DE4026564C2 - - Google Patents

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines zweidimensionalen Verteilungsbildes einer Ionenkonzentration, insbesondere einer Kalziumionenkonzentration und einer Wasserstoffionenkonzentra­ tion, in einer Zelle unter Verwendung eines Fluores­ zenzmikroskopsystems, in dem ein Fluoreszenzreagenz als eine Probe eingesetzt wird. Dieses Verfahren soll eine deutliche Anzeige eines Bildes einer Zel­ lenkontur und eine Anzeige des zweidimensionalen Verteilungs­ bildes der Ionenkonzentration im genauen Lageverhältnis mit der Zellenkontur ermöglichen.
Seit kurzem werden auf dem Gebiet der Biochemie der Nerven­ zellen (Neurologie) und der Zellbiologie Verfahren zur Be­ stimmung der Konzentration von freien Kalziumionen in einer lebenden Zelle in großem Umfang eingesetzt, um die metaboli­ schen Funktionen einer Zelle zu studieren. In diesem Verfah­ ren wird ein geeignetes Fluoreszenzreagenz (im folgenden als "Fluoreszenzprobe" bezeichnet), welches in der Lage ist, als eine Probe für die Untersuchung einer Zielsubstanz zu die­ nen, in eine lebende Zelle eingeführt. Auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität der Probe wird die Konzentration einer chemischen Zielspezies festgelegt. Dieses Verfahren wird durchgeführt, um verschiedene Arten von Ionen in einer Zelle zu untersuchen, wie beispielsweise Kalziumionen, Natrium­ ionen, Magnesiumionen und Chlorionen oder Makromoleküle.
Das Untersuchungsprinzip soll nun im folgenden erläutert werden.
Wenn die Fluoreszenzprobe sich mit einer bestimmten zu un­ tersuchenden Substanz verbunden hat, wird sich ihr Fluores­ zenzspektrum oder ihr Anregungsspektrum ändern. Der Betrag der Änderung hängt von dem Maß der Konzentration der Sub­ stanz ab. Folglich wird die Fluoreszenzintensität der Probe mittels eines Fluoreszenzspektrophotometers oder eines Fluo­ reszenzmikroskopes gemessen, wobei die Konzentration der be­ stimmten Substanz auf der Grundlage der Änderung des Spek­ trums bestimmt werden kann. Zum Beispiel wird, wenn Kal­ ziumionen in einer Zelle bestimmt werden sollen, fura-2® als Fluoreszenzprobe eingegeben und die Änderung im Anregungs­ spektrum, welche durch die spezifische Verbindung zwischen der Probe und den Kalziumionen verursacht wurde, gemes­ sen. Wenn ein Fluoreszenzmikroskop verwendet wird, muß dabei beachtet werden, daß die Änderung der Fluoreszenzintensität nicht bezüglich des vollständigen Fluoreszenzbildes gemessen wird, sondern bezüglich eines spezifischen kleinen kreisför­ migen Bereiches des Fluoreszenzbildes.
Gemäß dem obigen Verfahren kann die Konzentration von Kal­ ziumionen in einem spezifischen kleinen Bereich einer Zelle leicht festgelegt werden, wohingegen es große Schwierigkei­ ten verursacht, die Konzentrationsverteilung von Kalzium­ ionen in einem relativ großen zweidimensionalen Bereich her­ auszufinden. Um eine derartige Konzentrationsverteilung zu erhalten, ist es nötig, Proben bei vielen Punkten zu nehmen, was einen großen Zeit- und Arbeitsaufwand erfordert. Dem­ gegenüber ist es aber auf den Gebieten der Neurologie und Zellbiologie sehr wichtig, die Verteilung von Kalziumionen­ konzentrationen in einem relativ großen Bereich, z. B. über mehrere Zellen, herauszufinden. Unter Berücksichtigung der oben beschriebenen Situation gibt es daher einen Bedarf an einem verbesserten Verfahren, um eine zweidimensionale Kon­ zentrationsverteilung durch gleichzeitiges Messen der Kon­ zentration einer zu untersuchenden Zielsubstanz in einem re­ lativ großen zweidimensionalen Bereich leicht zu erhalten.
Einen Lösungsvorschlag für das oben angesprochene Problem macht die EP-A 03 39 582. Dort wird ein Fluoreszenzmikroskopsystem vorgeschlagen, welches mit einer Bildverarbeitungstech­ nik kombiniert ist. Auf die Offenbarung dieser Patentanmel­ dung wird in der Beschreibung vollinhaltlich Bezug genommen. Die Verwen­ dung dieses Fluoreszenzmikroskopsystems macht es möglich, eine intrazelluläre Ionenkonzentrationsverteilung in einem relativ großen zweidimensionalen Bereich leicht zu erhalten. Dieser Typ des Fluoreszenzmikroskops wird in einer bevorzug­ ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet und ist in der nachfolgenden Figurenbeschreibung näher beschrieben.
Indessen treten selbst bei der Verwendung des oben beschrie­ benen Fluoreszenzmikroskopsystems die folgenden Probleme bei dem konventionellen Verfahren zum Erhalten einer zweidimen­ sionalen Verteilung der intrazellulären Ionenkonzentration auf.
Wenn die physiologische Funktion einer Zelle untersucht wird, ist es sehr wichtig, Daten darüber zu erhalten, in welchem Teil der Zelle die Konzentration von freien Kalziumionen zu­ nimmt oder abnimmt. Indessen beinhaltet ein Fluoreszenzin­ tensitätsbild, welches mittels eines herkömmlichen Verfah­ rens erhalten wird, grundsätzlich nur Daten bezüglich einer Ionenkonzentration und keine Daten bezüglich des Lagever­ hältnisses zwischen der Ionenkonzentration und der Zelle. Daher ist es nicht möglich, selbst wenn das erhaltene Fluores­ zenzintensitätsbild bildverarbeitet wird, ein Bild zu erhal­ ten, in dem die Ionenkonzentrationsverteilung mit der Kontur der Zelle in Verbindung gebracht wird.
Zusätzlich beinhaltet das erhaltene Fluoreszenzintensitäts­ bild "Hintergrundfluoreszenz" von außerhalb der Zelle. Um eine zweidimensionale Konzentrationsverteilung von zu unter­ suchenden Ionen zu erhalten, muß daher die Hintergrundfluo­ reszenz von dem Fluoreszenzintensitätsbild subtrahiert wer­ den. Indessen ist es aber schwierig, den genauen Betrag der Hintergrundfluoreszenz objektiv zu bestimmen. Gemäß dem her­ kömmlichen Verfahren bestimmt der Experimentator den Wert des Hintergrundpegels empirisch auf der Grundlage eines Pro­ fils eines Fluoreszenzintensitätsbilds. Daher ist die Grund­ lage für die Bestimmung des Wertes des Hintergrundpegels un­ bestimmt und variiert von Experimentator zu Experimentator. Es ist daher bei den bekannten Verfahren schwierig, die Ionenkonzentration präzise zu bestimmen.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfah­ ren zur Herstellung eines zweidimensionalen Verteilungsbild der Ionenkonzentration von bestimm­ ten Ionen innerhalb einer Zelle in bezug auf die Zellenkon­ tur zu schaffen.
Diese Aufgabe wird gemäß der vorliegenden Er­ findung durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zur Festlegung des Hinter­ grundfluoreszenzwerts nicht nur ein Profil eines Fluoreszenzintensitätsbildes verwendet, sondern es wird des weiteren ein Profil des Zellbildes, welches aus der Gruppe bestehend aus einem Hellfeldbild, einem Phasenkontrastbild, einem Nomarskidifferentialinterferenzkontrastbild und einem Polarisationsbild ausgewählt wurde, als ein Referenzbild verwendet. Daher kann auf die subjektive Entscheidung eines Experimentators verzichtet und der Hintergrundfluo­ reszenzwert objektiv und genau festgelegt werden. Somit kann die Ionenkonzentration und die Konzentrationsverteilung exakt ermittelt werden.
Zusätzlich wird, da das zweidimensionale Konzentrationsbild von den zu untersuchenden Ionen mit dem Zellbild überlagert wird, das Verhältnis zwischen der Konzentrationsverteilung und der Zellstruktur klarer. Daher wird deutlich, welcher Teil einer Zelle welcher Ionenkonzentration bei jedem Punkt des Konzentrationsverteilungsbildes entspricht.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, daß das Verfahren eine objektive Bestimmung des Pegels des Hintergrundfluores­ zenzlichtes und eine exakte Messung der Ionenkonzentration ermöglicht.
Weitere Einzelheiten, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen.
Es zeigen:
Fig. 1 bis 4 Graphiken, um das Prinzip eines Ionen­ konzentrationsbestimmungsverfahrens zu erläutern, bei dem eine Fluoreszenzprobe verwendet wird;
Fig. 5 ein Flußdiagramm, um ein Verfahren zum Überlagern von Bildern in der vorliegenden Erfindung zu erläu­ tern;
Fig. 6 und 7 Ansichten, um ein Fluoreszenzmikros­ kopsystem zu beschreiben, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet wird;
Fig. 8 ein Flußdiagramm, um eine Ausführungsforn der Erfin­ dung darzustellen;
Fig. 9 ein Foto, in dem ein Hellfeldbild einer Zelle darge­ stellt ist, gemäß der Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 10 ein Diagramm, um ein Verfahren zum Bestimmen eines Hintergrundfluoreszenzwertes gemäß der Ausführungsform der Erfindung zu erläutern;
Fig. 11 ein Foto, in dem ein zweidimensionales Vertei­ lungsbild von Kalziumionen dargestellt ist; und
Fig. 12 ein Foto, in dem ein überlagertes Bild aus einem Hellfeldbild und einem zweidimensionalen Vertei­ lungsbild von Kalziumionen dargestellt ist, wel­ ches mittels der Ausführungsform der vorliegen­ den Erfindung erhalten wurde.
Um ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung zu vermitteln, wird im folgenden ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration einer Zielsubstanz in einer lebenden Zelle unter Verwendung einer Fluoreszenzprobe ausführlich beschrieben.
Wie bereits zuvor beschrieben wurde, verwendet das erfin­ dungsgemäße Verfahren eine Fluoreszenzprobe, welche ein Anregungsspektrum oder ein Fluoreszenzspektrum aufweist, das in Übereinstimmung mit der Konzentration von spezifischen Ionen variiert. Zum Beispiel können, wenn die Konzentration von Kalziumionen bestimmt werden soll, kommerziell erhältli­ che Fluoreszenzreagenzien als Fluoreszenzproben verwendet werden, welche unter den Handelsnamen fura-2, Quin-2 und Indo-1 bekannt sind.
Die Fluoreszenzreagenz fura-2® wird durch die unten gezeigte Strukturformel (I) beschrieben. Die Reagenz weist eine freie Carboxylgruppe auf, welche nicht in der Lage ist, durch eine Zellmembran einer etablierten Nervenzellenlinie (NG108, N115) oder einer etablierten Zellenlinie hindurchzutreten, welche von einer Gliazelle (C6Bu-1) abgeleitet wurde. Daher wird fura-2® in eine Testzelle in der Form von fura-2®/AM ein­ gegeben, welches ein Acetoxymethyl verestertes Derivat ist, und welches in der Lage ist, durch die Zellmembran hindurch­ zutreten. Wenn fura-2®/AM in die Zelle eingeführt ist, wird es unmittelbar metabolisiert und in fura-2® konvertiert, wel­ ches sich speziell mit Kalziumionen verbindet.
Wenn fura-2® sich mit Kalziumionen verbindet, variiert das Anregungsspektrum von fura-2® in Übereinstimnung mit der Kal­ ziumkonzentration. Das Fluoreszenzspektrum von fura-2® weist einen einzelnen Peak bei 510 nm und einen Bandpaß von 10 nm auf. Fig. 1 zeigt ein Spektrum, welches bei der Bestinmung der Fluoreszenzintensität bei 510 nm erhalten wurde, wobei ein Fluoreszenzspektrometer verwendet wurde, während sich die Wellenlänge des anregenden Lichtes ändert, in der Anwe­ senheit von Kalziumionen bei verschiedenen Konzentrationen. Wie aus Fig. 1 ersichtlich, ist die Variation der Fluores­ zenzintensität, die von der Kalziumkonzentration abhängt, bei einer Anregungswellenlänge von 340 nm am größten. Demge­ genüber wird, wenn die Wellenlänge des anregenden Lichtes 360 nm ist, eine Variation der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Kalziumkonzentration nicht beobachtet.
Zusätzlich variiert, wenn die Wellenlänge des anregenden Lichtes 380 nm ist, die Fluoreszenzintensität in einer Weise, die invers zu derjenigen ist, die bei einer Anregungswellenlänge von 340 nm beobachtet wurde.
Solange die Variation der Fluoreszenzintensität in Abhängig­ keit der Kalziumkonzentration bei verschiedenen Wellenlängen von Anregungslicht verschieden ist, ist ein Zweiwellenlängen- Bestimmungsverfahren besonders effektiv. Im einzelnen wird dabei die Fluoreszenzprobe bei zwei verschiedenen Wellenlän­ gen angeregt, und die Kalziumkonzentration wird aus dem Ver­ hältnis der Fluoreszenzintensitäten gemäß den beiden Anre­ gungswellenlängen bestimmt. Eine der beiden Anregungswellen­ längen wird auf einen Wert gesetzt, bei dem die Fluoreszen­ zintensität in ihrem größten Umfang variiert und die andere wird auf einen Wert gesetzt, bei dem die Fluoreszenzintensi­ tät nicht variiert oder invers variiert. Bei Verwendung des Zweiwellenlängen-Bestimmungsverfahrens kann die Konzentra­ tion und Dämpfung der Fluoreszenzprobe und die Variation in der Intensität des Anregungslichtes normalisiert werden. Un­ ter Bezugnahme auf Fig. 1 soll nun das Zweiwellenlängen-Be­ stimmungsverfahren, welches Anregungswellenlängen bei 340 nm und 360 nm verwendet (340 nm zum Messen des Lichtes; 360 nm für das Referenzlicht) im einzelnen beschrieben werden.
Es soll nun angenommen werden, daß die Fluoreszenzintensität I340 ist, wenn die Anregungswellenlänge 340 nm ist und die Fluoreszenzintensität I360 ist, wenn die Anregungswellen­ länge 360 nm ist. Der Wert von I340/I360 wird auf der Grund­ lage der Daten errechnet, die in Fig. 1 dargestellt sind. Der Wert variiert in einem Bereich von 0,64 bis 1,89, in Abhängigkeit der vorhandenen Kalziumkonzentration.
Wenn eine TV-Kamera zur Bestimmung verwendet wird, ist es nötig, einen dynamischen Bereich der TV-Kamera zu berück­ sichtigen, um die Zweiwellenlängenbestimmung exakt durch­ zuführen. Im einzelnen ist es nötig, da die gewünschte Ein­ gangs-/Ausgangslinearität nur in einem vorherbestimmten Dynamikbereich erhalten wird, daß der Wert von I340/I360 (der Eingang zu der Kamera) innerhalb eines Dynamikbereiches variiert, um einen genauen Ausgangswert zu erhalten. Aus diesem Grund wird die Intensität des Anregungslichtes mit­ tels eines neutralen Dichtefilters (im folgenden als "ND- Filter" bezeichnet) gesteuert und der Wert von I340/I360 wird normalisiert, so daß der mittlere Wert von I340/I360 eins wird. In Fig. 2 ist das Verhältnis zwischen den norma­ lisierten Werten von I340/I360 und der Kalziumkonzentration dargestellt. Die in Fig. 2 dargestellten Daten können als Kalibrierungskurve verwendet werden, wenn die Kalzium­ konzentration mittels eines Fluoreszenzmikroskopsystemes be­ stimmt wird.
Eine andere Fluoreszenzprobe, welche zur Bestimmung von Kal­ ziumkonzentrationen verwendet wird, ist Indo-1, das durch die unten dargestellte Strukturformel II beschrieben wird. Die Reagenz weist eine freie Carboxylgruppe auf, die nicht in der Lage ist, durch eine Zellmembran einer lebenden Zelle hindurchzutreten. Daher wird Indo-1 in eine Zellprobe in der Form von Indo-1/AM eingegeben, welches ein Acetoxymethyl verestertes Derivat ist. Es ist nicht Indo-1®/AM, sondern Indo-1®, welches durch den Metabolismus in der Zelle herge­ stellt wird, das sich spezifisch mit den Kalziumionen ver­ bindet.
Im Gegensatz zum Fall der Verwendung von fura-2® wird, wenn Indo-1® verwendet wird, das Fluoreszenzspektrum und nicht das Anregungsspektrum in Übereinstimmung mit der Kalziumkonzen­ tration variieren. In Fig. 3 ist ein Spektrum dargestellt, welches erhalten wird, wenn man Anregungslicht mit einer Wellenlänge von 340 nm auf Indo-1® in der Anwesenheit von verschiedenen Kalziumionenkonzentrationen einstrahlt. Wie man dem Spektrum entnehmen kann, ist die Variation der Fluo­ reszenzintensität in Abhängigkeit der Kalziumkonzentration dann am größten, wenn die Wellenlänge der Fluoreszenz um 410 nm herum ist. Im Gegensatz dazu wird, wenn die Wellen­ länge der Fluoreszenz 460 nm ist, eine Variation der Fluo­ reszenzintensität in Abhängigkeit der Kalziumkonzentration nicht beobachtet. Zusätzlich variiert, wenn die Wellenlänge der Fluoreszenz in einen Bereich von 460 bis 480 nm ist, die Fluoreszenzintensität in einer inversen Art und Weise als bei einer Fluoreszenzwellenlänge von 410 nm. Während die Wellenlänge des Anregungslichtes festgelegt ist, wird die Intensität der Fluoreszenz bei zwei ausgewählten Wellenlän­ gen bestimmt, wobei ein Zweiwellenlängenbestimmungsverfah­ ren, wie in dem Fall von fura-2®, durchgeführt wird. Herkömm­ licherweise werden Wellenlängen von 410 nm und 460 nm oder Wellenlängen von 410 nm und 480 nm kombiniert. Wenn eine TV- Kamera zur Bestimmung verwendet wird, wird der Wert von I410/I460 oder der Wert von I410/I480 aus denselben Gründen, wie bereits in Verbindung mit dem Fall von fura-2® erläutert, normalisiert. Des weiteren wird ein ND-Filter verwendet, um den mittleren Wert von I410/I460 oder I410/I480 auf eins zu setzen. In Fig. 4 ist das Verhältnis zwischen dem normali­ sierten Wert von I410/I460 und der Kalziumkonzentration dar­ gestellt. Die in Fig. 4 dargestellten Daten können als Kalibrierungskurve verwendet werden, wenn die Kalziumkonzen­ tration mittels eines Fluoreszenzmikroskopsystemes bestimmt werden soll.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung soll nun im folgenden beschrieben werden.
In der vorliegenden Erfindung wird der Hintergrundfluores­ zenzwert mittels Anzeige, bevorzugterweise auf einer Kathodenstrahlbildröhre oder ähnlichem, eines Profils, welches entlang einer gegebe­ nen Linie eines Fluoreszenzintensitätsverteilungsbildes er­ halten wurde, und eines Profils, welches entlang der gegebe­ nen Linie eines Zellbildes erhalten wurde, das als ein Hell­ feldbild oder ähnliches bereitgestellt wird, festgelegt.
Wie bereits weiter oben beschrieben wurde, werden das Fluores­ zenzintensitätverteilungsbild und das zweidimensionale Ionenkonzentrationsverteilungsbild mit einem Verfahren erhalten worden, welches dem Verfahren der EP-A 03 39 582 ähnelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können das zweidimensionale Konzentrationsverteilungsbild von zu untersuchenden Ionen und das Zellbild zum Beispiel mittels des Verfahrens, welches in dem Flußdiagramm von Fig. 5 dargestellt ist, in eine überlagerte Position gebracht werden.
In Schritt 1 wird ein Zellbild, welches als ein Hellfeld­ bild, ein Phasenkontrastbild, ein Nomarskidifferentialinter­ ferenzkontrastbild oder ein Polarisationsbild gebildet wurde, in ein Graustufenbild auf der Grundlage der Luminanz des Zellbildes konvertiert. Das erhaltene Graustufenbild wird auf der Anzeige einer Kathodenstrahlbildröhre angezeigt. Das zweidimensio­ nale Konzentrationsverteilungsbild (Fluoreszenzbild) der Zielionen wird mit dem Graustufenbild überlagert.
Im allgemeinen wird das Hellfeldbild, das Phasenkontrast­ bild, das Nomarskidifferentialinterferenzkontrastbild oder das Polarisationsbild nicht exakt mit dem Fluoreszenzbild überlagert sein. Um die Koordinaten der beiden Bilder koin­ zident zu machen, werden die Bilddaten des zweidimensionalen Ionenkonzentrationsverteilungsbildes einer affinen Transfor­ mation in dem Schritt 2 ausgesetzt. Im folgenden soll ange­ nommen werden, daß die Koordinaten eines Eingangsbildes (I, J) und die Koordinaten eines Ausgangsbildes (x, y) sind. Dann werden die Koordinaten (x, y) in (u, v) affin transfor­ miert, die Bildkoordinaten in (I, J) vom reellen Zahlentyp sind. Nachfolgend werden die Koordinaten (u, v) interpoliert und der interpolierte Konzentrationspegel (I′) wird bei (x, y) gespeichert. Eine Formel für die affine Transformation von Koordinaten ist gegeben durch:
u = a1x + a2y + a3
v = b1x + b2y + b3
wobei a1, a2, a3, b1, b2 und b3 beliebige Koeffizienten sind.
Die sich ergebenden transformierten Bilddaten des zweidimen­ sionalen Ionenkonzentrationsverteilungsbildes werden in Übereinstimmung mit den Ionenkonzentrationen gefärbt und mit dem Graustufenzellenbild, welches in dem Schritt 1 erhalten wurde, überlagert. In diesem Fall wird, um die Daten des Graustufenbildes aufrechtzuerhalten, welches im Schritt 1 erhalten wurde, eine Exklusiv-ODER-Verknüpfung bei den jeweili­ gen Orten der Koordinaten durchgeführt, wenn beide Bilder überlappt sind (Schritt 3). Daher wird das in Schritt 1 erhaltene Graustufenzellenbild mit dem Ionenkonzentrations­ verteilungsbild überlagert, und das überlagerte Bild wird angezeigt.
Die grundlegende Exklusiv-ODER (X-OR)-Verknüpfung ist im folgen­ den dargestellt:
In Übereinstimmung mit dieser Operation wird das Graustufen­ zellenbild mit dem Ionenkonzentrationsverteilungsbild über­ lagert, um ein zusammengesetztes Bild in der folgenden Art und Weise herzustellen:
Zellenbild:  ○○○××○×○
Konzentrationsverteilungsbild:  ××○○×○××
Zusammengesetztes Bild:  ○○×○×××○
("o" zeigt den Zustand an, in dem Daten auf den Schirm gesetzt werden; und "x" zeigt den Zustand an, in dem Daten auf dem Schirm nicht gesetzt werden.)
Die vorliegende Erfindung soll nun im folgenden unter Bezug­ nahme auf die Fig. 6 und 7 im einzelnen beschrieben wer­ den.
Unter Bezugnahme auf Fig. 6 und 7 ist ein Beispiel eines Fluoreszenzmikroskopsystems dargestellt, welches für die vorliegende Erfindung geeignet ist. Fig. 6 ist eine schema­ tische Darstellung eines Fluoreszenzmikroskopsystems und Fig. 7 ist ein Blockdiagramm, welches das gleiche darstellt. Dieses System ist in der EP-A 03 39 582 offen­ bart. In diesem System wird ein Fluoreszenzmikroskop des invertierten Epifluoreszenztyps (IMT-2®) mit einer TV-Kamera und einer Bildverar­ beitungsvorrichtung kombiniert. Mittels dieser Struktur wird die Fluoreszenzanalyse in einem vorherbestimmten zweidimen­ sionalen Bereich gleichzeitig durchgeführt und eine Kalzium­ konzentrationsverteilung kann leicht erhalten werden. Dieses Fluoreszenzmikroskopsystem ist entworfen, un eine Analyse auf der Grundlage der Variation im Anregungsspektrum durch­ zuführen, wie beispielsweise bei einer Untersuchung von Kal­ ziumionen, bei der fura-2® als Fluoreszenzprobe verwendet wird. In Fig. 6 erzeugt eine Beleuchtungsvorrichtung Anre­ gungslicht. Die Beleuchtungsvorrichtung 1 beinhaltet als Lichtquelle eine Hg-Lampe 2. Die Hg-Lampe 2 kann durch eine Xe-Lampe oder jede beliebige andere Lampe ersetzt werden, welche in der Lage ist, Licht bei der gewünschten Wellen­ länge zu emittieren. Die Beleuchtungsvorrichtung 1 ist mit einer Projektionsröhre 3 versehen, welche mit dem Mikroskop­ körper verbunden ist. Eine Filtereinheit 6 beinhaltet ein Filter neutraler Dichte (ND-Filter) 4 und ein Interferenz­ filter 5 und ist in der Projektionsröhre 3 auf einer opti­ schen Achse der Hg-Lampe 2 angeordnet. Das Interferenzfilter 5 erlaubt nur Licht einer vorherbestimmten Wellenlänge das Hindurchtreten. Der ND-Filter 4 steuert den Lichtbetrag, der bei jeder Wellenlänge hindurchgelassen wird. Wenn es die Bedingungen erlauben, kann auf das ND-Filter 4 auch verzich­ tet werden.
Das Anregungslicht, welches durch die Filtereinheit 6 hindurchgetreten ist, tritt in eine Objektivlinse 8 über ein nicht dargestelltes optisches System, welches innerhalb des Mikroskopkörpers angeordnet ist. Das Licht, welches aus der Linse 8 austritt, wird zu einer Probenzelle 10 fokus­ siert, die auf einer Stufe 9 bereitgestellt wird. Zuvor wurde fura-2® in die Probenzelle 10 eingegeben und die Pro­ benzelle 10 emittiert Fluoreszenzlicht bei Bestrahlung mit dem Anregungslicht. Das emittierte Epi-Fluoreszenzlicht wird durch ein Okular 12 über ein optisches System (nicht darge­ stellt) betrachtet und simultan an eine TV-Kamera 13 (SIT) angelegt. Die TV-Kamera 13 ist mit einem Bildverarbeitungs­ prozessor 14, einem Computer 15, einem Monitor 16 und einem Drucker 17 verbunden.
Das Fluoreszenzmikroskopsystem ist derart ausgelegt, daß es nicht nur für die Bestimmung von Kalziumkonzentrationen un­ ter Verwendung von Fluoreszenz, sondern auch für normale Mi­ kroskopbeobachtungen verwendet werden kann. In Fig. 6 emit­ tiert eine Quelle für sichtbares Licht 20a Licht für mi­ kroskopische Beobachtungen der Probenzelle 10. Das sichtbare Licht, welches von der Quelle 20a emittiert wurde, wird mit­ tels einer Sammellinse 20b gesammelt und auf die Probenzelle 10 gestrahlt. Das abgestrahlte sichtbare Licht tritt durch die Probenzelle 10 hindurch und erreicht das Okular 12 über das optische System für die Beobachtung. Mit anderen Worten wandert das sichtbare Licht über einen Lichtpfad vom Trans­ missionstyp in dem Zustand der normalen Mikroskopbeobach­ tung. Mittels dieser Struktur kann ein Hellfeldbild einer Zelle erhalten werden. Ein Nomarskibild kann erhalten wer­ den, indem man das Fluoreszenzmikroskop mit einem Nomarski­ kondensor IM2-LWDNC®, einem Nomarskiträger IM2-NA® und einer Nomarskiobjektivlinse LWDCD plan 40X® kombiniert. Zusätzlich kann ein Pha­ senkontrastbild erhalten werden, indem man das Fluoreszenz­ mikroskop mit einem Phasenkontrastkondensor IMT-2-LWCD® und einer Phasenkontrastobjek­ tivlinse LWDCD Plan 40X-PL® kom­ biniert. Des weiteren kann ein Polarisationsbild erhalten werden, indem man das Fluoreszenzmikroskop mit einem Nomars­ kikondensor IM2-LWDNC® und einer Nomarskiobjektivlinse LWDCD Plan 40X® kombiniert.
Unter Bezugnahme auf Fig. 7 soll nun das Fluoreszenzmi­ kroskopsystem im einzelnen beschrieben werden. Wie in Fig. 7 dargestellt, weist die Filtereinheit 6 drei Interferenzfil­ ter auf, um selektiv nur Anregungslicht mit Wellenlängen von 340 nm, 360 nm oder 380 nm hindurchzulassen. Einer der drei Interferenzfilter ist auf der optischen Achse positioniert, so daß Anregungslicht aus dem von der Hg-Lampe 2 emittierten Licht entnommen werden kann, das für die Zweiwellenlängenbe­ stimmung unter Verwendung von fura-2® benötigt wird. Zusätz­ lich weist die Filtereinheit 6 eine Mehrzahl von ND-Filtern 4 auf. Die ND-Filter 4 werden eingesetzt, um die Intensität des Anregungslichtes bei verschiedenen Wellenlängen zu steu­ ern, das für die Bestimmung verwendet wird. Im einzelnen müssen zwei Lichtstrahlen bei verschiedenen Wellenlängen, welche für die Zweiwellenlängenbestimmung verwendet werden, im wesentlichen die gleiche Intensität aufweisen. Indessen weist das von der Hg-Lampe 2 emittierte Licht bei verschie­ denen Wellenlängen verschiedene Intensitäten auf. Infolge­ dessen müssen die Intensitäten des Lichtes mittels der ND- Filter 4 justiert werden. Das ND-Filter 4 und das Interfe­ renzfilter 5 können mittels eines Schrittmotors 18 in eine Richtung bewegt werden, die den Lichtpfad kreuzt, wodurch das Anordnen der gewünschten Filtern in dem Lichtpfad ermög­ licht wird.
Obwohl nicht dargestellt, ist des weiteren ein zweiter ND- Filter für Korrekturzwecke bereitgestellt, der benötigt wird, wenn die Objektivlinse 8 gewechselt wird. Aus diesem Grunde wird eine Mehrzahl von ND-Filtern eingesetzt, welche verschiedene Transmissionsgrade, wie beispielsweise 0%, 25%, 40% und 100% aufweisen, und das gewünschte Filter wird in dem Lichtpfad positioniert. Wie in Fig. 7 dargestellt, wird ein dichroitischer Spiegel 7 auf der optischen Achse der Hg- Lampe 2 angeordnet. Der dichroitische Spiegel 7 ist unmit­ telbar unterhalb der in Fig. 6 dargestellten Objektivlinse 8 bereitgestellt. Das Anregungslicht, welches durch die Fil­ tereinheit 6 hindurchgetreten ist, wird durch den dichroiti­ schen Spiegel 7 reflektiert und bestrahlt die Probenzelle 10 durch die Objektivlinse 8. Das in der Probenzelle produ­ zierte Fluoreszenzlicht wird über die Objektivlinse 8 zu dem dichroitischen Spiegel 7 geleitet. Der dichroitische Spiegel 7 hat die Funktion, das Hindurchtreten von Fluoreszenzlicht zu gestatten. Ein Emissionsfilter 19 ist unmittelbar unter­ halb des dichroitischen Spiegels 7 angeordnet. Das Emis­ sionsfilter 19 erlaubt nur das Hindurchtreten von Fluores­ zenzlicht mit einer Wellenlänge von 510 nm zur Fluoreszenz­ bestimmung unter Verwendung von fura-2®. Das Fluoreszenz­ licht, welches eine Wellenlänge von 510 nm aufweist und wel­ ches durch das Emissionsfilter 19 hindurchgetreten ist, trifft dann auf einen Strahlteiler (nicht dargestellt). 20% des einfallenden Lichtes treten durch den Strahlteiler hin­ durch und erreichen das Okular 12 (in Fig. 6 dargestellt) über ein optisches System (nicht dargestellt). Demgegenüber erreichen 80% des einfallenden Lichtes die Kamera 13 über ein weiteres optisches System.
Die TV-Kamera 13 ist mit einem Bildprozessor 14 verbunden. Der Bildprozessor 14 hat die Funktion, die TV-Kamera 13 zu steuern und Bilddaten, die von der TV-Kamera 13 erhalten werden, zu integrieren. Der Bildprozessor 14 ist mit einem Computer 15, der eine RAM-Speicherplatte aufweist, dem Monitor 16 und dem Drucker 17 in dieser Reihenfolge verbunden. Der Computer 15 verarbeitet integrierte Bilddaten aus den Bildprozessor 14, wodurch eine Kalziumkonzentration und eine Kalziumkon­ zentrationsverteilung erhalten wird. Der Computer 15 ist mit dem Schrittmotor 18 verbunden, um den Betrieb des Motors 18 zu steuern.
In dem oben beschriebenen Fluoreszenzmikroskop ist die Fluo­ reszenzwellenlänge festgelegt, wohingegen die Anregungswel­ lenlänge geändert wird. Unterdessen kann umgekehrt auch die Anregungswellenlänge festgelegt sein und die Fluoreszenzwel­ lenlänge geändert werden. In diesem Fall ist es mög­ lich, eine Fluoreszenzprobe, wie beispielsweise Indo-1®, zu verwenden, welche ein variables Fluoreszenzspektrum auf­ weist.
Wenn das oben beschriebene Fluoreszenzmikroskop verwendet wird und fura-2® als Fluoreszenzprobe verwendet wird, kann ein Konzentrationsverteilungsbild von Kalziumionen in einer Zelle auf die folgende Art und Weise erhalten werden.
Fluoreszenzlicht, welches von der Probenzelle 10 emittiert wurde, fällt in die TV-Kamera 13. Die TV-Kamera 13 konver­ tiert das Eingangsfluoreszenzlicht in elektrische Signale, welche der Intensität des Eingangslichtes proportional sind und den individuellen Pixeln entsprechen. Die Bilddaten in der Form von elektrischen Signalen werden dann in den Bild­ prozessor eingegeben. Die TV-Kamera 13 gibt die Bilddaten in den Bildprozessor 14 zu jeder vorherbestimmten Belichtungs­ zeit (im allgemeinen 1/30 Sekunde). Der Bildprozessor 14 in­ tegriert die Eingangsbilddaten über eine vorherbestimmte An­ zahl. Ein mittels dieser Integration hergestelltes Bild wird dann in den Computer eingegeben.
Die Bilddaten des Bildprozessors 14 werden dann in einen Frame-Speicher des Computers 15 eingelesen. Die in dem Frame-Speicher eingelesenen Bilddaten werden in einer einge­ bauten RAM-Speicherplatte gespeichert. In dem Fall einer Zweiwellen­ längenbestimmung wird ein gemessenes Bild (Bild 1), welches bei einer ersten Wellenlänge erhalten wurde, und ein gemes­ senes Bild (Bild 2), welches bei einer zweiten Wellenlänge erhalten wurde, individuell gespeichert. Zum Beispiel wird, wenn fura-2® zur Bestimmung verwendet wird, das erste Bild mit der Anregungswellenlänge von 340 nm erhalten und das zweite Bild mit der Anregungswellenlänge von 360 nm.
In Übereinstimmung mit dem Bildverarbeitungsprogramm ver­ gleicht der Computer 15 das erste und das zweite Bild bezüg­ lich allen individuellen Pixeln, wodurch das Verhältnis (z. B. I340/I360) der Fluoreszenzintensitäten erhalten wird. Dann wird das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten in eine Kalziumkonzentration auf der Grundlage der in Fig. 3 darge­ stellten Kalibrierungskurve konvertiert. In Übereinstimmung mit der erhaltenen Kalziumkonzentration wird jedes Pixel mit einer künstlichen Farbe versehen. Genauer gesagt wird jedes Pixel mit der gleichen Kalziumkonzentration mit der gleichen künstlichen Farbe versehen und Pixel mit verschiedenen Kal­ ziumkonzentrationen werden mit verschiedenen künstlichen Farben versehen. Als Ergebnis werden Kalziumkonzentra­ tionen in den jeweiligen Teilen der Zelle durch Farben dar­ gestellt, welche den spezifischen Konzentrationen entspre­ chen. Darüber hinaus kann eine Kalziumkonzentrationsvertei­ lung in der Zelle mittels der Verwendung der Farben gemäß den spezifischen Konzentrationen leicht ausgewertet werden.
Es sollte beachtet werden, daß die in die RAM-Speicherplatte des Com­ puters 15 bei jedem Schritt eingeschriebenen Bilddaten, wenn nötig, auf einer Floppydisk gespeichert werden können. Die auf der RAM-Speicherplatte des Computers 15 oder auf einer Floppydisk gespeicherten Bilddaten können auf dem Schirm des Monitors 16 mit den künstlich hinzugefügten Farben angezeigt werden. Als Ergebnis kann die Kalziumkonzentration in der Zelle in der Form eines Farbbildes betrachtet werden. Wenn nötig, kann eine Hartkopie des Farbbildes mittels des Druckers 17 ausgedruckt werden.
Wie dem zuvor Gesagten entnehmbar ist, werden, gemäß dem oben beschriebenen Fluoreszenzmikroskopsystem, die durch das Fluoreszenzmikroskop erhaltenen Daten bildverarbeitet, und eine zweidimensionale Kalziumkonzentrationsverteilung in einer Zelle kann beobachtet werden. Indessen kann, wie be­ reits weiter oben ausgeführt, gemäß dieser Technik ein Hin­ tergrundfluoreszenzwert nicht genau festgelegt werden und das Konzentrationsverteilungsbild kann nicht im Verhälnis zur Zellenkontur oder der Zellenstruktur angezeigt werden.
Im folgenden soll nun eine Beschreibung einer Ausführungs­ form gegeben werden, in der diese Probleme mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens gelöst worden sind.
Diese Ausführungsform wird unter Bezugnahme auf das Flußdia­ gramm in Fig. 8 beschrieben. In einem Schritt 1 wird das oben beschriebene Fluoreszenzmikroskopsystem verwendet und eine etablierte Nervenzellenlinie (NG108, N115) wird auf der Stufe 9 als Testzelle 10 gesetzt. In einem nachfolgenden Schritt 2 wird ein Hellfeldbild der Probenzelle 10 erhalten. In Fig. 9 ist eine Fotographie dargestellt, in der das ein­ farbige Hellfeldbild dargestellt ist. Wie aus Fig. 9 ersichtlich, ist die Kontur und die innere Struktur der Zelle in dem Hellfeldbild klar dargestellt. Die Bilddaten des Hellfeldbildes werden in dem Computer 15 gespeichert.
In einem Schritt 3 wird fura-2® als Fluoreszenzprobe in die Probenzelle 10 eingegeben. Unter Verwendung von zwei Anre­ gungslichtstrahlen mit Wellenlängen von 340 nm und 360 nm wird die Intensität des Fluoreszenzlichtes bei einer Wellen­ länge von 510 nm bestimmt, wodurch zwei Fluoreszenzintensi­ tätsbilder erhalten werden. Die zwei Fluoreszenzintensitäts­ bilder werden in dem Computer 15 gespeichert.
In einem Schritt 4 wird ein Hintergrundfluoreszenzwert in der folgenden Art und Weise bestimmt. Auf der Grundlage des in dem Computer 15 gespeicherten Hellfeldbildes wird ein Luminanzprofil entlang der in Fig. 9 dargestellten X-X-Linie auf dem Monitor 16 angezeigt. Dann wird, auf der Grundlage der zwei in dem Computer 15 gespeicherten Fluoreszenzinten­ sitätsbilder, ein Fluoreszenzintensitätsprofil auf dem Moni­ tor 16 bei der gleichen Position wie das Luminanzprofil in einer überlagerten Art und Weise angezeigt. Die überlagerte Anzeige ist ohne Durchführung von Koordinatentransforma­ tionen möglich. In Fig. 10 sind die überlagert angezeigten Profile dargestellt. Die Kurve (1) ist ein Luminanzprofil des Hellfeldbildes, die Kurve (2) ist ein Fluoreszenzinten­ sitätsprofil, das erhalten wurde, wenn die Anregungswellen­ länge 340 nm ist, und Kurve (3) ist ein Fluoreszenzprofil, welches erhalten wurde, wenn die Anregungswellenlänge 360 nm ist. Aus dem Luminanzprofil 1 des Hellfeldbildes ist ableit­ bar, daß die durch die gestrichelten Linien A und B darge­ stellten Orte den Konturen der Zelle entsprechen. Der Teil des Fluoreszenzintensitätprofils, welcher sich außerhalb der gestrichelten Linien A und B befindet, zeigt das Hinter­ grundfluoreszenzlicht außerhalb der Zelle an. Daher kann der Hintergrundfluoreszenzwert auf der Grundlage der Fluores­ zenzintensität (in diesem Beispiel 10) bei den Kreuzungs­ punkten zwischen den gestrichelten Linien A und B und den Fluoreszenzintensitätprofilen (2) und (3) bestimmt werden. Eine gerade Linie C zeigt den derartig festgelegten Hinter­ grundpegel an. Mittels dieses Verfahrens kann der Hinter­ grundfluoreszenzwert objektiv und exakt festgelegt werden. Wenn ein ungenauer Hintergrundswert (z. B. 5 oder 15) be­ stimmt wird, würde ein zweidimensionales Kalziumkonzentra­ tionsverteilungsbild, welches aus dem nachfolgenden Schritt erhalten wird, nicht mit dem Zellbereich des Hellfeldbildes koinzidieren.
In dem Schritt 5 werden die zwei in dem Computer 15 gespei­ cherten Fluoreszenzintensitätsbilder auf der Grundlage des bestimmten Hintergrundfluoreszenzwertes korrigiert. Diese Korrektur wird durchgeführt, indem der Hintergrundfluores­ zenzwert von den Fluoreszenzintensitätswerten bei jedem Punkt der Fluoreszenzintensitätsbilder subtrahiert wird. Nachfolgend werden die zwei korrigierten Fluoreszenzintensi­ tätsbilder durch den Computer 15 bildverarbeitet und arith­ methische Teiloperationen der Bilder werden durchgeführt. Folglich wird ein Bild erhalten, welches Pixel aufweist, die Werte von I340/I360 darstellen.
In dem Schritt 6 wird das Fluoreszenzintensitätverhältnis, welches in dem Schritt 5 erhalten wurde, in eine Kalziumkon­ zentration auf der Grundlage der in Fig. 3 dargestellten Kalibrierungskurve konvertiert. Des weiteren wird für jedes Pixel des Bildes eine künstliche Farbe in Übereinstimmung mit der erhaltenen Kalziumkonzentration bereitgestellt, wodurch ein zweidimensionales Konzentrationsverteilungsbild erhalten wird, in dem jedes Pixel, welches der gleichen Kalziumkonzentration entspricht, mit der gleichen künstli­ chen Farbe versehen ist. In Fig. 11 ist eine Fotographie dargestellt, die das erhaltene zweidimensionale Konzentra­ tionsverteilungsbild zeigt. Obwohl die Fotographie (Fig. 11) einfarbig ist, ist die tatsächliche Fotographie ein Farb­ bild, in dem die Pixel mit künstlichen Farben in Überein­ stimmung mit den Kalziumkonzentrationen versehen worden sind. Das zweidimensionale Konzentrationsverteilungsbild wird in dem Computer 15 gespeichert.
In dem letzten Schritt 7 wird das zweidimensionale Konzen­ trationsverteilungsbild mit dem in Schritt 2 erhaltenen Hellfeldbild überlagert. Der Überlagerungsschritt wird mit­ tels einer affinen Transformation und einer Exklusiv-ODER- (X-OR)-Verknüpfung durchgeführt, wie bereits ausführlich unter Bezugnahme auf Fig. 5 beschrieben wurde. Die Transformation und die Operation werden mittels des Computers 15 durchge­ führt. Fig. 12 ist eine Fotographie, in der das erhaltene überlagerte Bild dargestellt ist. Obwohl die Fotographie (Fig. 12) einfarbig ist, ist die tatsächliche Fotographie ein Farb­ bild, in dem ein Kunstfarbenbild, welches eine Kalziumkon­ zentrationsverteilung darstellt, über dem einfarbigen Hell­ feldbild der Zelle gezeigt ist. In diesem zusammengesetzten Bild ist die Kalziumkonzentrationsverteilung in der Zelle in Bezug auf die Zellenkontur oder die Zellenstruktur klar er­ kennbar.
Bei den obigen Ausführungsformen ist das Hellfeldbild als ein Zellbild verwendet worden. Indessen kann das Zellenbild auch aus einem Hellfeldbild, einem Phasenkontrastbild, einem No­ marskidifferentialinterferenzkontrastbild und einem Polari­ sationsbild ausgewählt werden, so daß die Luminanz innerhalb der Zelle sich deutlich von der außerhalb der Zelle unter­ scheidet.
Die oben beschriebenen Ausführungsformen beziehen sich auf die Bestimmung der Kalziumionenkonzentration in der Zelle. Indessen ist die vorliegende Erfindung auch für die Bestim­ mung der Konzentration von Wasserstoffionen oder der Konzen­ tration von Makromolekülen wie beispielsweise Proteinen geeignet. In jedem der Fälle können die gleichen Effekte erzielt werden.
Wie zuvor beschrieben wurde, können gemäß der vorliegenden Erfindung herausragende Effekte erzielt werden. Zum Beispiel kann eine zweidimensionale Konzentrationsverteilung in einer Zelle in Bezug auf die Kontur der Zelle erhalten werden. Zusätzlich kann der Pegel des Hintergrundfluoreszenzlichtes objektiv gesetzt werden, um die Ionenkonzentration exakt zu bestimmen.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Bilden eines zwei­ dimensionalen Konzentrationsverteilungsbildes von spezifi­ schen zu untersuchenden Ionen in einer lebenden Zelle auf der Grundlage der Variation im Fluoreszenzspektrum oder im Anregungsspektrum einer Fluoreszenzprobe. Das Verfahren um­ faßt die Schritte des Eingebens einer Fluoreszenzprobe in eine Zelle; Erhalten eines Fluoreszenzintensitätsvertei­ lungsbildes durch Bestimmung des Fluoreszenzlichtes aus der Fluoreszenzprobe in einem Bereich, der die Zelle umfaßt; op­ tisches Vermessen der Zelle, wobei ein Bild der Zelle erhal­ ten wird, das aus der Gruppe bestehend aus einem Hellfeld­ bild, einem Phasenkontrastbild, einem Nomarskidifferential­ interferenzkontrastbild und einem Polarisationsbild ausge­ wählt wurde; Bestimmen eines Hintergrundfluoreszenzwertes aus einem Profil des Fluoreszenzintensitätsbildes und einem Profil des Zellbildes; Bilden eines zweidimensionalen Kon­ zentrationsverteilungsbildes der zu untersuchenden Ionen durch Bildverarbeitung, die die Subtraktion des Hintergrund­ fluoreszenzwertes von dem Fluoreszenzintensitätsverteilungs­ bild umfaßt; und Aussetzen des Zellbildes und des zweidimen­ sionalen Konzentrationsverteilungsbildes der Ionen einer Bildverarbeitung, wobei beide Bilder in einer überlagerten Art und Weise angezeigt werden.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung eines zweidimensionalen Verteilungsbildes der Ionenkonzentration von bestimmten zu untersuchenden Ionen in einer lebenden Zelle, auf der Grundlage der Variation im Fluoreszenzspektrum oder im Anregungsspektrum einer Fluoreszenzprobe, wobei das Verfahren die Schritte beinhaltet:
Eingeben einer Fluoreszenzprobe in eine Zelle;
Erhalten eines Fluoreszenzintensitätsverteilungsbildes durch Bestimmen des Fluoreszenzlichtes von der Fluoreszenzprobe in einem Bereich, der die Zelle umfaßt;
optisches Vermessen der Zelle, wobei ein Zellbild der Zelle erhalten wird, welches aus der Gruppe bestehend aus einem Hellfeldbild, einem Phasenkontrastbild, einem Nomarskidifferentialinterferenzkontrastbild und einem Polarisationsbild ausgewählt wurde;
Bestimmen eines Hintergrundfluoreszenzwertes aus einem Profil des Fluoreszenzintensitätsbildes und einem Profil des Zellbildes;
Bilden eines zweidimensionalen Verteilungsbildes der Konzentration der zu untersuchenden Ionen, indem eine Bildverarbeitung durchgeführt wird, die die Subtraktion des Hintergrundfluoreszenzwertes von dem Fluoreszenzintensitätsverteilungsbild beinhaltet; und
Unterziehen des Zellbildes und des zweidimensionalen Verteilungsbildes der Ionenkonzentration einer Bildverarbeitung, wobei beide Bilder in einer überlagerten Art und Weise angezeigt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Erhaltens eines Zellbildes vor dem Schritt des Erhaltens eines Fluoreszenzintensitätsverteilungsbildes durchgeführt wird, in dem Fluoreszenzlicht bestimmt wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein zweidimensionales Verteilungsbild der Kalziumionen-Konzentration in einer lebenden Zelle unter Verwendung einer Fluoreszenzprobe aus fura-2®, Quin-2® und Indo-1® gebildet wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Bilddaten des zweidimensionalen Verteilungsbildes einer affinen Transformation ausgesetzt werden, um das Koordinatensystem des zweidimensionalen Verteilungsbildes mit dem Koordinatensystem der Daten des Zellbildes in Koinzidenz zu bringen.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellbild ein monochromatisches Bild ist und das zweidimensionale Verteilungsbild ein Vielfarbenbild ist, welches Farben entsprechend den Ionenkonzentrationen aufweist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die überlagerte Anzeige des Zellbildes und des zweidimensionalen Verteilungsbildes mittels einer Exklusiv-ODER-Verknüpfung durchgeführt wird.
DE4026564A 1989-08-24 1990-08-22 Verfahren zum herstellen eines zweidimensionalen verteilungsbildes einer ionenkonzentration in einer zelle Granted DE4026564A1 (de)

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