erzeugte, physikalische Meßgrößen durch die Meßvorrichtung quantitativ bestimmt werden können. Erfindungsgemäß werden für die Entwicklung der Meßsensoren des Biosensorsystems ionenselektive Sen soren, z. B. pH-Elektroden bzw. pH-sensitive, ionenselek tive Feldeffekttransistoren oder Sauerstoffelektroden vom Typ der Clark-Elektroden bzw. wie diese gleiche Eigen schaften besitzende und mit Mediatoren modifizierte Elek troden oder Leitfähigkeitselektroden verwendet. Bei Bio sensorsystemen zur Bestimmung von Biokatalysatorsubstraten wie Harnstoff, Penicillin, Kreatinin, Aminosäuren, Acyl cholinen, Peptiden oder einigen Sacchariden sind auf den pH-sensitiven Oberflächen der ionenselektiven Sensoren oder Leitfähigkeitselektroden des ersten Sensors solche Biokatalysatoren immobilisiert, bei deren biokatalytischer Wirkung nach Zugabe oben genannter Biokatalysatorsubstrate zur Meßlösung pH-Änderungen oder Änderungen anderer Ionen konzentrationen auftreten. Solche Biokatalysatoren sind z. B. Enzyme wie Urease, Penicillinase, Penicillinacylase, Kreatininase, Deaminasen, Decarboxylasen, Proteasen und einige Kohlehydrate umzusetzenden Enzyme, z. B. Glukose oxidase, aber auch höher integrierte biokatalytisch aktive Systeme wie Mikroorganismen, Zellen unterschiedlicher Her kunft, Zellorganellen, Organschnitte, die diese Enzymakti vitäten besitzen und mit diesen genannten Biokatalysatoren modifizierte Antikörper, Antigene, Haptene, Hormone und andere biologisch aktive Verbindungen. Biosensorsysteme mit auf diese beschriebene Weise beschichtetem ersten Sen sor besitzen im allgemeinen einen unbeschichteten zweiten Sensor und einen Referenzsensor, wie er aus der Elektro chemie für pH-Werte messende Sensorsysteme bekannt ist. In einer anderen Variante ist das Biosensorsystem der Meß vorrichtung so aufgebaut, daß bei Verwendung von Sauer stoffkonzentration oder Konzentrationen seiner Reduktions produkte messenden Elektroden bzw. gleiche Eigenschaften besitzenden und mit elektrisch leitenden Verbindungen, den sogenannten Mediatoren, modifizierten Elektroden als Sen soren auf der sensitiven Oberfläche des ersten Sensors Biokatalysatoren immobilisiert sind, bei deren biokataly tischer Wirkung nach Zugabe ihrer Substrate zur Meßlösung Sauerstoff verbraucht oder gebildet wird. Zu diesen Bio katalysatoren zählt man die zu den Oxidreduktasen ge hörenden Enzymen, die in ihrer Vielfalt allein oder in Kom bination mit Enzymen aus anderen Enzymklassen, besonders aus der Enzymklasse der Hydrolasen oder als Bestandteil der bereits genannten höher integrierten biokatalytisch aktiven Systeme oder als Teil modifizierter Antikörper, Antigene, Haptene, Hormone und anderer biologisch aktiver Verbindungen auf dem ersten Sensor immobilisiert sind. Ihre Immobilisierung gestattet die quantitative Bestimmung ihrer Substrate. Der zweite Sensor ist bei diesen Systemen auch mit einem Biokatalysator beschichtet. Bevorzugt sind diese immobilisierten Biokatalysatoren ein Enzym oder mehrere Enzyme, die eine mit dem ersten Sensor interfe rierende Störsubstanz umsetzen und damit deren quantitati ve Bestimmung erlauben. Weniger bevorzugt werden dafür höher integrierte, biokatalytisch aktive Systeme verwendet. Re ferenzsensor ist ebenfalls eine aus der elektrochemischen Analytik allgemein bekannte Referenzelektrode.Coated with a biocatalyst means that enzymes, Microorganisms, animal, plant or human cells, Cell organelles and other biocatalytically active materials, e.g. B. antibodies modified with these biocatalysts, Antigens, haptens, hormones or mixtures of the named bio catalysts, on the sensitive surfaces of the sensor are immobilized. The second sensor is also a with at least one biocatalyst coated, electro chemical sensor, but it can also be an uncoated, electrochemical sensor, but it must be the same Kind of like the first sensor. This second sensor lies however, in a coated form, so on the sensitive Surface of this electrochemical sensor at least immobilized a biocatalyst that has one or more Interfering substances for the first sensor and thus can determine. The third electrochemical sensor is used as a reference sensor compared to the other two sensors. It does not have to be visible as a third sensor in every case be included in the biosensor system, since such electro chemical transducers for the development of the biosensor systems can be used, their integral and often invisible part of this reference sensor. However, its presence is essential for the functioning of the Biosensor systems an essential requirement. The electrochemical transducers for the sensors be of the most different kind, so that the most varied, physical produced by the biocatalytic reaction Measured quantities determined quantitatively by the measuring device can be. According to the invention for development of the measuring sensors of the biosensor system ion-selective Sen sensors, e.g. B. pH electrodes or pH-sensitive, ion-selective tive field effect transistors or oxygen electrodes from Type of Clark electrodes or the same as these owning and modified with mediators electrodes or conductivity electrodes. At Bio sensor systems for the determination of biocatalyst substrates such as urea, penicillin, creatinine, amino acids, acyl cholines, peptides or some saccharides are on the pH-sensitive surfaces of the ion-selective sensors or conductivity electrodes of the first sensor Immobilized biocatalysts in their biocatalytic Effect after adding the above-mentioned biocatalyst substrates for pH changes or changes in other ions concentrations occur. Such are biocatalysts e.g. B. enzymes such as urease, penicillinase, penicillin acylase, Creatininase, deaminases, decarboxylases, proteases and some enzymes to convert carbohydrates, e.g. B. Glucose oxidase, but also more integrated biocatalytically active Systems such as microorganisms, cells of different origins future, cell organelles, organ sections that these enzyme stocks vities and with these biocatalysts modified antibodies, antigens, haptens, hormones and other biologically active compounds. Biosensor systems with the first Sen coated in this way sor generally have an uncoated second Sensor and a reference sensor, like the one from the electro Chemistry for pH sensor systems is known. In another variant, the biosensor system is the measurement device constructed so that when using acid substance concentration or concentrations of its reduction electrodes that measure the product or have the same properties possessing and with electrically conductive connections, the so-called mediators, modified electrodes as Sen sensors on the sensitive surface of the first sensor Biocatalysts are immobilized in their biocataly table effect after adding their substrates to the measuring solution Oxygen is consumed or formed. To this bio Catalysts are considered to be oxide reductases listening enzymes, in their diversity alone or in com combination with enzymes from other enzyme classes, especially from the hydrolase enzyme class or as a component of the above-mentioned, higher integrated biocatalytic active systems or as part of modified antibodies, Antigens, haptens, hormones and other biologically active Connections are immobilized on the first sensor. Their immobilization allows quantitative determination of their substrates. The second sensor is in these systems also coated with a biocatalyst. Are preferred these immobilized biocatalysts are an enzyme or several enzymes that interfere with the first sensor Implementing interfering substance and thus its quantitative Allow determination. Less preferred are higher integrated, biocatalytically active systems are used. Right reference sensor is also one from the electrochemical Analytics commonly known reference electrode.
Ein zweites wesentliches Bauteil, das für die automatische Steuerung der Wechselwirkungen der mechanischen und elektro nischen Elemente der Meßabläufe und für die Auswertung der Meßsignale zur Ergebnisbildung und -dokumentation verant wortlich ist, ist die rechnergestützte Steuer- und Auswerte einheit. Sie besteht ausA second essential component that is used for automatic Control of the interaction of mechanical and electro African elements of the measurement processes and for the evaluation of Measurement signals responsible for the formation and documentation of results is literal is the computer-aided control and evaluation unit. it consists of
- - einer Meßzeiteinrichtung, die so dimensioniert ist, daß die Meßzeiten des Biosensorsystems frei wählbar, be vorzugt aber von 2 Sekunden bis 60 Sekunden festgelegt sind,- A measuring device that is dimensioned so that the measuring times of the biosensor system are freely selectable, be but preferably set from 2 seconds to 60 seconds are,
- - einer Zeitablaufsteuerung, die das Ende der programmierten Meßzeit nach Meßprobenzugabe zur und Meßprobener kennung in der Meßlösung bestimmt,- a timing control that the end of the programmed Measuring time after adding the test sample to the test sample identifier in the measurement solution,
- - einer Meßablaufsteuerung, die den zeitlichen Ablauf aller Meß- und Kontrollvorgänge koordiniert,- A measuring sequence control, the timing coordinated all measurement and control processes,
- - einem Probenerkennungssystem, das nach Meßprobenzugabe zur Meßlösung den Meßzeitbeginn auslöst,- a sample detection system, which is added after measurement sample triggers the start of the measuring time for the measuring solution,
- - einer Kalibrier- und Meßvorgangssteuerung, die die Reihen folge der Kalibrier-, Meß- und Kontrollvorgänge der Meß abläufe festlegt,- A calibration and measurement process control that the rows follow the calibration, measurement and control processes of the measurement defines processes,
- - einem Meßwertaufnahmesystem, das die Meßsignale von den Sensoren aufnimmt und ablegt,- A measurement recording system that the measurement signals from the Picks up and stores sensors,
- - einer Vorrichtung zur Verarbeitung der Meßsignale und Ergebnisbildung,- A device for processing the measurement signals and Formation of results,
- - einem Zwischenspeicher für die Ergebnisse der Kali brierung, der Kontrolle der Aktivitätszustände der Sen soren des Biosensorsystems und der zu programmierenden Meßzeiten,- a buffer for the results of the potash control of the activity status of the sen sensors of the biosensor system and those to be programmed Measuring times,
- - einem Erkennungssystem für den Aktivitätszustand der Sensoren des Biosensorsystems und- a detection system for the state of activity of the Biosensor system sensors and
- - einem Stromversorgungssystem für sämtliche Aggregate der Meßvorrichtung.- a power supply system for all units the measuring device.
Essentieller Bestandteil der Kalibrier- und Meßvorgangs steuerung der Auswerte- und Steuereinheit sind Vorrich tungen und Systeme, die gewährleisten, daß vor der Kon zentrationsbestimmung der Biokatalysatorsubstratkonzen tration die Ermittlung der Korrekturfaktoren, die ein un terschiedliches Ansprechverhalten der Sensoren gegenüber auf das Biosensorsystem einwirkenden Störsubstanzen berücksich tigen und eine Kalibrierung mit einer definierten Biokata lysatorsubstratkonzentration, die in einem Kalibrierpuffer mit geeigneter Pufferkapazität aufgelöst ist, ermöglichen. Die Korrekturfaktoren für das Biosensorsystem werden er mittelt, indem Substrate oder Produkte der biokatalytischen Reaktion, die auf dem mit einem Biokatalysator besichteten ersten Sensor abläuft, in dem Mengen und Konzentrationen zur Meßlösung addiert werden, daß etwa gleichgroße Meß signale erhalten werden, wie sie bei der durch die Biokata lysatoren realisierten biokatalytischen Reaktion nach der Substratzugabe zur Meßlösung auftreten. Für den Kalibrier vorgang ist die Kalibrier- und Meßvorgangssteuerung der Steuer- und Auswerteeinheit so ausgelegt, daß zur Kompen sierung von Toleranzen des Meßsystems und von Änderungen der Aktivitätszustände der immobilisierten Biokatalysatoren des Biosensorsystems mit Biokatalysatorsubstratkonzentra tionen kalibriert wird, die in Kalibrierpuffern aufgelöst sind, deren Pufferkapazitäten sich aus den Mittelwerten der unterschiedlichen Pufferkapazitäten der zu vermessenden Meßproben mit den unbekannten Biokatalysatorsubstratkon zentrationen ergeben, und die nach an sich bekannten Ver fahren bestimmt werden. Nach den Kalibrier- und Meßvor gängen werden mit der Vorrichtung zur Meßwertverarbeitung die anfallenden Meßsignale in Meßergebnisse umgewandelt. Dabei wird mit Hilfe von in die Vorrichtung zur Meßwert verarbeitung integrierten Bauteilen die Differenz aus dem Meßsignal des ersten Sensors und dem Meßsignal des zwei ten Sensors gebildet, die mit dem Korrekturfaktor multi pliziert wird, dieser Wert mit dem Wert für die Kalibrier konzentration verglichen wird und der Vergleichswert nach Umrechnung in Konzentrationseinheiten (oder Aktivitäts einheiten) der zu bestimmenden Biokatalysatorsubstrate als Meßergebnis ermittelt, das durch digitale Anzeige oder über einen Monitor oder Drucker dokumentiert wird. Erfin dungsgemäß wird die Meßvorrichtung zur Bestimmung der Penicillinkonzentration in Fermentationslösungen einge setzt. Es wird ein Biosensorsystem verwendet, das aus einer pH-Elektrode, die mit einem penicillinspaltenden Enzym be schichtet ist, einer unbeschichteten pH-Elektrode und einer Referenzelektrode besteht und in der Meßzelle angeordnet ist. Zur Kalibrierung des Meßsystems wird die zur Ermitt lung des Korrekturfaktors erforderliche Konzentration einer Mineralsäure, vorzugsweise Salzsäure, und die Pufferkapazität für den Kalibrierpuffer nach an sich bekannten Verfahren vorher bestimmt.Essential part of the calibration and measuring process Control of the evaluation and control unit are Vorrich and systems that ensure that before the Kon determination of the concentration of the biocatalyst substrate concentrations tration the determination of the correction factors, the un different response behavior of the sensors interfering substances acting on the biosensor system and a calibration with a defined biocata analyzer substrate concentration in a calibration buffer with a suitable buffer capacity. The correction factors for the biosensor system will be averages by substrates or products of biocatalytic Reaction based on that viewed with a biocatalyst first sensor expires in the quantities and concentrations be added to the measuring solution that measuring about the same size signals are obtained, as in the case of the biocata analyzers realized biocatalytic reaction after the Add substrate to the measuring solution. For calibration The process is the calibration and measurement process control of the Control and evaluation unit designed so that to compensate Tolerance of the measuring system and changes the activity states of the immobilized biocatalysts of the biosensor system with biocatalyst substrate concentration calibrated, which is dissolved in calibration buffers are whose buffer capacities are derived from the mean values the different buffer capacities of those to be measured Measurement samples with the unknown biocatalyst substrate con result in concentrations, and according to known Ver driving can be determined. After the calibration and measurement gears with the device for processing measured values the measurement signals are converted into measurement results. This is done with the help of the device for the measured value processing integrated components the difference from the Measurement signal of the first sensor and the measurement signal of the two ten sensors formed with the correction factor multi is copied, this value with the value for the calibration concentration is compared and the comparison value after Conversion to concentration units (or activity units) of the biocatalyst substrates to be determined as Measurement result determined by digital display or is documented on a monitor or printer. Erfin According to the measuring device for determining the Penicillin concentration in fermentation solutions puts. A biosensor system is used which consists of a pH electrode with a penicillin-cleaving enzyme is coated, an uncoated pH electrode and one There is a reference electrode and arranged in the measuring cell is. To calibrate the measuring system, the determination concentration of the correction factor required Mineral acid, preferably hydrochloric acid, and the buffering capacity for the calibration buffer according to known methods determined beforehand.
Die Bestimmung der Penicillinkonzentration und die vorherige Kalibrierung mit der bestimmten Konzentration an Salz säure (10-2 n HCl) und einer definierten Penicillinkonzen tration (30 mM Penicillin G/l), Pufferkonzentration 1 × 10-2 mol/l - 1 × 10-4 mol/l, pH = 6,0-8,11, erfolgen auto matisch durch die Meßablaufsteuerung mit Hilfe der Meß zeiteinrichtung, der Zeitablaufsteuerung des Probener kennungssystems und der Kalibrier- und Meßvorgangssteuerung, nach der Probenzugabe zur Meßlösung. In Abhängigkeit vom mit penicillinspaltenden Enzym beschichteten Sensor liegt die Meßzeit unter 20 Sekunden.The determination of the penicillin concentration and the previous calibration with the determined concentration of hydrochloric acid (10 -2 N HCl) and a defined penicillin concentration (30 mM penicillin G / l), buffer concentration 1 × 10 -2 mol / l - 1 × 10 - 4 mol / l, pH = 6.0-8.11, are carried out automatically by the measurement sequence control with the aid of the measurement time device, the time sequence control of the sample detection system and the calibration and measurement process control, after the sample has been added to the measurement solution. Depending on the sensor coated with penicillin-splitting enzyme, the measuring time is less than 20 seconds.
Zur Bestimmung von Harnstoff in Serum wird erfindungsge mäß ein Biosensorsystem eingesetzt, das aus einer pH-Elek trode, die mit Urease beschichtet ist, aus einer zweiten unbeschichteten pH-Elektrode und einer Referenzelektrode besteht. Zur Ermittlung des Korrekturfaktors verwendet man eine Base, vorzugsweise 0,015 n Natronlauge. Die Kalibrie rung erfolgt mit einer definierten Menge Harnstofflösung, vorzugsweise 10 mM Harnstoff/l, die Pufferkonzentration ist 1 × 10-3 mol/l bis 5 × 10-3 mol/l, der pH-Wert 6,8- 7,4. Die Meßzeit liegt unter 30 Sekunden.To determine urea in serum, a biosensor system according to the invention is used which consists of a pH electrode coated with urease, a second uncoated pH electrode and a reference electrode. A base, preferably 0.015N sodium hydroxide solution, is used to determine the correction factor. The calibration is carried out with a defined amount of urea solution, preferably 10 mM urea / l, the buffer concentration is 1 × 10 -3 mol / l to 5 × 10 -3 mol / l, the pH 6.8-7.4. The measuring time is less than 30 seconds.
Die Bestimmung des Disaccharids Saccharose in Gegenwart von Glukose erfolgt mit einem Biosensorsystem, das aus einer mit einer Enzymmembran beschichteten Sauerstoff oder Reduktionsprodukte messende Elektrode besteht. In der Enzymmembran sind Saccharose (Invertase), Mutarotase und Glukoseoxidase enthalten. Die zweite Elektrode ist ebenfalls eine Sauerstoff- oder seine Reduktionsprodukte messende Elektrode, die mit Glukoseoxidase und gegebenen falls Mutarotase beschichtet ist. Die dritte Elektrode ist eine Referenzelektrode. Der Korrekturfaktor wird mit einer definierten Menge Glukoselösung (10 mM Glukose/l) bestimmt, die Kalibrierung erfolgt mit einer Saccharoselösung (10 mM Saccharose), die Pufferkonzentration ist 2 mol/l und der pH-Wert 6,0 bis 7,5. Die Meßzeit liegt unter 30 Sekunden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des Disaccharids Laktose enthält in der Enzymmembran des ersten Sensors die Enzyme β-Galaktosidase, Mutarotase und Glukoseoxidase und in der Enzymmembran des zweiten Sensors Glukoseoxidase und gegebenenfalls Mutarotase, und die dritte Elektrode ist die Referenzelektrode. Der Korrektur faktor wird mit einer definierten Menge Glukoselösung (10 mM Glukose/l) bestimmt, die Kalibrierung des Meßsystems erfolgt mit einer definierten Menge Laktoselösung (10 mM Laktose), die Pufferkonzentration ist 2 mol/l bis 1 × 10-3 mol/l und der pH-Wert 6,0 bis 7,5.The disaccharide sucrose is determined in the presence of glucose using a biosensor system consisting of an electrode measuring oxygen or reduction products coated with an enzyme membrane. The enzyme membrane contains sucrose (invertase), mutarotase and glucose oxidase. The second electrode is also an electrode measuring oxygen or its reduction products, which is coated with glucose oxidase and, if appropriate, mutarotase. The third electrode is a reference electrode. The correction factor is determined with a defined amount of glucose solution (10 mM glucose / l), calibration is carried out with a sucrose solution (10 mM sucrose), the buffer concentration is 2 mol / l and the pH 6.0 to 7.5. The measuring time is less than 30 seconds. The method according to the invention for determining the disaccharide lactose contains the enzymes β- galactosidase, mutarotase and glucose oxidase in the enzyme membrane of the first sensor and glucose oxidase and optionally mutarotase in the enzyme membrane of the second sensor, and the third electrode is the reference electrode. The correction factor is determined with a defined amount of glucose solution (10 mM glucose / l), the measuring system is calibrated with a defined amount of lactose solution (10 mM lactose), the buffer concentration is 2 mol / l to 1 × 10 -3 mol / l and the pH 6.0 to 7.5.
Die Meßzeit liegt im Bereich von weniger als 30 Sekunden. Zur Bestimmung des Disaccharids Maltose nach dem erfin dungsgemäßen Verfahren enthält die Enzymmembran des ersten Sensors Glukoamylase, Mutarotase und Glukoseoxidase und die Enzymmembran des zweiten Sensors Glukoseoxidase und gegebenenfalls Mutarotase. Die dritte Elektrode ist die Referenzelektrode. Der Korrekturfaktor wird auch hier mit einer definierten Menge Glukoselösung (10 mM Glukose/l) bestimmt, und die Kalibrierung des Meßsystems wird mit einer definierten Menge Maltoselösung (10 mM Maltose) vorgenommen, die Pufferkonzentration ist 2 mol/l bis 1 × 10-3 mol/l und der pH-Wert 6,0 bis 7,5.The measurement time is in the range of less than 30 seconds. To determine the disaccharide maltose according to the method according to the invention, the enzyme membrane of the first sensor contains glucoamylase, mutarotase and glucose oxidase and the enzyme membrane of the second sensor contains glucose oxidase and optionally mutarotase. The third electrode is the reference electrode. The correction factor is also determined here with a defined amount of glucose solution (10 mM glucose / l), and the calibration of the measuring system is carried out with a defined amount of maltose solution (10 mM maltose), the buffer concentration is 2 mol / l to 1 × 10 -3 mol / l and the pH 6.0 to 7.5.
Die Meßzeit zur Bestimmung einer Meßprobe beträgt weniger als 30 Sekunden.The measuring time for determining a test sample is less than 30 seconds.
Mit der erfindungsgemäßen Meßvorrichtung können eine Vielzahl von Biokatalysatorsubstraten schnell und in ein facher Weise quantitativ bestimmt werden. Durch die rechner gestützte, automatisierte Ablaufsteuerung werden noch häufig anzutreffende manuelle und zeitaufwendige Arbeits schritte, die sich aus den Meß-, Steuer- und Auswertevor gängen bei Analysenverfahren ergeben, wesentlich ver ringert. Durch die Beseitigung von bei bisher vorhandenen Meßvorrichtungen auftretenden Fehlerquellen werden mit der erfindungsgemäßen Meßvorrichtung zusätzlich auch die Richtigkeit und Zuverlässigkeit der Analysenmethoden unter Verwendung von Biosensoren erheblich verbessert.With the measuring device according to the invention a Variety of biocatalyst substrates quickly and in one be quantitatively determined. Through the calculator supported, automated process control will still be frequently encountered manual and time-consuming work steps that result from the measurement, control and evaluation results in analytical processes, significantly ver wrestles. By eliminating from existing ones Sources of error occurring are identified with the measuring device according to the invention also the Accuracy and reliability of the analysis methods under Use of biosensors significantly improved.
Die erfindungsgemäße Meßvorrichtung zur effektiven und auto matischen Konzentrationsbestimmung von Biokatalysatorsubstraten wird nachfolgend anhand der durch sie verwirklichten Meß ablauffolge beschrieben:The measuring device according to the invention for effective and auto determination of the concentration of biocatalyst substrates is subsequently based on the measurement realized by them sequence described:
Fig. 1 stellt den prinzipiellen Aufbau der Meßvorrichtung dar und wird zur Darstellung der Meßabläufe herangezogen. Zur Bestimmung der Penicillinkonzentration in Fermentations lösungen wird das aus einer mit Penicillinase (EC 3.5.2.6.) beschichteten pH-Elektrode als Sensor (15) und einer unbe schichteten pH-Elektrode als Sensor (16) - beide Sensoren werden mit integriertem Referenzsensor (17) verwendet - bestehende Biosensorsystem (7) in der Meßzelle (5) angeord net. Als nächste vorbereitende Schritte zur Penicillin bestimmung in Fermentationslösungen werden die zur Ermitt lung des Korrekturfaktors erforderliche Konzentration einer Mineralsäure und danach die geeignete Pufferkapazität für den Kalibrierpuffer durch Titration von Fermen tationslösungen bestimmt. Alle weiteren Arbeitsschritte - ausgenommen die Dosiervorgänge, die nicht Gegenstand dieser erfindungsgemäßen Meßvorrichtung sind, aber durchaus in den automatischen Meßablauf integriert werden können - erfolgen mit Hilfe der Meßzeiteinrichtung (18), der Zeit ablaufsteuerung (19), der Meßablaufsteuerung (20), des Probenerkennungssystems (21) und der Kalibrier- und Meß vorgangssteuerung (22) automatisch bzw. werden nach vi suellen und über die rechnergestützte Steuer- und Aus werteeinheit (3) gesteuerten Anweisungen ausgeführt. Alle nachfolgend beschriebenen Meßschritte unterliegen einem programmierten Meßablauf, der gesteuert wird durch die Meßablaufsteuerung (20). Zu Beginn des Einsatzes der Meßvorrichtung wird die Meßlösung aus dem Vorratsbehälter (11) mit Hilfe der Dosierpumpe (10) bei geöffnetem Ventil (9) und geschlossenem Ventil (13) über die Meßzellenzu flußleitung (8) in die Meßzelle (5) gepumpt, in die obiges Biosensorsystem (7) eintaucht. Nach Füllen der Meß zelle (5) mit der Meßlösung beginnt das Überprüfen des Grundzustandes der Meßsensoren (15) und (16). Bei nicht konstanten Ausgangspotentialen der Meßsensoren (15) und (16) werden durch Befehle die Meßzelle geleert, wieder gefüllt und die Meßsensoren (15) und (16) damit so lange automatisch aquilibriert, bis die Ausgangspotentiale konstant sind. Gelingt das mit fünf der beschriebenen Spülvorgänge nicht, so erfolgt per Befehl über die Meßvorrichtungs teile (27) oder (28) die Ausschrift "Sensorwechsel". Bei konstanten Ausgangspotentialen wird der Befehl "Eingabe der Meßzeit" gegeben, der über die Dateneingabeeinheit (4) ausgeführt wird. In Abhängigkeit vom Aktivitätszustand des mit Penicillinase beschichteten Sensors (15) liegt bei der Bestimmung von Penicillin in Fermentationslösungen die Meß zeit im Bereich von zwei bis fünf Sekunden und ist in diesem Bereich über die Dateneingabeeinheit (4) der Meßzeit einrichtung (18) der Steuer- und Auswerteeinheit (3) auch mitzuteilen, in der sie für die nachfolgenden Meßvorgänge abgespeichert wird. Als nächster Meßvorgangsschritt er folgt die Bestimmung des Korrekturfaktors für das Biosen sorsystem (7). Zu diesem Zweck werden nach Befehlsertei lung 50 µl einer 10-2-normalen Salzsäurelösung zur Meß lösung addiert. Unmittelbar nach Erfassung der ersten Potentialänderungen durch das Probenerkennungssystem (21), das mit den Sensoren (15) und (16) über den Analog-Digital- Wandler (2) verbunden ist, wird der Meßzeitbeginn durch die in die Meßzeiteinrichtung (18) integrierte Zeit ablaufsteuerung (19) ausgelöst. Nach Ablauf der programmier ten Meßzeit wird der Meßvorgang - ebenfalls durch die Zeitablaufsteuerung (19) - abgebrochen. Die anfallenden Meßsignale gelangen danach in das Meßwertaufnahmesystem (23), von wo sie zur Berechnung des Korrekturfaktors durch die Vorrichtung zur Meßwertverarbeitung und Ergebnisbildung (24) abgerufen werden. Der hier ermittelte Korrektur faktor wird zunächst im Zwischenspeicher (25) abgelegt. Nach der Bestimmung des Korrekturfaktors wird bei ge schlossenem Ventil (9) und geöffnetem Ventil (13) die Meß zelle automatisch geleert und mit Meßlösung gefüllt, um den Grundzustand der Sensoren (15) und (16) wieder zu erreichen. Werden nach fünf Spülvorgängen die Ausgangs potentiale nicht erreicht, so wird wieder der Befehl "Sensorwechsel" erteilt und der Meßvorgang von Beginn an wiederholt. Bei Erreichen der Potentialgrundzustände wird als nächstes mit Hilfe der Kalibrier- und Meßvorgangs steuerung (22) das Meßsystem (1), genau genommen die Meß zelle (5) mit dem Biosensorsystem (7), mit einer definier ten Penicillinkonzentration kalibriert. Dazu wird nach Be fehlserteilung zunächst über die Dateneingabeeinheit (4) die Kalibrierkonzentration von Penicillin G der Steuer- und Auswerteeinheit (3) mitgeteilt, wo sie im Zwischenspei cher (25) abgelegt wird. Die darauf folgende Aufforderung zur Kalibrierprobendosierung wird durch Addition von 50 µl einer Kalibrierlösung, die ein 1 × 10-2 molarer Phosphat puffer vom pH-Wert 7,0 mit 30 mM Penicillin G ist, zur Meßlösung in der Meßzelle (5) ausgeführt. Durch den Magnet rührer (6) wird die nun penicillinhaltige Meßlösung durch mischt, und das Penicillin G dringt in die Enzymmembran des Sensors (15) ein, wo auf Grund der biokatalytischen Reaktion das Penicillin G innerhalb der programmierten Meßzeit umgesetzt wird und damit eine pH-Änderung in der Enzymmembran verursacht wird. Der zweite Meßsensor (16) übt beim Kalibriervorgang noch keine Funktion aus, da im allgemeinen davon auszugehen ist, daß Meßlösung und Kali brierlösung den gleichen pH-Wert besitzen. In gleicher Weise wie bei der Bestimmung des Korrekturfaktors beschrie ben, wird unmittelbar nach Erfassung erster Potentialän derungen am Sensor (15) durch das Probenerkennungssystem (21) der Meßbeginn gestartet und die Meßzeit auch beendet. Am Ende der Meßzeit liegt eine der Penicillinkonzentration entsprechende pH-Wertänderung bzw. eine dieser entsprechende Spannung an, die durch das Meßwertaufnahmesystem (23) aufgenommen und als Meßsignal für die Kalibrierkonzentra tion ebenfalls im Zwischenspeicher (25) abgelegt wird. Die nächsten automatischen Meßablaufschritte sind wie oben beschrieben wieder die Spülvorgänge zum Erlangen des Grund zustandes des Meßsensors (15), einschließlich des eventuell erforderlichen Befehls zum "Sensorwechsel" mit nachfolgender "Eingabe der Meßzeit" als erneuter Meßablaufbeginn mit neuem Biosensorsystem (7). Der Kalibriervorgang kann gleich zeitig verbunden werden mit der - wegen des unvermeidlichen Aktivitätsverlustes der Enzymschicht - notwendigen Bestimmung des Aktivitätszustandes des Sensors (15). Dazu wurde in einem der Kalibrier- und Meßvorgangssteuerung (22) folgendem Erkennungssystem (26) für den Aktivitätszustand des Sensors (15) ein Mindestwert der zu erreichenden Spannung für die Kalibrierkonzentration des Penicillins G eingegeben und abgespeichert. Wird dieser Spannungswert nach Zugabe der Kalibrierlösung zur Meßlösung nicht erreicht, so er folgt als erstes der Befehl über die Meßvorrichtungsteile (27) oder (28) "Verdoppelung des Kalibrierlösungsvolumens". Das bedeutet, daß man mit 50 µl einer 10-2 normalen Salz säure und 100 µl Kalibrierlösungsvolumen den Meßablauf von "Eingabe der Meßzeit" an wiederholt. Wird auch dann der Wert für die vorgegebene Mindestspannung nicht erreicht, so erfolgt wieder der Befehl "Sensorwechsel". Fig. 1 shows the basic structure of the measuring device and is used to illustrate the measurement processes. To determine the penicillin concentration in fermentation solutions, this is made from a pH electrode coated with penicillinase (EC 3.5.2.6.) As a sensor ( 15 ) and an uncoated pH electrode as a sensor ( 16 ) - both sensors are equipped with an integrated reference sensor ( 17 ) used - existing biosensor system ( 7 ) in the measuring cell ( 5 ) angeord net. As the next preparatory steps for penicillin determination in fermentation solutions, the concentration of a mineral acid required to determine the correction factor and then the suitable buffer capacity for the calibration buffer are determined by titration of fermentation solutions. All other work steps - except for the dosing processes, which are not the subject of this measuring device according to the invention, but can certainly be integrated into the automatic measuring sequence - are carried out with the aid of the measuring time device ( 18 ), the time sequence control ( 19 ), the measuring sequence control ( 20 ), and the sample detection system ( 21 ) and the calibration and measuring process control ( 22 ) automatically or are executed according to vi suellen and via the computer-aided control and evaluation unit ( 3 ) controlled instructions. All measuring steps described below are subject to a programmed measuring sequence, which is controlled by the measuring sequence controller ( 20 ). At the beginning of the use of the measuring device, the measuring solution is pumped from the reservoir ( 11 ) with the aid of the metering pump ( 10 ) with the valve ( 9 ) and the valve ( 13 ) open via the measuring cell flow line ( 8 ) into the measuring cell ( 5 ), in the above biosensor system ( 7 ) is immersed. After filling the measuring cell ( 5 ) with the measuring solution, the checking of the basic state of the measuring sensors ( 15 ) and ( 16 ) begins. If the output potentials of the measuring sensors ( 15 ) and ( 16 ) are not constant, the measuring cell is emptied, filled again and the measuring sensors ( 15 ) and ( 16 ) are automatically equilibrated until the output potentials are constant. If this does not succeed with five of the flushing processes described, parts of the measuring device ( 27 ) or ( 28 ) are given the command "sensor change". In the case of constant output potentials, the command "input of the measuring time" is given, which is carried out via the data input unit ( 4 ). Depending on the activity state of the sensor ( 15 ) coated with penicillinase, when measuring penicillin in fermentation solutions the measuring time is in the range of two to five seconds and is in this area via the data input unit ( 4 ) of the measuring time device ( 18 ) of the control and also to communicate the evaluation unit ( 3 ) in which it is stored for the subsequent measurement processes. The next step in the measurement process is the determination of the correction factor for the biosensor system ( 7 ). For this purpose, 50 µl of a 10 -2 normal hydrochloric acid solution are added to the measurement solution after the command has been issued. Immediately after the first potential changes have been detected by the sample detection system ( 21 ), which is connected to the sensors ( 15 ) and ( 16 ) via the analog-digital converter ( 2 ), the start of the measurement time is determined by the time integrated in the measurement time device ( 18 ) sequence control ( 19 ) triggered. After the programmed measuring time has elapsed, the measuring process - also by the time control ( 19 ) - is aborted. The resulting measurement signals then arrive in the measured value recording system ( 23 ), from where they are called up by the device for processing measured values and generating results ( 24 ) to calculate the correction factor. The correction factor determined here is first stored in the buffer ( 25 ). After determining the correction factor, the measuring cell is automatically emptied with the valve ( 9 ) and the valve ( 13 ) closed and filled with measuring solution in order to reach the basic state of the sensors ( 15 ) and ( 16 ) again. If the output potentials are not reached after five flushing processes, the "sensor change" command is issued again and the measuring process is repeated from the beginning. When the basic potential conditions are reached, the measuring system ( 1 ), strictly speaking the measuring cell ( 5 ) with the biosensor system ( 7 ), is calibrated with a defined penicillin concentration using the calibration and measuring process control ( 22 ). For this purpose, after the command has been issued, the calibration concentration of penicillin G is first communicated to the control and evaluation unit ( 3 ) via the data input unit ( 4 ), where it is stored in the intermediate store ( 25 ). The subsequent request for calibration sample dosing is carried out by adding 50 μl of a calibration solution, which is a 1 × 10 -2 molar phosphate buffer with a pH of 7.0 with 30 mM penicillin G, to the measurement solution in the measuring cell ( 5 ). The magnetic stirrer ( 6 ) mixes the measuring solution now containing penicillin, and the penicillin G penetrates into the enzyme membrane of the sensor ( 15 ), where due to the biocatalytic reaction the penicillin G is converted within the programmed measuring time and thus a pH Change in the enzyme membrane is caused. The second measuring sensor ( 16 ) has no function during the calibration process, since it can generally be assumed that the measuring solution and the calibration solution have the same pH. In the same way as described for the determination of the correction factor, immediately after detection of the first potential changes on the sensor ( 15 ) by the sample detection system ( 21 ) the start of the measurement is started and the measurement time is also ended. At the end of the measuring time there is a pH value change corresponding to the penicillin concentration or a voltage corresponding to this, which is recorded by the measured value recording system ( 23 ) and also stored in the buffer ( 25 ) as a measurement signal for the calibration concentration. As described above, the next automatic measuring sequence steps are again the rinsing processes for obtaining the basic state of the measuring sensor ( 15 ), including the possibly required command for "sensor change" with subsequent "input of the measuring time" as a new measuring sequence start with a new biosensor system ( 7 ). The calibration process can simultaneously be combined with the determination of the activity state of the sensor ( 15 ), which is necessary because of the inevitable loss of activity of the enzyme layer. For this purpose, a minimum value of the voltage to be achieved for the calibration concentration of penicillin G was entered and stored in a detection system ( 26 ) following the calibration and measurement process control ( 22 ) for the activity state of the sensor ( 15 ). If this voltage value is not reached after the calibration solution has been added to the measurement solution, the first step is the command via the measuring device parts ( 27 ) or ( 28 ) "doubling the volume of the calibration solution". This means that with 50 µl of a 10 -2 normal hydrochloric acid and 100 µl calibration solution volume, the measurement sequence is repeated from "entering the measurement time". If the value for the specified minimum voltage is still not reached, the "sensor change" command is issued again.
Erst nach der beschriebenen Ermittlung des Korrekturfaktors und Kalibrierung des Meßsystems (1) ist die quantitative Bestimmung von Penicillin G in Fermentationslösungen mög lich. Dazu werden auf den Befehl "Probendosierung" 50 µl (bei Kalibrierung mit 100 µl Kalibrierlösung 100 µl) Fer mentationslösung zur Meßlösung dosiert, wobei bei der wei teren Beschreibung des Meßablaufes davon ausgegangen wird, daß der pH-Wert der Fermentationslösung von dem der Meß lösung abweicht. Durch den Sensor (15) wird nach der Pro benzugabe zur gerührten Meßlösung die durch die biokataly tische Reaktion verursachte pH-Wert- bzw. Spannungsänderung und die pH-Wert- bzw. Spannungsdifferenz zwischen Meßlösung und Fermentationslösung in der gleichen Weise gemessen, wie es bei der Bestimmung des Korrekturfaktors und der Darstellung des Kalibriervorganges beschrieben wurde. Der Gesamtspannungswert vom Sensor (15) wird vom Meß wertaufnahmesystem (23) aufgenommen und danach im Zwischen speicher (25) abgelegt. Gleichzeitig mit der Erfassung der Spannungssignale am Sensor (15) wird am Sensor (16) allein die pH-Wertdifferenz bzw. die ihr entsprechende Spannungsdifferenz zwischen Meßlösung und Fermentations lösung gemessen, die auch im Zwischenspeicher (25) abge legt wird. Nach Abruf aus dem Zwischenspeicher (25) wird durch die Vorrichtung (24) die Differenz aus den Meßsig nalen des Sensors (15) und des Sensors (16) gebildet, und dieser Wert wird ebenfalls im Zwischenspeicher (25) abgelegt.Only after the described determination of the correction factor and calibration of the measuring system ( 1 ) is the quantitative determination of penicillin G in fermentation solutions possible. For this purpose, 50 µl (with calibration with 100 µl calibration solution, 100 µl) fermentation solution are metered to the measurement solution on the command "sample dosing", whereby it is assumed in the further description of the measurement process that the pH value of the fermentation solution is that of the measurement solution deviates. By the sensor ( 15 ) after the addition of gas to the stirred measuring solution, the pH or voltage change caused by the biocatalytic reaction and the pH or voltage difference between the measuring solution and fermentation solution are measured in the same way as for the determination of the correction factor and the representation of the calibration process has been described. The total voltage value from the sensor ( 15 ) is recorded by the measured value recording system ( 23 ) and then stored in the intermediate store ( 25 ). Simultaneously with the detection of the voltage signals on the sensor ( 15 ) on the sensor ( 16 ) alone the pH value difference or the voltage difference corresponding to it between the measurement solution and the fermentation solution is measured, which is also stored in the buffer ( 25 ). After retrieval from the buffer store ( 25 ), the device ( 24 ) forms the difference between the measurement signals from the sensor ( 15 ) and the sensor ( 16 ), and this value is also stored in the buffer store ( 25 ).
Nach Beendigung des Meßvorganges mit der penicillinhaltigen Fermentationslösungsprobe werden wieder die oben be schriebenen Spülvorgänge zum Erlangen der Grundzustände der Meßsensoren (15) und (16) automatisch ausgeführt, wobei nachfolgend in Abhängigkeit von den angezeigten Befehlen entweder die nächste penicillinhaltige Fermentations probe vermessen wird oder wegen zu niedrigem Aktivitäts zustand des Sensors (15) infolge Aktivitätsverlustes in der Enzymmembran bei zu langem Meßeinsatz neu kalibriert bzw. ein Sensorwechsel vorgenommen werden muß. Kürzere Meßunterbrechungen von größer als fünf Minuten werden durch die Meßablaufsteuerung (20) der Steuer- und Auswerteeinheit (3) automatisch mit der Überprüfung der Grundzustände der Meßsensoren (15) und (16) beantwortet und solche Meßunter brechungen von mehr als sechzig Minuten grundsätzlich mit einem neuen Meßbeginn durch den Befehl "Eingabe der Meßzeit" mit den sich anschließenden, beschriebenen Meßabläufen.After the end of the measuring process with the penicillin-containing fermentation solution sample, the rinsing processes described above for achieving the basic states of the measuring sensors ( 15 ) and ( 16 ) are automatically carried out again, depending on the commands displayed either the next penicillin-containing fermentation sample being measured or because of low activity state of the sensor ( 15 ) as a result of loss of activity in the enzyme membrane if the measurement is too long, or a sensor change must be carried out. Shorter interruptions in measurement of more than five minutes are automatically answered by the measurement sequence control ( 20 ) of the control and evaluation unit ( 3 ) by checking the basic states of the measurement sensors ( 15 ) and ( 16 ), and such measurement interruptions of more than sixty minutes are generally answered with one new start of measurement with the command "Enter the measurement time" with the subsequent described measurement sequences.
Durch die Meßablaufsteuerung (20) wird auch nach einer über die Dateneingabeeinheit (4) programmierten und damit frei wählbaren Zeit, vorteilhafterweise aber nach 60 Minuten, der Befehl zur Neukalibrierung des Meßsystems (1) gegeben. Weiter gehört zum durch die Meßablaufsteuerung (20) ge steuerten Meßablaufprogramm, daß nach jedem über die Daten eingabeeinheit (4) vorzunehmenden Auslösen eines Meß vorganges die Meßzelle zunächst geleert und wieder mit Meßlösung gefüllt wird. Die Berechnung der in der Fermen tationslösung enthaltenen Penicillinkonzentration wird durch die in die Steuer- und Auswerteeinheit (4) integrierte Vorrichtung zur Meßwertverarbeitung und Ergebnisbildung (24) übernommen, die dazu die im Zwischenspeicher (25) abgespeicherten Werte des Korrekturfaktors für das Bio sensorsystem (7) und die Differenzwerte als Ergebnis der Probenmessungen abruft. Der Wert des Korrekturfaktors und die Differenzwerte werden miteinander multipliziert, so daß Spannungswerte erhalten werden, die den wahren Peni cillinkonzentrationen in der Fermentationslösung ent sprechen. Gleichzeitig mit der Berechnung wird durch das Meßvorrichtungsteil (24) der Spannungswert für die Kalibrierkonzentration von 30 mM Penicillin G pro Liter Kalibrierpuffer aus dem Zwischenspeicher (25) abgerufen und im letzten Berechnungsschritt das Ergebnis der Kon zentrationsbestimmung von Penicillin G in Fermentations lösungen durch einen Vergleich des gemessenen und korrigier ten Spannungswertes mit dem Spannungswert für die bekannte Kalibrierkonzentration ermittelt. Dieses durch Vergleich erhaltene Meßergebnis wird zum Abschluß des Meßvorganges über das Anzeigegerät (27) digital oder über das Dokumen tationsgerät (28), das ein Drucker oder Monitor sein kann, in Konzentrationseinheiten pro Volumeneinheit - aber auch nach entsprechender Kalibrierung oder Umrechnung ein Akti vitätseinheiten pro Volumeneinheit - angezeigt bzw. ausge geben. Mit der beschriebenen Meßvorrichtung wurden bei der Penicillinbestimmung folgende Leistungsparameter erreicht:The measuring sequence control ( 20 ) also gives the command for recalibration of the measuring system ( 1 ) after a time programmed and thus freely selectable via the data input unit ( 4 ), but advantageously after 60 minutes. Next to the measuring sequence control ( 20 ) controlled measuring sequence program that after each data input unit ( 4 ) to be triggered triggering a measuring process, the measuring cell is first emptied and filled again with measuring solution. The calculation of the penicillin concentration contained in the fermentation solution is carried out by the device for measurement value processing and result generation ( 24 ) integrated in the control and evaluation unit ( 4 ), which for this purpose stores the values of the correction factor for the bio sensor system ( 7 ) stored in the buffer ( 25 ) ) and retrieves the difference values as a result of the sample measurements. The value of the correction factor and the difference values are multiplied with one another, so that voltage values are obtained which correspond to the true peni cillin concentrations in the fermentation solution. Simultaneously with the calculation, the voltage value for the calibration concentration of 30 mM penicillin G per liter of calibration buffer is called up from the buffer ( 25 ) by the measuring device part ( 24 ) and in the last calculation step the result of the concentration determination of penicillin G in fermentation solutions by comparing the measured and corrected voltage value determined with the voltage value for the known calibration concentration. This measurement result obtained by comparison is digitally at the end of the measuring process via the display device ( 27 ) or via the documentation device ( 28 ), which can be a printer or monitor, in concentration units per unit volume - but also after appropriate calibration or conversion, one activity unit per Volume unit - displayed or output. With the measuring device described, the following performance parameters were achieved when determining penicillin:
- - Ansprechzeit des Biosensorsystems (7): 2 bis 5 Sekunden- Response time of the biosensor system ( 7 ): 2 to 5 seconds
- - Meßzeit für eine Meßprobe einschließlich Eich- und Spülvorgänge: 15 bis 20 Sekunden- Measuring time for a sample including calibration and rinsing processes: 15 to 20 seconds
- - Variationskoeffizient (20 Proben): 2%- Coefficient of variation (20 samples): 2%
- - Geradengleichung für den Methodenvergleich (Regressionsanalyse für 25 Proben): Y = (1,017 ± 0,049) × -(1,135 ± 1,180)- Line equation for the method comparison (regression analysis for 25 samples): Y = (1.017 ± 0.049) × - (1.135 ± 1.180)
- - Korrelationskoeffizient: r (xy) = 0,9911.- Correlation coefficient: r (xy) = 0.9911.
Die erfindungsgemäße Meßvorrichtung wird benutzt zur Be stimmung von Harnstoff in Serum. Meßprinzip und Meßablauf entsprechen den in Beispiel 1 beschriebenen. Die pH-sen sitive Oberfläche des Meßsensors (15) des Biosensorsystems (7) wurde mit Urease beschichtet, während der Meßsensor (16) auch in diesem Falle unbeschichtet bleibt. Als Meß lösung wird eine von der Dialyse mit der künstlichen Niere her bekannte Dialyselösung verwendet, deren pH-Wert 7,4 ist. Der Korrekturfaktor für das Biosensorsystem (7) wird mit einer 0,015 n Natronlauge bestimmt. Kalibriert wird das Meßsystem (1) mit einer 10 millimolaren Harnstoffkali brierlösung. Folgende Leistungsparameter wurden bei der Harnstoffbestimmung erreicht:The measuring device according to the invention is used to determine urea in serum. The measuring principle and measuring sequence correspond to those described in Example 1. The pH-sensitive surface of the measuring sensor ( 15 ) of the biosensor system ( 7 ) was coated with urease, while the measuring sensor ( 16 ) also remains uncoated in this case. A dialysis solution known from dialysis with the artificial kidney is used as the measuring solution, the pH of which is 7.4. The correction factor for the biosensor system ( 7 ) is determined with a 0.015 N sodium hydroxide solution. The measuring system ( 1 ) is calibrated with a 10 millimolar urea potassium brine solution. The following performance parameters were achieved when determining urea:
- - Ansprechzeit des Biosensorsystems (7): 10 bis 15 Sekunden- Response time of the biosensor system ( 7 ): 10 to 15 seconds
- - Meßzeit für eine Meßprobe: 30 Sekunden- Measuring time for a test sample: 30 seconds
Die analytischen Parameter entsprechen denen des Beispiels 1. The analytical parameters correspond to those of Example 1.
Die erfindungsgemäße Meßvorrichtung wird benutzt zur Be stimmung von Disacchariden in Gegenwart von Glukose. Bei der Saccharosebestimmung in Gegenwart von Glukose sieht das Biosensorsystem (7) wie nachfolgend beschrieben aus.The measuring device according to the invention is used to determine disaccharides in the presence of glucose. When determining sucrose in the presence of glucose, the biosensor system ( 7 ) looks as described below.
Die Meßsensoren (15) und (16) sind Sauerstoff oder seine Reduktionsprodukte messende Sensoren mit Referenzsensor (17) und mit entsprechenden, die Meßsignale bildenden, kommerziellen Bauteilen. Der Meßsensor (15) ist be schichtet mit einer Enzymmembran, die Saccharose (Invertase), Mutarotase und Glukoseoxidase enthält, der Sensor (16) hingegen ist nur mit einer Glukoseoxidase enthalten den Membran, die gegebenenfalls noch Mutarotase enthalten kann, beschichtet. Als Meßlösung dient ein Phosphatpuffer (0,1 mol/l) vom pH-Wert im Bereich von 6 bis 7,5. Der Korrekturfaktor für das Biosensorsystem (7) wird mit einer Glukoselösung (10 mM) bestimmt und kalibriert wird mit einer Saccharoselösung (10 mM). Zur Ergebnisbildung wird die 1. Ableitung des Stromes nach der Zeit des Maximal wertes des Meßstromes als Meßsignal herangezogen. Inner halb von 10 bis 15 Sekunden steht das Meßergebnis zur Verfügung, und die Gesamtmeßzeit für eine Meßprobe beträgt weniger als 30 Sekunden.The measuring sensors ( 15 ) and ( 16 ) are oxygen or its reduction products sensors with a reference sensor ( 17 ) and with corresponding commercial components forming the measuring signals. The measuring sensor ( 15 ) is coated with an enzyme membrane containing sucrose (invertase), mutarotase and glucose oxidase, the sensor ( 16 ), on the other hand, is only coated with a glucose oxidase containing the membrane, which may also contain mutarotase. A phosphate buffer (0.1 mol / l) with a pH in the range from 6 to 7.5 is used as the measurement solution. The correction factor for the biosensor system ( 7 ) is determined with a glucose solution (10 mM) and calibrated with a sucrose solution (10 mM). The first derivative of the current after the time of the maximum value of the measuring current is used as the measuring signal to form the result. The measurement result is available within 10 to 15 seconds and the total measurement time for a measurement sample is less than 30 seconds.
Biosensorsysteme (7) der Meßvorrichtung mit gleichen Leistungsparametern können zur Bestimmung anderer Disaccharide wie Laktose oder Maltose herangezogen werden, wenn die Enzymzusammensetzung des Sensors (15) verändert wird bei unverändertem Sensor (16). Zur Bestimmung von Laktose besteht die Enzymmembran des Meßsensors (15) aus den immobilisierten Enzymen β-Galaktosidase, Mutarotease und Glukoseoxidase und für die Maltosebestimmung aus den immobilisierten Enzymen Glukoamylase, Mutarotase und Glukoseoxidase, während der Meßsensor (16) wie beim Bei spiel der Saccharosebestimmung aufgebaut ist.Biosensor systems ( 7 ) of the measuring device with the same performance parameters can be used to determine other disaccharides such as lactose or maltose if the enzyme composition of the sensor ( 15 ) is changed with the sensor ( 16 ) unchanged. To determine lactose, the enzyme membrane of the measuring sensor ( 15 ) consists of the immobilized enzymes β- galactosidase, mutarotease and glucose oxidase and for the determination of maltose from the immobilized enzymes glucoamylase, mutarotase and glucose oxidase, while the measuring sensor ( 16 ) is constructed as in the example of sucrose determination is.
Verwendete Bezugszeichen zur Fig. 1Reference numerals used for FIG. 1
1 = Meßsystem
2 = Analog-Digital-Wandler
3 = Steuer- und Auswerteeinheit
4 = Dateneingabeeinheit
5 = Meßzelle
6 = Rührer
7 = Biosensorsystem
8 = Meßzellenzuflußleitung
9 = Ventil
10 = Dosiervorrichtung
11 = Vorratsbehälter für die Meßlösung
12 = Meßzellenabflußleitung
13 = Ventil
14 = Absaugvorrichtung
15 = Sensor 1
16 = Sensor 2
17 = Referenzsensor
18 = Meßzeiteinrichtung
19 = Zeitablaufsteuerung
20 = Meßablaufsteuerung
21 = Probenerkennungssystem
22 = Kalibrier- und Meßvorgangssteuerung
23 = Meßwertaufnahmesystem
24 = Vorrichtung zur Meßwertverarbeitung und Ergebnisbildung
25 = Zwischenspeicher
26 = Erkennungssystem für Aktivitätszustand des Biosensorsystems (7)
27 = Anzeigegerät
28 = Dokumentationsgerät
29 = Stromversorgungssystem
30 = Gerätegehäuse
→ = elektrische Leitungen
← = elektrische Leitungen 1 = measuring system
2 = analog-digital converter
3 = control and evaluation unit
4 = data entry unit
5 = measuring cell
6 = stirrer
7 = biosensor system
8 = measuring cell inflow line
9 = valve
10 = dosing device
11 = storage container for the measuring solution
12 = measuring cell drain line
13 = valve
14 = suction device
15 = sensor 1
16 = sensor 2
17 = reference sensor
18 = measuring time device
19 = timing control
20 = measurement sequence control
21 = sample detection system
22 = calibration and measuring process control
23 = measurement recording system
24 = device for processing measured values and generating results
25 = buffer
26 = detection system for the state of activity of the biosensor system ( 7 )
27 = display device
28 = documentation device
29 = power supply system
30 = device housing
→ = electrical cables
← = electrical cables
Claims (8)
anschließend die Meßzelle geleert und erneut mit Meß lösung zur Herstellung der konstanten Grundzustände der Sensoren gefüllt wird, gegebenenfalls die Sensoren nach fünfmaligem Füllen und Leeren der Meßzelle infolge nicht konstanter Grundzustände zum Wechseln angezeigt werden und der Meßvorgang von Beginn an wiederholt wird, daß bei Erreichen konstanter Grundzustände die Meßzelle zur Kali brierung mit der Lösung definierter Mengen an zu bestimmen den Substraten der Biokatalysatoren zwischen 2 und 50 mmol Substrat pro Liter mit Meßlösung gefüllt wird, die Kali brierwerte über die Dateneingabeeinheit der Steuer- und Auswerteeinheit mitgeteilt und im Zwischenspeicher abge legt werden, daß nach Zudosierung der Kalibrierlösung die die Substrate der Biokatalysatoren enthaltende Meßlösung durchmischt wird, durch das Probenerkennungssystem der Meßbeginn gestartet und die Meßzeit auch beendet wird, die Meßsignale für die Kalibrierkonzentration durch das Meßwertaufnahmesystem aufgenommen und ebenfalls im Zwischen speicher abgelegt werden,
daß anschließend die Grundzustände der Sensoren des Meß systems durch bis zu fünfmaliges Spülen mit der Meßlösung, gegebenenfalls durch Sensorwechsel, wieder hergestellt werden, gegebenenfalls der Kalibriervorgang mit der Bestimmung des Aktivitätszustandes der Biosensoren des Meßsystems verbunden wird, wobei ein zu erreichender Mindestwert der elektrischen Meßsignale für die Kalibrier konzentration der Kalibrierlösung, der ebenfalls im Zwischen speicher abgespeichert ist, durch das Probenerkennungs system mit dem gemessenen Signal für die Kalibrierkonzentration verglichen wird und bei Nichterreichen dieses Mindest wertes die Aufforderung zum Wechsel der Biosensoren des Meß systems erfolgt, daß bei Vorliegen eines ausreichenden Aktivitätszustandes der Biosensoren dann die Probendosierung der zu bestimmenden Substrate der Biokatalysatoren zur Meßlösung erfolgt, diese durchmischt wird, die wie oben beschrieben erhaltenen Werte der elektrischen Meßsignale nach Probenzugabe für den ersten und zweiten Sensor vom Meßwertaufnahmesystem aufgenommen werden, durch eine Vor richtung zur Meßwertverarbeitung und Ergebnisbildung da raus die Differenz aus den Meßsignalen vom ersten Sensor und zweiten Sensor gebildet wird und dieser Differenzwert aus den Meßsignalen beider Sensoren im Zwischenspeicher abgelegt wird, daß danach die Berechnung der Konzentration der Substrate der Biokatalysatoren in der Meßlösung erfolgt, indem durch die in die Steuer- und Auswerteeinheit integrierte Vorrichtung zur Meßwertverarbeitung und Ergebnisbildung aus dem Zwischenspeicher die Werte für die Korrekturfaktoren und die Differenzwerte als Ergebnis der Probenmessungen abgerufen werden, beide Werte miteinander multipliziert werden, diese den zu bestimmenden Konzentrationen der Substrate der Biokatalysatoren entsprechenden, korrigierten Meßsignalwerte mit den Meßsignalwerten für die Kalibrier konzentrationen verglichen werden und daß die auf diese Weise ermittelten Konzentrationswerte für die Substrate von Biokatalysatoren in Probelösungen über ein Anzeigegerät digital oder über ein Dokumentationsgerät in Konzentrations einheiten pro Volumeneinheit, gegebenenfalls nach ent sprechender Eichung auch in Aktivitätseinheiten pro Volumen einheit oder Mengeneinheit, angezeigt beziehungsweise ausgegeben werden.7. The method for automatically determining the concentration of substrates of biocatalysts by means of a measuring device with a biosensor system, the biosensors immersed in a buffered measuring solution with immobilized biocatalysts, according to claim 6, characterized in that the measuring solution based on a buffer concentration of 2.0 is set to 10 -5 mol / l with a pH near the pH optimum of the immobilized biocatalyst, is pumped from a storage container into a measuring cell, the process for achieving constant electrical output signals from the sensors, if necessary, up to five times repeated in alternation with emptying the measuring cell and, if necessary, a sensor change is signaled in the case of non-constant output signals, that in the case of constant output signals the measuring time is communicated via a data input unit to a measuring time device and a control and evaluation unit, that subsequently a determination is made s correction factor for a different response behavior of the sensors of the measuring system, the solution of an interfering substance is added to the measuring solution, the measuring solution is mixed and after detection of the first measuring signal changes at the sensors by a sample detection system, which with the sensors of the measuring system via an analog-digital -Converter is connected, the start of the measuring time is triggered by a timing control integrated in the measuring time device, after the programmed measuring time the measuring process is also aborted by the timing control, the measuring signals then arrive in a measured value recording system, a correction factor for the sensor system is calculated and this is calculated in a buffer is stored,
then the measuring cell is emptied and again filled with measuring solution for producing the constant basic states of the sensors, if necessary the sensors are displayed after five filling and emptying of the measuring cell as a result of inconsistent basic states, and the measuring process is repeated from the beginning, so that when a constant is reached Basic states the measuring cell for calibration with the solution of defined amounts of the substrates of the biocatalysts between 2 and 50 mmol substrate per liter is filled with measuring solution, the calibration values are communicated to the control and evaluation unit via the data input unit and stored in the buffer, that after the calibration solution has been metered in, the measurement solution containing the substrates of the biocatalysts is mixed, the start of the measurement is started by the sample recognition system and the measurement time is also ended, the measurement signals for the calibration concentration are recorded by the measurement value measuring system and also stored in the clipboard,
that the basic states of the sensors of the measuring system are then restored by rinsing with the measuring solution up to five times, if necessary by changing the sensor, if necessary the calibration process is connected to the determination of the activity state of the biosensors of the measuring system, with a minimum value to be achieved for the electrical measuring signals for the calibration concentration of the calibration solution, which is also stored in the buffer, is compared by the sample detection system with the measured signal for the calibration concentration and, if this minimum value is not reached, the request to change the biosensors of the measuring system is made so that if there is a sufficient activity status the biosensors then the sample dosing of the substrates to be determined of the biocatalysts to the measurement solution is carried out, this is mixed, the values of the electrical measurement signals obtained as described above after sampling Abe for the first and second sensor are recorded by the measured value recording system, by means of a device for processing measured values and generating results, since the difference between the measured signals from the first sensor and the second sensor is formed and this difference value from the measured signals of both sensors is stored in the buffer memory, that after that The calculation of the concentration of the substrates of the biocatalysts in the measurement solution is carried out by calling up the values for the correction factors and the difference values as a result of the sample measurements by the device for measurement value processing and result formation integrated in the control and evaluation unit, multiplying both values together are, these to be determined corresponding concentrations of the substrates of the biocatalysts, corrected measurement signal values are compared with the measurement signal values for the calibration concentrations and that the Kon Concentration values for the substrates of biocatalysts in test solutions can be displayed or output digitally via a display device or via a documentation device in concentration units per volume unit, if necessary after appropriate calibration also in activity units per volume unit or unit of measure.
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