DE4026564C2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- DE4026564C2 DE4026564C2 DE4026564A DE4026564A DE4026564C2 DE 4026564 C2 DE4026564 C2 DE 4026564C2 DE 4026564 A DE4026564 A DE 4026564A DE 4026564 A DE4026564 A DE 4026564A DE 4026564 C2 DE4026564 C2 DE 4026564C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- image
- cell
- fluorescence
- concentration
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines
zweidimensionalen Verteilungsbildes einer
Ionenkonzentration, insbesondere einer
Kalziumionenkonzentration und einer Wasserstoffionenkonzentra
tion, in einer Zelle unter Verwendung eines Fluores
zenzmikroskopsystems, in dem ein Fluoreszenzreagenz als eine
Probe eingesetzt wird.
Dieses Verfahren soll eine deutliche Anzeige eines Bildes einer Zel
lenkontur und eine Anzeige des zweidimensionalen Verteilungs
bildes der Ionenkonzentration im genauen Lageverhältnis mit
der Zellenkontur ermöglichen.
Seit kurzem werden auf dem Gebiet der Biochemie der Nerven
zellen (Neurologie) und der Zellbiologie Verfahren zur Be
stimmung der Konzentration von freien Kalziumionen in einer
lebenden Zelle in großem Umfang eingesetzt, um die metaboli
schen Funktionen einer Zelle zu studieren. In diesem Verfah
ren wird ein geeignetes Fluoreszenzreagenz (im folgenden als
"Fluoreszenzprobe" bezeichnet), welches in der Lage ist, als
eine Probe für die Untersuchung einer Zielsubstanz zu die
nen, in eine lebende Zelle eingeführt. Auf der Grundlage der
Fluoreszenzintensität der Probe wird die Konzentration einer
chemischen Zielspezies festgelegt. Dieses Verfahren wird
durchgeführt, um verschiedene Arten von Ionen in einer Zelle
zu untersuchen, wie beispielsweise Kalziumionen, Natrium
ionen, Magnesiumionen und Chlorionen oder Makromoleküle.
Das Untersuchungsprinzip soll nun im folgenden erläutert
werden.
Wenn die Fluoreszenzprobe sich mit einer bestimmten zu un
tersuchenden Substanz verbunden hat, wird sich ihr Fluores
zenzspektrum oder ihr Anregungsspektrum ändern. Der Betrag
der Änderung hängt von dem Maß der Konzentration der Sub
stanz ab. Folglich wird die Fluoreszenzintensität der Probe
mittels eines Fluoreszenzspektrophotometers oder eines Fluo
reszenzmikroskopes gemessen, wobei die Konzentration der be
stimmten Substanz auf der Grundlage der Änderung des Spek
trums bestimmt werden kann. Zum Beispiel wird, wenn Kal
ziumionen in einer Zelle bestimmt werden sollen, fura-2® als
Fluoreszenzprobe eingegeben und die Änderung im Anregungs
spektrum, welche durch die spezifische Verbindung zwischen
der Probe und den Kalziumionen verursacht wurde, gemes
sen. Wenn ein Fluoreszenzmikroskop verwendet wird, muß dabei
beachtet werden, daß die Änderung der Fluoreszenzintensität
nicht bezüglich des vollständigen Fluoreszenzbildes gemessen
wird, sondern bezüglich eines spezifischen kleinen kreisför
migen Bereiches des Fluoreszenzbildes.
Gemäß dem obigen Verfahren kann die Konzentration von Kal
ziumionen in einem spezifischen kleinen Bereich einer Zelle
leicht festgelegt werden, wohingegen es große Schwierigkei
ten verursacht, die Konzentrationsverteilung von Kalzium
ionen in einem relativ großen zweidimensionalen Bereich her
auszufinden. Um eine derartige Konzentrationsverteilung zu
erhalten, ist es nötig, Proben bei vielen Punkten zu nehmen,
was einen großen Zeit- und Arbeitsaufwand erfordert. Dem
gegenüber ist es aber auf den Gebieten der Neurologie und
Zellbiologie sehr wichtig, die Verteilung von Kalziumionen
konzentrationen in einem relativ großen Bereich, z. B. über
mehrere Zellen, herauszufinden. Unter Berücksichtigung der
oben beschriebenen Situation gibt es daher einen Bedarf an
einem verbesserten Verfahren, um eine zweidimensionale Kon
zentrationsverteilung durch gleichzeitiges Messen der Kon
zentration einer zu untersuchenden Zielsubstanz in einem re
lativ großen zweidimensionalen Bereich leicht zu erhalten.
Einen Lösungsvorschlag für das oben angesprochene Problem
macht die EP-A 03 39 582.
Dort wird ein Fluoreszenzmikroskopsystem
vorgeschlagen, welches mit einer Bildverarbeitungstech
nik kombiniert ist. Auf die Offenbarung dieser Patentanmel
dung wird in
der Beschreibung vollinhaltlich Bezug genommen. Die Verwen
dung dieses Fluoreszenzmikroskopsystems macht es möglich,
eine intrazelluläre Ionenkonzentrationsverteilung in einem
relativ großen zweidimensionalen Bereich leicht zu erhalten.
Dieser Typ des Fluoreszenzmikroskops wird in einer bevorzug
ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet
und ist in der nachfolgenden Figurenbeschreibung
näher beschrieben.
Indessen treten selbst bei der Verwendung des oben beschrie
benen Fluoreszenzmikroskopsystems die folgenden Probleme bei
dem konventionellen Verfahren zum Erhalten einer zweidimen
sionalen Verteilung der intrazellulären Ionenkonzentration
auf.
Wenn die physiologische Funktion einer Zelle untersucht wird,
ist es sehr wichtig, Daten darüber zu erhalten, in welchem
Teil der Zelle die Konzentration von freien Kalziumionen zu
nimmt oder abnimmt. Indessen beinhaltet ein Fluoreszenzin
tensitätsbild, welches mittels eines herkömmlichen Verfah
rens erhalten wird, grundsätzlich nur Daten bezüglich einer
Ionenkonzentration und keine Daten bezüglich des Lagever
hältnisses zwischen der Ionenkonzentration und der Zelle. Daher
ist es nicht möglich, selbst wenn das erhaltene Fluores
zenzintensitätsbild bildverarbeitet wird, ein Bild zu erhal
ten, in dem die Ionenkonzentrationsverteilung mit der Kontur
der Zelle in Verbindung gebracht wird.
Zusätzlich beinhaltet das erhaltene Fluoreszenzintensitäts
bild "Hintergrundfluoreszenz" von außerhalb der Zelle. Um
eine zweidimensionale Konzentrationsverteilung von zu unter
suchenden Ionen zu erhalten, muß daher die Hintergrundfluo
reszenz von dem Fluoreszenzintensitätsbild subtrahiert wer
den. Indessen ist es aber schwierig, den genauen Betrag der
Hintergrundfluoreszenz objektiv zu bestimmen. Gemäß dem her
kömmlichen Verfahren bestimmt der Experimentator den Wert
des Hintergrundpegels empirisch auf der Grundlage eines Pro
fils eines Fluoreszenzintensitätsbilds. Daher ist die Grund
lage für die Bestimmung des Wertes des Hintergrundpegels un
bestimmt und variiert von Experimentator zu Experimentator.
Es ist daher bei den bekannten Verfahren schwierig, die
Ionenkonzentration präzise zu bestimmen.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfah
ren zur Herstellung eines zweidimensionalen Verteilungsbild der Ionenkonzentration von bestimm
ten Ionen innerhalb einer Zelle in bezug auf die Zellenkon
tur zu schaffen.
Diese Aufgabe wird gemäß der vorliegenden Er
findung durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind
in den Unteransprüchen angegeben.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zur Festlegung des Hinter
grundfluoreszenzwerts nicht nur ein Profil eines
Fluoreszenzintensitätsbildes verwendet, sondern es wird des
weiteren ein Profil des Zellbildes, welches aus der Gruppe
bestehend aus einem Hellfeldbild, einem Phasenkontrastbild,
einem Nomarskidifferentialinterferenzkontrastbild und einem
Polarisationsbild ausgewählt wurde, als ein Referenzbild
verwendet. Daher kann auf die subjektive Entscheidung eines
Experimentators verzichtet und der Hintergrundfluo
reszenzwert objektiv und genau festgelegt werden. Somit
kann die Ionenkonzentration und die Konzentrationsverteilung
exakt ermittelt werden.
Zusätzlich wird, da das zweidimensionale Konzentrationsbild
von den zu untersuchenden Ionen mit dem Zellbild überlagert
wird, das Verhältnis zwischen der Konzentrationsverteilung
und der Zellstruktur klarer. Daher wird deutlich, welcher
Teil einer Zelle welcher Ionenkonzentration bei jedem Punkt
des Konzentrationsverteilungsbildes entspricht.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, daß das Verfahren
eine objektive Bestimmung des Pegels des Hintergrundfluores
zenzlichtes und eine exakte Messung der Ionenkonzentration
ermöglicht.
Weitere Einzelheiten, Aspekte und Vorteile der vorliegenden
Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung
unter Bezugnahme auf die Zeichnungen.
Es zeigen:
Fig. 1 bis 4 Graphiken, um das Prinzip eines Ionen
konzentrationsbestimmungsverfahrens zu
erläutern, bei dem eine Fluoreszenzprobe
verwendet wird;
Fig. 5 ein Flußdiagramm, um ein Verfahren zum Überlagern
von Bildern in der vorliegenden Erfindung zu erläu
tern;
Fig. 6 und 7 Ansichten, um ein Fluoreszenzmikros
kopsystem zu beschreiben, welches in der
vorliegenden Erfindung verwendet wird;
Fig. 8 ein Flußdiagramm, um eine Ausführungsforn der Erfin
dung darzustellen;
Fig. 9 ein Foto, in dem ein Hellfeldbild einer Zelle darge
stellt ist, gemäß der Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 10 ein Diagramm, um ein Verfahren zum Bestimmen
eines Hintergrundfluoreszenzwertes gemäß der
Ausführungsform der Erfindung zu erläutern;
Fig. 11 ein Foto, in dem ein zweidimensionales Vertei
lungsbild von Kalziumionen dargestellt ist; und
Fig. 12 ein Foto, in dem ein überlagertes Bild aus einem
Hellfeldbild und einem zweidimensionalen Vertei
lungsbild von Kalziumionen dargestellt ist, wel
ches mittels der Ausführungsform der vorliegen
den Erfindung erhalten wurde.
Um ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung
zu vermitteln, wird im folgenden ein Verfahren zum Bestimmen
der Konzentration einer Zielsubstanz in einer lebenden Zelle
unter Verwendung einer Fluoreszenzprobe ausführlich
beschrieben.
Wie bereits zuvor beschrieben wurde, verwendet das erfin
dungsgemäße Verfahren eine Fluoreszenzprobe, welche ein
Anregungsspektrum oder ein Fluoreszenzspektrum aufweist, das
in Übereinstimmung mit der Konzentration von spezifischen
Ionen variiert. Zum Beispiel können, wenn die Konzentration
von Kalziumionen bestimmt werden soll, kommerziell erhältli
che Fluoreszenzreagenzien als Fluoreszenzproben verwendet
werden, welche unter den Handelsnamen fura-2, Quin-2 und
Indo-1 bekannt
sind.
Die Fluoreszenzreagenz fura-2® wird durch die unten gezeigte
Strukturformel (I) beschrieben. Die Reagenz weist eine freie
Carboxylgruppe auf, welche nicht in der Lage ist, durch eine
Zellmembran einer etablierten Nervenzellenlinie (NG108,
N115) oder einer etablierten Zellenlinie hindurchzutreten,
welche von einer Gliazelle (C6Bu-1) abgeleitet wurde. Daher
wird fura-2® in eine Testzelle in der Form von fura-2®/AM ein
gegeben, welches ein Acetoxymethyl verestertes Derivat ist,
und welches in der Lage ist, durch die Zellmembran hindurch
zutreten. Wenn fura-2®/AM in die Zelle eingeführt ist, wird
es unmittelbar metabolisiert und in fura-2® konvertiert, wel
ches sich speziell mit Kalziumionen verbindet.
Wenn fura-2® sich mit Kalziumionen verbindet, variiert das
Anregungsspektrum von fura-2® in Übereinstimnung mit der Kal
ziumkonzentration. Das Fluoreszenzspektrum von fura-2® weist
einen einzelnen Peak bei 510 nm und einen Bandpaß von 10 nm
auf. Fig. 1 zeigt ein Spektrum, welches bei der Bestinmung
der Fluoreszenzintensität bei 510 nm erhalten wurde, wobei
ein Fluoreszenzspektrometer verwendet wurde, während sich
die Wellenlänge des anregenden Lichtes ändert, in der Anwe
senheit von Kalziumionen bei verschiedenen Konzentrationen.
Wie aus Fig. 1 ersichtlich, ist die Variation der Fluores
zenzintensität, die von der Kalziumkonzentration abhängt,
bei einer Anregungswellenlänge von 340 nm am größten. Demge
genüber wird, wenn die Wellenlänge des anregenden Lichtes
360 nm ist, eine Variation der Fluoreszenzintensität in
Abhängigkeit der Kalziumkonzentration nicht beobachtet.
Zusätzlich variiert, wenn die Wellenlänge des anregenden
Lichtes 380 nm ist, die Fluoreszenzintensität in einer Weise,
die invers zu derjenigen ist, die bei einer Anregungswellenlänge
von 340 nm beobachtet wurde.
Solange die Variation der Fluoreszenzintensität in Abhängig
keit der Kalziumkonzentration bei verschiedenen Wellenlängen
von Anregungslicht verschieden ist, ist ein Zweiwellenlängen-
Bestimmungsverfahren besonders effektiv. Im einzelnen wird
dabei die Fluoreszenzprobe bei zwei verschiedenen Wellenlän
gen angeregt, und die Kalziumkonzentration wird aus dem Ver
hältnis der Fluoreszenzintensitäten gemäß den beiden Anre
gungswellenlängen bestimmt. Eine der beiden Anregungswellen
längen wird auf einen Wert gesetzt, bei dem die Fluoreszen
zintensität in ihrem größten Umfang variiert und die andere
wird auf einen Wert gesetzt, bei dem die Fluoreszenzintensi
tät nicht variiert oder invers variiert. Bei Verwendung des
Zweiwellenlängen-Bestimmungsverfahrens kann die Konzentra
tion und Dämpfung der Fluoreszenzprobe und die Variation in
der Intensität des Anregungslichtes normalisiert werden. Un
ter Bezugnahme auf Fig. 1 soll nun das Zweiwellenlängen-Be
stimmungsverfahren, welches Anregungswellenlängen bei 340 nm
und 360 nm verwendet (340 nm zum Messen des Lichtes; 360 nm
für das Referenzlicht) im einzelnen beschrieben werden.
Es soll nun angenommen werden, daß die Fluoreszenzintensität
I340 ist, wenn die Anregungswellenlänge 340 nm ist und die
Fluoreszenzintensität I360 ist, wenn die Anregungswellen
länge 360 nm ist. Der Wert von I340/I360 wird auf der Grund
lage der Daten errechnet, die in Fig. 1 dargestellt sind.
Der Wert variiert in einem Bereich von 0,64 bis 1,89, in
Abhängigkeit der vorhandenen Kalziumkonzentration.
Wenn eine TV-Kamera zur Bestimmung verwendet wird, ist es
nötig, einen dynamischen Bereich der TV-Kamera zu berück
sichtigen, um die Zweiwellenlängenbestimmung exakt durch
zuführen. Im einzelnen ist es nötig, da die gewünschte Ein
gangs-/Ausgangslinearität nur in einem vorherbestimmten
Dynamikbereich erhalten wird, daß der Wert von I340/I360
(der Eingang zu der Kamera) innerhalb eines Dynamikbereiches
variiert, um einen genauen Ausgangswert zu erhalten. Aus
diesem Grund wird die Intensität des Anregungslichtes mit
tels eines neutralen Dichtefilters (im folgenden als "ND-
Filter" bezeichnet) gesteuert und der Wert von I340/I360
wird normalisiert, so daß der mittlere Wert von I340/I360
eins wird. In Fig. 2 ist das Verhältnis zwischen den norma
lisierten Werten von I340/I360 und der Kalziumkonzentration
dargestellt. Die in Fig. 2 dargestellten Daten können als
Kalibrierungskurve verwendet werden, wenn die Kalzium
konzentration mittels eines Fluoreszenzmikroskopsystemes be
stimmt wird.
Eine andere Fluoreszenzprobe, welche zur Bestimmung von Kal
ziumkonzentrationen verwendet wird, ist Indo-1, das durch
die unten dargestellte Strukturformel II beschrieben wird.
Die Reagenz weist eine freie Carboxylgruppe auf, die nicht
in der Lage ist, durch eine Zellmembran einer lebenden Zelle
hindurchzutreten. Daher wird Indo-1 in eine Zellprobe in der
Form von Indo-1/AM eingegeben, welches ein Acetoxymethyl
verestertes Derivat ist. Es ist nicht Indo-1®/AM, sondern
Indo-1®, welches durch den Metabolismus in der Zelle herge
stellt wird, das sich spezifisch mit den Kalziumionen ver
bindet.
Im Gegensatz zum Fall der Verwendung von fura-2® wird, wenn
Indo-1® verwendet wird, das Fluoreszenzspektrum und nicht das
Anregungsspektrum in Übereinstimmung mit der Kalziumkonzen
tration variieren. In Fig. 3 ist ein Spektrum dargestellt,
welches erhalten wird, wenn man Anregungslicht mit einer
Wellenlänge von 340 nm auf Indo-1® in der Anwesenheit von
verschiedenen Kalziumionenkonzentrationen einstrahlt. Wie
man dem Spektrum entnehmen kann, ist die Variation der Fluo
reszenzintensität in Abhängigkeit der Kalziumkonzentration
dann am größten, wenn die Wellenlänge der Fluoreszenz um
410 nm herum ist. Im Gegensatz dazu wird, wenn die Wellen
länge der Fluoreszenz 460 nm ist, eine Variation der Fluo
reszenzintensität in Abhängigkeit der Kalziumkonzentration
nicht beobachtet. Zusätzlich variiert, wenn die Wellenlänge
der Fluoreszenz in einen Bereich von 460 bis 480 nm ist, die
Fluoreszenzintensität in einer inversen Art und Weise als
bei einer Fluoreszenzwellenlänge von 410 nm. Während die
Wellenlänge des Anregungslichtes festgelegt ist, wird die
Intensität der Fluoreszenz bei zwei ausgewählten Wellenlän
gen bestimmt, wobei ein Zweiwellenlängenbestimmungsverfah
ren, wie in dem Fall von fura-2®, durchgeführt wird. Herkömm
licherweise werden Wellenlängen von 410 nm und 460 nm oder
Wellenlängen von 410 nm und 480 nm kombiniert. Wenn eine TV-
Kamera zur Bestimmung verwendet wird, wird der Wert von
I410/I460 oder der Wert von I410/I480 aus denselben Gründen,
wie bereits in Verbindung mit dem Fall von fura-2® erläutert,
normalisiert. Des weiteren wird ein ND-Filter verwendet, um
den mittleren Wert von I410/I460 oder I410/I480 auf eins zu
setzen. In Fig. 4 ist das Verhältnis zwischen dem normali
sierten Wert von I410/I460 und der Kalziumkonzentration dar
gestellt. Die in Fig. 4 dargestellten Daten können als
Kalibrierungskurve verwendet werden, wenn die Kalziumkonzen
tration mittels eines Fluoreszenzmikroskopsystemes bestimmt
werden soll.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung soll nun im folgenden
beschrieben werden.
In der vorliegenden Erfindung wird der Hintergrundfluores
zenzwert mittels Anzeige, bevorzugterweise auf einer Kathodenstrahlbildröhre
oder ähnlichem, eines Profils, welches entlang einer gegebe
nen Linie eines Fluoreszenzintensitätsverteilungsbildes er
halten wurde, und eines Profils, welches entlang der gegebe
nen Linie eines Zellbildes erhalten wurde, das als ein Hell
feldbild oder ähnliches bereitgestellt wird, festgelegt.
Wie bereits weiter oben beschrieben wurde, werden das Fluores
zenzintensitätverteilungsbild und das zweidimensionale
Ionenkonzentrationsverteilungsbild mit einem Verfahren
erhalten worden, welches dem Verfahren der EP-A 03 39 582
ähnelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können das zweidimensionale
Konzentrationsverteilungsbild von zu untersuchenden Ionen
und das Zellbild zum Beispiel mittels des Verfahrens, welches
in dem Flußdiagramm von Fig. 5 dargestellt ist, in eine
überlagerte Position gebracht werden.
In Schritt 1 wird ein Zellbild, welches als ein Hellfeld
bild, ein Phasenkontrastbild, ein Nomarskidifferentialinter
ferenzkontrastbild oder ein Polarisationsbild gebildet
wurde, in ein Graustufenbild auf der Grundlage der Luminanz
des Zellbildes konvertiert. Das erhaltene Graustufenbild
wird auf der Anzeige einer Kathodenstrahlbildröhre angezeigt. Das zweidimensio
nale Konzentrationsverteilungsbild (Fluoreszenzbild) der
Zielionen wird mit dem Graustufenbild überlagert.
Im allgemeinen wird das Hellfeldbild, das Phasenkontrast
bild, das Nomarskidifferentialinterferenzkontrastbild oder
das Polarisationsbild nicht exakt mit dem Fluoreszenzbild
überlagert sein. Um die Koordinaten der beiden Bilder koin
zident zu machen, werden die Bilddaten des zweidimensionalen
Ionenkonzentrationsverteilungsbildes einer affinen Transfor
mation in dem Schritt 2 ausgesetzt. Im folgenden soll ange
nommen werden, daß die Koordinaten eines Eingangsbildes (I,
J) und die Koordinaten eines Ausgangsbildes (x, y) sind.
Dann werden die Koordinaten (x, y) in (u, v) affin transfor
miert, die Bildkoordinaten in (I, J) vom reellen Zahlentyp
sind. Nachfolgend werden die Koordinaten (u, v) interpoliert
und der interpolierte Konzentrationspegel (I′) wird bei (x,
y) gespeichert. Eine Formel für die affine Transformation
von Koordinaten ist gegeben durch:
u = a1x + a2y + a3
v = b1x + b2y + b3
v = b1x + b2y + b3
wobei a1, a2, a3, b1, b2 und b3 beliebige Koeffizienten
sind.
Die sich ergebenden transformierten Bilddaten des zweidimen
sionalen Ionenkonzentrationsverteilungsbildes werden in
Übereinstimmung mit den Ionenkonzentrationen gefärbt und mit
dem Graustufenzellenbild, welches in dem Schritt 1 erhalten
wurde, überlagert. In diesem Fall wird, um die Daten des
Graustufenbildes aufrechtzuerhalten, welches im Schritt 1
erhalten wurde, eine Exklusiv-ODER-Verknüpfung bei den jeweili
gen Orten der Koordinaten durchgeführt, wenn beide Bilder
überlappt sind (Schritt 3). Daher wird das in Schritt 1
erhaltene Graustufenzellenbild mit dem Ionenkonzentrations
verteilungsbild überlagert, und das überlagerte Bild wird
angezeigt.
Die grundlegende Exklusiv-ODER (X-OR)-Verknüpfung ist im folgen
den dargestellt:
In Übereinstimmung mit dieser Operation wird das Graustufen
zellenbild mit dem Ionenkonzentrationsverteilungsbild über
lagert, um ein zusammengesetztes Bild in der folgenden Art
und Weise herzustellen:
Zellenbild: ○○○××○×○
Konzentrationsverteilungsbild: ××○○×○××
Zusammengesetztes Bild: ○○×○×××○
Konzentrationsverteilungsbild: ××○○×○××
Zusammengesetztes Bild: ○○×○×××○
("o" zeigt den Zustand an, in dem Daten auf den Schirm
gesetzt werden; und "x" zeigt den Zustand an, in dem
Daten auf dem Schirm nicht gesetzt werden.)
Die vorliegende Erfindung soll nun im folgenden unter Bezug
nahme auf die Fig. 6 und 7 im einzelnen beschrieben wer
den.
Unter Bezugnahme auf Fig. 6 und 7 ist ein Beispiel eines
Fluoreszenzmikroskopsystems dargestellt, welches für die
vorliegende Erfindung geeignet ist. Fig. 6 ist eine schema
tische Darstellung eines Fluoreszenzmikroskopsystems und
Fig. 7 ist ein Blockdiagramm, welches das gleiche darstellt.
Dieses System ist in der EP-A 03 39 582 offen
bart. In diesem System wird ein Fluoreszenzmikroskop des
invertierten Epifluoreszenztyps (IMT-2®)
mit einer TV-Kamera und einer Bildverar
beitungsvorrichtung kombiniert. Mittels dieser Struktur wird
die Fluoreszenzanalyse in einem vorherbestimmten zweidimen
sionalen Bereich gleichzeitig durchgeführt und eine Kalzium
konzentrationsverteilung kann leicht erhalten werden. Dieses
Fluoreszenzmikroskopsystem ist entworfen, un eine Analyse
auf der Grundlage der Variation im Anregungsspektrum durch
zuführen, wie beispielsweise bei einer Untersuchung von Kal
ziumionen, bei der fura-2® als Fluoreszenzprobe verwendet
wird. In Fig. 6 erzeugt eine Beleuchtungsvorrichtung Anre
gungslicht. Die Beleuchtungsvorrichtung 1 beinhaltet als
Lichtquelle eine Hg-Lampe 2. Die Hg-Lampe 2 kann durch eine
Xe-Lampe oder jede beliebige andere Lampe ersetzt werden,
welche in der Lage ist, Licht bei der gewünschten Wellen
länge zu emittieren. Die Beleuchtungsvorrichtung 1 ist mit
einer Projektionsröhre 3 versehen, welche mit dem Mikroskop
körper verbunden ist. Eine Filtereinheit 6 beinhaltet ein
Filter neutraler Dichte (ND-Filter) 4 und ein Interferenz
filter 5 und ist in der Projektionsröhre 3 auf einer opti
schen Achse der Hg-Lampe 2 angeordnet. Das Interferenzfilter
5 erlaubt nur Licht einer vorherbestimmten Wellenlänge das
Hindurchtreten. Der ND-Filter 4 steuert den Lichtbetrag, der
bei jeder Wellenlänge hindurchgelassen wird. Wenn es die
Bedingungen erlauben, kann auf das ND-Filter 4 auch verzich
tet werden.
Das Anregungslicht, welches durch die Filtereinheit 6
hindurchgetreten ist, tritt in eine Objektivlinse 8 über ein
nicht dargestelltes optisches System, welches innerhalb des
Mikroskopkörpers angeordnet ist. Das Licht, welches aus der
Linse 8 austritt, wird zu einer Probenzelle 10 fokus
siert, die auf einer Stufe 9 bereitgestellt wird. Zuvor
wurde fura-2® in die Probenzelle 10 eingegeben und die Pro
benzelle 10 emittiert Fluoreszenzlicht bei Bestrahlung mit
dem Anregungslicht. Das emittierte Epi-Fluoreszenzlicht wird
durch ein Okular 12 über ein optisches System (nicht darge
stellt) betrachtet und simultan an eine TV-Kamera 13 (SIT)
angelegt. Die TV-Kamera 13 ist mit einem Bildverarbeitungs
prozessor 14, einem Computer 15, einem Monitor 16 und einem
Drucker 17 verbunden.
Das Fluoreszenzmikroskopsystem ist derart ausgelegt, daß es
nicht nur für die Bestimmung von Kalziumkonzentrationen un
ter Verwendung von Fluoreszenz, sondern auch für normale Mi
kroskopbeobachtungen verwendet werden kann. In Fig. 6 emit
tiert eine Quelle für sichtbares Licht 20a Licht für mi
kroskopische Beobachtungen der Probenzelle 10. Das sichtbare
Licht, welches von der Quelle 20a emittiert wurde, wird mit
tels einer Sammellinse 20b gesammelt und auf die Probenzelle
10 gestrahlt. Das abgestrahlte sichtbare Licht tritt durch
die Probenzelle 10 hindurch und erreicht das Okular 12 über
das optische System für die Beobachtung. Mit anderen Worten
wandert das sichtbare Licht über einen Lichtpfad vom Trans
missionstyp in dem Zustand der normalen Mikroskopbeobach
tung. Mittels dieser Struktur kann ein Hellfeldbild einer
Zelle erhalten werden. Ein Nomarskibild kann erhalten wer
den, indem man das Fluoreszenzmikroskop mit einem Nomarski
kondensor IM2-LWDNC®,
einem Nomarskiträger IM2-NA®
und einer Nomarskiobjektivlinse LWDCD plan 40X®
kombiniert. Zusätzlich kann ein Pha
senkontrastbild erhalten werden, indem man das Fluoreszenz
mikroskop mit einem Phasenkontrastkondensor IMT-2-LWCD®
und einer Phasenkontrastobjek
tivlinse LWDCD Plan 40X-PL® kom
biniert. Des weiteren kann ein Polarisationsbild erhalten
werden, indem man das Fluoreszenzmikroskop mit einem Nomars
kikondensor IM2-LWDNC® und einer
Nomarskiobjektivlinse LWDCD Plan 40X®
kombiniert.
Unter Bezugnahme auf Fig. 7 soll nun das Fluoreszenzmi
kroskopsystem im einzelnen beschrieben werden. Wie in Fig. 7
dargestellt, weist die Filtereinheit 6 drei Interferenzfil
ter auf, um selektiv nur Anregungslicht mit Wellenlängen von
340 nm, 360 nm oder 380 nm hindurchzulassen. Einer der drei
Interferenzfilter ist auf der optischen Achse positioniert,
so daß Anregungslicht aus dem von der Hg-Lampe 2 emittierten
Licht entnommen werden kann, das für die Zweiwellenlängenbe
stimmung unter Verwendung von fura-2® benötigt wird. Zusätz
lich weist die Filtereinheit 6 eine Mehrzahl von ND-Filtern
4 auf. Die ND-Filter 4 werden eingesetzt, um die Intensität
des Anregungslichtes bei verschiedenen Wellenlängen zu steu
ern, das für die Bestimmung verwendet wird. Im einzelnen
müssen zwei Lichtstrahlen bei verschiedenen Wellenlängen,
welche für die Zweiwellenlängenbestimmung verwendet werden,
im wesentlichen die gleiche Intensität aufweisen. Indessen
weist das von der Hg-Lampe 2 emittierte Licht bei verschie
denen Wellenlängen verschiedene Intensitäten auf. Infolge
dessen müssen die Intensitäten des Lichtes mittels der ND-
Filter 4 justiert werden. Das ND-Filter 4 und das Interfe
renzfilter 5 können mittels eines Schrittmotors 18 in eine
Richtung bewegt werden, die den Lichtpfad kreuzt, wodurch
das Anordnen der gewünschten Filtern in dem Lichtpfad ermög
licht wird.
Obwohl nicht dargestellt, ist des weiteren ein zweiter ND-
Filter für Korrekturzwecke bereitgestellt, der benötigt
wird, wenn die Objektivlinse 8 gewechselt wird. Aus diesem
Grunde wird eine Mehrzahl von ND-Filtern eingesetzt, welche
verschiedene Transmissionsgrade, wie beispielsweise 0%, 25%,
40% und 100% aufweisen, und das gewünschte Filter wird in dem
Lichtpfad positioniert. Wie in Fig. 7 dargestellt, wird ein
dichroitischer Spiegel 7 auf der optischen Achse der Hg-
Lampe 2 angeordnet. Der dichroitische Spiegel 7 ist unmit
telbar unterhalb der in Fig. 6 dargestellten Objektivlinse 8
bereitgestellt. Das Anregungslicht, welches durch die Fil
tereinheit 6 hindurchgetreten ist, wird durch den dichroiti
schen Spiegel 7 reflektiert und bestrahlt die Probenzelle 10
durch die Objektivlinse 8. Das in der Probenzelle produ
zierte Fluoreszenzlicht wird über die Objektivlinse 8 zu dem
dichroitischen Spiegel 7 geleitet. Der dichroitische Spiegel
7 hat die Funktion, das Hindurchtreten von Fluoreszenzlicht
zu gestatten. Ein Emissionsfilter 19 ist unmittelbar unter
halb des dichroitischen Spiegels 7 angeordnet. Das Emis
sionsfilter 19 erlaubt nur das Hindurchtreten von Fluores
zenzlicht mit einer Wellenlänge von 510 nm zur Fluoreszenz
bestimmung unter Verwendung von fura-2®. Das Fluoreszenz
licht, welches eine Wellenlänge von 510 nm aufweist und wel
ches durch das Emissionsfilter 19 hindurchgetreten ist,
trifft dann auf einen Strahlteiler (nicht dargestellt). 20%
des einfallenden Lichtes treten durch den Strahlteiler hin
durch und erreichen das Okular 12 (in Fig. 6 dargestellt)
über ein optisches System (nicht dargestellt). Demgegenüber
erreichen 80% des einfallenden Lichtes die Kamera 13 über
ein weiteres optisches System.
Die TV-Kamera 13 ist mit einem Bildprozessor 14 verbunden.
Der Bildprozessor 14 hat die Funktion, die TV-Kamera 13 zu
steuern und Bilddaten, die von der TV-Kamera 13 erhalten
werden, zu integrieren. Der Bildprozessor 14 ist mit einem
Computer 15, der eine RAM-Speicherplatte aufweist, dem Monitor 16 und
dem Drucker 17 in dieser Reihenfolge verbunden. Der Computer
15 verarbeitet integrierte Bilddaten aus den Bildprozessor
14, wodurch eine Kalziumkonzentration und eine Kalziumkon
zentrationsverteilung erhalten wird. Der Computer 15 ist mit
dem Schrittmotor 18 verbunden, um den Betrieb des Motors 18
zu steuern.
In dem oben beschriebenen Fluoreszenzmikroskop ist die Fluo
reszenzwellenlänge festgelegt, wohingegen die Anregungswel
lenlänge geändert wird. Unterdessen kann umgekehrt auch die
Anregungswellenlänge festgelegt sein und die Fluoreszenzwel
lenlänge geändert werden. In diesem Fall ist es mög
lich, eine Fluoreszenzprobe, wie beispielsweise Indo-1®, zu
verwenden, welche ein variables Fluoreszenzspektrum auf
weist.
Wenn das oben beschriebene Fluoreszenzmikroskop verwendet
wird und fura-2® als Fluoreszenzprobe verwendet wird, kann
ein Konzentrationsverteilungsbild von Kalziumionen in einer
Zelle auf die folgende Art und Weise erhalten werden.
Fluoreszenzlicht, welches von der Probenzelle 10 emittiert
wurde, fällt in die TV-Kamera 13. Die TV-Kamera 13 konver
tiert das Eingangsfluoreszenzlicht in elektrische Signale,
welche der Intensität des Eingangslichtes proportional sind
und den individuellen Pixeln entsprechen. Die Bilddaten in
der Form von elektrischen Signalen werden dann in den Bild
prozessor eingegeben. Die TV-Kamera 13 gibt die Bilddaten in
den Bildprozessor 14 zu jeder vorherbestimmten Belichtungs
zeit (im allgemeinen 1/30 Sekunde). Der Bildprozessor 14 in
tegriert die Eingangsbilddaten über eine vorherbestimmte An
zahl. Ein mittels dieser Integration hergestelltes Bild wird
dann in den Computer eingegeben.
Die Bilddaten des Bildprozessors 14 werden dann in einen
Frame-Speicher des Computers 15 eingelesen. Die in dem
Frame-Speicher eingelesenen Bilddaten werden in einer einge
bauten RAM-Speicherplatte gespeichert. In dem Fall einer Zweiwellen
längenbestimmung wird ein gemessenes Bild (Bild 1), welches
bei einer ersten Wellenlänge erhalten wurde, und ein gemes
senes Bild (Bild 2), welches bei einer zweiten Wellenlänge
erhalten wurde, individuell gespeichert. Zum Beispiel wird,
wenn fura-2® zur Bestimmung verwendet wird, das erste Bild
mit der Anregungswellenlänge von 340 nm erhalten und das
zweite Bild mit der Anregungswellenlänge von 360 nm.
In Übereinstimmung mit dem Bildverarbeitungsprogramm ver
gleicht der Computer 15 das erste und das zweite Bild bezüg
lich allen individuellen Pixeln, wodurch das Verhältnis (z.
B. I340/I360) der Fluoreszenzintensitäten erhalten wird.
Dann wird das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten in eine
Kalziumkonzentration auf der Grundlage der in Fig. 3 darge
stellten Kalibrierungskurve konvertiert. In Übereinstimmung
mit der erhaltenen Kalziumkonzentration wird jedes Pixel mit
einer künstlichen Farbe versehen. Genauer gesagt wird jedes
Pixel mit der gleichen Kalziumkonzentration mit der gleichen
künstlichen Farbe versehen und Pixel mit verschiedenen Kal
ziumkonzentrationen werden mit verschiedenen künstlichen
Farben versehen. Als Ergebnis werden Kalziumkonzentra
tionen in den jeweiligen Teilen der Zelle durch Farben dar
gestellt, welche den spezifischen Konzentrationen entspre
chen. Darüber hinaus kann eine Kalziumkonzentrationsvertei
lung in der Zelle mittels der Verwendung der Farben gemäß
den spezifischen Konzentrationen leicht ausgewertet werden.
Es sollte beachtet werden, daß die in die RAM-Speicherplatte des Com
puters 15 bei jedem Schritt eingeschriebenen Bilddaten, wenn
nötig, auf einer Floppydisk gespeichert werden können. Die
auf der RAM-Speicherplatte des Computers 15 oder auf einer Floppydisk
gespeicherten Bilddaten können auf dem Schirm des Monitors
16 mit den künstlich hinzugefügten Farben angezeigt werden.
Als Ergebnis kann die Kalziumkonzentration in der Zelle
in der Form eines Farbbildes betrachtet werden. Wenn nötig,
kann eine Hartkopie des Farbbildes mittels des Druckers 17
ausgedruckt werden.
Wie dem zuvor Gesagten entnehmbar ist, werden, gemäß dem
oben beschriebenen Fluoreszenzmikroskopsystem, die durch das
Fluoreszenzmikroskop erhaltenen Daten bildverarbeitet, und
eine zweidimensionale Kalziumkonzentrationsverteilung in
einer Zelle kann beobachtet werden. Indessen kann, wie be
reits weiter oben ausgeführt, gemäß dieser Technik ein Hin
tergrundfluoreszenzwert nicht genau festgelegt werden und
das Konzentrationsverteilungsbild kann nicht im Verhälnis
zur Zellenkontur oder der Zellenstruktur angezeigt werden.
Im folgenden soll nun eine Beschreibung einer Ausführungs
form gegeben werden, in der diese Probleme mittels eines
erfindungsgemäßen Verfahrens gelöst worden sind.
Diese Ausführungsform wird unter Bezugnahme auf das Flußdia
gramm in Fig. 8 beschrieben. In einem Schritt 1 wird das
oben beschriebene Fluoreszenzmikroskopsystem verwendet und
eine etablierte Nervenzellenlinie (NG108, N115) wird auf der
Stufe 9 als Testzelle 10 gesetzt. In einem nachfolgenden
Schritt 2 wird ein Hellfeldbild der Probenzelle 10 erhalten.
In Fig. 9 ist eine Fotographie dargestellt, in der das ein
farbige Hellfeldbild dargestellt ist. Wie aus Fig. 9
ersichtlich, ist die Kontur und die innere Struktur der
Zelle in dem Hellfeldbild klar dargestellt. Die Bilddaten
des Hellfeldbildes werden in dem Computer 15 gespeichert.
In einem Schritt 3 wird fura-2® als Fluoreszenzprobe in die
Probenzelle 10 eingegeben. Unter Verwendung von zwei Anre
gungslichtstrahlen mit Wellenlängen von 340 nm und 360 nm
wird die Intensität des Fluoreszenzlichtes bei einer Wellen
länge von 510 nm bestimmt, wodurch zwei Fluoreszenzintensi
tätsbilder erhalten werden. Die zwei Fluoreszenzintensitäts
bilder werden in dem Computer 15 gespeichert.
In einem Schritt 4 wird ein Hintergrundfluoreszenzwert in
der folgenden Art und Weise bestimmt. Auf der Grundlage des
in dem Computer 15 gespeicherten Hellfeldbildes wird ein
Luminanzprofil entlang der in Fig. 9 dargestellten X-X-Linie
auf dem Monitor 16 angezeigt. Dann wird, auf der Grundlage
der zwei in dem Computer 15 gespeicherten Fluoreszenzinten
sitätsbilder, ein Fluoreszenzintensitätsprofil auf dem Moni
tor 16 bei der gleichen Position wie das Luminanzprofil in
einer überlagerten Art und Weise angezeigt. Die überlagerte
Anzeige ist ohne Durchführung von Koordinatentransforma
tionen möglich. In Fig. 10 sind die überlagert angezeigten
Profile dargestellt. Die Kurve (1) ist ein Luminanzprofil
des Hellfeldbildes, die Kurve (2) ist ein Fluoreszenzinten
sitätsprofil, das erhalten wurde, wenn die Anregungswellen
länge 340 nm ist, und Kurve (3) ist ein Fluoreszenzprofil,
welches erhalten wurde, wenn die Anregungswellenlänge 360 nm
ist. Aus dem Luminanzprofil 1 des Hellfeldbildes ist ableit
bar, daß die durch die gestrichelten Linien A und B darge
stellten Orte den Konturen der Zelle entsprechen. Der Teil
des Fluoreszenzintensitätprofils, welcher sich außerhalb der
gestrichelten Linien A und B befindet, zeigt das Hinter
grundfluoreszenzlicht außerhalb der Zelle an. Daher kann der
Hintergrundfluoreszenzwert auf der Grundlage der Fluores
zenzintensität (in diesem Beispiel 10) bei den Kreuzungs
punkten zwischen den gestrichelten Linien A und B und den
Fluoreszenzintensitätprofilen (2) und (3) bestimmt werden.
Eine gerade Linie C zeigt den derartig festgelegten Hinter
grundpegel an. Mittels dieses Verfahrens kann der Hinter
grundfluoreszenzwert objektiv und exakt festgelegt werden.
Wenn ein ungenauer Hintergrundswert (z. B. 5 oder 15) be
stimmt wird, würde ein zweidimensionales Kalziumkonzentra
tionsverteilungsbild, welches aus dem nachfolgenden Schritt
erhalten wird, nicht mit dem Zellbereich des Hellfeldbildes
koinzidieren.
In dem Schritt 5 werden die zwei in dem Computer 15 gespei
cherten Fluoreszenzintensitätsbilder auf der Grundlage des
bestimmten Hintergrundfluoreszenzwertes korrigiert. Diese
Korrektur wird durchgeführt, indem der Hintergrundfluores
zenzwert von den Fluoreszenzintensitätswerten bei jedem
Punkt der Fluoreszenzintensitätsbilder subtrahiert wird.
Nachfolgend werden die zwei korrigierten Fluoreszenzintensi
tätsbilder durch den Computer 15 bildverarbeitet und arith
methische Teiloperationen der Bilder werden durchgeführt.
Folglich wird ein Bild erhalten, welches Pixel aufweist, die
Werte von I340/I360 darstellen.
In dem Schritt 6 wird das Fluoreszenzintensitätverhältnis,
welches in dem Schritt 5 erhalten wurde, in eine Kalziumkon
zentration auf der Grundlage der in Fig. 3 dargestellten
Kalibrierungskurve konvertiert. Des weiteren wird für jedes
Pixel des Bildes eine künstliche Farbe in Übereinstimmung
mit der erhaltenen Kalziumkonzentration bereitgestellt,
wodurch ein zweidimensionales Konzentrationsverteilungsbild
erhalten wird, in dem jedes Pixel, welches der gleichen
Kalziumkonzentration entspricht, mit der gleichen künstli
chen Farbe versehen ist. In Fig. 11 ist eine Fotographie
dargestellt, die das erhaltene zweidimensionale Konzentra
tionsverteilungsbild zeigt. Obwohl die Fotographie (Fig. 11)
einfarbig ist, ist die tatsächliche Fotographie ein Farb
bild, in dem die Pixel mit künstlichen Farben in Überein
stimmung mit den Kalziumkonzentrationen versehen worden
sind. Das zweidimensionale Konzentrationsverteilungsbild
wird in dem Computer 15 gespeichert.
In dem letzten Schritt 7 wird das zweidimensionale Konzen
trationsverteilungsbild mit dem in Schritt 2 erhaltenen
Hellfeldbild überlagert. Der Überlagerungsschritt wird mit
tels einer affinen Transformation und einer Exklusiv-ODER-
(X-OR)-Verknüpfung durchgeführt, wie bereits ausführlich unter
Bezugnahme auf Fig. 5 beschrieben wurde. Die Transformation
und die Operation werden mittels des Computers 15 durchge
führt. Fig. 12 ist eine Fotographie, in der das erhaltene
überlagerte Bild dargestellt ist. Obwohl die Fotographie (Fig. 12)
einfarbig ist, ist die tatsächliche Fotographie ein Farb
bild, in dem ein Kunstfarbenbild, welches eine Kalziumkon
zentrationsverteilung darstellt, über dem einfarbigen Hell
feldbild der Zelle gezeigt ist. In diesem zusammengesetzten
Bild ist die Kalziumkonzentrationsverteilung in der Zelle in
Bezug auf die Zellenkontur oder die Zellenstruktur klar er
kennbar.
Bei den obigen Ausführungsformen ist das Hellfeldbild als ein
Zellbild verwendet worden. Indessen kann das Zellenbild auch
aus einem Hellfeldbild, einem Phasenkontrastbild, einem No
marskidifferentialinterferenzkontrastbild und einem Polari
sationsbild ausgewählt werden, so daß die Luminanz innerhalb
der Zelle sich deutlich von der außerhalb der Zelle unter
scheidet.
Die oben beschriebenen Ausführungsformen beziehen sich auf
die Bestimmung der Kalziumionenkonzentration in der Zelle.
Indessen ist die vorliegende Erfindung auch für die Bestim
mung der Konzentration von Wasserstoffionen oder der Konzen
tration von Makromolekülen wie beispielsweise Proteinen
geeignet. In jedem der Fälle können die gleichen Effekte
erzielt werden.
Wie zuvor beschrieben wurde, können gemäß der vorliegenden
Erfindung herausragende Effekte erzielt werden. Zum Beispiel
kann eine zweidimensionale Konzentrationsverteilung in einer
Zelle in Bezug auf die Kontur der Zelle erhalten werden.
Zusätzlich kann der Pegel des Hintergrundfluoreszenzlichtes
objektiv gesetzt werden, um die Ionenkonzentration exakt zu
bestimmen.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Bilden eines zwei
dimensionalen Konzentrationsverteilungsbildes von spezifi
schen zu untersuchenden Ionen in einer lebenden Zelle auf
der Grundlage der Variation im Fluoreszenzspektrum oder im
Anregungsspektrum einer Fluoreszenzprobe. Das Verfahren um
faßt die Schritte des Eingebens einer Fluoreszenzprobe in
eine Zelle; Erhalten eines Fluoreszenzintensitätsvertei
lungsbildes durch Bestimmung des Fluoreszenzlichtes aus der
Fluoreszenzprobe in einem Bereich, der die Zelle umfaßt; op
tisches Vermessen der Zelle, wobei ein Bild der Zelle erhal
ten wird, das aus der Gruppe bestehend aus einem Hellfeld
bild, einem Phasenkontrastbild, einem Nomarskidifferential
interferenzkontrastbild und einem Polarisationsbild ausge
wählt wurde; Bestimmen eines Hintergrundfluoreszenzwertes
aus einem Profil des Fluoreszenzintensitätsbildes und einem
Profil des Zellbildes; Bilden eines zweidimensionalen Kon
zentrationsverteilungsbildes der zu untersuchenden Ionen
durch Bildverarbeitung, die die Subtraktion des Hintergrund
fluoreszenzwertes von dem Fluoreszenzintensitätsverteilungs
bild umfaßt; und Aussetzen des Zellbildes und des zweidimen
sionalen Konzentrationsverteilungsbildes der Ionen einer
Bildverarbeitung, wobei beide Bilder in einer überlagerten
Art und Weise angezeigt werden.
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung eines zweidimensionalen Verteilungsbildes
der Ionenkonzentration von bestimmten zu
untersuchenden Ionen in einer lebenden Zelle, auf der
Grundlage der Variation im Fluoreszenzspektrum oder im
Anregungsspektrum einer Fluoreszenzprobe, wobei das
Verfahren die Schritte beinhaltet:
Eingeben einer Fluoreszenzprobe in eine Zelle;
Erhalten eines Fluoreszenzintensitätsverteilungsbildes durch Bestimmen des Fluoreszenzlichtes von der Fluoreszenzprobe in einem Bereich, der die Zelle umfaßt;
optisches Vermessen der Zelle, wobei ein Zellbild der Zelle erhalten wird, welches aus der Gruppe bestehend aus einem Hellfeldbild, einem Phasenkontrastbild, einem Nomarskidifferentialinterferenzkontrastbild und einem Polarisationsbild ausgewählt wurde;
Bestimmen eines Hintergrundfluoreszenzwertes aus einem Profil des Fluoreszenzintensitätsbildes und einem Profil des Zellbildes;
Bilden eines zweidimensionalen Verteilungsbildes der Konzentration der zu untersuchenden Ionen, indem eine Bildverarbeitung durchgeführt wird, die die Subtraktion des Hintergrundfluoreszenzwertes von dem Fluoreszenzintensitätsverteilungsbild beinhaltet; und
Unterziehen des Zellbildes und des zweidimensionalen Verteilungsbildes der Ionenkonzentration einer Bildverarbeitung, wobei beide Bilder in einer überlagerten Art und Weise angezeigt werden.
Eingeben einer Fluoreszenzprobe in eine Zelle;
Erhalten eines Fluoreszenzintensitätsverteilungsbildes durch Bestimmen des Fluoreszenzlichtes von der Fluoreszenzprobe in einem Bereich, der die Zelle umfaßt;
optisches Vermessen der Zelle, wobei ein Zellbild der Zelle erhalten wird, welches aus der Gruppe bestehend aus einem Hellfeldbild, einem Phasenkontrastbild, einem Nomarskidifferentialinterferenzkontrastbild und einem Polarisationsbild ausgewählt wurde;
Bestimmen eines Hintergrundfluoreszenzwertes aus einem Profil des Fluoreszenzintensitätsbildes und einem Profil des Zellbildes;
Bilden eines zweidimensionalen Verteilungsbildes der Konzentration der zu untersuchenden Ionen, indem eine Bildverarbeitung durchgeführt wird, die die Subtraktion des Hintergrundfluoreszenzwertes von dem Fluoreszenzintensitätsverteilungsbild beinhaltet; und
Unterziehen des Zellbildes und des zweidimensionalen Verteilungsbildes der Ionenkonzentration einer Bildverarbeitung, wobei beide Bilder in einer überlagerten Art und Weise angezeigt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß der Schritt des Erhaltens eines Zellbildes vor
dem Schritt des Erhaltens eines Fluoreszenzintensitätsverteilungsbildes
durchgeführt wird, in dem
Fluoreszenzlicht bestimmt wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß ein zweidimensionales Verteilungsbild
der Kalziumionen-Konzentration in einer
lebenden Zelle unter Verwendung einer Fluoreszenzprobe
aus fura-2®, Quin-2® und Indo-1® gebildet wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß Bilddaten des zweidimensionalen
Verteilungsbildes einer affinen Transformation
ausgesetzt werden, um das Koordinatensystem des zweidimensionalen
Verteilungsbildes mit dem Koordinatensystem
der Daten des Zellbildes in Koinzidenz zu
bringen.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß das Zellbild ein monochromatisches
Bild ist und das zweidimensionale Verteilungsbild
ein Vielfarbenbild ist, welches Farben
entsprechend den Ionenkonzentrationen aufweist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die überlagerte Anzeige des
Zellbildes und des zweidimensionalen Verteilungsbildes
mittels einer Exklusiv-ODER-Verknüpfung durchgeführt
wird.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1218366A JP2799191B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | 細胞内イオンの2次元濃度分布像を形成する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4026564A1 DE4026564A1 (de) | 1991-02-28 |
DE4026564C2 true DE4026564C2 (de) | 1993-05-19 |
Family
ID=16718767
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE4026564A Granted DE4026564A1 (de) | 1989-08-24 | 1990-08-22 | Verfahren zum herstellen eines zweidimensionalen verteilungsbildes einer ionenkonzentration in einer zelle |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5097135A (de) |
JP (1) | JP2799191B2 (de) |
DE (1) | DE4026564A1 (de) |
FR (1) | FR2651321B1 (de) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19829495A1 (de) * | 1998-07-02 | 2000-01-05 | Jacques Paysan | Reagenzien und deren Anwendung zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen zellulären Molekülen und deren Lokalisation in Zellen |
DE102008057115A1 (de) * | 2008-11-13 | 2010-05-20 | Lre Medical Gmbh | Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Fluorophoren einer Substanz in einer Probe und Vorrichtung zu seiner Durchführung |
DE102011111315A1 (de) * | 2011-08-26 | 2013-02-28 | Bundesrepublik Deutschland, vertreten durch das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie, dieses vertreten durch den Präsidenten der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt | Verfahren zur Fluoreszenzmessung |
DE102021001955A1 (de) | 2021-04-14 | 2022-10-20 | Baumer Inspection Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur fluoreszenzbasierten Inspektion sowie Prüfanordung mit einer solchen Vorrichtung |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4026821A1 (de) * | 1990-08-24 | 1992-03-05 | Philips Patentverwaltung | Verfahren zur erfassung von anomalien der haut, insbesondere von melanomen, sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
US5461236A (en) * | 1992-06-09 | 1995-10-24 | Herbert R. Gram | Oil spill detection system |
US5949077A (en) * | 1992-08-10 | 1999-09-07 | Alfano; Robert R. | Technique for imaging an object in or behind a scattering medium |
JPH07194393A (ja) * | 1992-08-24 | 1995-08-01 | Hamamatsu Photonics Kk | 生細胞内イオン濃度の3波長測光法のための定数最適化方法 |
DE4228366C2 (de) * | 1992-08-26 | 1995-05-24 | Rainer Dr Uhl | Fluoreszenz-Meßvorrichtung |
US5355215A (en) * | 1992-09-30 | 1994-10-11 | Environmental Research Institute Of Michigan | Method and apparatus for quantitative fluorescence measurements |
FI96638C (fi) * | 1992-11-17 | 1996-07-25 | Biohit Oy | "Inner-filter"-korjaus fluorometripohjaisella monitoimintoisella laitteella |
US6800452B1 (en) * | 1994-08-08 | 2004-10-05 | Science Applications International Corporation | Automated methods for simultaneously performing a plurality of signal-based assays |
WO1997024601A1 (en) * | 1995-12-29 | 1997-07-10 | Thomas Adam Shine | Method for testing a cell sample |
US5986271A (en) * | 1997-07-03 | 1999-11-16 | Lazarev; Victor | Fluorescence imaging system |
US6544794B1 (en) * | 2000-05-12 | 2003-04-08 | Shiseido Company, Ltd. | Method for visual imaging of ion distribution in tissue |
US6702453B2 (en) | 2001-10-26 | 2004-03-09 | Birchwood Lighting, Inc. | Flexible light fixture |
DE10327382A1 (de) * | 2003-06-16 | 2005-01-05 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie |
US7396650B2 (en) * | 2003-06-27 | 2008-07-08 | Commissariat A L'energie Atomique | Method for dosing a biological or chemical sample |
FR2856792B1 (fr) * | 2003-06-27 | 2006-09-15 | Commissariat Energie Atomique | Procede et dispositif de dosage d'un echantillon biologique ou chimique |
US7491943B2 (en) * | 2005-01-13 | 2009-02-17 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Method and apparatus for UV imaging |
US20090092319A1 (en) * | 2007-10-03 | 2009-04-09 | Olympus Corporation | Phase-information extraction method |
FR2942899B1 (fr) * | 2009-03-03 | 2011-09-23 | Jose Balbuena | Dispositif et procede d'analyse optique de documents |
JP5387328B2 (ja) * | 2009-08-31 | 2014-01-15 | ソニー株式会社 | 蛍光像取得装置、蛍光像取得方法及び蛍光像取得プログラム |
US8649008B2 (en) * | 2010-02-04 | 2014-02-11 | University Of Southern California | Combined spectral and polarimetry imaging and diagnostics |
JP6253225B2 (ja) * | 2012-09-18 | 2017-12-27 | オリンパス株式会社 | 顕微鏡システムおよび顕微鏡観察方法 |
EP3086110A4 (de) * | 2013-12-18 | 2017-06-21 | Konica Minolta, Inc. | Bildverarbeitungsvorrichtung, system zur unterstützung einer pathologischen diagnose, bildverarbeitungsprogramm und bildverarbeitungsverfahren |
JP6681875B2 (ja) * | 2015-03-02 | 2020-04-15 | シチズン時計株式会社 | 光測定装置及びこれを備えた歯ブラシ |
CN105548097B (zh) * | 2015-12-04 | 2018-06-29 | 贵州大学 | 一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞成像方法 |
JP6742724B2 (ja) * | 2015-12-28 | 2020-08-19 | シスメックス株式会社 | 細胞領域決定方法、細胞撮像システム、細胞画像の処理装置及びコンピュータプログラム |
WO2019012771A1 (ja) * | 2017-07-11 | 2019-01-17 | 浜松ホトニクス株式会社 | 試料観察装置及び試料観察方法 |
JP6656210B2 (ja) * | 2017-07-21 | 2020-03-04 | 株式会社日立ハイテクサイエンス | 分光蛍光光度計 |
JP6919890B2 (ja) * | 2017-07-21 | 2021-08-18 | 株式会社日立ハイテクサイエンス | 光分析装置用の表示装置 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4006360A (en) * | 1974-08-21 | 1977-02-01 | Block Engineering, Inc. | Method of discriminating between dyed particles and background fluorescence of the dye |
US4631750A (en) * | 1980-04-11 | 1986-12-23 | Ampex Corporation | Method and system for spacially transforming images |
US4492752A (en) * | 1982-09-03 | 1985-01-08 | Ortho Diagnostics Systems Inc. | Method for discriminating between unstained and absorbing dye stained cells |
EP0112401B1 (de) * | 1982-12-27 | 1987-04-22 | International Business Machines Corporation | Optisches Nahfeldabtastmikroskop |
US4495293A (en) * | 1983-02-24 | 1985-01-22 | Abbott Laboratories | Fluorometric assay |
US4668868A (en) * | 1986-02-20 | 1987-05-26 | Noller Hans T | Apparatus for performing fluoroimmunoassays of biological specimens |
US5049673A (en) * | 1987-10-30 | 1991-09-17 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent indicator dyes for calcium working at long wavelengths |
JP2749069B2 (ja) * | 1988-04-26 | 1998-05-13 | オリンパス光学工業株式会社 | 蛍光顕微鏡装置 |
JPH0212060A (ja) * | 1988-06-30 | 1990-01-17 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 細胞の状態のモニター方法及びその装置 |
-
1989
- 1989-08-24 JP JP1218366A patent/JP2799191B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-08-06 US US07/563,251 patent/US5097135A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-10 FR FR9010269A patent/FR2651321B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-22 DE DE4026564A patent/DE4026564A1/de active Granted
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19829495A1 (de) * | 1998-07-02 | 2000-01-05 | Jacques Paysan | Reagenzien und deren Anwendung zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen zellulären Molekülen und deren Lokalisation in Zellen |
DE102008057115A1 (de) * | 2008-11-13 | 2010-05-20 | Lre Medical Gmbh | Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Fluorophoren einer Substanz in einer Probe und Vorrichtung zu seiner Durchführung |
US8334522B2 (en) | 2008-11-13 | 2012-12-18 | Lre Medical Gmbh | Method for the quantitative determination of the concentration of fluorophores of a substance in a sample and apparatus for carrying out the same |
DE102008057115B4 (de) * | 2008-11-13 | 2013-11-28 | Lre Medical Gmbh | Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Fluorophoren einer Substanz in einer Probe und Vorrichtung zu seiner Durchführung |
DE102011111315A1 (de) * | 2011-08-26 | 2013-02-28 | Bundesrepublik Deutschland, vertreten durch das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie, dieses vertreten durch den Präsidenten der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt | Verfahren zur Fluoreszenzmessung |
DE102021001955A1 (de) | 2021-04-14 | 2022-10-20 | Baumer Inspection Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur fluoreszenzbasierten Inspektion sowie Prüfanordung mit einer solchen Vorrichtung |
DE102021001955B4 (de) | 2021-04-14 | 2023-03-23 | Baumer Inspection Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur fluoreszenzbasierten Inspektion sowie Prüfanordung mit einer solchen Vorrichtung |
US11921044B2 (en) | 2021-04-14 | 2024-03-05 | Baumer Inspection Gmbh | Inspection arrangement and method for fluorescence-based inspection |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2799191B2 (ja) | 1998-09-17 |
US5097135A (en) | 1992-03-17 |
FR2651321B1 (fr) | 1994-04-29 |
JPH0381648A (ja) | 1991-04-08 |
DE4026564A1 (de) | 1991-02-28 |
FR2651321A1 (fr) | 1991-03-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE4026564C2 (de) | ||
EP1504300B1 (de) | Verfahren und anordnung zur untersuchung von proben | |
DE10033180B4 (de) | Verfahren zur Detektion von Farbstoffen in der Fluoreszenzmikroskopie | |
DE19915137C2 (de) | Verfahren zur Quantifizierung mehrerer Fluorochrome in einer mehrfach gefärbten Probe bei der Fluoreszenzmikroskopie und Verwendungen des Verfahrens | |
DE102005022880B4 (de) | Trennung spektral oder farblich überlagerter Bildbeiträge in einem Mehrfarbbild, insbesondere in transmissionsmikroskopischen Mehrfarbbildern | |
DE2437984B2 (de) | Verfahren zur kontrastverbesserung eines optischen mikroskopes | |
WO2004080308A1 (de) | Bildgerungsverfahren, basierend auf zwei verschiedenen röntgestrahlspektren | |
EP1556728A1 (de) | Verfahren zur berbesserung der tiefendiskriminierung optisch abbildender systeme | |
WO2022079260A1 (de) | Verfahren und fluoreszenzmikroskop zur ortsbestimmung einzelner fluoreszierender farbstoffmoleküle durch adaptive abtastung | |
DE102017203448B4 (de) | Mikroskopiesystem und Mikroskopieverfahren zum Quantifizieren einer Fluoreszenz | |
EP3374755B1 (de) | Lichtmikroskop und verfahren zum bestimmen einer wellenlängenabhängigen brechzahl eines probenmediums | |
EP1461600A1 (de) | Verfahren und/oder anordnung zur identifikation von fluoreszierenden, lumineszierenden und/oder absorbierenden substanzen auf und/oder in probenträgern | |
EP1384104A2 (de) | Vorrichtung und verfahren zur optischen messung von chemischen und/oder biologischen proben | |
DE102017221187B4 (de) | Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von verschiedenen, in einem Objekt enthaltenen Fluoreszenzemittern und Mikroskopiesystem | |
DE102018122816B4 (de) | Verfahren und Vorrichtung zum Bestimmen einer Eigenschaft eines Objekts | |
DE2742957C2 (de) | Mikroskop-Photometer | |
DE102021203187B3 (de) | Verfahren zum Bereitstellen einer Abbildung mittels eines Operationsmikroskops und Operationsmikroskop | |
EP4187306A1 (de) | Verfahren zum auswerten von messdaten eines lichtfeldmikro-skops und vorrichtung zur lichtfeldmikroskopie | |
DE102004044626B4 (de) | Verfahren zur Untersuchung von Transportprozessen | |
EP0678193A1 (de) | Vorrichtung zur mehrfarbbeleuchtung von präparaten | |
DE60017240T2 (de) | Vorrichtung und Verfahren zur Analyse aufgenommener Scandaten | |
DE102020107762A1 (de) | Fluoreszenzmikroskop und Verfahren zur Abbildung eines Objekts | |
DE102021112658A1 (de) | VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUM GEWINNEN EINES WEIßABGEGLICHENEN BILDS EINER PROBE | |
DE102021133867A1 (de) | Mikroskopiesystem und Verfahren zur Reduzierung einer Bildvignettierung | |
DE102021114288A1 (de) | Synthetische fluoreszenzbilder mit proben-spezifischer referenz |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |