Recherche Images Maps Play YouTube Actualités Gmail Drive Plus »
Connexion
Les utilisateurs de lecteurs d'écran peuvent cliquer sur ce lien pour activer le mode d'accessibilité. Celui-ci propose les mêmes fonctionnalités principales, mais il est optimisé pour votre lecteur d'écran.

Brevets

  1. Recherche avancée dans les brevets
Numéro de publicationDE4110085 A1
Type de publicationDemande
Numéro de demandeDE19914110085
Date de publication1 oct. 1992
Date de dépôt27 mars 1991
Date de priorité27 mars 1991
Numéro de publication19914110085, 914110085, DE 4110085 A1, DE 4110085A1, DE-A1-4110085, DE19914110085, DE4110085 A1, DE4110085A1, DE914110085
InventeursHelmut Dipl Ing Brunar, Armin Dipl Ing Holzner, Georg Dipl Ing Issakides, Max Prof Dr Knollmueller, Christian Dipl Ing Dr Noe, Max Prof Dr Birnstiel, Matthew Dr Cotten, Bernd Dr Oberhauser, Ernst Dr Wagner, Gotthold Dr Schaffner
DéposantBoehringer Ingelheim Int
Exporter la citationBiBTeX, EndNote, RefMan
Liens externes: DPMA (Office allemand des brevets et des marques), Espacenet
New 2'O-alkyl-oligo-ribonucleotide(s) with 8-35 nucleotide units - useful as anti-sense oligo-nucleotide(s), primers and probes
DE 4110085 A1
Résumé
The following are claimed: (A) Prepn. of an oligoribonucleotide (A), based on 8-35 nucleotides of formula (II) (or a 2'-OH or 2'-deoxy deriv.) comprises: (a) linking the corresp. ribonucleotide building blocks in the presence of a coupling agent; and (b) opt. incorporating labelled gps. and/or lipophilic gps. in (A) and opt. cleaving protecting gps.. In (II), B = cytosine, uracil, adenine, guanine or inosine; R = 1-30C alkyl; E1 = a phosphate diester-, methyl phosphonate, phosphoramidate- or phosphorthioate-residue; Provided that (i) at least one R is 2-30C alkyl and (ii) the terminal 3' and 5' positions are an OH gp. (opt. modified by a labelled or lipophilic gp.) or a phosphite ester-, H-phosphonate- or phosphate ester-residue. (B) Prepn. of an oligoribonucleotide (A'), based on 8-35 nucleotides; (C) (A) are new (A'') when the terminal 3' and 5' positions are OH (opt. modified by labelled or lipophilic gps.) or a phosphate ester residue; (D) Prepn. of nucleosides of formula (III) where B'' = opt. protected cytosine, uracil, adenine, guanine or inosine; R'' = 2-30C alkyl when B is opt. protected adenine, otherwise 1-30C. (E) (III) are new (i) when B'' is guanine protected in 6-position by nitrophenylethyl and R'' is methyl, and (ii) when R'' is 2-30C alkyl and B'' is opt. protected cytosine, inosine, uracil or guanine. (F) Alkylated ribonucleotide building blocks are new; and (G) Liposomes, in which are incorporated (A'') modified by 3'cholesterol or 3'-thiocholesterol, are new. USE - (A'') are useful as antisense oligonucleotides, probes, primers or primer sections. They may be used to inhibit gene expression or virus replication.
Revendications(23)  Langue du texte original : Allemand
1. Oligoribonukleotide, aufgebaut aus 8 bis 35 Nukleotiden der allgemeinen Formel II, worin 1. oligoribonucleotides, composed of 8 to 35 nucleotides of the general formula II wherein
B Cytosin, Uracil, Adenin, Guanin oder Inosin bedeutet, B is cytosine, uracil, adenine, guanine or inosine means
R Alkyl mit 1 bis 30 C-Atomen bedeutet, und R is alkyl having 1 to 30 carbon atoms, and
E¹ ein Phosphatdiester-, Methylphosphonat-, Phosphoramidat- oder Phosphorthioatrest ist, E¹ a Phosphatdiester-, methylphosphonate, phosphoramidate or Phosphorthioatrest is,
oder deren 2′-OH oder 2′-Desoxyderivat, or its 2'-OH or 2'-deoxy derivative,
wobei in mindestens einem der Nukleotide R Alkyl mit 2 bis 30 C-Atomen ist, und worin die endständigen Gruppen in den Positionen 3′ und 5′ unabhängig voneinander eine Hydroxylgruppe oder einen Phosphatesterrest, oder eine durch eine markierende Gruppe oder lipophile Gruppe modifizierte Hydroxylgruppe bedeuten. wherein in at least one of the nucleotides R is alkyl having 2 to 30 carbon atoms, and wherein the terminal groups are independently at positions 3 'and 5' represent a hydroxyl group or a phosphate ester moiety or a marking by a group or lipophilic group-modified hydroxyl group ,
2. Oligoribonukleotid nach Anspruch 1, worin in dem Nukleotid der Formel II B ungeschütztes Adenin, Cytosin, Uracil oder Guanin ist. 2. oligoribonucleotide according to claim 1, wherein in the nucleotide of the formula B is unprotected adenine, cytosine, guanine, uracil or II.
3. Oligoribonukleotid nach Anspruch 1 oder 2, worin R Alkyl mit 2 bis 8 C-Atomen, vorzugsweise Ethyl, ist. 3. oligoribonucleotide according to claim 1 or 2, wherein R is alkyl having 2 to 8 carbon atoms, preferably ethyl, is.
4. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das in Position 3′ durch Fluorescein oder Thiocholesterol modifiziert ist. 4. oligoribonucleotide according to any one of claims 1 to 3, modified in position 3 'by fluorescein or Thiocholesterol.
5. Liposom, in das 3′-Cholesterin oder 3′-thiocholesterinmodifiziertes Oligoribonukleotid, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, inkorporiert ist. 5. liposome is in the 3 'or 3'-cholesterol thiocholesterinmodifiziertes oligoribonucleotide, as defined in any one of claims 1 to 3, incorporated.
6. Alkylierter Ribonukleotidbaustein der allgemeinen Formel I, worin 6. alkylated Ribonukleotidbaustein of the general formula I wherein
B ungeschütztes oder geschütztes Cytosin, Uracil, Adenin, Guanin oder Inosin bedeutet, B unprotected or protected cytosine, uracil, adenine, guanine or inosine means
R Alkyl mit 2 bis 30 C-Atomen bedeutet, E ein Phosphitester-, H-Phosphonat-, Phosphatester-, Phosphatdiester- oder Phosphoramidatrest ist und R is alkyl having 2 to 30 carbon atoms, E is a Phosphitester-, H-phosphonate, phosphate ester, or Phosphatdiester- Phosphoramidatrest and
S¹ eine in der Oligonukleotidsynthese übliche Schutzgruppe bedeutet. S¹ is a conventional in oligonucleotide synthesis protecting group.
7. Ribonukleotidbaustein nach Anspruch 6, worin B N⁶-Benzoyladenin oder N⁶-Phenoxyacetyl-adenin, N⁴-Benzoyl-cytosin, Uracil oder N³-Cyanoethyl-uracil, N²-Benzoyl-guanin, N²-Phenoxyacetyl-guanin oder N²-Phenoxyacetyl-O⁶-nitrophenylethyl-guanin ist. 7. Ribonukleotidbaustein according to claim 6, wherein B N⁶-benzoyladenine or N⁶-phenoxyacetyl-adenine, N⁴-benzoyl-cytosine, uracil or N³-cyanoethyl-uracil, N²-benzoyl-guanine, N²-phenoxyacetyl-guanine or N²-phenoxyacetyl-O⁶ -nitrophenylethyl-guanine is.
8. Ribonukleotidbaustein nach Anspruch 6 oder 7, worin R Alkyl mit 2 bis 8 C-Atomen, vorzugsweise Ethyl oder n-Butyl ist. 8. Ribonukleotidbaustein according to claim 6 or 7, wherein R is alkyl having 2 to 8 carbon atoms, preferably ethyl or n-butyl.
9. Ribonukleotidbaustein nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin EN,N-Di(1-methylethyl)methoxyphosphoramidit oder N,N-Di(1-methylethyl)-cyanoethoxyphosphoramidit ist. 9. Ribonukleotidbaustein according to any one of claims 6 to 8, wherein EN, N-di (1-methylethyl) methoxyphosphoramidit or N, N-di (1-methylethyl) is -cyanoethoxyphosphoramidit.
10. Ribonukleotidbaustein nach einem der Ansprüche 6 bis 9, worin S¹ Dimethoxytrityl oder Monoethoxytrityl ist. 10. Ribonukleotidbaustein according to any one of claims 6 to 9, wherein S¹ or Monoethoxytrityl is dimethoxytrityl.
11. Nukleosid der allgemeinen Formel III, worin 11. nucleoside of the general formula III in which
B in Position 6 durch Nitrophenylethyl geschütztes Guanin und B in position 6, protected by nitrophenylethyl guanine and
R Methyl ist, oder R is methyl, or
B ungeschütztes oder geschütztes Cytosin, Inosin, Uracil oder Guanin ist und B unprotected or protected cytosine, inosine, uracil or guanine and
R Alkyl mit 2 bis 30 C-Atomen. R is alkyl having 2 to 30 carbon atoms.
12. Nukleosid nach Anspruch 11, worin B N⁴-Benzoyl-cytosin, N³-Cyanoethyl-uracil, N²-Phenoxyacetyl-guanin oder N²-Phenoxyacetyl-O⁶-nitrophenylethyl-guanin ist und/oder R Alkyl mit 2 bis 8 C-Atomen, vorzugsweise Ethyl oder n-Butyl ist. 12. The nucleoside of claim 11, wherein B N⁴-benzoyl-cytosine, N³-cyanoethyl-uracil, guanine or N²-phenoxyacetyl-N²-phenoxyacetyl-O⁶-nitrophenylethyl-guanine and / or R is alkyl having 2 to 8 carbon atoms, preferably ethyl or n-butyl.
13. Verfahren zur Herstellung eines Oligoribonukleotides, aufgebaut aus 8 bis 35 Nukleotiden der allgemeinen Formel II, worin 13. A method for producing a oligoribonucleotide, composed of 8 to 35 nucleotides of the general formula II wherein
B Cytosin, Uracil, Adenin, Guanin oder Inosin bedeutet, B is cytosine, uracil, adenine, guanine or inosine means
R Alkyl mit 1 bis 30 C-Atomen bedeutet, und R is alkyl having 1 to 30 carbon atoms, and
E¹ ein Phosphatdiester-, Methylphosphonat-, Phosphoramidat- oder Phosphorthioatrest ist, E¹ a Phosphatdiester-, methylphosphonate, phosphoramidate or Phosphorthioatrest is,
oder deren 2′-OH oder 2′-Desoxyderivat, or its 2'-OH or 2'-deoxy derivative,
wobei in mindestens einem der Nukleotide R Alkyl mit 2 bis 30 C-Atomen ist, und wherein in at least one of the nucleotides R is alkyl having 2 to 30 carbon atoms, and
worin die endständigen Gruppen in den Positionen 3′ und 5′ unabhängig voneinander eine Hydroxylgruppe, einen Phosphitester-, H-Phosphonat- oder Phosphatesterrest, oder eine durch eine markierende Gruppe oder lipophile Gruppe modifizierte Hydroxylgruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man die entsprechenden Ribonukleotidbausteine in Gegenwart eines Kopplungsreagenz verknüpft und gewünschtenfalls in das so erhaltene Oligoribonukleotid markierende Gruppen und/oder lipophile Gruppen einführt und gewünschtenfalls Schutzgruppen abspaltet. wherein the terminal groups in the positions 3 'and 5' are independently a hydroxyl group, a Phosphitester-, H-phosphonate or phosphate ester moiety or a labeling group or by a lipophilic group mean modified hydroxyl group, characterized in that, in the corresponding ribonucleotide moieties the presence of a coupling reagent linked and introducing, if desired, in the resulting oligoribonucleotide labeling groups and / or lipophilic groups and, if desired, removing any protecting groups.
14. Verfahren zur Herstellung eines Oligoribonukleotides, aufgebaut aus 8 bis 35 Nukleotiden der allgemeinen Formel II worin 14. A method for producing a oligoribonucleotide, composed of 8 to 35 nucleotides of the general formula II wherein
B Cytosin, Uracil, Adenin, Guanin oder Inosin bedeutet, B is cytosine, uracil, adenine, guanine or inosine means
R Alkyl mit 1 bis 30 C-Atomen bedeutet, und R is alkyl having 1 to 30 carbon atoms, and
E¹ ein Phosphatester-, Phosphatdiester-, Methylphosphonat-, Phosphoramidat- oder Phosphorthioatrest ist, E¹ a phosphate ester, Phosphatdiester-, methylphosphonate, phosphoramidate or Phosphorthioatrest is,
oder deren 2′-OH oder 2′-Desoxyderivat, wobei mindestens eines der Nukleotide ein 2′-OR-Nukleotid (II) ist, und or its 2'-OH or 2'-deoxy derivative, wherein at least one of the nucleotides is a 2'-OR-nucleotide (II), and
worin die endständigen Gruppen in den Positionen 3′ und 5′ unabhängig voneinander eine Hydroxylgruppe, oder einen Phosphatesterrest, oder eine durch eine markierende Gruppe oder lipophile Gruppe modifizierte Hydroxylgruppe bedeuten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die entsprechenden Ribonukleotidbausteine durch folgendes mehrstufiges Verfahren herstellt wherein the terminal groups in the positions 3 'and 5' are independently a hydroxyl group, or a phosphate ester moiety or a marking by a group or lipophilic group mean modified hydroxyl group, which is characterized by preparing the corresponding ribonucleotide moieties by the following multi-step procedure
  • a) Alkylieren eines Nukleosids der allgemeinen Formel IV, worin B geschütztes oder ungeschütztes Adenin, Cytosin oder Inosin oder O⁶-geschütztes Guanin oder N³-geschütztes Uracil ist und gewünschtenfalls die Hydroxygruppe in Position 5′ geschützt ist, in Gegenwart einer deprotonierenden Base mit einem Alkylierungsmittel der allgemeinen Formel V,RZ (V)worin R Alkyl mit 1 bis 30 C-Atomen ist und Z für eine nukleophile Abgangsgruppe (z. B. Halogen, Tosyl, Mesyl, Ethylsulfatrest) vorzugsweise Jod steht, umsetzt; a) alkylation of a nucleoside of the general formula IV wherein B is protected or unprotected adenine, cytosine or inosine or O⁶-protected guanine or N³-protected uracil and, if desired, the hydroxy group is' protected in position 5, in the presence of a deprotonating base with an alkylating agent of the general formula V, RZ (V) wherein R is alkyl having 1 to 30 carbon atoms, and Z is a nucleophilic leaving group, preferably iodine, is reacted (for example, halogen, tosyl, mesyl, Ethylsulfatrest.);
  • b) Einführen von Schutzgruppen in den Basen und der Position 5′ (vorzugsweise Mono- oder Dimethoxytrityl); b) introducing the protective groups in the bases and the 5 'position (preferably mono- or dimethoxytrityl);
  • c) Phosphorylieren des aus dem Reaktionsgemisch isolierten 2′-O-Alkylnukleosides durch Umsetzen mit einem Phosphorylierungsmittel, vorzugsweise Phosphoramidit; c) phosphorylation of the isolated from the reaction mixture 2'-O-Alkylnukleosides by reacting with a phosphorylating agent, preferably phosphoramidite;
  • d) Isolieren des 2′-O-Alkylnukleosid-Phosphoramidits durch Standardverfahren oder vorzugsweise durch Zusatz eines lipophilen Alkohols, vorzugsweise sec-Butanol oder iso-Propanol und Abtrennen des erwünschten 2′-O-Alkylnukleosid-Phosphoramidits durch Extraktion und Ausfällung; d) isolating said 2'-O-phosphoramidite Alkylnukleosid by standard methods or, preferably, by addition of a lipophilic alcohol, preferably sec-butanol or iso-propanol, and separating the desired 2'-O-phosphoramidite Alkylnukleosid by extraction and precipitation; und and
  • e) die so erhaltenen Ribonukleotidbausteine (gewünschtenfalls zusammen mit obengenannten 2′-OH und/oder 2′-H-Derivaten) nach Standardmethoden verknüpft, die Schutzgruppen abtrennt und gewünschtenfalls in das so erhaltene Oligonukleotid markierende Gruppen und/oder lipophile Gruppen einführt. e) the thus obtained ribonucleotide moieties (optionally linked together with the above-mentioned 2'-OH and / or 2'-H derivatives) according to standard methods, the protecting groups is separated off and, if desired, in the resulting oligonucleotide labeling groups and / or lipophilic groups introduced.
15. Verfahren nach Anspruch 14, worin zur Herstellung von Guanin enthaltenden Endprodukten ein Nukleosid (IV) verwendet wird, in dem B O⁶-[2-(4-Nitrophenyl)ethyl]-guanin ist. 15. The method of claim 14, wherein used for the production of guanine-containing end products a nucleoside (IV) in which B O⁶- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] guanine is.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkylierung in Gegenwart von Natriumhydrid als deprotonierender Base, unter Verwendung von R-Jodid als Alkylierungsmittel (V) bei Temperaturen bis höchstens Raumtemperatur ausgeführt wird. 16. The method according to claim 14 or 15, characterized in that the alkylation is carried out in the presence of sodium hydride as a base deprotonierender, using R-iodide as the alkylating agent (V) at temperatures up to at most room temperature.
17. Verfahren zur Herstellung der Liposomen gemäß Anspruch 4, durch Mischen und Beschallen der beiden Phasen, deren eine die Liposomen und deren andere die cholesterin- und/oder thiocholesterinmodifizierten Oligoribonukleotide enthält. 17. A method for preparing the liposomes according to claim 4, by mixing and sonication of the two phases, one of which, the liposome and the other cholesterol and / or contains thiocholesterinmodifizierten oligoribonucleotides.
18. Verfahren zur Herstellung eines Ribonukleotidbausteins nach einem der Ansprüche 6 bis 10 durch Umsetzen des entsprechenden Nukleosides mit einem Phosphorylierungsmittel und Isolieren des gegebenenfalls Schutzgruppen enthaltenden Nukleotides. 18. A method for producing a Ribonukleotidbausteins according to one of claims 6 to 10 by reacting the appropriate nucleoside with a phosphorylating agent and isolating the protecting groups optionally containing nucleotide.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß Phosphoramidid als Phosphorylierungsmittel verwendet wird und das Isolieren des 2′-O-Alkylnukleosid-phosphoramidits durch Standardverfahren oder vorzugsweise durch Zusatz eines lipophilen Alkohols, vorzugsweise sec-Butanol oder iso-Propanol, Extraktion und Ausfällung erfolgt. 19. The method according to claim 18, characterized in that Phosphoramidid is used as a phosphorylating agent and isolating the 2'-O-phosphoramidite Alkylnukleosid by standard methods or, preferably, by addition of a lipophilic alcohol, preferably sec-butanol or iso-propanol, extraction and precipitation carried out.
20. Verfahren zur Herstellung eines Nukleosides der allgemeinen Formel III, worin B geschütztes oder ungeschütztes Cytosin, Uracil, Adenin, Guanin oder Inosin bedeutet und R Alkyl mit 1-30 C-Atomen bedeutet wenn B geschütztes oder ungeschütztes Cytosin, Uracil, Guanin oder Inosin ist und Alkyl mit 2-30 C-Atomen bedeutet, wenn B geschütztes oder ungeschütztes Adenin bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nukleosid der allgemeinen Formel IV worin B geschütztes oder ungeschütztes Adenin, Cytosin oder Inosin oder O⁶-geschütztes Guanin oder N³-geschütztes Uracil ist und gewünschtenfalls die Hydroxygruppe in Position 5′ geschützt ist, in Gegenwart einer deprotonierenden Base mit einem Alkylierungsmittel der allgemeinen Formel V,RZ (V)worin R Alkyl mit 1 bis 30 C-Atomen ist und Z für eine nukleophile Abgangsgruppe steht, umsetzt und gewünschtenfalls Schutzgruppen abtrennt. 20. A process for the preparation of a nucleoside of the general formula III in which B protected or unprotected cytosine, uracil, adenine, guanine or inosine, and R is alkyl of 1-30 carbon atoms when B is protected or unprotected cytosine, uracil, guanine or inosine and is alkyl having 2-30 C atoms, or, when B represents adenine, protected or unprotected, characterized in that a nucleoside of the general formula IV wherein B is protected or unprotected adenine, cytosine or inosine or O⁶-protected guanine or N³-protected is uracil and, if desired, the hydroxy group is' protected in position 5, in the presence of a deprotonating base with an alkylating agent of the general formula V, RZ (V) wherein R is alkyl having 1 to 30 carbon atoms and Z is a nucleophilic leaving group, is reacted and, if desired, protecting groups separated.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Alkylierungsmittel (V) verwendet, worin Z Brom oder vorzugsweise Jod ist. 21. The method according to claim 20, characterized in that an alkylating agent (V) wherein Z is bromine or preferably iodine.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Alkylierungsmittel verwendet in dem R Alkyl mit 2 bis 8 C-Atomen ist, vorzugsweise Ethyl ist. 22. The method according to claim 20 or 21, characterized in that an alkylating agent is used in which R is alkyl having 2 to 8 carbon atoms, preferably ethyl.
23. Verwendung eines Oligonukleotides nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Antisense-Oligonukleotid, Sonde, Primer oder Primerabschnitt. 23. Use of an oligonucleotide according to any one of claims 1 to 4 as an antisense oligonucleotide, probe, primer, or primer portion.
Description  Langue du texte original : Allemand

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf 2′-O-Alkyloligoribonukleotide, die Bausteine, aus denen sie aufgebaut sind, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Antisense-Oligonukleotide, Sonden, Primer oder Primerabschnitte und ferner auf 2′-O-Alkyloligoribonukleotide, die an den Positionen am 3′- und 5′-Ende modifiziert sind. The present invention relates to 2'-O-Alkyloligoribonukleotide, the building blocks from which they are constructed, the process for their preparation and their use as antisense oligonucleotides probes, primers or primer segments and also to 2'-O-Alkyloligoribonukleotide, are modified in positions at the 3 'and 5' end.

Oligonukleotide binden durch spezifische Wasserstoffbrückenbindungen von Basenpaaren an komplementäre Sequenzen von genomischer DNA oder RNA, wobei bereits relativ kurze Oligomere von <20 Basen spezifisch mit DNA oder RNA hybridisieren und auf diese Weise die Genexpression oder die virale Replikation gezielt beeinträchtigen können. Oligonucleotides bind by specific hydrogen bonding of base pairs to complementary sequences of genomic DNA or RNA, whereby even relatively short oligomers of <20 bases of specifically hybridizing with DNA or RNA, and the gene expression or viral replication can affect targeted in this manner.

Im folgenden sind als Antisense-Substanzen Oligonukleotide definiert, die aufgrund Basensequenz-spezifischer Wechselwirkung eine inhibierende Wirkung auf bestimmte Gene ausüben können. The following are defined as antisense oligonucleotides substances which can exert an inhibiting effect on specific genes due to the base sequence-specific interaction. Diese Antisense Oligonukleotide können durch Basenpaarung komplementäre einzelsträngige Nukleinsäuresequenzen (DNA oder RNA) oder auch doppelsträngige Nukleinsäuresequenzen (DNA) von Genabschnitten binden, wobei aus dieser Bindung eine Inhibierung des entsprechenden Gens resultiert. These antisense oligonucleotides can bind of gene segments, wherein the binding results from an inhibition of the corresponding gene by base pairing complementary single stranded nucleic acid sequences (DNA or RNA) or double-stranded nucleic acid sequences (DNA). Dabei kann das Antisense Oligonukleotid komplementär zu dem RNA-Strang sein ("antisense"), oder im gegebenen Falle auch die gleiche Sequenz ("sense") haben; Here, the antisense oligonucleotide can be complementary to the RNA strand of his ("antisense"), or in a given case, the same sequence ("sense") have; letztere ist somit komplementär zum entsprechenden DNA-Strang der Sequenz. the latter is thus complementary to the appropriate DNA strand of the sequence.

Die Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden als spezifische Inhibitoren der Genexpression oder der Virusreplikation, sog. "Antisenseoligonukleotide", hat in den letzten Jahren zunehmend an Interesse gewonnen. The use of synthetic oligonucleotides as specific inhibitors of gene expression or viral replication, so-called. "Antisense oligonucleotides", has gained in recent years increasing interest. Eine wesentliche Beschränkung bei der Anwendung dieser Strategie besteht jedoch darin, daß kurze einzelsträngige Nukleinsäure-Moleküle nach ihrem Eintritt in die Zelle biologisch instabil sind. A major limitation in the application of this strategy, however, is that short single stranded nucleic acid molecules after their entrance are biologically unstable in the cell. Um diesem Nachteil zu begegnen, sind bereits einige Versuche unternommen worden, nicht in der Natur vorkommende Nukleinsäure-Analoge zu synthetisieren, die bei erhöhter Biostabilität die Hemmaktivität der natürlichen Nukleinsäuren aufweisen. To obviate this disadvantage, some attempts have already been made to synthesize non-naturally occurring nucleic acid analogues having the inhibitory activity of the natural nucleic acids at elevated biostability. Ergebnisse dieser Versuche, die sich bisher vor allem auf Oligodesoxyribonukleotid-Analoge konzentriert haben, sind z. B. Phosphorthioate, Methylphosphonate und Phosphoramidate. Results of these experiments, which have so far focused mainly on oligodeoxyribonucleotide analogs are,., Phosphorothioates, phosphoramidates, methyl phosphonates and.

Da der RNA-RNA-Doppelstrang stabiler ist als das DNA-RNA-Hybrid, wurde der vorliegenden Erfindung die Aufgabenstellung auf RNA-RNA-Hybride ausgerichtet, bei denen dem Vorteil einer größeren Hybridstabilität eine größere Anfälligkeit der RNA gegenüber Nukleaseabbau gegenübersteht. Since the RNA-RNA duplex is more stable than DNA-RNA hybrid, of the present invention has been aligned with the task on RNA-RNA hybrids, in which the advantage of a larger hybrid stability is offset by a greater susceptibility of the RNA to nuclease degradation.

Es sind relativ wenige Beispiele für Oligoribonukleotid-Analoge bekannt, die diesen Nachteil nicht oder in geringerem Maß als die natürlichen Ribonukleotide aufweisen (dies ist zum Teil darauf zurückzuführen, daß technische Schwierigkeiten bei der RNA-Synthese bestanden). There are relatively few examples of oligoribonucleotide analogues known, or to a lesser degree than the natural ribonucleotides have (this is partly due to the fact that technical difficulties in RNA synthesis passed). This drawback

Eines dieser bekannten Beispiele ist die Modifikation der Ribose durch Anfügen einer 2′-O-Methylgruppe, von der festgestellt wurde, daß sie die Wirkung von RNA- und DNA-spezifischen Nukleasen hemmt (Sproat et al., Nucleic Acids Research, 1 (1989) 3373-3386). One of these well-known examples is the modification of the ribose by attaching a 2'-O-methyl group was determined by the in that it inhibits the action of RNA- and DNA-specific nucleases (Sproat et al., Nucleic Acids Research, 1 (1989 ) 3373-3386). Ein weiteres Beispiel für 2′-O-modifizierte Oligoribonukleotide sind 2′-O-Allyl-Oligoribonukleotide, von denen gezeigt wurde, daß sie die Nukleaseresistenz der 2′-O-Methyl-Oligoribonukleotide und zusätzlich eine erhöhte Bindungsfähigkeit an einen komplementären RNA-Abschnitt aufweisen. Another example of 2'-O-modified oligoribonucleotides are 2'-O-allyl-oligoribonucleotides have been shown that the nuclease resistance of the 2'-O-methyl-oligoribonucleotides and additionally an increased ability to bind to a complementary RNA portion have. Von denselben Autoren wurden 2′-O-Dimethylallyl-Oligoribonukleotide beschrieben, die zwar Stabilität gegenüber Nukleasen, jedoch relativ geringe Bindungsaffinität zu den Zielsequenzen aufweisen (Iribarren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990) 7747-7751). By the same authors 2'-O-dimethylallyl-oligoribonucleotides have been described which have indeed stability against nucleases, but relatively low binding affinity to the target sequences (Iribarren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990) 7747- 7751).

Es ist bekannt, Oligoribonukleotide aus Ribonukleotidbausteinen mittels der Festphasenmethode herzustellen. It is known to produce oligoribonucleotides from Ribonukleotidbausteinen by the solid phase method. Nach Sproat et al., Nucleic Acids Research 17, (9), (1989) 3373-3386 können zum Beispiel 2′-O-Methyloligoribonukleotide nach der Festphasenmethode aus 5′-O-Dimethoxytrityl-2′-O-methyl ribonukleosid-3′-O-(2-cyanoethyl N,N-diisopropyl- phosphoramiditen unter Verwendung von 5-(4-Nitrophenyl)-1H-tetrazol als Aktivator hergestellt werden. Bei diesen Verfahren wird die Alkylierung nach Anbringung entsprechender Schutzgruppen in einer späteren Stufe des Gesamtverfahrens mit in der Regel schlechten Ausbeuten ausgeführt, so daß insbesondere auch durch die erforderliche Abtrennung des bei der Reaktion gebildeten 3′-O-Methyl Isomers in einer späteren Stufe große Ausbeuteverluste in Kauf genommen werden müssen. According to Sproat et al., Nucleic Acids Research 17 (9), (1989) 3373-3386, for example, 2'-O-Methyloligoribonukleotide by the solid phase method of 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl ribonucleoside 3 '-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl phosphoramidites are prepared as activator using 5- (4-nitrophenyl) -1H-tetrazole. In these methods, the alkylation is carried out after application of appropriate protective groups at a later stage of the overall process carried out with generally poor yields, so that large losses of yield have to be accepted in particular also by the required separation of the reaction formed in the 3'-O-methyl isomer in a later stage.

Herkömmliche Verfahren zur Herstellung methylierter Ribonukleotidbausteine beruhen vor allem auf der Alkylierung mit Diazomethan. Conventional methods for the production of methylated ribonucleotide moieties are mainly based on the alkylation with diazomethane. Wegen der ungünstigen Eigenschaften, vor allem der Explosivität dieses Alkylierungsmittels ist die Herstellung größerer Mengen an alkylierten Verbindungen auf diesem Weg kaum möglich. Because of the unfavorable features, especially the explosive nature of this alkylating agent to produce larger amounts of alkylated compounds in this way is hardly possible. Als ganz besonderer weiterer Nachteil des Verfahrens ergibt sich die Tatsache, daß eine Variation des Alkylrestes kaum möglich ist. As a very special further disadvantage of the method results in the fact that a variation of the alkyl radical is hardly possible. Methoden zur Herstellung von 2′-O-Methylnukleosiden unter Verwendung von Methyljodid sind ebenfalls bekannt. Methods for the preparation of 2'-O-methyl nucleosides using methyl iodide are also known. Zum Beispiel wird in EP 2 69 574 die Herstellung von 2′-O-Methyladenosin unter Verwendung von Methyljodid und Silberoxid beschrieben. For example, the preparation of 2'-O-methyladenosine using methyl iodide and silver oxide described in EP 2 69 574. Die Herstellung von gewissen 2′-O-Methylnukleosiden unter Verwendung von Methyliodid und Silberoxid und/oder der sterisch gehinderten starken organischen Base 2-tert.- Butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhydro- 1,3,2-diazaphosphorin (BDDDP) wird von Brian S. Sproat et al., Nucleic Acids Research 18 (1990), 41-49 beschrieben. The preparation of certain 2'-O-methyl nucleosides using methyl iodide and silver oxide and / or sterically hindered strong organic base 2-tert-butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhydro- 1,3,2-diazaphosphorine ( BDDDP) is described by Brian S. Sproat et al., Nucleic Acids Research 18 (1990), 41-49. Diese Verfahren benötigen für die Methylierung eine große Anzahl von Reaktionsstufen, was für die Herstellung größerer Mengen sehr von Nachteil ist. These methods require for the methylation a large number of reaction stages, which is very for the production of larger amounts of disadvantage. J. Yano, LS Kan und POP TS'O, Biochim. J. Yano, LS Kan and POP Ts'o, Biochim. Biophys. Biophys. Acta, 629 (1980), 178-183 beschreibt die Herstellung von 2′-O-Methyladenosin durch Methyliodid in einem wasserfreien alkalischen Medium. Acta, 629 (1980), 178-183 describes the preparation of 2'-O-methyl adenosine by methyl iodide in an anhydrous alkaline medium. Dieses Verfahren ist auf die Herstellung von anderen 2′-O-Alkylnukleosiden nicht ohne weiteres übertragbar. This method is not applicable to the preparation of other 2'-O-Alkylnukleosiden easily.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue, 2′-O-modifizierte Oligoribonukleotide bereitzustellen, die als Antisense-Oligonukleotide verwendbar sind sowie ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 2′-O-modifzierten Oligoribonukleotiden und von 2′-O-modifizierten Ribonukleotidbausteinen. The present invention was based on the object to provide novel, 2'-O-modified oligoribonucleotides, that are useful as antisense oligonucleotides, as well as an improved process for the preparation of 2'-O-modifed oligoribonucleotides and 2'-O-modified Ribonukleotidbausteinen.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Oligoribonukleotide, aufgebaut aus 8 bis 35 Nukleotiden der allgemeinen Formel II, The present invention relates to novel oligoribonucleotides, composed of 8 to 35 nucleotides of the general formula II,

worin wherein
B Cytosin, Uracil, Adenin, Guanin oder Inosin bedeutet, B is cytosine, uracil, adenine, guanine or inosine means
R Alkyl mit 1 bis 30 C-Atomen bedeutet, und R is alkyl having 1 to 30 carbon atoms, and
E¹ ein Phosphatdiester-, Methylphosphonat-, Phosphoramidat- oder Phosphorthioatrest ist, E¹ a Phosphatdiester-, methylphosphonate, phosphoramidate or Phosphorthioatrest is,
oder deren 2′-OH oder 2′-Desoxyderivat, wobei in mindestens einem der Nukleotide R Alkyl mit 2 bis 30 C-Atomen ist, und worin die endständigen Gruppen in den Positionen 3′ und 5′ unabhängig voneinander eine Hydroxylgruppe oder einen Phosphatesterrest, oder eine durch eine markierende Gruppe oder lipophile Gruppe modifizierte Hydroxylgruppe bedeuten. or its 2'-OH or 2'-deoxy derivative, wherein in at least one of the nucleotides R is alkyl having 2 to 30 carbon atoms, and wherein the terminal groups in the positions 3 'and 5' are independently a hydroxyl group or a phosphate ester group, or a labeling by a group or lipophilic group-modified hydroxyl group. Bevorzugt sind Oligoribonukleotide, worin in dem Nukleotid der Formel II B ungeschütztes Adenin, Cytosin, Uracil oder Guanin ist, insbesondere solche, worin R Alkyl mit 2 bis 8 (insbesondere 2 bis 4) C-Atomen, vorzugsweise Ethyl, ist. Preferred are oligoribonucleotides wherein in the nucleotide of the formula B unprotected adenine, cytosine, uracil or guanine, II especially those wherein R is alkyl having 2 to 8 (preferably 2 to 4) carbon atoms, preferably ethyl, is.

Die genannten erfindungsgemäßen 2′-O-Alkyl-Oligoribonukleotide sind aus Nukleotiden aufgebaut, deren Zucker identisch oder verschieden voneinander sein können und deren Nukleobasen (wie das allgemein bei bekannten Oligoribonukleotiden üblich ist) verschieden sind. The inventive 2'-O-alkyl-oligoribonucleotides are synthesized from said nucleotides whose sugar may be identical to or different from each other and their nucleobases (as is common practice in prior art oligoribonucleotides) are different.

Bevorzugt sind Oligoribonukleotide, die nur aus Nukleotiden der Formel II aufgebaut sind sowie Oligoribonukleotide, die vorwiegend aus Nukleotiden der Formel II aufgebaut sind und zwischen diesen Bausteinen Bausteine enthalten, die in Position 2′ OH oder H aufweisen. Preferred are oligoribonucleotides which are composed only of nucleotides of the formula II and oligoribonucleotides which are predominantly composed of nucleotides of the formula II and between these modules contain components which have in position 2 'OH or H. Die Länge der erfindungsgemäßen 2′-O-Alkyl-Oligoribonukleotide richtet sich nach dem Anwendungszweck. The length of the 2'-O-alkyl-oligoribonucleotides of the invention depends on the application purpose. Parameter für die Länge der Oligoribonukleotide ist die Bindungsfähigkeit an die Zielsequenz unter den jeweiligen Anwendungsbedingungen, z. B. bei Anwendung als Antisense-Oligonukleotide unter physiologischen Bedingungen oder bei Anwendung als Primer unter den spezifischen Versuchsbedingungen. Parameter for the length of oligoribonucleotides is the ability to bind to the target sequence under the particular conditions of use, for, example, when used as antisense oligonucleotides under physiological conditions or when used as a primer under the specific test conditions. Im Falle der Anwendung als Antisense Oligonukleotide bestehen diese Oligonukleotide bevorzugt aus mindestens 8 und höchstens ca. 30-35 Nukleotiden, insbesondere 8 bis 19 Nukleotiden. In the case of use as antisense oligonucleotides, these oligonucleotides are preferably composed of at least 8 and at most about 30-35 nucleotides, in particular 8 to 19 nucleotides.

Die erfindungsgemäßen Oligoribonukleotide weisen eine wesentlich stärkere Hemmwirkung auf als herkömmliche Antisense-Verbindungen und sind hinsichtlich ihrer inhibierenden Antisense-Eigenschaften den 2′-O-Methyloligoribonukleotiden zumindest ebenbürtig. The oligoribonucleotides of the invention have a substantially stronger inhibitory effect than conventional antisense compounds and are at least equal with respect to their inhibitory properties the antisense 2'-O-Methyloligoribonukleotiden. Verglichen mit den bekannten 2′-O-Methyloligoribonukleotiden zeigen die erfindungsgemäßen Oligoribonukleotide erhöhte Lipophilität und erhöhte Stabilität gegenüber Nukleasen innerhalb der Zelle, verglichen mit den bekannten 2′-O-Allyloligoribonukleotiden zeigen sie niedrigere chemische Reaktivität in biologischen Systemen. Compared with the known 2'-O-Methyloligoribonukleotiden show the oligoribonucleotides of the invention increased lipophilicity and increased stability to nucleases within the cell, compared with the known 2'-O-Allyloligoribonukleotiden they exhibit lower chemical reactivity in biological systems. Die erwähnte erhöhte Lipophilität bewirkt bei der Anwendung der erfindungsgemäßen Oligoribonukleotiden als Antisense-Oligonukleotid eine verbesserte Aufnahme in die Zelle. The mentioned increased lipophilicity effected in the application of the invention as oligoribonucleotides antisense oligonucleotide improved uptake into the cell.

Die vorliegende Erfindung betrifft vorzugsweise neue 2′-O-Alkyl-Oligoribonukleotide, in denen Alkyl Ethyl ist und deren Verwendung als Antisense-Oligonukleotide, insbesondere zur Inhibierung der Genexpression oder der Virus-Replikation. The present invention preferably relates to novel 2'-O-alkyl-oligoribonucleotides, where alkyl is ethyl and their use as antisense oligonucleotides, particularly for inhibition of gene expression or viral replication.

Die erfindungsgemäßen Oligoribonukleotide können ferner, gegebenenfalls markiert, auch als Sonden zum Nachweis spezifischer DNA oder RNA verwendet werden. The oligoribonucleotides of the invention may further, optionally labeled, are also used as probes to detect specific DNA or RNA. Die erfindungsgemäßen Oligoribonukleotide können auch als Primer bzw. Primerabschnitte bei der enzymatischen DNA-Amplifikation eingesetzt werden. The oligoribonucleotides of the invention may also be used as a primer or primer portions in the enzymatic DNA amplification.

Zusätzlich zur 2′-Modifizierung können die erfindungsgemäßen 2′-modifizierten Oligoribonukleotide Modifikationen an anderen Positionen aufweisen, vorzugsweise am 3′- und/oder am 5′-Ende. In addition to the 2'-modification of 2'-modified oligoribonucleotides of the invention may comprise modifications at other positions, preferably at the 3'- and / or 5'-end. Mögliche Modifikationen sind an sich bekannt; Possible modifications are known per se; dazu zählen fluoreszierende Gruppen, Biotin oder andere prosthetische Gruppen sowie - im Hinblick auf eine höhere Affinität zu Membranen - lipophile Gruppierungen wie Thiocholesterin oder Cholesterin, Liposome, in die solche lipophile Oligoribonukleotide inkorporiert sind, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung! these include fluorescent groups, biotin or other prosthetic groups and - in terms of a higher affinity for membranes - lipophilic groups like thiocholesterol or cholesterol liposomes, are incorporated into the lipophilic such oligoribonucleotides are also the subject of the present invention!

Die erfindungsgemäßen 2′-O-Alkyl-Oligoribonukleotide können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden. The 2'-O-alkyl-oligoribonucleotides of the invention can be prepared by processes known per se.

Ein Verfahren zur Herstellung eines Oligoribonukleotides, aufgebaut aus 8 bis 35 Nukleotiden der allgemeinen Formel II, A process for producing a oligoribonucleotide, composed of 8 to 35 nucleotides of the general formula II,

worin wherein
B Cytosin, Uracil, Adenin, Guanin oder Inosin bedeutet, B is cytosine, uracil, adenine, guanine or inosine means
R Alkyl mit 1 bis 30 C-Atomen bedeutet, und R is alkyl having 1 to 30 carbon atoms, and
E¹ ein Phosphatdiester-, Methylphosphonat-, Phosphoramidat- oder Phosphorthioatrest ist, E¹ a Phosphatdiester-, methylphosphonate, phosphoramidate or Phosphorthioatrest is,
oder deren 2′-OH- oder 2′-Desoxyderivate, or the 2'-OH or 2'-deoxy derivatives,
wobei in mindestens einem der Nukleotide R Alkyl mit 2 bis 30 C-Atomen ist, wherein in at least one of the nucleotides R is alkyl having 2 to 30 carbon atoms,
und worin die endständigen Gruppen in den Positionen 3′ und 5′ unabhängig voneinander eine Hydroxylgruppe, einen Phosphitester-, H-Phosphonat- oder Phosphatesterrest, oder eine durch eine markierende Gruppe oder lipophile Gruppe modifizierte Hydroxylgruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man die entsprechenden Ribonukleotidbausteine in Gegenwart eines Kopplungsreagenz verknüpft und gewünschtenfalls in das so erhaltene Oligoribonukleotid markierende Gruppen und/oder lipophile Gruppen einführt und gewünschtenfalls Schutzgruppen abspaltet. and wherein the terminal groups in the positions 3 'and 5' are independently a hydroxyl group, a Phosphitester-, H-phosphonate or phosphate ester moiety or a labeling group or by a lipophilic group mean modified hydroxyl group, characterized in that the corresponding ribonucleotide moieties linked in the presence of a coupling reagent and, if desired, introduced into the thus obtained oligoribonucleotide labeling groups and / or lipophilic groups and, if desired, removing any protecting groups.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines Oligoribonukleotides, aufgebaut aus 8 bis 35 Nukleotiden der allgemeinen Formel II Another aspect of the present invention relates to an improved process for preparing a oligoribonucleotide, composed of 8 to 35 nucleotides of the general formula II

worin wherein
B Cytosin, Uracil, Adenin, Guanin oder Inosin bedeutet, B is cytosine, uracil, adenine, guanine or inosine means
R Alkyl mit 1 bis 30 C-Atomen bedeutet, und R is alkyl having 1 to 30 carbon atoms, and
E¹ ein Phosphatester-, Phosphatdiester-, Methylphosphonat-, Phosphoramidat- oder Phosphorthioatrest ist, E¹ a phosphate ester, Phosphatdiester-, methylphosphonate, phosphoramidate or Phosphorthioatrest is,
oder deren 2′-OH- oder 2′-Desoxyderivate, or the 2'-OH or 2'-deoxy derivatives,
und worin die endständigen Gruppen in den Positionen 3′ und 5′ unabhängig voneinander eine Hydroxylgruppe, oder einen Phosphatesterrest, oder eine durch eine markierende Gruppe oder lipophile Gruppe modifizierte Hydroxylgruppe bedeuten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die entsprechenden Ribonukleotidbausteine durch folgendes mehrstufiges Verfahren herstellt and wherein the terminal groups in the positions 3 'and 5' are independently a hydroxyl group, or a phosphate ester moiety or a marking by a group or lipophilic group mean modified hydroxyl group, which is characterized by preparing the corresponding ribonucleotide moieties by the following multi-step procedure

  • a) Alkylieren eines Nukleosids der allgemeinen Formel IV, worin B geschütztes oder ungeschütztes Adenin, Cytosin oder Inosin oder O⁶-geschütztes Guanin oder N³-geschütztes Uracil ist und gewünschtenfalls die Hydroxygruppe in Position 5′ geschützt ist, in Gegenwart einer deprotonierenden Base mit einem Alkylierungsmittel der allgemeinen Formel V,RZ (V)worin R Alkyl mit 1 bis 30 C-Atomen ist und Z für eine nukleophile Abgangsgruppe (z. B. Halogen, Tosyl, Mesyl, Ethylsulfatrest) vorzugsweise Jod steht, umsetzt; a) alkylation of a nucleoside of the general formula IV wherein B is protected or unprotected adenine, cytosine or inosine or O⁶-protected guanine or N³-protected uracil and, if desired, the hydroxy group is' protected in position 5, in the presence of a deprotonating base with an alkylating agent of the general formula V, RZ (V) wherein R is alkyl having 1 to 30 carbon atoms, and Z is a nucleophilic leaving group, preferably iodine, is reacted (for example, halogen, tosyl, mesyl, Ethylsulfatrest.);
  • b) Einführen von Schutzgruppen in den Basen und der Position 5′ (vorzugsweise Mono- oder Dimethoxytrityl); b) introducing the protective groups in the bases and the 5 'position (preferably mono- or dimethoxytrityl);
  • c) Phosphorylieren des aus dem Reaktionsgemisch isolierten 2′-O-Alkylnukleosides durch Umsetzen mit einem Phosphorylierungsmittel, vorzugsweise Phosphoramidit; c) phosphorylation of the isolated from the reaction mixture 2'-O-Alkylnukleosides by reacting with a phosphorylating agent, preferably phosphoramidite;
  • d) Isolieren des 2′-O-Alkylnukleosid-Phosphoramidits durch Standardverfahren oder vorzugsweise durch Zusatz eines lipophilen Alkohols, vorzugsweise sec-Butanol oder iso-Propanol und Abtrennen des erwünschten 2′-O-Alkylnukleosid-Phosphoramidits durch Extraktion und Ausfällung; d) isolating said 2'-O-phosphoramidite Alkylnukleosid by standard methods or, preferably, by addition of a lipophilic alcohol, preferably sec-butanol or iso-propanol, and separating the desired 2'-O-phosphoramidite Alkylnukleosid by extraction and precipitation; und and
  • e) die so erhaltenen Ribonukleotidbausteine (gewünschtenfalls zusammen mit obengenannten 2′-OH und/oder 2′-H-Derivaten) nach Standardmethoden verknüpft, die Schutzgruppen abtrennt und gewünschtenfalls in das so erhaltene Oligonukleotid markierende Gruppen und/oder lipophile Gruppen einführt. e) the thus obtained ribonucleotide moieties (optionally linked together with the above-mentioned 2'-OH and / or 2'-H derivatives) according to standard methods, the protecting groups is separated off and, if desired, in the resulting oligonucleotide labeling groups and / or lipophilic groups introduced.
    Vorzugsweise wird zur Herstellung von Guanin enthaltenden Endprodukten ein Nukleosid (IV) verwendet, in dem B O⁶-[2-(4-Nitrophenyl)ethyl]-guanin ist und gegebenenfalls zur Herstellung von Uracil enthaltenden Endprodukten ein Nukleosid (IV), in dem B N³-Cyanoethyluracil ist. Preferably a nucleoside (IV) for the production of guanine-containing end products used in which B is O⁶- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] guanine and optionally for the production of end products containing uracil one nucleoside (IV) in which B N³-Cyanoethyluracil is.
    Gemäß der Erfindung wird die Alkylierung vorzugsweise in Gegenwart von Natriumhydrid als deprotonierender Base, unter Verwendung von R-Jodid als Alkylierungsmittel (V) bei Temperaturen bis höchstens Raumtemperatur ausgeführt wird. According to the invention, the alkylation is carried out preferably in the presence of sodium hydride as a base deprotonierender, using R-iodide as the alkylating agent (V) at temperatures no higher than room temperature is executed.
    Nähere Angaben zu diesen Verfahren sind in den Beispielen enthalten. For details of these procedures are included in the examples.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 2′-O-Alkyloligoribonukleotiden weist im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Oligoribonukleotiden und 2′-O-Methyloligoribonukleotiden einen vereinfachten Verfahrensablauf und bessere Ausbeuten auf. The inventive method for the preparation of 2'-O-Alkyloligoribonukleotiden has to conventional methods for the preparation of oligoribonucleotides and 2'-O-Methyloligoribonukleotiden a simplified procedure and improved yields compared. Die letzte Stufe des Verfahrens, der Aufbau der Oligoribonukleotide aus den Nukleotidbausteinen erfolgt nach herkömmlichen Kopplungsmethoden. The last step of the process, the structure of the oligoribonucleotides from the nucleotide carried by conventional coupling methods. Ein wesentlicher Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Alkylierung des Nukleosids zu dem benötigten 2′-O-Alkylnukleosid im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren in einer früheren Stufe des Verfahrens erfolgt. An essential aspect of the inventive process is that the alkylation of the nucleoside is done to the required 2'-O-Alkylnukleosid in contrast to the conventional method in an earlier stage of the process. Die Alkylierung ist innerhalb des Gesamtverfahrens die verlustreichste Stufe, was vor allem durch die Bildung der unerwünschten Nebenprodukte (basenalkylierte Produkte, 2′, 3′-O-Dialkylnukleoside und insbesondere 3′-O-Alkylnukleosid) bedingt ist. The alkylation is within the overall process, the loss richest stage, which is mainly due to the formation of undesired by-products (basenalkylierte products, 2 ', 3'-O-Dialkylnukleoside and in particular 3'-O-Alkylnukleosid). Da erfindungsgemäß diese Stufe zu Beginn des Gesamtverfahrens ausgeführt wird, ergibt sich eine wesentliche Verbesserung der Gesamtausbeute des Verfahrens. Since according to the invention, this stage is carried out at the beginning of the overall process, there is a substantial improvement in the overall yield of the process. Durch die erfindungsgemäße Ausführung des Alkylierungsverfahrens wird die Bildung der Nebenprodukte (besonders vorteilhaft des Nebenproduktes 3′-O-Alkylnukleosid) relativ niedrig gehalten. Due to the inventive embodiment of the alkylation process, the formation of by-products is maintained (particularly preferably the by-product 3'-O-Alkylnukleosid) is relatively low. (In mehreren Untersuchungen wurde festgestellt, daß der Anteil an 3′-O-Alkylnukleosiden nur 7-20% der Gesamtmenge der monoalkylierten (dh 2′-O- und 3′-O-Alkylnukleoside) Produkte beträgt.) Zudem ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches durch Chromatographie oder Kristallisation möglich, was eine wesentliche Vereinfachung darstellt. (In several studies it has been found that the amount of 3'-O-Alkylnukleosiden is only 7-20% of the total amount of mono-alkylated (ie, 2'-O- and 3'-O-Alkylnukleoside) products.) In addition, in the inventive process, the work-up of the reaction mixture by chromatography or crystallization possible, which represents a significant simplification. (Insbesondere ist die Aufarbeitung durch den geringen Anteil an 3′-O-Alkylnukleosid bedingt.) (In particular, the work-up by the small proportion of 3'-O-Alkylnukleosid is limited.)

Die Verwendung von Methyljodid für die Herstellung von 2′-O-Methyladenosin ohne Verwendung eines Katalysators wie Silberoxid ist bekannt (Yano, J., Biochim. Biophys. Acta 629 (1980), 178-183). The use of methyl iodide for the production of 2'-O-methyl adenosine without using a catalyst such as silver oxide is known (Yano, J., Biochim. Biophys. Acta 629 (1980), 178-183). Die Anwendung dieser Methode für die Herstellung anderer 2′-O-Methylnukleoside sowie 2′-O-Alkylnukleoside (insbesondere 2′-O-Ethylnukleoside) ist jedoch nicht ohne weiteres möglich. The application of this method for the preparation of other 2'-O-Methylnukleoside and 2'-O-Alkylnukleoside (particularly 2'-O-Ethylnukleoside) is not readily possible. (So ist die Reaktivität von Methyliodid wesentlich höher als die der anderen Alkyliodide. Die übrigen Nukleoside unterscheiden sich in ihrer Reaktivität wesentlich von Adenosin.) Gemäß der Erfindung wird die Alkylierung von Adenosin und Cytidin vorzugsweise an den unmodifizierten (keine Schutzgruppen enthaltende) Verbindungen ausgeführt. (Thus, the reactivity of methyl iodide is much higher than that of the other alkyl iodides. The other nucleosides are significantly different in their reactivity by adenosine.) In accordance with the invention, the alkylation of adenosine and cytidine preferably to the unmodified (no protective group-containing) is carried out connections. Somit stellt hier die Alkylierung die erste Stufe des Gesamtverfahrens dar. Die Alkylierung von Guanosin und Uridin erfolgt vorzugsweise an O⁶-geschütztem Guanosin beziehungsweise N³-geschütztem Uridin. Thus, here, the alkylation is the first stage of the overall process. The alkylation of guanosine and uridine is preferably carried out at O⁶-protected guanosine or N³-protected uridine. (Die bevorzugten Schutzgruppen sind O⁶-Nitrophenylethyl beziehungsweise N³-Cyanoethyl.) Somit ist für Guanosin und Uridin die Alkylierung die zweite Stufe des Herstellungsverfahrens. (The preferred protecting groups are O⁶-nitrophenylethyl or N³-cyanoethyl.) Thus, the alkylation of guanosine and uridine, the second stage of the manufacturing process. Im allgemeinen sind an sich bekannte Schutzgruppen geeignet, wie sie z. B. beschrieben werden in Welch, Ch. J. et al., Acta Chem. Scand. In general, known protecting groups are suitable, such as are described, for. Example, in Welch, Ch. J. et al., Acta Chem. Scand per se. B37 (1983), 147-150. B37 (1983) 147-150.

Wie bereits beschrieben worden ist, erfolgt das erfindungsgemäße Alkylierungsverfahren mittels Alkylhalogenid (vorzugsweise Alkylbromid und insbesondere Alkyljodid) in Gegenwart von Natriumhydrid. As has already been described, the alkylation process according to the invention is carried out by means of an alkyl halide (preferably, alkyl bromide and alkyl iodide, in particular) in the presence of sodium hydride. Durch Alkylieren bei tiefen Temperaturen kann man die Selektivität der Alkylierung (Reduzieren der 3′-O-Alkylierung) wesentlich erhöhen, wodurch die Ausbeute an gewünschtem Produkt erhöht und die Aufarbeitbarkeit des Reaktionsgemisches wesentlich verbessert wird. By alkylating at low temperatures can substantially increase the selectivity of the alkylation (reducing the 3'-O-alkylation), whereby the yield of desired product increases and the workability of the reaction mixture is substantially improved. Andererseits sinkt mit der Reaktionstemperatur die Reaktivität der Reaktionskomponenten. On the other hand, decreases with the reaction temperature, the reactivity of the reaction components. Wie in Beispielen gezeigt wird, wird die Ethylierung von Cytidin und Adenosin vorzugsweise ausgehend von 0°C der Reaktionsmischung bis Raumtemperatur ausgeführt. As shown in Examples, the ethylation of cytidine and adenosine, preferably from 0 ° C the reaction mixture is carried out to room temperature. Hingegen wird die Ethylierung von Guanosin vorzugsweise ausgehend von -60°C bis 0°C ausgeführt und die Ethylierung von Uridin vorzugsweise ausgehend von -40°C bis Raumtemperatur. However, the ethylation of guanosine preferably from -60 ° C to 0 ° C is performed and the ethylation of uridine preferably from -40 ° C to room temperature.

Allgemein ist festzustellen, daß die Alkylierung erfindungsgemäß bei möglichst tiefer Temperatur ausgeführt wird, um die Selektivität der 2′-O-Alkylierung zu erhöhen. In general, it should be noted that the alkylation is carried out according to the invention at low temperature in order to increase the selectivity of the 2'-O-alkylation.

Nach dem Alkylieren und dem Einführen der erforderlichen Schutzgruppen erfolgt das Phosphorylieren der Nukleoside nach bekannten Methoden (z. B. mit H-Phosphonat, Phosphoramidit etc.). After alkylation and the introduction of the protecting groups required the phosphorylation of nucleosides (z. B. H-phosphonate, phosphoramidite etc.) by known methods. Wenn die Phosphorylierung mit einem Phosphoramidit (vorzugsweise mit (2-Cyanoethoxy)-N,N-diisopropylmonochlorphosphoramidit) ausgeführt wird, das in Überschuß eingesetzt wird, wird gemäß der erfindungsgemäßen Aufarbeitung zunächst ein lipophiler Alkohol (z. B. sec.-Butanol oder iso-Propanol) zugesetzt, wodurch das überschüssige Phosphorylierungsmittel zu einem lipophilen Phosphoramidit umgesetzt wird. If the phosphorylation phosphoramidite (preferably with (2-cyanoethoxy) -N, N-diisopropylmonochlorphosphoramidit) is executed, which is used in excess, a lipophilic alcohol (eg. As sec-butanol or isobutanol, according reappraisal of the invention first -propanol) was added, whereby the excess phosphorylating agent is converted to a lipophilic phosphoramidite. Nach extraktiver Aufarbeitung kann dann das Nukleosid-Phosphoramidit durch Fällung isoliert werden; After extractive workup can then nucleoside phosphoramidite be isolated by precipitation;
das lipophile Nebenprodukt, das in einer Oligonukleotid-Synthese erheblich stören würde, bleibt dabei in Lösung und wird dadurch vollständig abgetrennt. the lipophilic byproduct that would interfere significantly in an oligonucleotide synthesis, remains in solution and is thereby completely separated. Die Methode hat den Vorteil, daß chromatographische Aufreinigung nicht notwendig ist. The method has the advantage that chromatographic purification is not necessary. Im konkreten Fall der Bausteine mit basenlabilen Phenoxyacetyl-Schutzgruppen (speziell Guanosin) ist diese Aufarbeitung besonders vorteilhaft, da die chromatographische Trennung nur erschwert möglich ist bzw. zu Produkten mit niedriger Kopplungseffizienz bei der Oligonukleotid-Synthese führt. In the specific case of the blocks with base-labile protecting groups Phenoxyacetyl (especially guanosine), this work-particularly advantageous because the chromatographic separation is possible only with difficulty and leads to products with low coupling efficiency of oligonucleotide synthesis.

Von den in dem beschriebenen Verfahren verwendeten Zwischenverbindungen sind folgende Verbindungen neu und ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung: Of the intermediate compounds used in the described method, the following compounds are novel and also subject matter of the present invention:

Alkylierter Ribonukleotidbaustein der allgemeinen Formel I, Alkylated Ribonukleotidbaustein of the general formula I,

worin wherein
B ungeschütztes oder geschütztes Cytosin, Uracil, Adenin, Guanin oder Inosin bedeutet, B unprotected or protected cytosine, uracil, adenine, guanine or inosine means
R Alkyl mit 2 bis 30 C-Atomen bedeutet, R is alkyl having 2 to 30 C-atoms,
E ein Phosphitester-, H-Phosphonat-, Phosphatester-, Phosphatdiester- oder Phosphoramidatrest ist und E is a Phosphitester-, H-phosphonate, phosphate ester, Phosphatdiester- or Phosphoramidatrest and
S¹ eine in der Oligonukleotidsynthese übliche Schutzgruppe bedeutet. S¹ is a conventional in oligonucleotide synthesis protecting group.

Bevorzugt sind Ribonukleotidbausteine der Formel I, worin B N⁶-Benzoyladenin oder N⁶-Phenoxyacetyladenin, N⁴-Benzoyl-cytosin, Uracil oder N³-Cyanoethyl-uracil, N²-Benzoyl-guanin, N²-Phenoxyacetyl-guanin oder N²-Phenoxyacetyl-O⁶-nitrophenylethyl-guanin ist, insbesondere solche Ribonukleotidbausteine, worin R Alkyl mit 2 bis 8 C-Atomen, vorzugsweise Ethyl oder n-Butyl ist und/oder EN,N-Di(1-methylethyl)methoxyphosphoramidit oder N,N-Di(1-methylethyl)-cyanoethoxyphosphoramidit ist und/oder S¹ Dimethoxytrityl oder Monomethoxytrityl ist. Ribonucleotide moieties are preferably of the formula I wherein B N⁶-benzoyladenine or N⁶-Phenoxyacetyladenin, N⁴-benzoyl-cytosine, uracil or N³-cyanoethyl-uracil, N²-benzoyl-guanine, N²-phenoxyacetyl-guanine or N²-phenoxyacetyl-O⁶-nitrophenylethyl guanine is, in particular those ribonucleotide moieties, wherein R is alkyl having 2 to 8 carbon atoms, preferably ethyl or n-butyl and / or EN, N-di (1-methylethyl) methoxyphosphoramidit or N, N-di (1-methylethyl ) is -cyanoethoxyphosphoramidit and / or S¹ dimethoxytrityl or monomethoxytrityl is.

Nukleosid der allgemeinen Formel III, Nucleoside of the general formula III,

worin wherein
B in Position 6 durch Nitrophenylethyl geschütztes Guanin und B in position 6, protected by nitrophenylethyl guanine and
R Methyl ist, R is methyl,
oder or
B ungeschütztes oder geschütztes Cytosin, Inosin, Uracil oder Guanin ist und B unprotected or protected cytosine, inosine, uracil or guanine and
R Alkyl mit 2 bis 30 C-Atomen. R is alkyl having 2 to 30 carbon atoms.

Diese Nukleoside können nach an sich bekanntem Verfahren hergestellt werden. These nucleosides can be prepared by known per se.

Bevorzugt sind Nukleoside, worin B N⁴-Benzoyl-Cytosin, N³-Cyanoethyl-uracil, N²-Phenoxyacetyl-guanin oder N²-Phenoxyacetyl-O⁶-nitrophenylethyl-guanin ist und/oder R Alkyl mit 2 bis 8 C-Atomen, vorzugsweise Ethyl oder n-Butyl ist. Preferably, nucleosides, wherein B N⁴-benzoyl-cytosine, N³-cyanoethyl-uracil, guanine or N²-phenoxyacetyl-N²-phenoxyacetyl-O⁶-nitrophenylethyl-guanine and / or R is alkyl having 2 to 8 carbon atoms, preferably ethyl or n-butyl.

Zum Nachweis der biologisch hemmenden Aktivität der erfindungsgemäßen 2′-O-Ethyl-Oligoribonukleotide und der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten 2′-O-Methyl-Oligoribonukleotide wurde ein System verwendet, in dem die Hemmung der Histon-RNA-Biosynthese verfolgt werden kann: For the detection of biologically inhibitory activity of 2'-O-ethyl-oligoribonucleotides produced according to the invention and the method of the invention 2'-O-methyl-oligoribonucleotides a system was used in which the inhibition of histone RNA biosynthesis can be followed:

Eine der wesentlichen Kontrollstellen in dem komplexen Syntheseweg der Histon-RNA-Biosynthese ist die Wechselwirkung des "U7 small nuclear ribonucleoprotein" (snRNP) mit der Histon-Voräufer-mRNA (Histon-pre-mRNA). One of the key control points in the complex synthesis of histone RNA biosynthesis is the interaction of "U7 small nuclear ribonucleoprotein" (snRNP) with the histone mRNA Voräufer (histone pre-mRNA). Diese Wechselwirkung ist erforderlich, um die pre-mRNA endonukleolytisch zu spalten. This interaction is required in order to divide the pre-mRNA endonukleolytisch. Diese Spaltung führt zur Entstehung der reifen mRNA, die daraufhin ins Zytoplasma transportiert wird (Birnstiel, ML, et al. (1985 Cell 41, 349-359). Die 15-20 Nukleotide nahe dem 5′-Ende der U7-RNA enthalten zur Histon-pre-mRNA-Sequenz komplementäre Sequenzen (Strub, K., et al., (1984) EMBO J. 3, 2801-2807; Mowry, K., et al., (1987) Science 238, 1682-1687; Cotten, M., et al., (1988) EMBO J. 7, 801-808; Soldati, D. et al., (1988) Mol. Cell, Biol. 8, 1518-1524). Diese Komplementaritäten sind wesentlich für das Processing (Mowry, K., et al., (1987) Science 238, 1682-1687; Cotten, M., et al., (1988) EMBO J. 7, 801-808; Soldati, D. et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 1518-1524; Schaufele, F., et al. (1986) Nature 323, 777-781; Cotten, M., et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4479-4487). Weiters ist gezeigt worden, daß während des Zellzyklus die Zugänglichkeit eben dieser 5′-Nukleotide der U7 snRNP von der Zelle gemeinsam mit der DNA-Synthese moduliert wird (Hoffmann, I. et al. (1990) Nature 346, 665-668). This cleavage leads to the formation of the mature mRNA, which is then transported to the cytoplasm (Birnstiel, ML, et al. (1985 Cell 41, 349-359). The 15-20 nucleotides near the 5 'end of the RNA-U7 to contain histone pre-mRNA sequence complementary sequences (Strub, K., et al, (1984) EMBO J. 3, 2801-2807;. Mowry, K., et al, (1987) Science 238, 1682-1687.; . Cotten, M., et al, (1988) EMBO J. 7, 801-808;.... Soldati, D. et al, (1988) Mol Cell Biol 8, 1518-1524) are essential for this complementarities the processing (Mowry, K., et al, (1987) Science 238, 1682-1687;. Cotten, M., et al, (1988) EMBO J. 7, 801-808;. Soldati, D. et al. .. (1988) Mol Cell Biol 8, 1518-1524;. Schaufele, F., et al (1986) Nature 323, 777-781;.... Cotten, M., et al (1989) Mol Cell Biol . 9, 4479-4487). Furthermore, it has been shown that during the cell cycle, the accessibility just this 5'-nucleotides of the U7 snRNP is modulated from the cell together with the DNA-synthesis (Hoffmann, I. et al. (1990) Nature 346, 665-668). Da das Processing der Histon-pre-mRNA durch U7 snRNP eine wichtige Rolle in der Zellzykluskontrolle der Histonbiosynthese spielt, wurde ein in-vitro-System entwickelt, um dieses Processing reproduzieren zu können (Gick, O., et al., (1986) EMBO J. 5, 1319-1326). Since the processing of histone pre-mRNA by U7 snRNP plays an important role in cell cycle control of Histonbiosynthese, an in vitro system was developed to reproduce this processing can (Gick, O., et al., (1986) EMBO J. 5, 1319-1326). Dieses System verwendet als Quelle für die Processing-Faktoren, in erster Linie U7 snRNP (Gick, O., et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8937-8940; Vasserot, A., et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4345-4349), einen Kernextrakt aus sich rasch teilenden Säugetierzellen. This system uses as a source of the processing factors, primarily U7 snRNP (Gick, O., et al, (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84, 8937-8940;..... Vasserot, A., et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4345-4349), a nuclear extract of rapidly dividing mammalian cells. Wenn ein radioaktiv markiertes RNA-Molekül, das die Processing-Signale einer Histon-pre-mRNA enthält, diesem Extrakt hinzugefügt wird, findet eine spezifische Spaltung der pre-mRNA statt, wobei ein Molekül gebildet wird, das identisch ist mit dem in vivo gespaltenen Produkt (Gick, O., et al., (1986) EMBO J. 5, 1319-1326). If a radiolabeled RNA molecule that contains the processing signals of a histone pre-mRNA, this extract is added, is a specific cleavage of the pre-mRNA place, wherein a molecule is formed which is identical to the in vivo cleaved product (Gick, O., et al., (1986) EMBO J. 5, 1319-1326). Da dieses Spaltungsereignis eine über Basenpaarung ablaufende Wechselwirkung zwischen U7 snRNP und der pre-mRNA (Schaufele, F., et al. (1986) Nature 323, 777-781) erfordert und da die Sequenz der U7 RNA bekannt ist, konnten Oligonukleotide mit Komplementarität zu pre-mRNA oder zu U7 snRNP entworfen werden, die nach Bindung zu ihrer Zielsequenz das Processing beeinträchtigen (Cotten, M., et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4479-4487). Since this cleavage event requires an on base pairing between U7 snRNP-running interaction and the pre-mRNA (Spatulas, F., et al. (1986) Nature 323, 777-781), and since the sequence of the U7 RNA is known oligonucleotides with complementarity could are designed to pre-mRNA or U7 snRNP to that after binding to their target sequence that affect Processing (Cotten, M., et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4479-4487). Dieses Testsystem wurde kürzlich verwendet, um die hemmende Wirkung verschiedener natürlicher RNA- und DNA- Antisensemoleküle und Ribozyme, gerichtet gegen die U7-Sequenz, zu vergleichen. This test system has been recently used to compare the inhibitory effect of different natural RNA and DNA, antisense molecules and ribozymes, directed against the U7 sequence.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde mit Hilfe dieses Test-Systems untersucht, ob die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten 2′-O-Methyl-Oligoribonukleotide und die erfindungsgemäßen 2′-O-Ethyl-Oligoribonukleotide geeignet sind, Gene spezifisch zu inhibieren. In the context of the present invention was measured using this test system to investigate whether the products prepared by the process of the invention 2'-O-methyl-oligoribonucleotides and 2'-O-ethyl-oligoribonucleotides of the invention are capable of inhibiting specific genes. Es wurde festgestellt, daß sowohl die 2′-O-Methyl- als auch die 2′-O-Ethyl-Oligoribonukleotide den nichtmodifizierten Antisense-RNA-Molekülen bei der Hemmung des RNA-Processing um das ca. 5fache überlegen sind, wobei für die Hemmung nur ein geringer Überschuß (weniger als 5fach) das Inhibitors gegenüber der Ziel-RNA erforderlich ist, um die Processing-Reaktion zu 80% zu inhibieren. It has been found that both the 2'-O-methyl and 2'-O-ethyl-oligoribonucleotides are superior to the unmodified antisense RNA molecules in the inhibition of the RNA processing by approximately 5 times, wherein for the inhibition only a slight excess (less than 5X) the inhibitor against the target RNA is required to inhibit the processing reaction to 80%. Unter Bedingungen, die die Hemmung durch ein natürliches Antisense-RNA-Molekül rückgängig machen, ist die Hemmung durch die modifizierten Antisense-Oligonukleotide praktisch irreversibel, ohne daß damit eine Modifikation der Ziel-RNA einhergeht, wie kürzlich für die Adenosindeaminase-Aktivität beschrieben (Bass, BL, et al. (1987) Cell 48, 607-613; Bass, B. L, et al. (1988) Cell 55, 1089-1098; Rebagliati, MR, et al. (1987) Cell 48, 599-605). Under conditions that make inhibition by a natural antisense RNA molecule reversed the inhibition by the modified antisense oligonucleotides is practically irreversible, without this being accompanied by a modification of the target RNA as previously described for the adenosine deaminase activity (Bass BL, et al (1987) Cell 48, 607-613;. Bass, B. L, et al (1988) Cell 55, 1089-1098;. Rebagliati, MR, et al (1987) Cell 48, 599-. 605). Eine mögliche Erklärung für die Irreversibilität könnte im verminderten Abbau der nicht-hybridisierten 2′-O-Methyl-RNA im Extrakt gelegen sein. A possible explanation for the irreversibility could be located in reduced degradation of the unhybridized 2'-O-methyl-RNA in the extract. Die vermutete hohe Schmelztemperatur des Inhibitor/U7-Hybrids (aufgrund der größeren Länge wurde eine höhere Schmelztemperatur als die von Inoue, H., et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15, 6131-6148, beschriebene angenommen) und die Schwierigkeit, ausreichend Komplement zum Inhibitor hinzuzufügen, um die Inhibitor/U7-Dissoziation zu bewirken, machen es beinahe unmöglich, die Bindung unter physiologischen Bedingungen rückgängig zu machen. The presumed high melting temperature of the inhibitor / U7 hybrid (due to the greater length has a higher melting temperature than that of Inoue, H., et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15, 6131-6148, described adopted) and the difficulty , add sufficient to complement inhibitor to cause the inhibitor / U7 dissociation, make it almost impossible to make binding under physiological conditions reversed. Diese Irreversibilität spricht dafür, daß diese Klasse von Inhibitoren für in-vivo-Anwendungen geeignet ist. This irreversibility suggests that this class of inhibitors is suitable for in vivo applications.

Die Versuche im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit verschiedener Inhibitoren der U7-Funktion zu untersuchen. The experiments in the context of the present invention were conducted to investigate the effectiveness of various inhibitors of U7 function. (Es war festgestellt worden, daß die 20 Nukleotide am 5′-Ende des aktiven U7 snRNP zugänglich für die Verdauung durch Mikrokokken-Nuklease sind und daß die Komplexierung dieser 5′-Nukleotide mit einem komplementären RNA-Nukleotid oder deren Entfernung mittels einer gekoppelten Desoxyoligo-Bindung/RNase H-Spaltung das Processing blockiert (Cotten, M., et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4479-4487; Hoffmann, I. et al. (1990) Nature 346, 665-668; Gilmartin, G., et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 1076-1084). In Vorversuchen zur vorliegenden Erfindung war festgestellt worden, daß der - auf molarer Basis - stärkste Inhibitor der Reaktion ein Antisense-RNA-Molekül mit Komplementarität zu 61 der 63 Nukleotide der U7-Sequnz war und daß die Beschränkung für die Funktion der Antisense-Inhibitoren hauptsächlich in deren raschem Abbau in den nukleasereichen Extrakten gelegen war, die in den Versuchen verwendet wurden. Es zeigte sich, daß ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenes, 19 Nukleotide großes 2′-O-Methyl-Oligoribonukleotid der 61mer-RNA überlegen ist. (It was found that 20 nucleotides at the 5'-end of the active U7 snRNP are accessible for digestion by micrococcal nuclease and in that the complexing of these 5 'nucleotides with a complementary RNA nucleotide or their removal by means of a coupled Desoxyoligo retention / RNase H cleavage, the processing blocks (Cotten, M., et al (1989) Mol Cell Biol 9, 4479-4487;.... Hoffmann, I. et al (1990) Nature 346, 665-668. .....; Gilmartin, G., et al (1988) Mol Cell Biol 8, 1076-1084) In the present invention, preliminary tests it was established that the - on a molar basis - most powerful inhibitor of the reaction, an antisense RNA molecule having complementarity to 61 of the 63 nucleotides of the U7-Sequnz was and that the limit on the function of the antisense inhibitors was mainly located in their rapid degradation in the nukleasereichen extracts which were used in the experiments. It was found that a by the process of the invention obtained, 19 nucleotides great 2'-O-methyl oligoribonucleotide the 61mer RNA is superior. Weiters zeigte sich, daß das 2′-O-Methyl-19mer einem Phosphorthioat-DNA-19mer in der Hemmung der Processing-Reaktion beträchtlich überlegen ist, woraus gefolgert wurde, daß die Nuklease-Beständigkeit für die Wirksamkeit der Inhibierung nicht der einzig ausschlaggebende Faktor ist. Furthermore, it was found that the 2'-O-methyl-19mer is a phosphorothioate DNA 19mer significantly superior in inhibiting the processing reaction, from which was concluded that the nuclease resistance of the effectiveness of inhibition is not the only factor is.

Beispiel 1 Example 1 Hemmwirkung einer natürlichen 63mer-Antisense-RNA im Vergleich mit einer 2′-O-Methyl-7U-19mer-Antisense-RNA Inhibitory effect of a natural 63mer antisense RNA in comparison with a 2'-O-methyl-7U 19mer antisense RNA

Die Reaktion zur Hemmung der Processing-Reaktion in diesem und in den folgenden Beispielen wurde durchgeführt, wie bei Cotten, M., Schaffner, G. und Birnstiel, M. L,. The reaction to inhibit the processing reaction in this and the following examples was carried out as at Cotten, M., Schaffner, G. and Birnstiel, M. L ,. (1989) Mol. Cell. (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4479-4487, beschrieben: Ein 15 @l bzw. 7,5@l Aliquot Kernextrakt (in Puffer D: 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 20% Glycerin, 20 mM HEPES, pH 7,4) aus einer Maus-Hybridom-Zellinie, enthaltend ca. 10 bzw. 20 fmol U7-RNA (Dignam, J., Lebovitz, R. und Roeder, R. (1983) Nucl. Acids Res. 11, 1475-1489; Gick, O. Krämer, A., Keller, W. und Birnstiel, ML (1986) EMBO J. 5, 1319-1326), wurde mit dem jeweiligen Test-Oligonukleotid in Gegenwart von 5 mM MgCl₂ (in einem Volumen von 15@l) 30 min auf Eis, 30 min bei Raumtemperatur und 30 min bei 30°C präinkubiert. Biol 9, 4479-4487, described. A 15l or 7.5 @ l aliquot of nuclear extract (in buffer D: 0.1 M KCl, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 20% glycerol, 20 mM HEPES, pH 7.4) from a mouse hybridoma cell line, comprising about 10 or 20 fmol U7 RNA (Dignam, J., Lebovitz, R., and Roeder, R. ( 1983) Nucl Acids Res 11, 1475-1489;.. Gick, O. Kramer, A., Keller, W. and Birnstiel, ML (1986) EMBO J. 5, 1319-1326), was with the respective test oligonucleotide in the presence of 5 mM MgCl₂ preincubated (in a volume of 15 @ l) for 30 minutes on ice, 30 minutes at room temperature and 30 min at 30 ° C. Danach wurden 15 @l einer Reaktionsmischung, enthaltend tRNA, RNasin, EDTA (Endkonzentrationen 0,17 mg/ml, 400 Einheiten/ml bzw. 20 mM) und ca. 10 fmol (10 000 CPM) einer ³²P-markierten Histon-pre-mRNA der Probe hinzugefügt. Thereafter, 15 werel of a reaction mixture containing tRNA, RNasin, EDTA (final concentration 0.17 mg / ml, 400 units / ml and 20 mM) and 10 fmol (10,000 CPM) of a ³²P-labeled histone pre- mRNA of the sample added. Das Gemisch wurde 2 h lang bei 30°C reagieren gelassen, daraufhin wurden Proteinase K (auf 0,5 mg/ml) und SDS (0,5%) hinzugefügt und die Proben bei 37°C 30 min inkubiert. The mixture was 2 h at 30 ° C allowed to react, then proteinase K (0.5 mg / ml) and SDS (0.5%) were added and the samples were incubated at 37 ° C for 30 min. Die RNA aus der Probe wurde daraufhin mit Phenol/Chloroform behandelt, mit Ethanol gefällt, in 80% Formamid/0,5 × TBE plus 0,025% Bromphenolblau & 0,025% Xylencyanol gelöst und auf einem vorgeheizten 10,7% Acrylamid/8,3 M Harnstoff/TBE-Gel aufgetrennt. The RNA from the sample was then treated with phenol / chloroform, precipitated with ethanol, in 80% formamide / 0.5 x TBE plus 0.025% bromophenol blue and xylene cyanol and 0.025% dissolved in a preheated 10.7% acrylamide / 8.3 M urea / TBE gel. Das erhaltene radioaktive Muster wurde durch Belichten eines Röntgenfilms bei -70°C sichtbar gemacht. The radioactive obtained pattern was visualized by exposing X-ray film at -70 ° C.

Die in den Versuchen verwendeten Sequenzen sind in Fig. 1 dargestellt. The sequences used in the experiments are shown in FIG. 1. Die U7-Sequenz und die Maus-Histon H4-pre-mRNA sind in Cotten, M., Schaffner, G. und Birnstiel, ML (1989) Mol. Cell. The U7 sequence and the mouse histone H4 pre-mRNA in Cotten, M., Schaffner, G. and Birnstiel, ML (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4479-4487, beschrieben (Die U7-RNA funktioniert wahrscheinlich aufgrund einer Basenpaarung-Wechselwirkung mit dem purinreichen Element in der pre-mRNA, das in Fig. 1 gekennzeichnet ist). Biol. 9, 4479-4487, described (U7 The RNA does probably due to base-pairing interaction with the purine-rich element in the pre-mRNA which is characterized in Fig. 1). Weiters sind in Fig. 1 die Sequenzen des 7U-19mer (als 2′-O-Methyl- und 2′-O-Ethyl-RNA) und des DNA-18mer, das Kontroll-2′-O-Methyl-Oligonukleotid NS19mer (ohne Komplementarität zu U7) und das Antisense-U7-RNA-63mer (die zusätzlichen Vektorsequenzen sind eingerahmt) dargestellt (Antisense-U7-RNA (7U) wurde durch in vitro T7 Polymerase-Transkription eines Derivats von pTZ19 (Pharmacia) mit einem Maus-U7-Insert, erhalten aus synthetischen DNA-Oligonukleotiden, synthetisiert). Furthermore, the sequences of the 19mer-7U (as 2'-O-methyl and 2'-O-ethyl-RNA) and the DNA 18-mer, the check-2'-O-methyl-oligonucleotide are shown in Fig. 1 NS19mer ( without complementarity to U7), and the antisense U7 RNA 63mer (the additional vector sequences are boxed) depicted (antisense U7 RNA (7U) was prepared by in vitro T7 polymerase transcription of a derivative of pTZ19 (Pharmacia) with a mouse U7 insert obtained from synthetic DNA oligonucleotides synthesized).

Um zu untersuchen, ob ein 2′-O-Methyl-RNA-Molekül inhibierende Eigenschaften besitzt, wurde zunächst die Inhibierung des Processing durch ein 19 Nukleotid-2′-O-Methyl-RNA-Molekül (im folgenden als 2′-O-Methyl-7U-19mer bezeichnet) mit einem auf natürlichem Weg synthetisierten RNA-Molekül, enthaltend die zu 61 Nukleotiden der U7-RNA komplementäre Sequenz, verglichen (diese komplementäre Sequenz wird als 7U-RNA bezeichnet). In order to investigate whether a 2'-O-methyl-RNA molecule has inhibitory properties, the inhibition of the first processing was by a 19 nucleotide 2'-O-methyl-RNA molecule (hereinafter referred to as 2'-O- methyl-7U 19mer) having a naturally synthesized RNA molecule comprising the 61 nucleotides of the complementary sequence U7-RNA compared (this complementary sequence is referred to as 7U-RNA). (In Vorversuchen war festgestellt worden, daß die 63mer-Antisense-RNA der stärkste Inhibitor des in vitro Processing war, wobei dieses Molekül bei 30fachem molarem Überschuß über die U7-RNA die Reaktion vollständig blockierte (Cotten, M., Schaffner, G. und Birnstiel, ML (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4479-4487). Entsprechend ergab der Inhibierungsversuch, dessen Ergebnisse in Fig. 3 dargestellt sind, daß die Gegenwart von 300 fmol 7U-63merRNA ca. 95% der Processing-Aktivität blockiert und daß 30 fmol eine partielle Verringerung der Processing-Aktivität ergeben (Spuren 4 und 5). Im Vergleich dazu ergab das 2′-O-Methyl-7U-19mer bei 300 fmol eine vollständige Inhibierung und bei 30 fmol eine Inhibierung von ca. 80% (Spuren 8 und 9). Als Kontrolle wurde das 2′-O-Methyl-7U-19mer mit einem 10fachen Überschuß von U7-RNA prähybridisiert, bevor es dem Kernextrakt zugegeben wurde. Diese Vorgangsweise ergab eine totale Blockierung der Inhibierung (Spur 12), welche mit 300 fmol von 2′-O-Methyl-7U-19mer allein vollständig war (Spur 9). (In preliminary experiments it was established that the 63mer antisense RNA of the strongest inhibitor was in vitro processing, this molecule and 30X molar excess over the U7 RNA, the reaction completely blocked (Cotten, M., Schaffner, G. Birnstiel, ML (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4479-4487). Accordingly the inhibition assay showed the results of which are shown in FIG. 3 that the presence of 300 fmol 7U 63merRNA about 95% of the processing activity blocked and that 30 fmol a partial reduction of the processing-result type (lanes 4 and 5). By comparison, the 2'-O-methyl-7U-19mer resulted in complete inhibition of 300 fmol and 30 fmol, inhibition of about 80% (lanes 8 and 9). As a control, the 2'-O-methyl-7U-19mer was hybridized with a 10-fold excess of U7 RNA before it was added to the nuclear extract was added. This procedure resulted in a total blockage of inhibition (lane 12), which completely alone with 300 fmol of 2'-O-methyl-7U-19mer was (lane 9). Diese Ergebnisse zeigen, daß der 2′-O-Methyl-Inhibitor über Hybridisierung mit der Ziel-RNA via Basenpaarung funktioniert und daß die Inhibierung nicht auf unspezifische Effekte zurückzuführen ist. These results show that the 2'-O-methyl-inhibitor works by hybridization with the target RNA via base pairing, and that the inhibition is not due to non-specific effects. (Wenn das Komplement zum Inhibitor nach der Präinkubation des Inhibitors mit dem Extrakt zugesetzt wird, kann die durch Antisense-RNA bewirkte Hemmung rückgängig gemacht werden; Cotten, M., Schaffner, G. und Birnstiel, ML (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4479-4487. Die Durchführung desselben Experiments mit dem 2′-O-Methyl-Inhibitor ergab, daß nur ein kleiner Anteil der Hemmung rückgängig gemacht werden konnte (Spur 13). (If the complement to the inhibitor after preincubation of the inhibitor is added to the extract that caused by antisense RNA inhibition can be reversed; Cotten, M., Schaffner, G. and Birnstiel, ML (1989) Mol Cell Biol.. . 9, 4479-4487. The implementation of the same experiment with the 2'-O-methyl-inhibitor showed that only a small percentage of inhibition could be reversed (lane 13).

Fig. 3: Fig. 3:

Spur 1: nicht-reagiertes Substrat Lane 1: unreacted substrate
Spur 2: Kontroll-Processing Lane 2: Control Processing
Spuren 3 bis 6: Lanes 3 to 6:
Processing nach einer Präinkubation mit 3, 30, 300, 3000 fmol 7U-63merRNA Processing fmol after preincubation with 3, 30, 300, 3000 7U 63merRNA
Spuren 7 bis 11: Lanes 7 to 11:
Processing nach Präinkubation mit 3, 30, 300, 3000 oder 30 000 fmol 2′-O-Methyl-7U-19mer Processing after preincubation with 3, 30, 300, 3000 or 30,000 fmol 2'-O-methyl-7U 19mer
Spur 12: Lane 12:
300 fmol 2′-O-Methyl-7U-19mer wurden mit 3 pmol U7-RNA (in Puffer D) vor Zugabe zum Kernextrakt präinkubiert 300 fmol 2'-O-methyl-7U-19mer were pre-incubated with 3 pmol U7 RNA (in buffer D) prior to addition to the nuclear extract
Spur 13: Track 13:
Der Kernextrakt wurde mit 300 fmol 2′-O-Methyl-7U-19mer präinkubiert. The nuclear extract was pre-incubated with 300 fmol of 2'-O-methyl-7U 19mer. Danach wurden 3 pmol U7-RNA zur Reaktion hinzugefügt Thereafter 3 pmoles U7 RNA were added to the reaction
Spur 14: Lane 14:
Kontroll-Processing (Die Zugabe von 3 pmol U7-RNA hat keinen Einfluß auf die Processing-Reaktion) Control Processing (The addition of 3 pmol U7 RNA has no influence on the processing reaction)
Spuren M: Tracks M:
Molekulargewichtsstandards: HpaII-geschnittenes pBr322 ( ³²p -markiert mit Hilfe des Klenow-Fragments der Polymerase I und @-³²P-dCTP), wobei die Größe einiger der Fragmente links von der Figur angegeben ist. Molecular weight standards: HpaII cut pBR322 (³²P -labeled using the Klenow fragment of polymerase I and @ -³²P-dCTP), the size of some of the fragments is indicated on the left of the figure. Die Abkürzungen "sub." The abbreviations "sub." und "proc." and "proc." zeigen die Positionen des pre-mRNA-Substrats und des prozessierten Produkts an. indicate the positions of the substrate pre-mRNA and of the processed product.

Beispiel 2 Example 2 Hemmwirkung eines Phosphorthioat-Antisense-DNA-19mer im Vergleich mit einem 2′-O-Methyl-7U-Antisense-RNA-19mer Inhibitory effect of a phosphorothioate antisense DNA 19mer as compared with a 2'-O-methyl-7U antisense RNA 19mer

Bei der Durchführung dieses Beispiels wurde von folgender Überlegung ausgegangen: Wenn die einzige Determinante für die verstärkte Inhibierung durch das 2′-O-Methyl-RNA-Molekül die Stabilität gegen Nukleasen ist, dann sollte die Verwendung eines Phosphorthioat-Derivats des 7U-19mer-Oligonukleotids ebenfalls eine verstärkte Fähigkeit zur Inhibierung zeigen (mit der erhöhten Nukleasebeständigkeit geht jedoch eine verringerte Bindungsaffinität zur Komplementärsequenz einher (Zon, 1988, Pharm. Res. 5, 539-549)). In the implementation of this example was based on the following consideration: If the only determinant of the increased inhibition by 2'-O-methyl RNA molecule is the stability against nucleases, you should use a phosphorothioate derivative of 7U 19mer- oligonucleotide also an enhanced ability to inhibit show (with the increased nuclease resistance, however, is a reduced binding affinity to complementary sequence associated (Zon, 1988, Pharm. Res. 5, 539-549)). Der Versuch wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1 angegeben; The experiment was carried out as indicated in Example 1; die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. the results are shown in Fig. 4. Bezüglich des 2′-O-Methyl-7U-19mer wurden identische Ergebnisse wie in Beispiel 1 gefunden (Spalten 4-7). With respect to the 2'-O-methyl-7U 19mer gave identical results as in Example 1 (columns 4-7). Als Kontrolle wurde ein Nonsense-2′-O-Methyl-Oligonukleotid, ein 19mer ohne zu U7 komplementäre Sequenzen, verwendet. As a control, a nonsense 2'-O-methyl-oligonucleotide, a 19mer without U7 complementary sequences. Dieses Oligonukleotid (NS19mer) hat keinen Einfluß auf das Processing, wenn 3 pmol der Reaktion hinzugefügt werden (Spur 8). This oligonucleotide (NS19mer) has no effect on the processing when 3 pmol of the reaction are added (lane 8). Wenn das Phosphorthioat-DNA-7U-19mer in diesem System getestet wird, zeigt sich, daß bei 300 fmol eine geringe Inhibierung der Reaktion und bei 3 pmol ca. 30% Inhibierung stattfindet (Spuren 9-13). If the DNA is tested phosphorothioate 19mer-7U in this system, it is found that at 300 fmol a low inhibition of the reaction and 3 pmol in 30% inhibition occurs (lanes 9-13).

Fig. 4: Fig. 4:

Spur 1: nicht-reagiertes Substrat Lane 1: unreacted substrate
Spur 2: Kontroll-Processing Lane 2: Control Processing
Spur 3: Processing nach Vorbehandlung mit Magnesium Lane 3: Processing after pretreatment with magnesium
Spuren 4-7: Lanes 4-7:
Processing nach Präinkubation mit 3, 30, 300 oder 3000 fmol 2′-O-Methyl-7U-19mer Processing after preincubation with 3, 30, 300, or 3000 fmol 2'-O-methyl-7U 19mer
Spur 8: Lane 8:
Processing nach Präinkubation mit 3 pmol eines Kontroll-2′-O-Methyl-19mer Processing after preincubation with 3 pmol of a control-2'-O-methyl-19mer
Spuren 9-13: Tracks 9-13:
Processing nach einer Präinkubation mit 0,3, 3, 30, 300, 3000 fmol Phosphorthioat-DNA-7U-19mer Processing after a pre-incubation with 0.3, 3, 30, 300, 3000 fmol phosphorothioate DNA 7U 19mer
Spur 14: Kontroll-Processing Lane 14: Control Processing
Spur M: Molekulargewichtstandards wie in Fig. 3 Lane M: molecular weight standards as in Figure 3.

Beispiel 3 Example 3 Hemmwirkung eines 2′-O-Ethyl-7U-19mer im Vergleich mit einem Nitrophenylethyl-G-blockierten 2′-O-Ethyl-7U-19mer Inhibitory effect of a 2'-O-ethyl-7U 19mer as compared with a G-nitrophenylethyl-blocked 2'-O-ethyl-7U 19mer

Den im Rahmen dieses Beispiels durchgeführten Versuchen lag folgende Überlegung zugrunde: Guanin-Gruppen, die mit Nitrophenylethyl (NPE) modifiziert sind, haben die Fähigkeit verloren, GC-Basenpaare zu bilden. Carried out in the context of this example tests was based on the following consideration: guanine groups (NPE) modified with nitrophenylethyl who have lost ability to form GC base pairs. Da im 7U-19mer die G-Reste über die Sequenz verteilt sind ( Fig. 1), sollte die Gegenwart von NPE-modifizierten G-Resten die Hybridisierung des Inhibitors zur U7-Zielsequenz und damit die Inhibierung blockieren. Since in 7U the 19mer G-residues are distributed over the sequence (Fig. 1), the presence should of NPE-modified G residues thus block the hybridization of the inhibitor to the U7-targeting sequence and the inhibition. NPE-G-blockiertes 2′-O-Ethyl-7U-19mer wurde somit als Kontrolle für die Spezifität der Inhibierung herangezogen. NPE-G-blocked 2'-O-ethyl-7U-19mer was thus used as a control for the specificity of the inhibition. (Es wurde das in einem weiter unten beschriebenen Beispiel vor der Entfernung der NPE-Schutzgruppen als Zwischenprodukt erhaltene NPE-G-blockierte 2′-O-Ethyl-7U-19mer verwendet.) Das Ergebnis der Versuche ist in Fig. 5 dargestellt: das 2′-O-Ethyl-7U-19mer die Prozessierungsreaktion inhibierte bei 300 fmol komplett und bei 30 fmol zu <95%. (It was used the product obtained in an example described below as an intermediate product prior to the removal of NPE-protecting groups NPE-G-blocked 2'-O-ethyl-7U 19mer.) The result of the tests are shown in FIG. 5: the 2'-O-ethyl-7U 19mer the processing reaction inhibited completely at 300 fmol and 30 fmol to <95%. Diese Hemmaktivität ist ähnlich der für 2′-O-Methyl-Verbindungen beobachteten (vgl. Fig. 3). This inhibitory activity is similar to that observed for 2'-O-methyl compounds (see. FIG. 3). Im Gegensatz dazu wies das NPE-G-blockierte 2′-O-Ethyl-7U-19mer nicht einmal bei den höchsten Konzentrationen, die untersucht wurden (3 pmol; Fig. 5), Hemmaktivität auf. In contrast, the NPE-G-blocked 2'-O-ethyl-7U 19mer had not even at the highest concentrations that were examined (3 pmol; Fig. 5), inhibitory activity. Daraus ergibt sich die Bedeutung der Guanosin-Basenpaarung für die Inhibierung. Hence the importance of the guanosine base pairing for the inhibition.

Fig. 5: Fig. 5:

Spur 1: nicht-reagiertes Substrat Lane 1: unreacted substrate
Spur 2: Kontroll-Processing Lane 2: Control Processing
Spur 3: Processing nach Vorbehandlung mit Magnesium Lane 3: Processing after pretreatment with magnesium
Spuren 4-7: Lanes 4-7:
Processing nach Präinkubation mit 3, 30, 300 oder 3000 fmol 2′-O-Ethyl-7U-19mer Processing after preincubation with 3, 30, 300, or 3000 fmol 2'-O-ethyl-7U 19mer
Spuren 8-11: Tracks 8-11:
Processing nach Präinkubation mit 3, 30, 300 oder 3000 fmol NPE G-2′-O-Ethyl-7U-19mer Processing after preincubation with 3, 30, 300, or 3000 fmol NPE G-2'-O-ethyl-7U 19mer
Spuren M: Tracks M:
Molekulargewichtsstandards wie in Fig. 3 Molecular weight standards as in Fig. 3

Beispiel 4 Example 4 Hemmwirkung eines 2′-O-Methyl-7U-19mer im Vergleich mit einem 2′-O-Ethyl-7U-19mer Inhibitory effect of a 2'-O-methyl-7U 19mer as compared with a 2'-O-ethyl-7U 19mer

In diesem Versuch wurde die Kernextraktkonzentration auf 7,5 @l verringert, um eine empfindlichere Analyse der Processing-Reaktion durchführen zu können. In this experiment, the nuclear extract concentration was reduced to 7.5l in order to carry out a more sensitive analysis of the processing reaction can. Das Ergebnis der durchgeführten Versuche ist in Fig. 6 dargestellt. The result of the tests is shown in Fig. 6. Wenn die beiden Inhibitoren bei Konzentrationen von 3, 9, 30, 90 und 300 fmol untersucht wurden, wurde praktisch identische Hemmaktivität festgestellt (Spuren 3-12). If the two inhibitors at concentrations of 3, 9, 30, 90 and 300 fmol studied, virtually identical inhibitory activity was observed (lanes 3-12). Um die Hemmaktivität in Abwesenheit von Magnesium zu untersuchen, wurde der Test geringfügig abgewandelt. In order to investigate the inhibitory activity in the absence of magnesium, the test was modified slightly. Wenn die beiden Inhibitoren in Abwesenheit des 2wertigen Kations direkt dem Extrakt hinzugefügt wurden und die Processing-Substrat-RNA daraufhin rasch in Gegenwart von 20 mM EDTA hinzugefügt wurde, wurde eine geringfügig höhere Aktivität des 2′-O-Ethyl-Inhibitors festgestellt (vgl. die Spuren 13 und 14). If the two inhibitors were added in the absence of 2wertigen cation directly to the extract and the processing substrate RNA was then rapidly added in the presence of 20 mM EDTA, a slightly higher activity of 2'-O-ethyl-inhibitor was detected (see FIG. the tracks 13 and 14). Beide Inhibitoren zeigten eine Steigerung ihrer Aktivität 30 fmol, wenn sie mit dem Extrakt plus Magnesium präinkubiert wurden (vgl. Spuren 5 und 13 für 2′-O-Methyl und Spuren 10 und 14 für 2′-O-Ethyl). Both inhibitors showed an increase of its activity 30 fmol when they were preincubated with the extract plus magnesium (see FIG. 13 lanes 5 and for 2'-O-methyl and traces 10 and 14 for 2'-O-ethyl).

Fig. 6: Fig. 6:

Spur 1: Kontroll-Processing Lane 1: control-processing
Spur 2: Processing nach Vorbehandlung mit Magnesium Lane 2: Processing after pretreatment with magnesium
Spuren 3-7: Lanes 3-7:
Processing nach Präinkubation mit 3, 9, 30, 90 oder 300 fmol 2′-O-Methyl-7U-19mer Processing after preincubation with 3, 9, 30, 90 or 300 fmol 2'-O-methyl-7U 19mer
Spuren 8-12: Tracks 8-12:
Processing nach Präinkubation mit 3, 9, 30, 90 oder 300 fmol 2′-O-Ethyl-7U-19mer Processing after preincubation with 3, 9, 30, 90 or 300 fmol 2'-O-ethyl-7U 19mer
Spur 13: Track 13:
Processing nach Zugabe von 30 fmol 2′-O-Methyl-7U-19mer ohne Vorbehandlung mit Magnesium Processing after the addition of 30 fmol of 2'-O-methyl-7U 19mer without pretreatment with magnesium
Spur 14: Lane 14:
Processing nach Zugabe von 30 fmol 2′-O-Ethyl-7U-19mer ohne Magnesium-Vorbehandlung Processing after the addition of 30 fmol of 2'-O-ethyl-7U 19mer without magnesium pretreatment
Spur 15: Kontroll-Processing Track 15: Control Processing
Spuren M: Tracks M:
Molekulargewichtsstandards wie in Fig. 3 Molecular weight standards as in Fig. 3

Beispiel 5 Example 5 Bestimmung der U7-RNA-Konzentrationen in Kernextrakten vor und nach Behandlung mit Antisense-Inhibitor Determination of U7 RNA concentrations in nuclear extracts before and after treatment with antisense inhibitor

Es besteht die Möglichkeit, daß in Gegenwart von Magnesium sowohl die 2′-O-Ethyl- als auch die 2′-O-Methyl-Oligonukleotide eine Modifikation (oder Zerstörung) der U7-Zielsequenz auslösen, die zur inhibierenden Wirkung beiträgt, was gegebenenfalls für die Irreversibilität der 2′-O-Methyl-Inhibierung ( Fig. 3) eine Rolle spielt. It is possible that the presence of magnesium in both the 2'-O-ethyl- and 2'-O-methyl-oligonucleotides a modification (or destruction) of the trigger U7-targeting sequence that contributes to the inhibitory effect, which, if appropriate, for the irreversibility of the 2'-O-methyl-inhibition (Fig. 3) plays a role. Obwohl nicht erwartet wurde, daß der RNA-RNA-ähnliche Doppelstrang im 2′-O-Methyl- oder -Ethyl-U7-Hybrid ein Substrat für den enzymatischen Abbau von U7 darstellt (wie das DNA-RNA-Hybrid für RNase H), wurde festgestellt, daß die Präinkubation der beiden Inhibitoren mit Kernextrakten in Gegenwart von 5 mM Mg 2+ zu einer verstärkten Inhibierung und, im Fall von 2′-O-Methyl-RNA, zur Irreversibilität ( Fig. 3 und 6) führt. Although it was not expected that the RNA-RNA double strand-like in the 2'-O-methyl or ethyl-U7 hybrid a substrate for the enzymatic degradation of U7 is (such as the DNA-RNA hybrid for RNase H), it was found that the pre-incubation of the two inhibitors with nuclear extracts in the presence of 5 mM Mg 2+ to an increased inhibition and, in the case of 2'-O-methyl RNA, to irreversibility (Fig. 3 and 6) leads. Um zu untersuchen, ob eine Modifikation der U7-RNA stattgefunden hat, die deren Fähigkeit, Basenpaarwechselwirkungen zu bilden, beeinträchtigt, wurde ein empfindlicher RNase-Protection-Assay verwendet. In order to investigate whether a modification of the U7 RNA has occurred which affects their ability to form base pair interactions, a sensitive RNase protection assay was used. Damit wurden die Menge von U7 und seine Fähigkeit zu hybridisieren vor und nach der Behandlung mit den verschiedenen Oligonukleotid-Inhibitoren bestimmt. Thus the amount of U7 and its ability to hybridize were before and after the treatment with the different oligonucleotide inhibitors. Nach Inkubation mit den verschiedenen Inhibitoren wurde, in Gegenwart von 5 mM Mg 2+ oder ohne Magnesium, die EDTA-Konzentration auf 20 mM erhöht. After incubation with various inhibitors have been, in the presence of 5 mM Mg 2+ or without magnesium, the EDTA concentration increased to 20 mM.

Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen: Die Kernextraktproben (7,5 @l) wurden in Puffer D 7,5/11,5 (Puffer D, verdünnt um einen Faktor 7,5/11,5), enthaltend die in Fig. 7 angegebenen Mengen der Oligoribonukleotide ssDNA-7U-18mer, 2′-O-Ethyl- oder 2′-O-Methyl-7U-19mer oder 2′-O-Methyl-NS-19mer, inkubiert. In particular, it was proceeded as follows: The nuclear extract samples (7.5l) was dissolved in buffer D 7.5 / 11.5 (buffer D, diluted by a factor 7.5 / 11.5), containing the 7 in Fig. the stated amounts of oligoribonucleotides ssDNA 7U-18mer, 2'-O-ethyl or 2'-O-methyl-7U-19mer or 2'-O-methyl-NS-19mer incubated. Die Proben, die mit "Mg 2+ " gekennzeichnet sind (4, 10-14, 16), enthielten 5 mM MgCl₂ und wurden 30 min auf Eis, 30 min bei Raumtemperatur und 30 min bei 30°C inkubiert, worauf 20 mM EDTA hinzugefügt wurden. The samples marked with "Mg 2+" (4, 10-14, 16), containing 5 mM MgCl₂ and incubated for 30 min at room temperature and 30 min at 30 ° C for 30 min on ice, after which 20 mM EDTA were added. Bei den übrigen Proben (3, 5-9, 15) wurde die Probe in Puffer D 7,5/11,5 (mit einem Gehalt von 0,13 mM EDTA und ohne zweiwertige Kationen) 20 min auf Eis inkubiert, worauf 20 mM EDTA hinzugefügt wurden. For the other samples (3, 5-9, 15) the sample in buffer D 7.5 / 11.5 was incubated (with a content of 0.13 mM EDTA and without divalent cations) for 20 min on ice, after which 20 mM EDTA were added. Das Mapping wurde mit einer Antisense-Maus-U7-RNA durchgeführt, wie bei Cotten, M., Schaffner, G. und Birnstiel, ML (1989) Mol. Cell. The mapping was performed with an antisense mouse-U7 RNA, as in Cotten, M., Schaffner, G., and Birnstiel, ML (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4479-4487, beschrieben. Biol. 9, 4479-4487, described. Das Protein in der Probe wurde durch Proteinase K Verdau zerstört, die RNA geerntet und mit radioaktiver 7U-RNA hybridisiert. The protein in the sample was destroyed by proteinase K digestion, the RNA harvested and hybridized with radioactive RNA 7U. Anschließend wurde die Probe mit RNase A plus RNase Tl behandelt, um die gesamte nicht-doppelsträngige RNA zu zerstören, und die geschützte RNA durch Gelelektrophorese aufgetrennt ( Fig. 7): Die Kontrolle, unbehandelte Kernextraktproben, ergaben die für intakte U7-RNA erwartete Bande (Spuren 3 und 17). The sample with RNase A was plus RNase Tl treated to destroy the entire non-double-stranded RNA, and the protected RNA by gel electrophoresis gel (Fig. 7): The control, untreated seed extract samples yielded the expected for intact U7 RNA band (lanes 3 and 17). Aus der Messung der Radioaktivität dieser Bande konnte gefolgert werden, daß 7,5 @l dieses Kernextraktes ca. 10-15 fmol U7-RNA enthielten. From the measurement of the radioactivity of this band could be concluded that 7.5l this nuclear extract 10-15 fmol U7 RNA contained. Inkubation des Extraktes mit Mg 2+ allein bewirkte eine geringfügige Verringerung der U7-Menge sowie das Erscheinen einer geringen Menge eines U7-Subfragments ( Fig. 7, Spur 4). Incubation of the extract with Mg 2+ alone caused a slight reduction in the amount of U7 and the appearance of a small amount of U7 subfragment (Fig. 7, lane 4). U7-Zerstörung in geringem Ausmaß tritt mit dem DNA-7U-19mer in Abwesenheit von Mg 2+ (Spur 5) ein. U7-destruction occurs to a small extent with the DNA-7U-19mer in the absence of Mg 2+ (lane 5). Die Zerstörung von U7 ist vollständig, wenn die Probe mit 5 mM Mg 2+ inkubiert wird (Spur 10). The destruction of U7 is complete when the sample is incubated with 5 mM Mg 2+ (lane 10). Jedoch wurde - in Abwesenheit und in Gegenwart von Mg 2+ - weder mit 2′-O-Methyl-7U-19mer noch mit 2′-O-Ethyl-7U-19mer des Kontroll-2′-O-Methyl-NS19mer eine nachweisbare Änderung der U7-RNA-Menge festgestellt. However, it has - in the absence and in the presence of Mg 2+ - either with 2'-O-methyl-7U-19mer or with 2'-O-ethyl-7U of the control 19mer 2'-O-methyl-a detectable NS19mer change in the U7 RNA amount found. Die verwendeten Bedingungen waren dieselben, die für die 7U-19mer-Oligonukleotide vollständige Inhibierung des Histon-Processing hervorriefen ( Fig. 6). The conditions used were the same as those evoked for the 7U-19mer oligonucleotides complete inhibition of histone processing (Fig. 6). Die schwache Verringerung in den U7-Konzentrationen und das Erscheinen des U7-Subfragments in den Spuren 11-14 sind nicht ausgeprägter als die Änderungen, die mit Mg 2+ -Inkubation in Abwesenheit von Oligonukleotid beobachtet wurden (Spur 4). The weak reduction in the U7 concentrations and the appearance of the U7 subfragment in lanes 11-14 are more pronounced than the changes that have been observed with Mg 2+ -Inkubation in the absence of oligonucleotide (lane 4). Aufgrund der Ergebnisse dieses Versuchs konnte geschlossen werden, daß die starke inhibitorische Aktivität der 2′-O-Methyl- und Ethyl-Oligoribonukleotide nicht von einer enzymatischen Veränderung der Ziel-RNA begleitet ist. Based on the results of this experiment it could be concluded that the potent inhibitory activity of 2'-O-methyl-oligoribonucleotides and ethyl is not accompanied by an enzymatic alteration of the target RNA.

Fig. 7: Fig. 7:

Spur 1: 7U Sonde Lane 1: 7U probe
Spur 2: 7U, hybridisiert mit 20 @g tRNA Lane 2: 7U, hybridized with 20g tRNA
Spuren 3 und 17: Kontrolle: Extrakt, behandelt ohne Oligonukleotid, ohne Mg 2+ Lanes 3 and 17: Control: extract treated without oligonucleotide without Mg 2+
Spur 4: Extrakt, behandelt mit Mg 2+ Lane 4: extract treated with Mg 2+
Spur 5: Extrakt, behandelt mit 30 pmol ssDNA-7U-19mer Lane 5, extract, treated with 30 pmol ssDNA 19mer-7U
Spuren 5 und 7: Extrakt, behandelt mit 30 und 300 fmol 2′-O-Methyl-7U-19mer Lanes 5 and 7: extract, treated with 30 and 300 fmol of 2'-O-methyl-7U 19mer
Spuren 8 und 9: Extrakt, behandelt mit 30 und 300 fmol 2′-O-Ethyl-7U-19mer Lanes 8 and 9: extract, treated with 30 and 300 fmol of 2'-O-ethyl-7U 19mer
Spur 10: Extrakt, behandelt mit 30 pmol ssDNA-7U-19mer plus Mg 2+ Lane 10: extract with 30 pmol ssDNA 19mer plus 7U-treated Mg 2+
Spuren 11 und 12: Extrakt, behandelt mit 30 und 300 fmol 2′-O-Methyl-7U-19mer plus Mg 2+ Lanes 11 and 12: the extract is treated with 30 and 300 fmol of 2'-O-methyl-7U 19mer plus Mg 2+
Spuren 13 und 14: Extrakt, behandelt mit 30 und 300 fmol 2′-O-Ethyl-7U-19mer plus Mg 2+ Lanes 13 and 14: the extract is treated with 30 and 300 fmol of 2'-O-ethyl-7U 19mer plus Mg 2+
Spur 15: Extrakt, behandelt mit 3 pmol Kontroll-2′-O-Methyl NS-19mer Track 15: extract treated with 3 pmol check-2'-O-methyl NS-19mer
Spur 16: Extrakt, behandelt mit 3 pmol Kontroll-2′-O-Methyl NS-19mer plus Mg 2+ Lane 16: extract treated with 3 pmol check-2'-O-methyl NS-19mer plus Mg 2+
Spuren M: Molekulargewichtsstandards wie in Fig. 3. Lanes M: molecular weight standards as in Fig. 3.

Die verkürzten U7-Spezies, die durch NA-Oligonukleotid/RNase H Spaltung gebildet wurden, sind angegeben. The shortened U7 species formed by NA oligonucleotide / RNase H cleavage are indicated.

Die folgenden Beispiele erläutern einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung. The following examples illustrate a further object of the present invention.

Die Synthese der Oligodeoxynukleotide kann nach Standardverfahren auf den ABI 380 B DNA-Synthesizer erfolgen (Applied Biosystems, 380 B DNA synthesizer, users manual, Version 1.0, Juli 1985). The synthesis of oligodeoxynucleotides can according to standard procedures on the ABI 380B DNA synthesizer done (Applied Biosystems 380B DNA synthesizer, users manual, Version 1.0, July 1985). Das Oligodeoxynukleotid wird durch Ausfällen durch Ethanol und denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese oder Reverse Phase-HPLC gereinigt. The oligodeoxynucleotide is purified by precipitation with ethanol and denaturing polyacrylamide gel electrophoresis or reverse phase HPLC.

Die 19mer 2′-Methoxyoligonukleotide können mit einem ABI 380 B DNA-Synthesizer synthetisiert werden, wobei CPG-Festphase (controlles-pore glass) mit einem 3′-Deoxynukleosid als Starter verwendet wird. The 19mer 2'-Methoxyoligonukleotide can be synthesized using an ABI 380B DNA synthesizer, with CPG solid phase (controlles-pore glass) is used with a 3'-deoxynucleoside as a starter.

Vorzugsweise werden 2′-O-Methylnukleosid(2-cyanoethyl)- (N,N-diisopropylamino)phosphoramidite mit folgenden Schutzgruppen verwendet: Preferably 2'-O-Methylnukleosid (2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropylamino) phosphoramidites with the following protective groups used:

Adenosin: Adenosine:
N⁶-Phenoxyacetyl 5′-O-DMTr (Dimethoxytrityl) N⁶-phenoxyacetyl 5'-O-DMTr (dimethoxytrityl)
Cytidin: Cytidine:
N⁴-Benzoyl 5′-O-MMTr (Monomethoxytrityl) N⁴-benzoyl-5'-O MMTr (monomethoxytrityl)
Guanosin: N²-Phenoxyacetyl 5′-O-DMTr (Dimethoxytrityl) Guanosine: N²-phenoxyacetyl 5'-O-DMTr (dimethoxytrityl)
Uridin: Uridine:
5′-O-MMTr (Monoethoxytrityl) 5'-O-MMTr (Monoethoxytrityl)

Die Herstellung dieser Verbindungen ist in den Beispielen beschrieben. The preparation of these compounds is described in the examples. Das Standard-DNA-Verfahren wird dabei mit verlängerter Kopplungszeit (5 Min. anstelle von 3 Min.) verwendet. The standard DNA methods is thereby extended coupling time (5 min., Instead of 3 min.) Was used. Das Oligonukleotid wird nach der Festphasensynthese durch die Behandlung mit 25%iger wässeriger NH₄OH-Lösung (z. B. 15 Stunden bei 55°C) von den Schutzgruppen befreit und von dem festen Träger getrennt. The oligonucleotide is freed after the solid-phase synthesis by treatment with 25% aqueous NH₄OH solution (z. B. 15 hours at 55 ° C) of the protective groups and separated from the solid support. Die Abspaltung der NPE-Gruppe am Guanosin (falls vorhanden) erfolgt mit DBU. The removal of the NPE group at the guanosine (if any) is done with DBU. Nach der abschließenden Detritylation wird das rohe Oligonukleotid durch denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. After the final detritylation the crude oligonucleotide was purified by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Für die U7-Hemmung wird das Material weiter durch RP-HPLC (reverse phase-HPLC) gereinigt ( Fig. 2). U7 for the inhibition, the material further by RP-HPLC (reverse phase HPLC) is cleaned (Fig. 2).

Die Synthese der Phosphorthioatoligodeoxynukleotide kann durch die H-Phosphonatmethode mit einem AB 380 B DNA-Synthesizer, mit den empfohlenen Verfahren erfolgen. The synthesis of phosphorothioate oligodeoxynucleotides can be performed by the H-phosphonate with an AB 380 B DNA synthesizer, using the recommended method. (Applied Biosystems, User Bulletin DNA synthesizer model 380, Issue No. 44, Dec. 1987. Froehler, BC and Matteucci, MD (1986) Tetrahedron Lett. 27, 469-72 und (1986) Nucl. Acids Res. 14, 5399-5407. Die Schwefelung kann mit Schwefel (5% in Schwefelkohlenstoff, Pyridin, Triethylamin 12 : 12 : 1) an dem festen Trägermaterial erfolgen, wobei die 5′-Endgruppe geschützt ist. Nach dem Abtrennen von dem festen Trägermaterial und dem Entfernen der Schutzgruppen der Basen, wird das 5′-Tritylphosphorothioatoligonukleotid durch RP-HPLC (reverse phase-HPLC) gereinigt. Das Material des Haupt-Peaks wird detrityliert und nochmals durch RP-HPLC (reverse phase-HPLC) gereinigt. (Applied Biosystems, User Bulletin DNA synthesizer Model 380, Issue No. 44, Dec. 1987. Froehler, BC and Matteucci, MD (1986) Tetrahedron Lett. 27, 469-72 and (1986) Nucl. Acids Res. 14, 5399 . -5407 The sulfurization can with sulfur (5% in carbon disulfide, pyridine, triethylamine 12: 12: 1) take place on the solid support material, the 5'-terminal group is protected After separation of the solid support and removal of the protecting groups. of the bases, the 5'-Tritylphosphorothioatoligonukleotid by RP-HPLC (reverse phase HPLC) is purified. The material of the main peak is detritylated and further purified by RP-HPLC (reverse phase HPLC).

Die Synthese der Phosphorthioat-2′-O-Alkyloligoribonukleotide kann auch durch die Phosphoramiditmethode analog dem Standardverfahren (Applied Biosystem, 380B DNA Synthesizer, users manual, Version 1.0, Juli 1985) mit 2′-O-Alkylnukleosiden erfolgen mit der Abänderung, daß im Oxidationsschritt statt Jod eine 0,2 M Lösung von 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid in Acetonitil eingesetzt wird, wie in IYER, RPJ Am. The synthesis of phosphorothioate 2'-O-Alkyloligoribonukleotide can also by the phosphoramidite method analogous to the standard method (Applied Biosystem 380B DNA synthesizer, users manual, Version 1.0, July 1985) carried out with 2'-O-Alkylnukleosiden with the modification that the oxidation step instead of iodine, a 0.2 M solution of 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide in acetonitrile is used as described in Iyer RPJ Am. Chem. Soc. Chem. Soc. 112 (1990), 1253-1254 beschrieben ist. 112 (1990), 1253-1254 described.

Die Synthese der 2′-O-Ethyloligoribonukleotide kann z. B. an einem Pharmacia Gene Assembler erfolgen, der mit 0,2 µmol festem Trägermaterial (5 µm Polymerkörner auf Basis Polystyrol) mit Deoxythymidin als 3′-Starternukleotid beladen ist. The synthesis of the 2'-O-Ethyloligoribonukleotide can, for. Example, on a Pharmacia Gene Assembler carried out, is loaded with 0.2 .mu.mol solid support material (5 micron polymer seeds based on polystyrene) with deoxythymidine 3'-Starternukleotid.

Vorzugsweise werden 2′-O-Ethylnukleosid(2-cyanoethyl)- (N,N-diisopropylamino)phosphoramidite mit folgenden Schutzgruppen verwendet: Preferably 2'-O-Ethylnukleosid (2-cyanoethyl) are - (N, N-diisopropylamino) phosphoramidites with the following protective groups used:

Adenosin: Adenosine:
N⁶-Phenoxyacetyl 5′-O-DMTr (Dimethoxytrityl) N⁶-phenoxyacetyl 5'-O-DMTr (dimethoxytrityl)
Cytidin: Cytidine:
N⁴-Benzoyl 5′-O-DMTr (Dimethoxytrityl) N⁴-benzoyl-5'-O DMTr (dimethoxytrityl)
Guanosin: N²-Phenoxyacetyl Guanosine: N² Phenoxyacetyl
O⁶-NPE (NPE: 2-(4-Nitrophenyl)-ethyl) O⁶-NPE (NPE: 2- (4-nitrophenyl) ethyl)
5′-O-DMTr (Dimethoxytrityl) 5'-O-DMTr (dimethoxytrityl)
Uridin: Uridine:
5′-O-DMTr (Dimethoxytrityl) 5'-O-DMTr (dimethoxytrityl)

Die Bedingungen entsprechen dem Standard der DNA-Synthese, ausgenommen die Kopplungsdauer, die zweckmäßig auf 5 Minuten erhöht wird. The conditions correspond to the standard of DNA synthesis, except that the coupling time which is suitably increased to 5 minutes. (Ablauf: Entfernen der Schutzgruppen: 0,4 Min, 3% Trichloressigsäure in Dichlorethan, Koppeln: 5,0 Min, 25 Äquivalente Amidit, 500 Äquivalente Tetranol in Acetonitril; Capping: 0,4 Minuten, 10% Essigsäureanhydrid, 3% 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin (DMAP), 15% Collidin in Acetonitril; Oxidation: 0,1 Min, 0,01 MI₂, 5% Collidin in Acetonitril). (Proceedings of: removing the protecting groups: 0.4 min, 3% trichloroacetic acid in dichloroethane, coupling: 5.0 min, 25 equivalents amidite, 500 equivalents Tetranol in acetonitrile; Capping: 0.4 minutes, 10% acetic anhydride, 3% 4- (N, N-dimethylamino) pyridine (DMAP), collidine in 15% acetonitrile; Oxidation: 0.1 min, 0.01 MI₂, collidine in 5% acetonitrile). Diese Maßnahmen sind nötig, um der reduzierten Kopplungseffizienz entgegenzuwirken, die durch die sterische Hinderung durch die sperrige 3′-Ethoxygruppe bedingt ist. These measures are necessary in order to counteract the reduced coupling efficiency, which is due to the steric hindrance by the bulky 3'-ethoxy group. Die durchschnittliche Kopplungseffizienz ist etwa 98,3% (berechnet aus der beim Entfernen der Schutzgruppen freigesetzten Menge an Tritylkationen). The average coupling efficiency is about 98.3% (calculated from the released upon removal of the protecting groups the amount of trityl cation). Entfernen der Schutzgruppen der Base und Reinigung: Nach dem letzten De-tritylieren wird das gebundene Oligonukleotid mit 25%igem wässerigen Ammoniak während 2 Stunden bei 55°C behandelt, um es vom Träger zu trennen und alle Schutzgruppen (außer der O⁶-2-(4-Nitrophenyl)ethylgruppe (NPE) bei Guanosin) zu entfernen. Removing the protecting groups of the base and purification: After the last De-tritylation the bound oligonucleotide washed with 25% aqueous ammonia for 2 hours at 55 ° C is treated to separate it from the support and all protecting groups (except the O⁶-2- ( 4-nitrophenyl) ethyl (NPE) in guanosine) to remove. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockene gedampft und ein Teil des rohen Oligonukleotids (oder NPE-geschützten Guanosins) wird durch RP-HPLC (reverse phase-HPLC) gereinigt ( Fig. 2) um als Negativkontrolle in den Hemmstudien verwendet zu werden. The solution is evaporated to dryness in vacuo and a portion of the crude oligonucleotide (or NPE-protected guanosine) is purified by RP-HPLC (reverse phase-HPLC) (Fig. 2) to be used as a negative control in the inhibition studies. Bei der Herstellung von Guanosinverbindungen wird, um die NPE-Gruppe zu entfernen, das Oligonukleotid für 24 Stunden mit 500 µl von 1 M DBU (1,8-Diazabicyclo [5,4,0]undec-7-ene) in Pyridin bei 55°C behandelt. In the production of Guanosinverbindungen is to remove the NPE group, the oligonucleotide for 24 hours with 500 ul of 1 M DBU (1,8-diazabicyclo [5,4,0] undec-7-ene) in pyridine at 55 treated ° C. (Mag, M. and Engels, JW (1988) Nucl. Acids Res. 16, 3525-3543). (Mag, M. and Engels, JW (1988) Nucl. Acids Res. 16, 3525-3543). Nach dem Neutralisieren des DBU mit 1,1 Äquivalenten Essigsäure und teilweisem Eindampfen im Vakuum, wird die gelbe Lösung einer Gelfiltration unterworfen und das Produkt weiter gereinigt durch präparative Polyacrylamidgelelektrophorese. After neutralizing with 1.1 equivalents of DBU acetic acid and partial evaporation in vacuo, the yellow solution is subjected to gel filtration and the product further purified by preparative polyacrylamide gel electrophoresis. Die Ausbeute an gereinigtem 19mer: 240 µg (36 pmol, 18% bezogen auf das feste Trägermaterial, RP-HPLC Profil, Fig. 2). The yield of purified 19mer: 240 ug (36 pmole, 18% based on the solid support material, RP-HPLC profile, Fig. 2).

Die anderen Oligonukleotide der Erfindung können analog der obigen Anleitung hergestellt werden. The other oligonucleotides of the invention can be prepared analogously to the above instructions.

Beispiele für die Herstellung von Nukleosiden Examples of preparation of nucleosides N⁴-Benzoyl-5′-O-dimethoxytrityl-2′-O-methyl-cytidin 3a N⁴-benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-cytidine 3a

40 g (0,164 mol) Cytidin wurden 20 Stunden bei 80°C am Hochvakuum getrocknet und hierauf in 650 ml wasserfreiem Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst. 40 g (0.164 mol) of cytidine were dried at 80 ° C under high vacuum and thereafter dissolved in 650 ml of anhydrous dimethylformamide under heating for 20 hours. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und mit 4,33 g (0,18 mol) gewaschenem Natriumhydrid versetzt und 45 Minuten bei 0°C gerührt. The solution was cooled to 0 ° C and treated with 4.33 g (0.18 mol) of washed sodium hydride and stirred at 0 ° C for 45 minutes. Dann wurden portionsweise, über einen Zeitraum von 4 Stunden und unter Erwärmung auf Raumtemperatur insgesamt 36,9 g (0,26 mol) Methyljodid (20%ig in Dimethylformamid) zugetropft. Then, in portions, over a period of 4 hours while warming to room temperature and 36.9 g (0.26 mol) of methyl iodide (20% solution in dimethylformamide) added dropwise. Die Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt und zu dem Zeitpunkt abgebrochen, als der Anteil an dimethyliertem Produkt im Reaktionsgemisch stark anstieg. The reaction was monitored by TLC and stopped at the time when the proportion of dimethylated product in the reaction mixture rose sharply. Bei der Aufarbeitung wurde ausgefallenes Natriumjodid abgetrennt und das Reaktionsgemisch am Hochvakuum eingedampft. In the workup precipitated sodium iodide was separated and evaporated, the reaction mixture under high vacuum. Der Rückstand wurde mittels Flashchromatographie gereinigt (Substanz/Kieselgel = 1/10, Eluens: Chloroform/Methanol = 5/1). The residue was purified by flash chromatography (substance / = 1.10 silica gel, eluent: chloroform / methanol = 5/1). Rohausbeute: 22,2 g (Gemisch der 2′- und 3′-O-Methyl Isomeren, mit Natriumjodid verunreinigt; DC: Chloroform/Methanol = 3/2. R f = 0,3 für beide Isomere). Crude yield: 22.2 g (mixture of 2'- and 3'-O-methyl isomers, contaminated with sodium iodide; TLC: chloroform / methanol = 3/2 Rf = 0.3 for both isomers.). 20,8 g des Rohproduktes wurden mehrmals mit Benzol/Pyridin abgeschleppt und in 250 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. 20.8 g of the crude product were repeatedly towed with benzene / pyridine and dissolved in 250 ml of anhydrous pyridine. Hierauf wurden bei Raumtemperatur 34,9 g (0,32 mol) Trimethylchlorsilan zugetropft und 60 Minuten gerührt. Then at room temperature, 34.9 g (0.32 mol) of trimethylchlorosilane were added dropwise and stirred for 60 minutes. Anschließend wurden 13,5 g (0,096 mol) Benzoylchlorid zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Subsequently, 13.5 g (0.096 mol) of benzoyl chloride were added and left overnight at room temperature. Die Reaktionslösung wurde auf 300 ml Wasser gegossen, mit 300 ml Methanol verdünnt und mit 250 ml konzentriertem Ammoniak versetzt. The reaction solution was poured onto 300 ml of water, diluted with 300 ml of methanol and treated with 250 ml of concentrated ammonia. Nach 20 Minuten wurde auf Dichlormethan geschüttet und die wäßrige Phase zehnmal mit Dichlormethan extrahiert. After 20 minutes, was poured onto dichloromethane and the aqueous phase extracted ten times with dichloromethane. Die gesammelten organischen Phasen wurden vereinigt, mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. The collected organic phases were combined, dried, filtered and evaporated with sodium sulphate. Es wurden 32 g Rohprodukt 2a/5a = 4,26/1 erhalten (DC: Dichlormethan/Methanol = 10/1. R f = 0,2, beide Regioisomere). There were 32 g of crude product 2a / 5A = 4.26 / 1 (TLC: dichloromethane / methanol = 10/1 Rf = 0.2, both regioisomers.). Das Gemisch 2a/5a wurde dreimal mit Pyridin/Benzol abgeschleppt, in wasserfreiem Pyridin mit 33 g (0,0976 mol) Dimethoxytritylchlorid versetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. The mixture 2a / 5a was towed three times with pyridine / benzene in anhydrous pyridine with 33 g (0.0976 mol) of dimethoxytrityl chloride and stirred for 2 hours at room temperature. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und zwischen Dichlormethan und Natriumhydrogencarbonatlösung verteilt. The reaction mixture was concentrated and partitioned between dichloromethane and sodium bicarbonate solution. Die wäßrige Phase wurde mehrmals mit Dichlormethan extrahiert. The aqueous phase was extracted several times with dichloromethane. Die gesammelten organischen Phasen wurden mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. The collected organic phases were dried with sodium sulfate and evaporated. Das erhaltene Rohprodukt wurde mittels Flashchromatographie (1200 g Kieselgel, Eluens: Dichlormethan dann Dichlormethan/Aceton = 8/1)) gereinigt. The crude product obtained was purified by flash chromatography (1200 g silica gel, eluent: dichloromethane then dichloromethane / acetone = 8/1) to give). Es wurden 25,3 g (25%) 3a und 5,1 g (5%) 6a als gelbe feste Öle erhalten (ausgehend von Cytidin). There were 25.3 g (25%) 3a and 5.1 g (5%) 6a as yellow solid oils obtained (starting from cytidine). DC: Dichlormethan/Aceton = 3,5/1,5. TLC: dichloromethane / acetone = 3.5 / 1.5. R f = 0,28 für 3a, R f = 0,24 für 6a. R f = 0.28 for 3a, R f = 0.24 for 6a.

¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ = 8,58 (d, J = 7,2 Hz, 1 H; 6-H), 7,98-7,18 (m, 16H; DMTr, Bz, NH, 5-H), 6,89 (d, J = 7,5 Hz, 4H; DMTr), 6,02 (s, 1H; 1′-H), 4,65-3,92 (m, 4H; 2′-H, 3′-H, 4′-H, 3′-OH), 3,82 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,7 (s, 3H); ¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ = 8.58 (d, J = 7.2 Hz, 1 H, 6-H), 7.98 to 7.18 (m, 16H, DMTr, Bz, NH , 5-H), 6.89 (d, J = 7.5 Hz, 4H, DMTr), 6.02 (s, 1H; 1'-H), 4.65 to 3.92 (m, 4H; 2'-H, 3'-H, 4'-H, 3'-OH), 3.82 (s, 6H, DMTr OCH₃), 3.7 (s, 3H); 2′-OCH₃), 3,6 (m, 2H; 5′-CH₂). 2'-OCH₃), 3.6 (m, 2H; 5'-CH₂).

¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 166,22 (s, C=O), 162,36 (s, 4-C*), 158,25 (s, arom., C-OCH₃), 154,37 (s, 2-C), 144,58 (d, 6-C), 143,73/135,29 (2 s, DMTr), 134,98/132,7/132,54 (arom., Bz), 129,74/129,62/ 128,38/127,90/127,64/127,39/126,754 (arom.), 112,94 (d, DMTr), 96,46 (d, 5-C), 87,99 (d, 1′-C), 86,62 (s, C-(Ph)3), 83,51 (d, 2′-C), 82,46 (d, 4′-C), 67,42 (d, 3′-C), 60,58 (t, 5′-CH₂), 58,22 (q, OCH₃), 54,78 (q, DMTr OCH₃). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 166.22 (s, C = O), 162.36 (s, C-4 *), 158.25 (arom s, C-OCH₃.), 154 , 37 (s, 2-C), 144.58 (d, C-6), 143.73 / 135.29 (2 s, DMTr), 134.98 / 132.7 / 132.54 (arom., Bz), 129.74 / 129.62 / 128.38 / 127.90 / 127.64 / 127.39 / 126.754 (arom.), 112.94 (d, DMTr), 96.46 (d, 5- C), 87.99 (d, 1'-C), 86.62 (s, C- (Ph) 3), 83.51 (d, 2'-C), 82.46 (d, 4'- C), 67.42 (d, C-3 '), 60.58 (t, 5'-CH₂), 58.22 (q, OCH₃), 54.78 (q, DMTr OCH₃).

N⁴-Benzoyl-5′-O-dimethoxytrityl-3′-O-methylcytidin 6a N⁴-benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-3'-O-methylcytidine 6a

¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 8,43 (d, J = 7,7 Hz, 1H; 6-H), 7,91 (d, J = 7,7, 2H, Bz), 7,65-7,2 (m, 13H; DMTr, Bz, 5-H), 6,9 (d, J = 9,7, 4H; DMTr), 5,98 (s, 1H; 1′-H), 4,47 (m, 1H; 2′-H), 4,31 (m, 1H; 4′-H), 4,02 (m, 1H; 3′-H), 3,82 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,6 (d, J = 10,3, 1H; 5′-H), 3,44 (s, 3H; 3′-OCH₃), 3,5-3,35 (m, 1H; 5′-H). ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 8.43 (d, J = 7.7 Hz, 1H, 6-H), 7.91 (d, J = 7.7, 2H, Bz), 7 , from 65 to 7.2 (m, 13H, DMTr, Bz, 5-H), 6.9 (d, J = 9.7, 4H, DMTr), 5.98 (s, 1H; 1'-H) , 4.47 (m, 1H; 2'-H), 4.31 (m, 1H; 4'-H), 4.02 (m, 1H; 3'-H), 3.82 (s, 6H ; DMTr OCH₃), 3.6 (d, J = 10.3, 1H; 5'-H), 3.44 (s, 3H, 3'-OCH₃), 3.5 to 3.35 (m, 1H ; 5'-H).

¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 166,5 (s, Ar-NH-C=O), 162,51 (s, 4-C), 158,62 (s, arom., C-OCH₃), 155,34 (s, 2-C), 144,78 (d, 6-C), 144,01/135,49/ 135,24/132,98/130,0/129,88/128,83/128,08/127,96/ 127,65/127,08/113,26 (arom.), 96,89 (d, 5-C), 92,24 (d, 1′-C), 86,96 (s, C-(Ph)3), 81,5 (d, 4′-C), 78,01 (d, 3′-C), 73,92 (d, 2′-C) 61,64 (t, 5′-CH₂), 58,27 (q, OCH₃), 55,14 (q, DMTr OCH₃). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 166.5 (s, Ar-NH-C = O), 162.51 (s, C-4), 158.62 (s, arom, C-OCH₃. ), 155.34 (s, 2-C), 144.78 (d, C-6), 144.01 / 135.49 / 135.24 / 132.98 / 130.0 / 129.88 / 128, 83 / 128,08 / 127,96 / 127,65 / 127,08 / 113,26 (arom.), 96.89 (d, 5-C), 92.24 (d, 1'-C), 86 , 96 (s, C- (Ph) 3), 81.5 (d, 4'-C), 78.01 (d, C-3 '), 73.92 (d, 2'-C) 61, 64 (t, 5'-CH₂), 58.27 (q, OCH₃), 55.14 (q, DMTr OCH₃).

N⁴-Benzoyl-2′-O-methylcytidin 2a (wurde als durch Detritylierung von 3a erhaltenes Produkt charakterisiert): 430 mg (0,65 mmol) 3a wurden 5 min in 16 ml 2%iger Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan gerührt. N⁴-benzoyl-2'-O-methylcytidine 2a (as was obtained by detritylation of the product characterized 3a): 430 mg (0.65 mmol) of 3a were dissolved in 16 ml min 2% trichloroacetic acid in dichloromethane was stirred 5. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser extrahiert, die vereinigten wäßrigen Phasen eingedampft und mittels Flashchromatographie gereinigt (9 g Kieselgel, Eluens: Dichlormethan/Aceton = 4/1 dann 3/2): 220 mg (94%) 2a, weißer Schaum, DC: Dichlormethan/Methanol = 10/1. The reaction mixture was extracted with water, the combined aqueous phases evaporated and purified by flash chromatography (9 g silica gel, eluent: dichloromethane / acetone = 4/1 then 3/2): 220 mg (94%) 2a, a white foam, TLC: dichloromethane / methanol = 10/1. R f = 0,2. R f = 0.2.

¹H-NMR (DMSO, 200 MHz): δ = 8,9 (m, 1H; 6-H), 8,69-7,42 (m, 3H; 3′-OH, 5′-OH, NH), 8,15 (d, J = 7,7 Hz, 2H; Bz), 7,78-7,42 (m, 4H; Bz, 5-H), 5,83 (s, 1H; 1′-H), 4,12 (m, 1H; 3′-H), 3,98 (m, 1H; 4′-H), 3,87 (m, 2H; 2′-H, 5′-H), 3,67 (d, J = 12,7 Hz, 1H; 5′-H), 3,48 (s, 3H; 2′-OCH₃). ¹H-NMR (DMSO, 200 MHz): δ = 8.9 (m, 1H, 6-H), 8.69 to 7.42 (m, 3H, 3'-OH, 5'-OH, NH), 8.15 (d, J = 7.7 Hz, 2H, Bz), 7.78 to 7.42 (m, 4H, Bz, 5-H), 5.83 (s, 1H; 1'-H) , 4.12 (m, 1H; 3'-H), 3.98 (m, 1H; 4'-H), 3.87 (m, 2H, 2'-H, 5'-H), 3, 67 (d, J = 12.7 Hz, 1H; 5'-H), 3.48 (s, 3H, 2'-OCH₃).

¹³C-NMR (DMSO, 50 MHz): δ = 166,69 (s, Ar-NH-C=O), 160,09 (s, 4-C), 149,22 (s, 2-C/d, 6-C), 133,87 (d, arom.), 131,71/128,86/128,79 (arom.), 95,34 (d, 5-C), 88,78 (d, 1′-C), 84,55 (d, 4′-C), 83,38 (d, 2′-C), 67,11 (d, 3′-C), 58,96 (t, 5′-CH₂), 58,09 (q, OCH₃). ¹³C-NMR (DMSO, 50 MHz): δ = 166.69 (s, Ar-NH-C = O), 160.09 (s, C-4), 149.22 (s, C-2 / d, 6-C), 133.87 (d, arom.), 131.71 / 128.86 / 128.79 (arom.), 95.34 (d, 5-C), 88.78 (d, 1 ' -C), 84.55 (d, 4'-C), 83.38 (d, 2'-C), 67.11 (d, C-3 '), 58.96 (t, 5'-CH₂ ), 58.09 (q, OCH₃).

N⁴-Benzoyl-3′-O-methylcytidin 5a (erhalten durch Detritylierung von 6a): 400 mg (0,60 mmol) 6a wurden in 10 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und auf -5°C abgekühlt. N⁴-benzoyl-3'-O-methylcytidine 5a (obtained by detritylation of 6): 400 mg (0.60 mmol) of 6a were dissolved in 10 ml of anhydrous dichloromethane and cooled to -5 ° C. Die Lösung wurde mit 0,2 ml einer 10%igen etherischen Salzsäurelösung versetzt. The solution was treated with 0.2 ml of 10% ethereal hydrochloric acid solution. Das Reaktionsgemisch färbte sich sofort rot und es fiel ein Niederschlag aus. The reaction mixture immediately turned red and there fell a precipitate. Das Reaktionsgemisch wurde eingedampft und der Rückstand wurde mittels Flashchromatographie (8 g Kieselgel, Eluens: Dichlormethan/Aceton = 2/1.) gereinigt und aus Ethylacetat/Methanol ausgefällt. The reaction mixture was evaporated and the residue was purified by flash chromatography (8 g silica gel, eluent:. Dichloromethane / acetone = 2/1) and precipitated from ethyl acetate / methanol. Es wurden 194 mg (89,5%) 5a als weißer Schaum erhalten. There were 194 mg (89.5%) 5a as a white foam. DC: Dichlormethan/Methanol = 10/1. TLC: dichloromethane / methanol = 10/1. R f = 0,4. R f = 0.4.

¹H-NMR (DMSO, 200 MHz): δ = 8,75 (d, J = 7,7 Hz, 1H; 6-H), 8,1 (d, J = 7,7 Hz, 2H; Bz) 7,74-7,37 (m, 4H; Bz, 5-H), 6,9-5,5 (m, 2H; 3′-OH; 5′-OH), 5,76 (s, 1H; 1′-H), 4,33 (m, 1H; 2′-H), 4,08 (m, 1H; 4′-H), 3,9-3,7 (m, 2H; 3′-H, 5′-H), 3,63 (d, J = 12,7 Hz, 1H; 5′-H), 3,34 (s, 3H; 3′-OCH₃). ¹H-NMR (DMSO, 200 MHz): δ = 8.75 (d, J = 7.7 Hz, 1H, 6-H), 8.1 (d, J = 7.7 Hz, 2H, Bz) 7 , 74 to 7.37 (m, 4H, Bz, 5-H), 6.9 to 5.5 (m, 2H, 3'-OH, 5'-OH), 5.76 (s, 1H; 1 '-H), 4.33 (m, 1H; 2'-H), 4.08 (m, 1H; 4'-H), 3.9 to 3.7 (m, 2H, 3'-H, 5'-H), 3.63 (d, J = 12.7 Hz, 1H; 5'-H), 3.34 (s, 3H, 3'-OCH₃).

¹³C-NMR (DMSO, 50 MHz): δ = 166,95 (s, Ar-NH-C=O), 160,83 (s, 4-C), 150,54 (s, 2-C), 148,14 (d, 6-C), 133,53/132,15/128,75/128,66 (arom.), 95,40 (d, 5-C), 91,31 (d, 1′-C), 82,54 (d, 4′-C), 77,01 (d, 3′-C), 72,24 (d, 2′-C), 59,46 (t, 5′-CH₂), 57,38 (q, OCH₃). ¹³C-NMR (DMSO, 50 MHz): δ = 166.95 (s, Ar-NH-C = O), 160.83 (s, C-4), 150.54 (s, C-2), 148 , 14 (d, 6-C), 133.53 / 132.15 / 128.75 / 128.66 (arom.), 95.40 (d, 5-C), 91.31 (d, 1 ' C), 82.54 (d, 4'-C), 77.01 (d, C-3 '), 72.24 (d, 2'-C), 59.46 (t, 5'-CH₂) , 57.38 (q, OCH₃).

N⁴-Benzoyl-2′-O-ethylcytidin 2b N⁴-benzoyl-2'-O-ethylcytidin 2b

45 g (0,185 mol) Cytidin wurden wie für 3a beschrieben gelöst und abgekühlt, mit 7,4 g (0,185 mol) Natriumhydrid (60% in Paraffin, gewaschen in wasserfreiem n-Hexan) versetzt und 1 h bei 0°C gerührt. 45 g (0.185 mol) cytidine were dissolved and cooled as described for 3a with 7.4 g (0.185 mol) of sodium hydride (60% in paraffin, washed in anhydrous n-hexane) and stirred for 1 h at 0 ° C. Es wurden analog zu 3a 40,52 g (3,825 mol) Ethyljodid zugegeben. It was added analogously to 3a 40.52 g (3.825 mol) of ethyl iodide. Reinigung durch SC (Klieselgel feinst, Eluens Dichlormethan/THF = 7/1) gereinigt und ergab 25,5 g farblosen Schaum, der mit 32,8 g (0,301 mol) Trimethylchlorsilan und 19,8 g (0,140 mol) Benzoylchlorid versetzt wurde. Purification by SC (Klieselgel finely, eluent dichloromethane / THF = 7/1) to give 25.5 g of colorless foam, which with 32.8 g (0.301 mol) of trimethylchlorosilane and 19.8 g (0.140 mol) of benzoyl chloride was added. Nach Aufarbeitung wurde in Ethylacetat aufgenommen und zur Kristallisation gebracht. After work-up was taken up in ethyl acetate and crystallized. Nach Trocknen wurden 16,6 g (24%) Reinprodukt 2b, Schmelzpunkt 193-194°, erhalten. After drying 16.6 g (24%) of pure product 2b, mp 193-194 ° obtained.

¹H-NMR (CDCl₃/DMSO, 200 MHz): δ = 10,5 (s br, 1H; NH), 8,62 (d, J = 8 Hz, 1H; 6-H), 8,03 (d, 2H; Bz), 7,70-7,30 (m, 4H; Bz, 5-H), 5,87 (s, 1H; 1′-H), 5,18* (s br, 1H; 5′-OH), 4,75* (s br, 1H; 3′-OH), 4,30-3,50 (m, 7H; 2′-H, 3′-H, 4′-H, O-CH₂-CH₃, 5′-CH₂), 1,21 (t, J = 7 Hz, 3H; O-CH₂-CH₃). ¹H-NMR (CDCl₃ / DMSO, 200 MHz): δ = 10.5 (s br, 1H, NH), 8.62 (d, J = 8 Hz, 1H, 6-H), 8.03 (d, 2H; Bz), 7.70 to 7.30 (m, 4H, Bz, 5-H), 5.87 (s, 1H; 1'-H), 5.18 * (s br, 1H, 5 ' -OH), 4.75 * (s br, 1H; 3'-OH), 4.30 to 3.50 (m, 7H, 2'-H, 3'-H, 4'-H, O-CH₂ -CH₃, 5'-CH₂), 1.21 (t, J = 7 Hz, 3H; O-CH₂-CH₃).

¹³C-NMR (CDCl₃/DMSO): δ = 166,25 (s, Ar-NH-C=O),. C-NMR (CDCl₃ / DMSO): δ = 166.25 (s, Ar-NH-C = O) ,. 161,98 (s, 4-C), 153,48 (s, 2-C), 143,70 (d, 6-C), 132,01 (d, arom.), 131,22/127,01 (arom.), 95,18 (d, 5-C), 87,56 (d, 1′-C), 82,88 (d, 4′-C), 80,97 (d, 2′-C), 65,89 (d, 3′-C), 64,55 (t, O-CH₂-CH₃), 57,95 (t, 5′-CH₂), 13,98 (q, O-CH₂-CH₃). 161.98 (s, C-4), 153.48 (s, 2-C), 143.70 (d, C-6), 132.01 (d, arom.), 131.22 / 127.01 (arom.), 95.18 (d, 5-C), 87.56 (d, 1'-C), 82.88 (d, 4'-C), 80.97 (d, 2'-C ), 65.89 (d, C-3 '), 64.55 (t, O-CH₂-CH₃), 57.95 (t, 5'-CH₂), 13.98 (q, O-CH₂-CH₃ ).

N⁴-Benzoyl-5′-O-dimethoxytrityl-2′-O-ethylcytidin 3b N⁴-benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-ethylcytidin 3b

7,30 g (19,4 mmol) 2b wurden mit 9,88 g (29,2 mmol) Dimethoxytritylchlorid umgesetzt und analog zu 3a aufgearbeitet. 7.30 g (19.4 mmol) of 2b were treated with 9.88 g (29.2 mmol) of dimethoxytrityl chloride reacted and worked up as in 3a. Reinigung durch SC (Kieselgel feinst, Eluens Dichlormethan/Isopropanol = 30 : 1) ergab 7,43 g (56,6%) Reinprodukt 3b. Purification by CC (silica gel, very fine eluent dichloromethane / isopropanol = 30: 1) gave 7.43 g (56.6%) of pure product 3b.

¹H-NMR (CD₃CN, 250 MHz): δ = 9,36 (s br, 1H, NH), 8,50 (d, J = 8 Hz, 1H; 6-H), 7,95 (d, J = 8 Hz, 2H; Bz 2,6-H), 7,70-7,20 (m, 12H; DMTr, Bz 3,4,5-H), 7,13 (d, J = 8Hz, 1H; 5-H), 6,91 (m, 4H; DMTr), 5,84 (s, 1H; 1′-H), 4,42 (s br, 1H; 3′-OH), 4,20-3,10 (m, 13H; 2′-H, 3′-H, 4′-H, O-CH₂-CH₃, 5′-CH₂, [with 3,80 (s, 6H; DMTr OCH₃]), 1,22 (t, 3H; O-CH₂-CH₃). ¹H-NMR (CD₃CN, 250 MHz): δ = 9.36 (s br, 1H, NH), 8.50 (d, J = 8 Hz, 1H, 6-H), 7.95 (d, J = 8Hz, 2H; 2.6 Bz-H), 7.70 to 7.20 (m, 12H, DMTr, Bz 3,4,5-H), 7.13 (d, J = 8Hz, 1H; 5 -H), 6.91 (m, 4H, DMTr), 5.84 (s, 1H; 1'-H), 4.42 (s br, 1H; 3'-OH), 4.20 to 3, 10 (m, 13H, 2'-H, 3'-H, 4'-H, O-CH₂-CH₃, CH₂-5 ', [with 3.80 (s, 6H, DMTr OCH₃]), 1.22 (t, 3H; O-CH₂-CH₃).

¹³C-NMR (CD₃CN, 62,5 MHz) δ = 168,05 (s, Ar-NH-C = O), 163,64 (s, DMTr, C-OCH₃), 155,49 (s, 2-C), 145,81 (d, 6-C), 145,32/136,81 (arom., DMTr), 136,43/134,30/133,73 (arom.-C, C-Benzoyl), 130,98/130,81/129,50/129,06/128,92/128,88/127,93 (arom.-C), 114,06 (arom., DMTr), 96,92 (d, 5-C), 90,06 (d, 1′-C), 87,50 (s, C-(Ph)3), 83,49 (d, 4′-C), 82,74 (d, 2′-C), 68,66 (d, 3′-C), 67,00 (t, O-CH₂-CH₃), 62,01 (t, 5′-CH₂), 55,78 (q, DMTr OCH₃), 15,45 (q, O-CH₂-CH₃). ¹³C NMR (CD₃CN, 62.5 MHz) δ = 168.05 (s, Ar-NH-C = O), 163.64 (s, DMTr, C-OCH₃), 155.49 (s, 2-C ), 145.81 (d, 6-C), 145.32 / 136.81 (arom., DMTr), 136.43 / 134.30 / 133.73 (arom.-C, C-benzoyl), 130 98 / 130.81 / 129.50 / 129.06 / 128.92 / 128.88 / 127.93 (arom.-C), 114.06 (arom., DMTr), 96.92 (d, 5 -C), 90.06 (d, 1'-C), 87.50 (s, C- (Ph) 3), 83.49 (d, 4'-C), 82.74 (d, 2 ' -C), 68.66 (d, C-3 '), 67.00 (t, O-CH₂-CH₃), 62.01 (t, 5'-CH₂), 55.78 (q, DMTr OCH₃) , 15,45 (q, O-CH₂-CH₃).

5′-O-Dimethoxytrityl-2′-O-methyl-N⁶-(phenoxyacetyl)-adenosin 9a 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-N⁶- (phenoxyacetyl) -adenosine 9a

50 g (0,187 mol) Adenosin wurden 20 Stunden bei 80°C am Hochvakuum getrocknet und hierauf in 700 ml wasserfreiem Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst. 50 g (0.187 mol) of adenosine were dried for 20 hours at 80 ° C under high vacuum and thereafter dissolved in 700 ml of anhydrous dimethylformamide under heating. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und mit 5,34 g (0,224 mol) gewaschenem Natriumhydrid versetzt und 45 Minuten bei 0°C gerührt. The solution was cooled to 0 ° C and treated with 5.34 g (0.224 mol) washed sodium hydride and stirred at 0 ° C for 45 minutes. Dann wurden portionsweise über einen Zeitraum von 4 Stunden und unter Erwärmung auf Raumtemperatur insgesamt 42,2 g (0,3 mol) Methyljodid (20%ig in Dimethylformamid) zugetropft. Then added portionwise over a period of 4 hours while warming to room temperature and 42.2 g (0.3 mol) methyl iodide (20% in dimethylformamide) were added dropwise. Die Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt und zu dem Zeitpunkt abgebrochen, als der Anteil an dimethyliertem Produkt im Reaktionsgemisch stark anstieg. The reaction was monitored by TLC and stopped at the time when the proportion of dimethylated product in the reaction mixture rose sharply. Bei der Aufarbeitung wurde nicht gelöstes Natriumjodid abgetrennt und das Reaktionsgemisch am Hochvakuum eingedampft. In the work up dissolved sodium iodide was not separated and the reaction mixture evaporated in a high vacuum. Der Rückstand wurde mittels Flashchromatographie gereinigt (Substanz/Kieselgel = 1/10, Eluens: Gradient von 5-20% Methanol in Chloroform). The residue was purified by flash chromatography (substance / = 1.10 silica gel, eluent: gradient of 5-20% methanol in chloroform). Die erhaltenen 42 g Rohprodukt (Gemisch der 2′- und 3′-O-Methyl Isomeren, mit Natriumjodid verunreinigt; DC: Chloroform/Ethanol = 3/1, R f = 0,3 für beide Isomere) wurden mehrmals mit einem Gemisch aus Benzol und Pyridin abgeschleppt und in 500 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. The obtained 42 g of crude product (mixture of 2'- and 3'-O-methyl isomers, contaminated with sodium iodide; TLC: chloroform / ethanol = 3/1, R f = 0.3 for both isomers) were several times with a mixture benzene and pyridine towed and dissolved in 500 ml of anhydrous pyridine. Anschließend wurden bei Raumtemperatur 64,8 g (0,597 mol) Trimethylchlorsilan zugetropft und nach weiteren 2 Stunden wurden 51,2 g (0,179 mol) Phenoxyessigsäureanhydrid zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Then, at room temperature, 64.8 g (0.597 mol) of trimethylchlorosilane were added dropwise and after a further 2 hours, 51.2 g (0.179 mol) Phenoxyessigsäureanhydrid added and stirred overnight at room temperature. Die Reaktionslösung wurde auf 1 Liter Wasser gegossen mit 400 ml Methanol verdünnt, sodaß eine klare Lösung erhalten wurde. The reaction solution was poured into 1 liter of water diluted with 400 ml of methanol, so that a clear solution was obtained. Nach 40 Minuten wurde Natriumbicarbonat zugegeben noch weitere 10 Minuten gerührt und dann mehrmals mit Dichlormethan extrahiert. After 40 minutes, sodium bicarbonate was added, stirred for a further 10 minutes and then extracted several times with dichloromethane. Die gesammelten organischen Phasen wurden vereinigt, mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. The collected organic phases were combined, dried, filtered and evaporated with sodium sulphate. Das erhaltene Rohprodukt (45 g) mit 8a/11a = 4,6/l wurde dreimal mit Pyridin/Benzol abgeschleppt und in wasserfreiem Pyridin mit 53,2 g (0,157 mol) Dimethoxytritylchlorid versetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. The resulting crude product (45 g) with 8a / 11a = 4.6 / l was towed three times with pyridine / benzene and dissolved in anhydrous pyridine with 53.2 g (0.157 mol) of dimethoxytrityl chloride and stirred for 2 hours at room temperature. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und zwischen Dichlormethan und Natriumhydrogencarbonatlösung verteilt. The reaction mixture was concentrated and partitioned between dichloromethane and sodium bicarbonate solution. Die wäßrige Phase wurde mehrmals mit Dichlormethan extrahiert. The aqueous phase was extracted several times with dichloromethane. Die gesammelten organischen Phasen wurden mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. The collected organic phases were dried, filtered and evaporated with sodium sulphate. Die so erhaltenen 112 g Rohprodukt wurden mittels Flashchromatographie (1200 g Kieselgel, Eluens: Dichlormethan dann Dichlormethan/Aceton = 8/1) gereinigt. The thus obtained 112 g of crude product was purified by flash chromatography (1200 g silica gel, eluent: then dichloromethane / acetone = 8/1 dichloromethane). Es wurden 32,8 g 9a (24,5% bezogen auf Adenosin) und 3,3 g 12a als farblose Festkörper erhalten. It 9a were 32.8 g (24.5% relative to adenosine) and obtain 3.3 g of 12a as a colorless solid. DC: Dichlormethan/Aceton = 3,5/1,5 9a: R f = 0,52, 12a: R f = 0,48. TLC: dichloromethane / acetone = 3.5 / 1.5 9: R f = 0,52, 12a: R f = 0.48.

¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ = 9,5 (s br, 1H; NH), 8,72 (s, 1H; 2-H), 8,28 (s, 1H; 8-H), 7,5-6,7 (m, 18H; DMTr, PhOAc), 6,2 (d, J = 3 Hz, 1H; 1′-H), 4,87 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,65-4,4 (m, 2H; 2′-H, 3′-H), 4,25 (m, 1H; 4′-H), 3,77 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,56 (s, 3H; 2′-OCH₃), 3,52 (m, 2H; 5′-H), 2,82 (s, 1H; 3′-OH). ¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ = 9.5 (s br, 1H, NH), 8.72 (s, 1H; 2-H), 8.28 (s, 1H; 8-H), 7.5 to 6.7 (m, 18H, DMTr, PhOAc), 6.2 (d, J = 3 Hz, 1H; 1'-H), 4.87 (s, 2H; CH₂ PhOAc), 4, 65 to 4.4 (m, 2H, 2'-H, 3'-H), 4.25 (m, 1H; 4'-H), 3.77 (s, 6H, DMTr OCH₃), 3.56 (s, 3H, 2'-OCH₃), 3.52 (m, 2H; 5'-H), 2.82 (s, 1H, 3'-OH).

¹³C-NMR (CDCl₃, 22,5 MHz): δ = 167,03 (s, C=O), 158,09 (s, arom., C-OCH₃), 156,9 (s, arom., CO-CH₂), 151,9 (d, 2-C), 150,89 (s, 6-C), 148,02 (s, 4-C), 144,17 (arom., DMTr), 141,95 (d, 8-C), 135,24 (arom., DMTr), 129,6 (d, arom., PhOAc), 129,22/128,68/127,70/127,38/126,46 (arom., DMTr), 122,45 (s, 5-C), 121,63/114,48 (2d, arom., PhOAc), 112,75 (arom., DMTr), 86,41 (d, 1′-C), 86,15 (s, C-(Ph)3), 83,75 (d, 4′-C), 82,68 (d, 2′-C), 69,35 (d, 3′-C), 68,0 (t, Ph-O-CH₂), 62,69 (t, 5′-CH₂), 58,24 (q, OCH₃), 54,67 (q, DMTr OCH₃). C-NMR (CDCl₃, 22.5 MHz): δ = 167.03 (s, C = O), 158.09 (. S, arom, C-OCH₃), 156.9 (s, arom, CO. CH₂), 151.9 (d, 2-C), 150.89 (s, C-6), 148.02 (s, C-4), 144.17 (arom., DMTr), 141.95 ( d, 8-C), 135.24 (arom., DMTr), 129.6 (d, arom., PhOAc), 129.22 / 128.68 / 127.70 / 127.38 / 126.46 (arom ., DMTr), 122.45 (s, C-5), 121.63 / 114.48 (2d, arom., PhOAc), 112.75 (arom., DMTr), 86.41 (d, 1 ' -C), 86.15 (s, C- (Ph) 3), 83.75 (d, 4'-C), 82.68 (d, 2'-C), 69.35 (d, 3 ' C), 68.0 (t, Ph-O-CH₂), 62.69 (t, 5'-CH₂), 58.24 (q, OCH₃), 54.67 (q, DMTr OCH₃).

5′-O-Dimethoxytrityl-3′-O-methyl-N⁶-(phenoxyacetyl)ade nosin 12a 5'-O-dimethoxytrityl-3'-O-methyl-N⁶- (phenoxyacetyl) ade Nosin 12a

¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 9,43 (s br, 1H; NH), 8,73 (s, 1H; 2-H), 8,22 (s, 1H; 8-H), 7,46-6,99 (m, 14H; DMTr, PhOAc), 6,81 (d, J = 9,7 Hz, 4H; DMTr), 6,04 (d, J = 6,5 Hz, 1H; 1′-H), 5,01-4,8 (m, 1H; 2′-H), 4,89 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,4-4,27 (m, 1H; 4′-H*), 4,18-4,06 (m, 1H; 3′-H*), 3,79 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,57-3,26 (m, 2H; 5′-CH₂), 3,5 (s, 3H; 3′-OCH₃). ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 9.43 (s br, 1H, NH), 8.73 (s, 1H; 2-H), 8.22 (s, 1H; 8-H), 7.46 to 6.99 (m, 14H, DMTr, PhOAc), 6.81 (d, J = 9.7 Hz, 4H, DMTr), 6.04 (d, J = 6.5 Hz, 1H; 1'-H), 5.01 to 4.8 (m, 1H; 2'-H), 4.89 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4.4 to 4.27 (m, 1H, 4 ' -H *), 4.18 to 4.06 (m, 1H; 3'-H *), 3.79 (s, 6H, DMTr OCH₃), 3.57 to 3.26 (m, 2H, 5 ' -CH₂), 3.5 (s, 3H, 3'-OCH₃).

¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 166,74 (s, Ar-NH-C=O), 158,47 (s, arom., C-OCH₃), 156,98 (s, arom., CO-CH₂), 152,29 (d, 2-C), 151,40 (s, 6-C), 148,25 (s, 4-C), 144,34 (arom., DMTr), 142,11 (d, 8-C), 135,43 (arom., DMTr), 129,87 (d, arom., PhOAc), 129,67/127,94/127,78/126,84 (4d, DMTr), 122,85 (s, 5-C), 122,21/114,83 (d, arom., PhOAc), 113,09 (d, arom., DMTr), 89,27 (d, 1′-C), 86,52 (s, C-(Ph)3), 81,89 (d, 4′-C), 79,97 (d, 3′-C), 73,59 (d, 2′-C), 68,06 (t, Ph-O-CH₂), 63,12 (t, 5′-CH₂), 58,13 (q, OCH₃), 55,09 (q, DMTr OCH₃). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 166.74 (s, Ar-NH-C = O), 158.47 (. S, arom, C-OCH₃), 156.98 (s, arom. CO-CH₂), 152.29 (d, 2-C), 151.40 (s, C-6), 148.25 (s, C-4), 144.34 (arom., DMTr), 142, 11 (d, 8-C), 135.43 (arom., DMTr), 129.87 (d, arom., PhOAc), 129.67 / 127.94 / 127.78 / 126.84 (4d, DMTr ), 122.85 (s, 5-C), 122.21 / 114.83 (d, arom., PhOAc), 113.09 (d arom., DMTr), 89.27 (d, 1 ' C), 86.52 (s, C- (Ph) 3), 81.89 (d, 4'-C), 79.97 (d, C-3 '), 73.59 (d, 2'- C), 68.06 (t, Ph-O-CH₂), 63.12 (t, 5'-CH₂), 58.13 (q, OCH₃), 55.09 (q, DMTr OCH₃).

2′-O-Methyl-N⁶-(phenoxyacetyl)adenosin 8a: Das aus analogem Ansatz erhaltene Produktgemisch 8a/11a wurde mittels Flashchromatographie (400 g Kieselgel, Eluens: Dichlormethan/Aceton = 4/1) gereinigt. 2'-O-methyl-N⁶- (phenoxyacetyl) adenosine 8a: The resulting product mixture from analog approach 8a / 11a was purified by flash chromatography chromatography (400 g silica gel, eluent dichloromethane / acetone = 4/1). Nach einmaliger Chromatographie wurden 5,5 g (7,05%) 8a, mit den unten angegebenen analytischen NMR-Daten, und 14,1 g (18,1%) 8a/11a erhalten. After a single chromatography, 5.5 g (7.05%) 8a, obtained with the below analytical NMR data, and 14.1 g (18.1%) 8a / 11a. DC: Dichlormethan/Methanol = 4,5/0,5. TLC: dichloromethane / methanol = 4.5 / 0.5. 8a: R f = 0,50; 8a: R f = 0.50; 11a: R f = 0,48. 11a: R f = 0.48.

¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ = 9,70 (s br, 1H; NH), 8,7 (s, 1H; 2-H), 8,1 (s, 1H; 8-H), 7,4-6,8 (m, 5H; PhOAc arom.), 5,95 (d, J = 6 Hz, 1H; 1′-H), 5,7 (s br, 1H; 5′-OH), 4,88 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,7-4,5 (m, 2H; 2′-H, 3′-H), 4,3 (s, 1H; 4′-H), 4,05-3,6 (m, 2H; 5′-CH₂), 3,45 (s, 3H; 2′-OCH₃), 3,12 (s, 1H; 3′-OH). ¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ = 9.70 (s br, 1H, NH), 8.7 (s, 1H; 2-H), 8.1 (s, 1H; 8-H), 7.4-6.8 (m, 5H; PhOAc arom.), 5.95 (d, J = 6 Hz, 1H; 1'-H), 5.7 (s br, 1H; 5'-OH) , 4.88 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4.7 to 4.5 (m, 2H, 2'-H, 3'-H), 4.3 (s, 1H; 4'-H), 4.05 to 3.6 (m, 2H; 5'-CH₂), 3.45 (s, 3H, 2'-OCH₃), 3.12 (s, 1H, 3'-OH).

¹³C-NMR (CDCl₃, 22,5 MHz): δ = 167,5 (s, Ar-NH-C=O), 157,01 (s, arom., CO-CH₂), 151,6 (d, 2-C), 150,41 (s, 6-C), 148,67 (s, 4-C), 143,41 (d, 8-C), 129,38 (d, arom.), 123,26 (s, 5-C), 121,85/114,73 (d, arom.), 88,53 (d, 1′-C), 87,40 (d, 4′-C), 82,8 (d, 2′-C), 69,73 (d, 3′-C), 68,21 (t, Ph-O-CH₂), 62,3 (t, 5′-CH₂), 58,3 (q, 2′-OCH₃). ¹³C-NMR (CDCl₃, 22.5 MHz): δ = 167.5 (s, Ar-NH-C = O), 157.01 (s. Arom, CO-CH₂), 151.6 (d, 2 -C), 150.41 (s, C-6), 148.67 (s, C-4), 143.41 (d, C-8), 129.38 (d, arom.), 123.26 (s, 5-C), 121.85 / 114.73 (d, arom.), 88.53 (d, 1'-C), 87.40 (d, 4'-C), 82.8 ( d, 2'-C), 69.73 (d, C-3 '), 68.21 (t, Ph-O-CH₂), 62.3 (t, 5'-CH₂), 58.3 (q , 2'-OCH₃).

3′-O-Methyl-N⁶-(phenoxyacetyl)adenosin 11a wurde als Reinprodukt durch Detritylierung von 12a erhalten: 1 g (1,39 mmol) 12a wurden in 20 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und auf -5°C abgekühlt. 3'-O-methyl-N⁶- (phenoxyacetyl) adenosine 11a was obtained as pure product by detritylation of 12a: 1 g (1.39 mmol) 12a were solved in 20 ml of anhydrous dichloromethane and cooled to -5 ° C. Die Lösung wurde mit 0,5 ml einer 10%igen etherischen Salzsäurelösung versetzt. The solution was treated with 0.5 ml of 10% ethereal hydrochloric acid solution. Das Reaktionsgemisch färbte sich sofort rot und ein Niederschlag fiel aus. The reaction mixture immediately turned red and a precipitate formed. Nach einer Minute wurde die Reaktionslösung mit wäßriger Natriumbicarbonatlösung verdünnt und mit Dichlormethan extrahiert. After one minute, the reaction solution was diluted with aqueous sodium bicarbonate solution and extracted with dichloromethane. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. The combined organic phases were dried, filtered and evaporated with sodium sulphate. Der Rückstand wurde mittels Flashchromatographie (12 g Kieselgel, Eluens: Dichlormethan/Aceton = 3,5/1) gereinigt. The residue was purified by flash chromatography (12 g silica gel, eluent: dichloromethane / acetone = 3.5 / 1). Es wurden 530 mg (92%) 11a erhalten. There were 530 mg (92%) of 11a obtained. DC: Dichlormethan/Methanol = 9/1; TLC: dichloromethane / methanol = 9/1; R f = 0,48, weißer Schaum. R f = 0.48, white foam.

¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 9,58 (s br, 1H; NH), 8,72 (s, 1H; 2-H), 8,08 (s, 1H; 8-H), 7,42-7,26 (m, 2H; PhOAc arom.), 7,13-7,0 (m, 3H; PhOAc arom.), 5,82 (d, J = 7,7 Hz, 1H; 1′-H), 5,02 (dd, J₁ = 5,5, J₂ = 7,7, 1H; 2′-H), 4,88 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,36* (s, 1H; 4′-H), 4,1* (d, J = 5,5 Hz, 1H; 3′-H), 4,02/3,74 (2d, J = 12,8 Hz, 2H; 5′-CH₂), 3,54 (s, 3H; 3′-OCH₃). ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 9.58 (s br, 1H, NH), 8.72 (s, 1H; 2-H), 8.08 (s, 1H; 8-H), 7.42 to 7.26 (m, 2H; PhOAc arom.), 7.13 to 7.0 (m, 3H;. PhOAc arom), 5.82 (d, J = 7.7 Hz, 1H; 1 '-H), 5.02 (dd, J₁ = 5.5, J₂ = 7.7, 1H; 2'-H), 4.88 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4.36 * (s, 1H; 4'-H), 4.1 * (d, J = 5.5 Hz, 1H; 3'-H), 4.02 / 3.74 (2d, J = 12.8 Hz, 2H; 5 '-CH₂), 3.54 (s, 3H, 3'-OCH₃).

¹³C-NMR (CDCl₃, 22,5 MHz): δ = 167,0 (s, Ar-NH-C=O), 156,95 (s, arom., CO-CH₂), 151,79 (d, 2-C), 150,38 (s, 6-C), 148,77 (s, 4-C), 143,5 (d, 8-C), 129,71 (d, arom.), 123,59 (s, 5-C), 122,28/ 114,82 (d, arom.), 91,8 (d, 1′-C), 84,57 (d, 4′-C), 80,79 (d, 3′-C), 73,52 (d, 2′-C), 68,06 (t, Ph-O-CH₂), 63,34 (t, 5′-CH₂), 58,0 (q, 3′-OCH₃). C-NMR (CDCl₃, 22.5 MHz): δ = 167.0 (s, Ar-NH-C = O), 156.95 (. S arom, CO CH₂), 151.79 (d, 2 -C), 150.38 (s, C-6), 148.77 (s, C-4), 143.5 (d, C-8), 129.71 (d, arom.), 123.59 (s, 5-C), 122.28 / 114.82 (d, arom.), 91.8 (d, 1'-C), 84.57 (d, 4'-C), 80.79 ( d, 3'-C), 73.52 (d, 2'-C), 68.06 (t, Ph-O-CH₂), 63.34 (t, 5'-CH₂), 58.0 (q , 3'-OCH₃).

5′-O-Dimethoxytrithyl-2′-O-ethyl-N⁶-(phenoxyacetyl)ad enosin 9b 5'-O-Dimethoxytrithyl-2'-O-ethyl-N⁶- (phenoxyacetyl) ad enosin 9b

50 g (0,187 mol) Adenosin wurden wie für 9a beschrieben gelöst, abgekühlt und mit 8,98 g (0,225 mol) Natriumhydridsuspension (60% in Paraffin, gewaschen mit wasserfreiem n-Hexan) versetzt. 50 g (0.187 mol) adenosine were dissolved as described for 9a, cooled and mixed with 8.98 g (0.225 mol) of sodium hydride (60% in paraffin, washed with anhydrous n-hexane) was added. 34,8 g (0,225 mol) Ethyljodid in 40 ml wasserfreiem DMF wurden portionsweise zugegeben. 34.8 g (0.225 mol) of anhydrous ethyl iodide in 40 ml of DMF was added in portions. Nach 2 h Rühren bei 0°C wurden 46,5 g (0,300 mol) Ethyljodid in 50 ml wasserfreiem DMF zugegeben und weitere 2 h bei 0°C gerührt. After 2 h stirring at 0 ° C 46.5 g (0.300 mol) of ethyl iodide were added in 50 ml of anhydrous DMF and stirred for a further 2 h at 0 ° C. Die Aufarbeitung erfolgte in Analogie zu 8a und ergab 30,0 g farblosen Schaum. The workup was carried out analogously to 8a and gave 30.0 g of a colorless foam. Dieser wurde wie für 9a beschrieben mit 44,1 g (0,406 mol) Trimethylchlorsilan und 58,4 g (0,203 mol) Phenoxyessigsäureanhydrid umgesetzt und aufgearbeitet. This was prepared as described for 9a with 44.1 g (0.406 mol) of trimethylchlorosilane and 58.4 g (0.203 mol) Phenoxyessigsäureanhydrid reacted and worked up. SC-Reinigung (Kieselgel feinst, Eluens Dichlormethan/THF = 1/1) ergab 19,7 g (25%) Rohprodukt 8b/11b (Verhältnis 14 : 1) als farblosen Schaum. SC-cleaning (finely silica gel, eluent dichloromethane / THF = 1/1) gave 19.7 g (25%) of crude product 8b / 11b (ratio 14: 1) as a colorless foam. 19,6 g des Rohproduktes wurden getrocknet, danach in 100 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und mit 23,2 g (0,069 mol) Dimethoxytritylchlorid versetzt. 19.6 g of the crude product were dried, then dissolved in 100 ml of anhydrous pyridine and treated with 23.2 g (0.069 mol) of dimethoxytrityl chloride. Die Umsetzung erfolgte analog zu 8a/11a. The reaction took place as 8a / 11a. SC-Reinigung (Kieselgel feinst, Eluens Dichlormethan/THF = 12/1 bis 6/1) ergab 4,8 g 9b (3,5% Th. ausgehend von Adenosin) als farblosen Schaum. SC-cleaning (finely silica gel, eluent dichloromethane / THF = 01/12 to 01/06) gave 4.8 g of 9b (3.5% Th., Starting from adenosine) as a colorless foam.

¹H-NMR (CD₃CN, 250 MHz): d = 9,5 (s, 1H; NH), 8,58 (s, 1H; 2-H), 8,30 (s, 1H; 8-H), 7,5-6,7 (m, 18H; DMTr, PhOAc), 6,15 (d, J = 3 Hz, 1H; 1′-H), 4,99 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,64-4,44 (m, 2H; 2′-H, 3′-H), 4,11 (m, 1H; 4′-H), 3,76 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,7-3,3 (m, 5H; O-CH₂-CH₃, 5′-CH₂, 3′-OH), 1,15 (t, 3H; O-CH₂-CH₃). ¹H-NMR (CD₃CN, 250 MHz): d = 9.5 (s, 1H; NH), 8.58 (s, 1H; 2-H), 8.30 (s, 1H; 8-H), 7 , 5 to 6.7 (m, 18H, DMTr, PhOAc), 6.15 (d, J = 3 Hz, 1H; 1'-H), 4.99 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4.64 -4.44 (m, 2H, 2'-H, 3'-H), 4.11 (m, 1H; 4'-H), 3.76 (s, 6H, DMTr OCH₃), 3,7- 3.3 (m, 5H, O-CH₂-CH₃, CH₂-5 ', 3'-OH), 1.15 (t, 3H; O-CH₂-CH₃).

¹³C-NMR (CD₃CN, 62,5 MHz): δ = 168,17 (s, Ar-NH-C=O), 159,52 (s, arom., C-OCH₃), 158,54 (s, arom., C-OCH₂), 152,76 (d, 2-C), 152,28 (s, 6-C), 149,51 (s, 4-C), 145,86 (arom.; DMTr), 143,49 (d, 8-C), 136,67 (arom., DMTr), 130,90 (d, arom. PhOAc), 130,86/130,54/128,86/128,68/127,71 (arom., DMTr), 123,86 (s, 5-C), 122,56/115,56 (d, arom., PhOAc), 113,88 (arom.; DMTr), 87,99 (d, 1′-C), 87,02 (s, C-(Ph)3), 84,81 (d, 4′-C), 81,76 (d, 2′-C), 70,47 (d, 3′-C), 68,92 (t, Ph-O-CH₂), 67,20 (t, O-CH₂-CH₃), 64,03 (t, 5′-CH₂), 55,76 (q, DMTr OCH₃), 15,38 (q, O-CH₂-CH₃). ¹³C NMR (CD₃CN, 62.5 MHz): δ = 168.17 (s, Ar-NH-C = O), 159.52 (arom s, C-OCH₃.), 158.54 (s, arom ., C-OCH₂), 152.76 (d, 2-C), 152.28 (s, C-6), 149.51 (s, C-4), 145.86 (arom .; DMTr), 143.49 (d, 8-C), 136.67 (arom., DMTr), 130.90 (d, arom. PhOAc), 130.86 / 130.54 / 128.86 / 128.68 / 127, 71 (arom., DMTr), 123.86 (s, 5-C), 122.56 / 115.56 (d, arom., PhOAc), 113.88 (arom .; DMTr), 87.99 (d , 1'-C), 87.02 (s, C- (Ph) 3), 84.81 (d, 4'-C), 81.76 (d, 2'-C), 70.47 (d , 3'-C), 68.92 (t, Ph-O-CH₂), 67.20 (t, O-CH₂-CH₃), 64.03 (t, 5'-CH₂), 55.76 (q , DMTr OCH₃), 15.38 (q, O-CH₂-CH₃).
2′-O-Ethyl-(phenoxyacetyl)adenosin (8b): NMR-Daten aus 8b/11b-Gemisch (14 : 1) erhalten. Obtained 2'-O-ethyl (phenoxyacetyl) adenosine (8b): NMR data from 8b / 11b mixture (1 14).
¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ=9,93 (s br, 1H; NH), 8,96 (s, 1H; 2-H), 8,36 (s, 1H; 8-H), 7,6-6,9 (m, 5H; PhOAc arom.), 6,10 (d, J=6 Hz, 1H; 1′-H), 5,8-5,6 (m, 1H; 5′-OH), 4,92-4,55 (m, 4H; PhOAc CH₂, 2′-H, 3′-H), 4,40 (s, 1H; 4′-H), 4,05-3,41 (m, 5H; 5′-CH₂, O-CH₂-CH₃, 3′-OH), 1,09 (t, 3H; O-CH₂-CH₃). ¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ = 9.93 (s br, 1H, NH), 8.96 (s, 1H; 2-H), 8.36 (s, 1H; 8-H), 7.6 to 6.9 (m, 5H; PhOAc arom.), 6.10 (d, J = 6 Hz, 1H; 1'-H), 5.8 to 5.6 (m, 1H, 5 ' -OH), 4.92 to 4.55 (m, 4H, CH₂ PhOAc, 2'-H, 3'-H), 4.40 (s, 1H; 4'-H), 4.05 to 3, 41 (m, 5H, 5'-CH₂, O-CH₂-CH₃, 3'-OH), 1.09 (t, 3H; O-CH₂-CH₃). - charakteristische Lage von 11b im Gemisch: d=5,9 (d, J=6 Hz, 1′-H). - Typical location in a mixture of 11b: d = 5.9 (d, J = 6 Hz, 1'-H).
¹³C-NMR (CDCl₃, 22,5 MHz): δ 167,50 (s, Ar-NH-C=O), 157,05 (s, arom., CO-CH₂), 151,67 (d, 2-C), 150,45 (s, 6-C), 148,73 (s, 4-C), 143,40 (d, 8-C), 129,42 (d, arom.), 123,35 (s, 5-C), 121,91/ 114,73 (d, arom.), 88,60 d, 1′-C), 87,44 (d, 4′-C), 82,81 (d, 2′-C), 69,75 (d, 3′-C), 68, 31 (t, Ph-O-CH₂), 67,60 (t, O-CH₂-CH₃); ¹³C-NMR (CDCl₃, 22.5 MHz): δ 167.50 (s, Ar-NH-C = O), 157.05 (s, arom, CO-CH₂.), 151.67 (d, 2- C), 150.45 (s, C-6), 148.73 (s, C-4), 143.40 (d, C-8), 129.42 (d, arom.), 123.35 ( s, 5-C), 121.91 / 114.73 (d, arom.) 88.60 d, 1'-C), 87.44 (d, 4'-C), 82.81 (d, 2'-C), 69.75 (d, C-3 '), 68, 31 (t, Ph-O-CH₂), 67.60 (t, O-CH₂-CH₃); 63,01 (t, 5′-CH₂), 15,45 (q, O-CH₂-CH₃). 63.01 (t, 5'-CH₂), 15.45 (q, O-CH₂-CH₃).

2′-O-Methyl-O⁶-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]guanosin 14a 2'-O-methyl-O⁶- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] guanosine 14a

8,1 g (18,7 mmol) 13 (2) wurden mehrmals mit Dimethylformamid/Benzol abgeschleppt, in 130 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst und bei -60°C mit 0,72 g (30 mmol) gewaschenem Natriumhydrid versetzt und 45 Minuten bei -50°C gerührt. 8.1 g (18.7 mmol) 13 (2) were repeatedly towed with dimethylformamide / benzene, dissolved in 130 ml of anhydrous dimethylformamide, and at -60 ° C with 0.72 g (30 mmol) washed sodium hydride and 45 minutes at -50 ° C stirred. Hierauf wurden innerhalb von 5 Stunden 21,3 g (0,15 mol) Methyljodid zugetropft und das Reaktionsgemisch auf -15°C erwärmt. Thereto were within 5 hours 21.3 g (0.15 mol) of methyl iodide are added dropwise and the reaction was warmed to -15 ° C. Die Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt. The reaction was followed by thin layer chromatography. Zur Aufarbeitung wurde die Lösung mit Ammoniumchlorid versetzt und bis zur Trockene eingedampft. For workup, the solution was treated with ammonium chloride and evaporated to dryness. Der ölige Rückstand wurde mittels Flashchromatographie (220 g Kieselgel, Eluens: Chloroform/Methanol=80/1) gereinigt. The oily residue was purified by flash chromatography (220 g silica gel, eluent: chloroform / methanol = 80/1) purified. Es wurden 4,0 g (48%) Isomerengemisch 14a/19a=86/14 erhalten. There was added 4.0 g (48%) isomer mixture obtained 14a / 19a = 86/14. Durch dreimalige Umkristallisation aus Benzol/ Chloroform konnten 1,8 g (22%) 14a (<1% 19a) mit den unten angegebenen analytischen Daten erhalten werden. Three times by recrystallization from benzene / chloroform were 1.8 g (22%) 14a (<1% 19 a) can be obtained with the analytical data shown below. Die Mutterlaugen wurden eingedampft und der Rückstand, 2,2 g (26,5% 19a) säulenchromatographisch (250 g Kieselgel, Eluens: Dichlormethan/Isopropanol= 30/1) gereinigt, wobei 1,7 g (20,4%) weiße Kristalle 14a/19a=82/18 erhalten wurden. The mother liquors were evaporated and the residue, 2.2 g (26.5% 19a) by column chromatography (250 g silica gel, eluant: dichloromethane / isopropanol = 30/1) to give 1.7 g (20.4%) of white crystals 14a / 19a = 82/18 were obtained. DC: Dichlormethan/Isopropanol=5/1, R f =0,57 (14a), R f =0,61 (19a). TLC: dichloromethane / isopropanol = 5/1, R f = 0.57 (14a), R f = 0.61 (19a).
14a: farblose Kristalle, Fp.: 109-111°C. 14a: colorless crystals, mp .: 109-111 ° C.
¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ=8,17 (d, J=9 Hz, 2H; NPE), 7,65 (s, 1H; 8-H), 7,48 (d, J=9 Hz, 2H; NPE), 6,68 (d, J=12 Hz, 1H; 5′-OH), 5,75 (d, J=8 Hz, 1H; 1′-H), 4,98 (s br, 2H; NH₂,), 4,73 (t, J=7,3 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4,65 (dd, J₁=8 Hz, J₂=4,6 Hz, 1H, 2′-H), 4,55 (d, J=4,6 Hz, 1H; 3′-H), 4,32 (s, 1H; 4′-H), 3,95/3,74 (AB, J AB =13,3 Hz, J BX =12 Hz, 2H; 5′-CH₂), 3,35 (s, 3H; 2′-OCH₃), 3,28 (t, J=7,3 Hz, 2H; NPE CH₂-Ph), 2,87 (s, 1H; 3′-OH). ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 8.17 (d, J = 9 Hz, 2H; NPE), 7.65 (s, 1H; 8-H), 7.48 (d, J = 9 Hz, 2H; NPE), 6.68 (d, J = 12 Hz, 1H; 5'-OH), 5.75 (d, J = 8 Hz, 1H; 1'-H), 4.98 (s br, 2H, NH₂,), 4.73 (t, J = 7.3 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4.65 (dd, J₁ = 8Hz, J₂ = 4.6 Hz, 1H, 2 '-H), 4.55 (d, J = 4.6 Hz, 1H; 3'-H), 4.32 (s, 1H; 4'-H), 3.95 / 3.74 (AB, J AB = 13.3 Hz, J BX = 12 Hz, 2H; 5'-CH₂), 3.35 (s, 3H, 2'-OCH₃), 3.28 (t, J = 7.3 Hz, 2H ; NPE CH₂-Ph), 2.87 (s, 1H, 3'-OH).
¹³C-NMR (CDCl₃, 22,5 MHz): δ=159,1 (s, 6-C), 157,07* (s, 2-C), 150,96* (s, CH₂-C(Ph)), 145,24* (s, 4-C), 143,93* (s, O2N-C(Ph)), 138,02 (d, 8-C), 128,69/122,25 (d, arom., NPE), 115,55 (s, 5-C), 88,42 (d, 1′-C), 87,1 (d, 4′-C), 82,11 (d, 2′-C), 70,36 (d, 3′-C), 66,29 (t, O-CH₂ NPE), 63,0 (t, 5′-CH₂), 58,54 (q, 2′-OCH₃), 35,54 (t, CH₂-Ph NPE). ¹³C-NMR (CDCl₃, 22.5 MHz): δ = 159.1 (s, C-6), 157.07 * (s, 2-C), 150.96 * (s, CH₂-C (Ph) ), 145.24 * (s, 4-C), 143.93 * (s, O2N-C (Ph)), 138.02 (d, C-8), 128.69 / 122.25 (d, arom., NPE), 115.55 (s, 5-C), 88.42 (d, 1'-C), 87.1 (d, 4'-C), 82.11 (d, 2 ' C), 70.36 (d, C-3 '), 66.29 (t, O-CH₂ NPE), 63.0 (t, 5'-CH₂), 58.54 (q, 2'-OCH₃) , 35,54 (t, CH₂-Ph NPE).

2′-O-Ethyl-O⁶-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]guanosin 14b 2'-O-ethyl-O⁶- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] guanosine 14b

3,15 g (7,29 mmol) 13 wurden wie für 14a beschrieben getrocknet in 30 ml DMF gelöst, auf -60°C abgekühlt und mit 0,263 g (6,6 mmol) 60% Natriumhydridsuspension (gewaschen mit wasserfreiem n-Hexan) versetzt und bei -15°C 1 h gerührt. 3.15 g (7.29 mmol) 13 were prepared as described for 14a in 30 ml of dried DMF, cooled to -60 ° C and treated with 0.263 g (6.6 mmol) of 60% sodium hydride (washed with anhydrous n-hexane) and stirred at -15 ° C for 1 h. Dann wurden 4,31 g (29,2 mmol) Ethyljodid, nach 60 min 2,15 g (14,6 mmol) und nach weiteren 60 min noch einmal 2,15 g (14,6 mmol) Ethyljodid zugegeben und die Temperatur in dieser Zeit langsam auf 0°C angehoben. Then, 4.31 g (29.2 mmol) of ethyl iodide after 60 min 2.15 g (14.6 mmol) and after a further 60 minutes again 2.15 g (14.6 mmol) of ethyl iodide are added and the temperature in this time slowly raised to 0 ° C. 3 h nach der letzten Zugabe wurde aufgearbeitet und mittels SC (Kieselgel feinst, Eluens: Dichlormethan/Isopropanol=16 : 1) gereinigt. 3 h after the last addition was worked up and purified by CC (silica gel finely, eluent: dichloromethane / isopropanol = 16: 1). Es wurden 0,440 g (13%) Reinprodukt 14b als farbloser Schaum erhalten. There were 0.440 g (13%) of pure product obtained 14b as a colorless foam.
¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ=8,17 (d, J=9,5 Hz, 2H; NPE), 7,65 (s, 1H; 8-H), 7,48 (d, J=9,5 Hz, 2H; NPE), 6,68 (d, J=12,5 Hz, 1H; 5′-OH), 5,75 (d, J=7,6 Hz, 1H; 1′-H), 4,98 (s, 2H; NH₂), 4,83-4,62 (m, 2H; NPE O-CH₂), 4,49 (d, J=4,5 Hz, 1H; 3′-H), 4,33 (s, 1H; 4′-H), 4,12-3,88 (m, 2H; 5′-CH₂), 3,85 (m, 2H; O-CH₂-CH₃), 3,28 (t, J=6,4 Hz, 2H; NPE CH₂-Ph), 2,85 (s, 1H; 3′-OH), 1,10 (t, J=6,4 Hz, O-CH₂-CH₃). ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 8.17 (d, J = 9.5 Hz, 2H; NPE), 7.65 (s, 1H; 8-H), 7.48 (d, J = 9.5 Hz, 2H; NPE), 6.68 (d, J = 12.5 Hz, 1H; 5'-OH), 5.75 (d, J = 7.6 Hz, 1H; 1'- H), 4.98 (s, 2H, NH₂), 4.83 to 4.62 (m, 2H; NPE O-CH₂), 4.49 (d, J = 4.5 Hz, 1H; 3'- H), 4.33 (s, 1H; 4'-H), 4.12 to 3.88 (m, 2H; 5'-CH₂), 3.85 (m, 2H, O-CH₂-CH₃), 3.28 (t, J = 6.4 Hz, 2H; NPE CH₂-Ph), 2.85 (s, 1H, 3'-OH), 1.10 (t, J = 6.4 Hz, O CH₂-CH₃).
¹³C-NMR (CDCl₃, 22,5 MHz): δ=159,1 (s, 6-C), 157,07 (s, 2-C), 150,96* (s, 4-C), 145,24* (s, CH₂-C(Ph)), 143,93 (s, O2N-C(Ph)), 138,02 (d, 8-C), 128,65/122,25 (d, arom. NPE), 115,55 (s, 5-C), 88, 42 (d, 1′-C), 87,1 (d, 4′-C), 82,11 (d, 2′-C), 70,36 (d, 3′-C), 66,29 (t, O-CH₂ NPE), 65,38 (t, O-CH₂-CH₃), 63,01 (t, 5′-CH₂), 35,54 (t, CH₂-Ph NPE), 15,04 (q, O-CH₂-CH₃). ¹³C-NMR (CDCl₃, 22.5 MHz): δ = 159.1 (s, C-6), 157.07 (s, 2-C), 150.96 * (s, 4-C), 145, 24 * (s, CH₂-C (Ph)), 143.93 (s, O2N-C (Ph)), 138.02 (d, C-8), 128.65 / 122.25 (d, arom. NPE), 115.55 (s, C-5), 88, 42 (d, 1'-C), 87.1 (d, 4'-C), 82.11 (d, 2'-C), 70.36 (d, C-3 '), 66.29 (t, O-CH₂ NPE), 65.38 (t, O-CH₂-CH₃), 63.01 (t, 5'-CH₂), 35 , 54 (t, CH₂-Ph NPE), 15.04 (q, O-CH₂-CH₃).

2′-O-Methyl-O⁶-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]-N²-(phenoxyacetyl)guanosin 15a 2'-O-methyl-O⁶- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -N²- (phenoxyacetyl) guanosine 15a

a) 1,5 g (3,3 mmol) 14a wurden dreimal mit Pyridin/Benzol abgeschleppt und in 150 ml Pyridin gelöst. a) 1.5 g (3.3 mmol) 14a were towed three times with pyridine / benzene and dissolved in 150 ml of pyridine. Innerhalb von 30 Minuten wurden bei Raumtemperatur 1,78 g (16,5 mmol) Trimethylchlorsilan zugetropft. Within 30 minutes, 1.78 g (16.5 mmol) of trimethylchlorosilane were added dropwise at room temperature. Nach 2 Stunden wurden 1,32 g (4,6 mmol) Phenoxyessigsäureanhydrid zugegeben und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. After 2 hours, 1.32 g (4.6 mmol) Phenoxyessigsäureanhydrid were added and stirred at room temperature overnight. Das Reaktionsgemisch wurde mit 250 ml Wasser/Methanol=1/1 und mit 10 ml conc. The reaction mixture was concentrated to 250 ml of water / methanol = 1/1 and treated with 10 ml. wäßrigem Ammoniak versetzt, nach 10 Minuten wurde die wäßrige Phase siebenmal mit Dichlormethan extrahiert. aqueous ammonia added, after 10 minutes the aqueous phase was extracted seven times with dichloromethane. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. The combined organic phases were dried, filtered and evaporated over sodium sulfate. Es wurden 1,85 g (95%) 15a, farbloser, fester Schaum mit den unten angegebenen analytischen Daten erhalten. There were obtained 1.85 g (95%) of 15a, a colorless solid foam with the analytical data shown below.

b) Es wurden dieselben Versuchsbedingungen gewählt, doch wurden 1,7 g (3,81 mmol) 14a/19/a=82/18 eingesetzt. b) The same experimental conditions were chosen, but 1.7 g (3.81 mmol) of 14a / 19 / a = 82/18 were used. Es wurden 1,8 g (81%) 15a/20a erhalten. There was added 1.8 g (81%) of 15a / 20a. DC: Chloroform/Methanol=5/0,3, R f =0,36 für 15a, R f =0,38 für 20a. TLC: chloroform / methanol = 5 / 0.3, R f = 0.36 for 15a, R f = 0.38 for 20a.
¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ=8,98 (s br, 1H; NH), 8,15 (d, J=8,5 Hz, 2H; NPE) 8,00 (s, 1H; 8-H), 7,52 (d, J=8,5 Hz, 2H; NPE), 7,42-7,26 (m, 2H; PhOAc arom.), 7,14-6,93 (m, 3H; PhOAc arom.), 5,92 (d, J=6,2 Hz, 1H; 1′-H), 5,05 (s br, 1H; OH), 4,85 (t, J=6,8 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4,69 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,65 (m, 2H; 2′-H, 3′-H), 4,3 (s, 1H; 4′-H), 4,02 (d, J=12,5 Hz, 1H; 5′-H), 3,84 (d, J=12,5 Hz, 1H; 5′-H), 3,39 (s, 3H; 2′-OCH₃), 3,35 (t, J=6,8 Hz, 2H; NPE CH₂-Ph). ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 8.98 (s br, 1H, NH), 8.15 (d, J = 8.5 Hz, 2H; NPE) 8.00 (s, 1H; 8 -H), 7.52 (d, J = 8.5 Hz, 2H; NPE), 7.42 to 7.26 (m, 2H; arom PhOAc), 7.14 to 6.93 (m, 3H. ; PhOAc arom), 5.92 (d, J = 6.2 Hz, 1H;. 1'-H), 5.05 (s br, 1H; OH), 4.85 (t, J = 6.8 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4.69 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4.65 (m, 2H, 2'-H, 3'-H), 4.3 (s, 1H; 4 '-H), 4.02 (d, J = 12.5 Hz, 1H; 5'-H), 3.84 (d, J = 12.5 Hz, 1H; 5'-H), 3.39 (s, 3H, 2'-OCH₃), 3.35 (t, J = 6.8 Hz, 2H; NPE CH₂-Ph).
¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ=165,95 (s, NH-C=O), 160,8 (s, 6-C), 156,8 (s, CH₂-OC(Ph)), 151,68* (s, 2-C), 150,61* (s, CH₂-C(Ph) NPE), 146,76* (s, 4-C), 145,40* (s, O₂N-C(Ph)), 142,18 (d, 8-C), 129,91/129,75 (d, arom., Phenoxyac.), 123,62 (d, arom., NPE), 122,41 (arom.), 119,81 (s, 5-C), 114,77 (arom.), 88,54 (d, 1′-C), 87,11 (d, 4′-C), 82,44 (d, 2′-C), 69,85 (d, 3′-C), 67,56 (t, O-CH₂ NPE), 67,17 (t, CH₂-O-Ph), 62,47 (t, 5′-CH₂), 58,63 (q, OCH₃), 34,87 (t, CH₂-Ph NPE). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 165.95 (s, NH-C = O), 160.8 (s, C-6), 156.8 (s, CH₂-OC (Ph)), 151.68 * (s, 2-C), 150.61 * (s, CH₂-C (Ph) NPE), 146.76 * (s, 4-C), 145.40 * (s, O₂N-C (Ph)), 142.18 (d, 8-C), 129.91 / 129.75 (d, arom., Phenoxyac.), 123.62 (d, arom., NPE), 122.41 (arom .), 119.81 (s, C-5), 114.77 (arom.), 88.54 (d, 1'-C), 87.11 (d, 4'-C), 82.44 ( d, 2'-C), 69.85 (d, C-3 '), 67.56 (t, O-CH₂ NPE), 67.17 (t, CH₂-O-Ph), 62.47 (t , 5'-CH₂), 58.63 (q, OCH₃), 34.87 (t, CH₂-Ph NPE).

2′-O-Ethyl-O⁶-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]-N²- (phenoxyacetyl)guanosin 15b 2'-O-ethyl-O⁶- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -N²- (phenoxyacetyl) guanosine 15b

0,440 g (0,96 mmol) 14b wurden analog zu 15a mit 0,521 g (4,8 mmol) Trimethylchlorsilan und 0,440 g (1,54 mmol) Phenoxyessigsäureanhydrid versetzt. 0.440 g (0.96 mmol) were added analogous to 15a 14b with 0.521 g (4.8 mmol) of trimethylchlorosilane and 0.440 g (1.54 mmol) Phenoxyessigsäureanhydrid. Nach gleichen Reaktionsbedingungen und analoger Aufarbeitung wurde durch SC-Reinigung (Kieselgel feinst, Eluens: Dichlormethan/Isopropanol=10 : 1) 0,470 g (82%) Reinprodukt 15b als farbloser Schaum erhalten. After the same reaction conditions and similar workup was carried SC-purification (silica gel, very fine eluent: dichloromethane / isopropanol = 10: 1) 0.470 g (82%) of pure product 15b as a colorless foam.
¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ=8,98 (s br, 1H; NH), 8,62 (m, 1H; OH), 8,15 (d, J=8,4 Hz, 2H; NPE arom.), 7,91 (s, 1H; 8-H), 7,56 (d, J=8,4 Hz; NPE arom.), 7,44-7,25 (m, 2H; PhOAc arom.), 7,15-6,95 (m, 3H; PhOAc arom.), 5,90 (d, J=7,3 Hz, 1H; 1′-H), 4,88 (d, J=7,3 Hz, 1H; 2′-H), 4,85 (t, J=7,3 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4,68 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,65 (m, 1H; 3′-H), 4,30 (s, 1H; 4′-H), 4,02/3,84 (2d, J=12,5 Hz, 2H; 5′-CH₂), 3,44-3,27 (m, 2H; O-CH₂-CH₃), 3,35 (t, J=7,3 Hz, 2H; NPE CH₂-Ph), 1,15 (t, 3H; O-CH₂-CH₃). ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 8.98 (s br, 1H, NH), 8.62 (m, 1H; OH), 8.15 (d, J = 8.4 Hz, 2H; NPE arom), 7.91 (s, 1H;. 8-H), 7.56 (d, J = 8.4 Hz; NPE arom), 7.44 to 7.25 (m, 2H;. PhOAc arom .), 7.15 to 6.95 (m, 3H; arom PhOAc), 5.90 (d, J = 7.3 Hz, 1H;. 1'-H), 4.88 (d, J = 7 , 3 Hz, 1H; 2'-H), 4.85 (t, J = 7.3 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4.68 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4.65 (m , 1H; 3'-H), 4.30 (s, 1H; 4'-H), 4.02 / 3.84 (2d, J = 12.5 Hz, 2H; 5'-CH₂), 3, 44 to 3.27 (m, 2H, O-CH₂-CH₃), 3.35 (t, J = 7.3 Hz, 2H; NPE CH₂-Ph), 1.15 (t, 3H; O-CH₂- CH₃).
¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ=165,95 (s, NH-C=O), 160,80 (s, 6-C), 156,50 (s, CH₂O-C(Ph)), 151,70 (s, 2-C), 150,65* (s, 4-C), 146,75* (s, CH₂-C(Ph) NPE), 145,40 (s, O2N-C(Ph)), 142,20 (d, 8-C), 129,90/129,75 (d, arom., PhOAc), 123,62 (d, arom. NPE), 122,40 (arom.), 119,85 (s, 5-C), 114,76 (arom.), 88,55 (d, 1′-C), 87,13 (d, 4′-C), 82,43 (d, 2′-C), 69,87 (d, 3′-C), 67,56 (t, O-CH₂ NPE), 67,16 (t, CH₂-O-Ph), 67,61 (t, O-CH₂-CH₃), 62,42 (t, 5′-CH₂), 34,83 (t, CH₂-Ph NPE), 15,18 (q, O-CH₂-CH₃). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 165.95 (s, NH-C = O), 160.80 (s, C-6), 156.50 (s, CH₂O-C (Ph)), 151.70 (s, 2-C), 150.65 * (s, 4-C), 146.75 * (s, CH₂-C (Ph) NPE), 145.40 (s, O2N-C (Ph )), 142.20 (d, 8-C), 129.90 / 129.75 (d, arom., PhOAc), 123.62 (d arom. NPE), 122.40 (arom.), 119 , 85 (s, 5-C), 114.76 (arom.), 88.55 (d, 1'-C), 87.13 (d, 4'-C), 82.43 (d, 2 ' -C), 69.87 (d, C-3 '), 67.56 (t, O-CH₂ NPE), 67.16 (t, CH₂-O-Ph), 67.61 (t, O-CH₂ -CH₃), 62.42 (t, 5'-CH₂), 34.83 (t, CH₂-Ph NPE), 15.18 (q, O-CH₂-CH₃).

5′-O-Dimethoxynitril-2′-O-methyl-O⁶-[2-(4- nitrophenyl)ethyl]-N²-(phenoxyacetyl)guanosin 16a 5'-O-Dimethoxynitril-2'-O-methyl-O⁶- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -N²- (phenoxyacetyl) guanosine 16a

3,0 g (5,18 mmol) 15a als Gemisch mit 0,3 g Regioisomer 20a wurden dreimal mit Pyridin/Benzol abgeschleppt, in 350 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und mit 2,13 g (6,3 mmol) Dimethoxytritylchlorid 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. 3.0 g (5.18 mmol) of 15a as a mixture with 0.3 g of regioisomer 20a were towed three times with pyridine / benzene, dissolved in 350 ml of anhydrous pyridine and treated with 2.13 g (6.3 mmol) of dimethoxytrityl chloride for 2 hours at room temperature. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und zwischen Dichlormethan und wäßriger Natriumbicarbonatlösung verteilt. The reaction mixture was concentrated and partitioned between dichloromethane and aqueous sodium bicarbonate. Die wäßrige Phase wurde mit Dichlormethan ausgeschüttelt. The aqueous phase was extracted with dichloromethane. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. The combined organic phases were dried, filtered and evaporated with sodium sulphate. Der erhaltene Schaum wurde säulenchromatographisch (500 g Kieselgel, Eluens: Toluol/Isopropanol=30/1) gereinigt. The resulting foam was purified by column chromatography (500 g silica gel, eluent: toluene / isopropanol = 30/1) purified. Es wurden 4,1 g 16a (81%) und 0,3 g 21a (6%) als gelbliche feste Öle erhalten. There were 4.1 g of 16a (81%) of 21a and 0.3 g (6%) was obtained as yellowish solid oils. DC: Toluol/Isopropanol=9/1, R f =0,24 für 16a, R f =0,28 für 21a. DC: toluene / isopropanol = 9/1, R f = 0.24 for 16a, R f = 0.28 for 21a.
¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ=8,75 (s, 1H; NH), 8,18 (d, J=10 Hz, 2H; NPE arom.), 8,09 (s, 1H; 8-H), 7,55 (d, J=10 Hz, 2H; NPE arom.), 7,47-6,93 (m, 14H; DMTr, PhOAc), 6,80 (d, J=9,6 Hz, 4H; DMTr), 6,05 (d, J=2,6 Hz, 1H; 1′-H), 4,86 (t, J=6,7 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4,69 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,57 (dd, J₁=10, J₂=6,7, 1H; 3′-H), 4,42-4,32 (m, 1H; 2′-H), 4,24-4,13 (s, 1H; 4′-H), 3,78 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,63 (s, 3H; 2′-OCH₃), 3,48 (s, 2H; 5′-CH₂), 3,34 (t, 2H; NPE CH₂-Ph), 2,65 (d, J=6,7 Hz, 1H; 3′-OH). ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 8.75 (s, 1H, NH), 8.18 (d, J = 10 Hz, 2H; NPE arom.), 8.09 (s, 1H; 8 -H), 7.55 (d, J = 10 Hz, 2H; arom NPE), 7.47 to 6.93 (m, 14H;. DMTr, PhOAc), 6.80 (d, J = 9.6 Hz, 4H, DMTr), 6.05 (d, J = 2.6 Hz, 1H; 1'-H), 4.86 (t, J = 6.7 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4 , 69 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4.57 (dd, J₁ = 10, J₂ = 6.7, 1H; 3'-H), 4.42 to 4.32 (m, 1H; 2'- H), 4.24 to 4.13 (s, 1H; 4'-H), 3.78 (s, 6H, DMTr OCH₃), 3.63 (s, 3H, 2'-OCH₃), 3.48 (s, 2H; 5'-CH₂), 3.34 (t, 2H; NPE CH₂-Ph), 2.65 (d, J = 6.7 Hz, 1H; 3'-OH).
¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ=165,77 (s, C=O), 160,23 (s, 6-C), 158,15 (s, CH₃O-C(Ph), DMTr), 156,67 (s, CH₂-OC(Ph)), 152,00* (s, 2-C), 150,65* (s, CH₂-C(Ph) NPE), 146,48* (s, 4-C), 145,23* (s, O2N-C(Ph)), 144,13 (s, arom., DMTr), 140,02 (d, 8-C), 135,3/135,21/129,68/129,62/ 129,46/127,76/127,48/126,54/123,34/122,04 (arom.) 118,53 (s, 5-C), 114,48 (arom., PhOAc), 112,78 (arom., DMTr), 86,19 (s, C(Ph)3), 86,19 (d, 1′-C), 83,57 (d, 4′-C), 83,07 (d, 2′-C), 69,35 (d, 3′-C), 67,53 (t, O-CH₂ NPE), 66,75 (t, CH₂-O-Ph), 62,79 (t, 5′-CH₂), 58,5 (q, OCH₃), 54,78 (q, DMTr OCH₃), 34,87 (t, CH₂-Ph NPE). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 165.77 (s, C = O), 160.23 (s, C-6), 158.15 (s, CH₃O-C (Ph), DMTr), 156.67 (s, CH₂-OC (Ph)), 152.00 * (s, 2-C), 150.65 * (s, CH₂-C (Ph) NPE), 146.48 * (s, 4 -C), 145.23 * (s, O2N-C (Ph)), 144.13 (s, arom., DMTr), 140.02 (d, C-8), 135.3 / 135.21 / 129.68 / 129.62 / 129.46 / 127.76 / 127.48 / 126.54 / 123.34 / 122.04 (arom.) 118.53 (s, 5-C), 114.48 ( arom., PhOAc), 112.78 (arom., DMTr), 86.19 (s, C (Ph) 3), 86.19 (d, 1'-C), 83.57 (d, 4'- C), 83.07 (d, 2'-C), 69.35 (d, C-3 '), 67.53 (t, O-CH₂ NPE), 66.75 (t, CH₂-O-Ph ), 62.79 (t, 5'-CH₂), 58.5 (q, OCH₃), 54.78 (q, DMTr OCH₃), 34.87 (t, CH₂-Ph NPE).

5′-O-Dimethoxytrityl-3′-O-methyl-O⁶-[2-(4-nitrophenyl) ethyl]-N²-(phenoxyacetyl)guanosin 21a 5'-O-dimethoxytrityl-3'-O-methyl-O⁶- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -N²- (phenoxyacetyl) guanosine 21a

¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ=8,83 (s, 1H; NH), 8,07 (d, J=9,3 Hz, 2H; NPE arom.), 8,02 (s, 1H; 8-H), 7,4 (d, J=9,3 Hz, 2H; NPE arom.), 7,33-6,9 (m, 14H; DMTr, PhOAc), 6,6 (d, J=9 Hz, 4H; DMTr), 5,87 (d, J=6,3 Hz, 1H; 1′-H), 5,64 (s, 1H; 2′-OH), 4,94 (dd, J₁=6,3, J₂=5,3, 1H; 2′-H), 4,75 (t, J=6,7 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4,57 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,29* (m, 1H; 3′-H), 4,03* (m, 1H; 4′-H), 3,67 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,5 (s, 3H; 3′-OCH₃, 3,33-3,08 (m, 4H; 5′-CH₂, NPE CH₂-Ph). ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 8.83 (s, 1H, NH), 8.07 (d, J = 9.3 Hz, 2H; NPE arom.), 8.02 (s, 1H ; 8-H), 7.4 (d, J = 9.3 Hz, 2H; arom NPE), 7.33 to 6.9 (m, 14H;. DMTr, PhOAc), 6.6 (d, J = 9 Hz, 4H, DMTr), 5.87 (d, J = 6.3 Hz, 1H; 1'-H), 5.64 (s, 1H; 2'-OH), 4.94 (dd, J₁ = 6.3, J₂ = 5.3, 1H; 2'-H), 4.75 (t, J = 6.7 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4.57 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4.29 * (m, 1H; 3'-H), 4.03 * (m, 1H; 4'-H), 3.67 (s, 6H, DMTr OCH₃), 3.5 (s , 3H, 3'-OCH₃, 3.33 to 3.08 (m, 4H, 5'-CH₂, CH₂-Ph NPE).
¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ=165,76 (s, C=O), 160,3 (s, 6-C), 158,08 (s, CH₃O-C(Ph), DMTr), 156,54 (s, CH₂-OC(Ph)), 151,55* (s, 2-C), 150,18* (s, NPE), 146,47* (s, 4-C), 145,17* (s, NPE), 144,03 (arom., DMTr), 140,63 (d, 8-C), 135,15/135,06/129,53/ 127,57/127,37/126,42/123,34/122,18 (arom.), 118,82 (s, 5-C), 114,51 (arom., PhOAc), 112,68 (arom., DMTr), 90,40 (d, 1′-C), 86,15 (s, C(Ph)₃), 83,47 (d, 4′-C), 81,21 (d, 3′-C), 75,29 (d, 2′-C), 67,40 (t, O-CH₂ NPE), 66,82 (t, CH₂-O-Ph), 63,51 (t, 5′-CH₂), 58,45 (q, 3′-OCH₃), 54,73 (q, DMTr OCH₃), 34,65 (t, CH₂-Ph NPE). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 165.76 (s, C = O), 160.3 (s, C-6), 158.08 (s, CH₃O-C (Ph), DMTr), 156.54 (s, CH₂-OC (Ph)), 151.55 * (s, 2-C), 150.18 * (s, NPE), 146.47 * (s, 4-C), 145, 17 * (s, NPE), 144.03 (arom., DMTr), 140.63 (d, 8-C), 135.15 / 135.06 / 129.53 / 127.57 / 127.37 / 126 , 42 / 123,34 / 122,18 (arom.), 118.82 (s, 5-C), 114.51 (arom., PhOAc), 112.68 (arom., DMTr), 90.40 ( d, 1'-C), 86.15 (s, C (Ph) ₃), 83.47 (d, 4'-C), 81.21 (d, C-3 '), 75.29 (d , 2'-C), 67.40 (t, O-CH₂ NPE), 66.82 (t, CH₂-O-Ph), 63.51 (t, 5'-CH₂), 58.45 (q, 3'-OCH₃), 54.73 (q, DMTr OCH₃), 34.65 (t, CH₂-Ph NPE).

5′-O-Dimethoxytrityl-2′-O-ethyl-O⁶-[2-(4-nitrophenyl) ethyl)-N²-(phenoxyacetyl)guanosin 16b 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-ethyl-O⁶- [2- (4-nitrophenyl) ethyl) -N (phenoxyacetyl) guanosine 16b

0,470 g (0,79 mmol) 15b wurden analog zu 16a getrocknet, gelöst, mit 0,321 g (0,95 mmol) Dimethoxytritylchlorid versetzt und in gleicher Weise aufgearbeitet. 0.470 g (0.79 mmol) of 15b were prepared analogously to 16a dried, dissolved with 0.321 g (0.95 mmol) of dimethoxytrityl chloride and the mixture worked up in the same way. Durch SC (Kieselgel feinst, Eluens Dichlormethan/Aceton=15/1) wurden 483 mg (67,6%) Reinprodukt 16b als gelbes Pulver erhalten. By CC (silica gel finely, eluent dichloromethane / acetone = 15/1) were 483 mg (67.6%) of pure product 16b as a yellow powder.
¹H-NMR (CDCl₃, 250 MHz): δ=8,88 (s, 1H; NH), 8,10 (d, J=9,2 Hz, 2H; NPE arom.), 8,04 (s, 1H; 8-H), 7,56 (d, J=9,2 Hz, 2H; NPE arom.), 7,44-6,60 (m, 18H; DMTr, PhOAc), 6,00 (d, J=4,5 Hz, 1H; 1′-H), 4,88 (s, 2H; PhOAcCH₂), 4,83 (t, J=6,9 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4,66-4,48 (m, 2H; 2′-H, 3′-H), 4,18-3,94 (m, 1H); ¹H-NMR (CDCl₃, 250 MHz): δ = 8.88 (s, 1H, NH), 8.10 (d, J = 9.2 Hz, 2H; NPE arom.), 8.04 (s, 1H ; 8-H), 7.56 (d, J = 9.2 Hz, 2H; arom NPE), 7.44 to 6.60 (m, 18H;. DMTr, PhOAc), 6.00 (d, J = 4.5 Hz, 1H; 1'-H), 4.88 (s, 2H; PhOAcCH₂), 4.83 (t, J = 6.9 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4,66- 4.48 (m, 2H, 2'-H, 3'-H), 4.18 to 3.94 (m, 1H); 4′-H), 3,72 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,68-3,51 (m, 2H; O-CH₂-CH₃), 3,50-3,15 (m, 5H; 5′-CH₂, NPE CH₂-Ph), 3′-OH), 1,13 (t, 3H; O-CH₂-CH₃). 4'-H), 3.72 (s, 6H, DMTr OCH₃), 3.68 to 3.51 (m, 2H, O-CH₂-CH₃), 3.50 to 3.15 (m, 5H; 5 'is -CH₂, NPE CH₂-Ph), 3'-OH), 1.13 (t, 3H; O-CH₂-CH₃).
¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ=165,77 (s, NH-C=O), 160,59 (s, 6-C), 158,50 (s, CH₃O-C(Ph)), 157,02 (s, CH₂-OC(Ph)), 152,38 (s, 2-C), 150,98* (s, 4-C), 146,86* (s, CH₂-C(Ph, NPE)), 145,56 (s, O₂N-C(Ph)), 144,48 (s, arom., DMTr), 140,39 (d, 8-C), 135,65/135,56/130,01/129,81/128,10/127,82/ 126,88/123,71/122,40 (arom.), 118,89 (s, 5-C), 114,82 (arom., PhOAc), 113,12 (arom., DMTr), 86,95 (d, 1′-C), 86,53 (s, C(Ph)3), 84,01 (d, 4′-C), 81,54 (d, 3′-C), 76,36 (d, 2′-C), 67,87 (t, O-CH₂ NPE), 67,10 (t, CH₂-O-Ph), 66,91 (t, O-CH₂-CH₃), 63,22 (t, 5′-CH₂), 55,13 (q, DMTr OCH₃), 35,03 (t, CH₂-Ph NPE), 15,20 (q, O-CH₂-CH₃). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 165.77 (s, NH-C = O), 160.59 (s, C-6), 158.50 (s, CH₃O-C (Ph)), 157.02 (s, CH₂-OC (Ph)), 152.38 (s, 2-C), 150.98 * (s, 4-C), 146.86 * (s, CH₂-C (Ph, NPE)), 145.56 (s, O₂N-C (Ph)), 144.48 (s, arom., DMTr), 140.39 (d, C-8), 135.65 / 135.56 / 130 01 / 129.81 / 128.10 / 127.82 / 126.88 / 123.71 / 122.40 (arom.), 118.89 (s, 5-C), 114.82 (arom., PhOAc ), 113.12 (arom., DMTr), 86.95 (d, 1'-C), 86.53 (s, C (Ph) 3), 84.01 (d, 4'-C), 81 , 54 (d, 3'-C), 76.36 (d, 2'-C), 67.87 (t, O-CH₂ NPE), 67.10 (t, CH₂-O-Ph), 66, 91 (t, O-CH₂-CH₃), 63.22 (t, 5'-CH₂), 55.13 (q, DMTr OCH₃), 35.03 (t, CH₂-Ph NPE), 15.20 (q , O-CH₂-CH₃).

5′-O-Dimethoxytrityl-2′-O-methyl-N²-(phenoxyacetyl)- guanosin 18a 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-N²- (phenoxyacetyl) - guanosine 18a

150 mg (0,17 mmol) 16a wurden in 5 ml einer 0,5molaren Lösung von 1,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en (DBU) in Pyridin 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. 150 mg (0.17 mmol) 16a were stirred in 5 ml of a solution of 0,5molaren 1,8-diazabicyclo (5.4.0) undec-7-ene (DBU) in pyridine for 2 hours at room temperature. Dann wurden 1,5 ml 1M wäßrige Essigsäure zugetropft, es wurde mit Wasser verdünnt und die wäßrige Phase mit Dichlormethan extrahiert. Then, 1.5 ml of 1M aqueous acetic acid were added dropwise, it was diluted with water and the aqueous phase extracted with dichloromethane. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. The combined organic phases were dried, filtered and evaporated with sodium sulphate. Der ölige Rückstand wurde mittels Flashchromatographie (4 g Kieselgel, Eluens: Dichlormethan/Aceton/Triethylamin=100/10/2) gereinigt. The oily residue was purified by flash chromatography (4 g silica gel, eluent: dichloromethane / acetone / triethylamine = 100/10/2). Es wurden 95 mg (76%) farbloses festes Öl 18a erhalten. There were 95 mg (76%) of a colorless solid oil 18a. DC: Chloroform/Methanol=4,8/0,3, R f =0,38. TLC: chloroform / methanol = 4.8 / 0.3, R f = 0.38.
¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ=9,1 (s br, 1H; NH), 7,87 (s, 1H; 8-H), 7,49-6,75 (m, 18H; DMTr), 6,02 (d, J=5,3 Hz, 1H; 1′-H); ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 9.1 (s br, 1H, NH), 7.87 (s, 1H; 8-H), 7.49 to 6.75 (m, 18H; DMTr ), 6.02 (d, J = 5.3 Hz, 1H; 1'-H); 4,65 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,48 (m, 1H; 3′-H), 4,33-4,15 (m, 2H; 2′-H, 4′-H), 3,78 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,49 (s, 3H; 2′-OCH₃), 3,44 (s, 2H; 5′-CH₂), 2,78 (s br, 1H; 3′-OH). 4.65 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4.48 (m, 1H; 3'-H), 4.33 to 4.15 (m, 2H, 2'-H, 4'-H), 3 , 78 (s, 6H, DMTr OCH₃), 3.49 (s, 3H, 2'-OCH₃), 3.44 (s, 2H; 5'-CH₂), 2.78 (s br, 1H, 3 ' -OH).
¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ=169,5 (s, NH-C=O), 158,61 (s, CH₃O-C(Ph), DMTr), 156,3 (s, CH₂-OC(Ph)), 155,26 (s, 6-C), 147,78 (s, 2-C), (146,29 (s, 4-C), 144,33 (s, arom., DMTr), 137,17 (d, 8-C), 135,47/135,37 (arom., DMTr) 129,98 (arom.-C, PhOAc), 128,09/127,91/127,03 (arom., DMTr), 123,01 (s, 5-C), 122,05/114,83 (arom., PhOAc), 113,2 (arom., DMTr), 86,74 (s, C(Ph3), 85,47 (d, 1′-C), 84,15 (d, 4′-C), 83,85 (d, 2′-C), 69,96 (d, 3′-C), 66,88 (t, CH₂-O-Ph), 63,3 (t, 5′-CH₂), 58,85 (q, 2′-OCH₃), 55,2 (q, DMTr OCH₃). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 169.5 (s, NH-C = O), 158.61 (s, CH₃O-C (Ph), DMTr), 156.3 (s, CH₂-OC (Ph)), 155.26 (s, C-6), 147.78 (s, C-2), (146.29 (s, C-4), 144.33 (s, arom., DMTr) , 137.17 (d, 8-C), 135.47 / 135.37 (arom., DMTr) 129.98 (arom.-C, PhOAc), 128.09 / 127.91 / 127.03 (arom ., DMTr), 123.01 (s, C-5), 122.05 / 114.83 (arom., PhOAc), 113.2 (arom., DMTr), 86.74 (s, C (Ph3) , 85.47 (d, 1'-C), 84.15 (d, 4'-C), 83.85 (d, 2'-C), 69.96 (d, C-3 '), 66 , 88 (t, CH₂-O-Ph), 63.3 (t, 5'-CH₂), 58.85 (q, 2'-OCH₃), 55.2 (q, OCH₃ DMTr).

N³-Cyanoethyl-5′-O-monomethoxytrityluridin 24a N³-cyanoethyl-5'-O-monomethoxytrityl 24a

7 g (13,6 mmol) 23a (hergestellt nach Schaller, H., et al. (1963), J. Am. Chem. Soc., 3821-27) wurden dreimal mit Dimethylformamid/Benzol abgeschleppt und in 100 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst, auf 0°C abgekühlt und mit 325 mg (13,6 mmol) gewaschenem Natriumhydrid versetzt und eine Stunde bei 0°C gerührt. 7 g (13.6 mmol) of 23a (prepared according to Schaller, H., et al. (1963), J. Am. Chem. Soc., 3821-27) were towed three times with dimethylformamide / benzene and anhydrous in 100 ml of dimethylformamide , cooled to 0 ° C and treated with 325 mg (13.6 mmol) of washed sodium hydride and stirred for one hour at 0 ° C. Hierauf wurden innerhalb von 12 Stunden 14,4 g (0,272 mol) Acrylnitril zugegeben und das Reaktionsgemisch auf 80°C erwärmt. Then acrylonitrile were added and the reaction mixture heated to 80 ° C within 12 hours, 14.4 g (0.272 mol). Die Reaktionsmischung wurde a 44013 00070 552 001000280000000200012000285914390200040 0002004110085 00004 43894uf Wasser/Dichlormethan geleert und die wäßrige Phase wurde mit Dichlormethan ausgeschüttelt. The reaction mixture was a 44013 00070 552 00004 0002004110085 001000280000000200012000285914390200040 43894uf water / dichloromethane emptied and the aqueous phase was extracted with dichloromethane. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. The combined organic phases were dried, filtered and evaporated with sodium sulphate.

Das Rohprodukt wurde mittels Flashchromatographie (200 g Kieselgel, Eluens: Dichlormethan/Aceton = 30/1) gereinigt. The crude product was purified by flash chromatography (200 g silica gel, eluent: dichloromethane / acetone = 30/1). Es wurden 3,5 g (45%) weißer Schaum 24a erhalten. There 3.5 g (45%) white foam 24a was obtained. DC: Dichlormethan/Aceton=33/2, R f =0,42. TLC: dichloromethane / acetone = 33/2, R f = 0.42.
¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ=7,95 (d, J=8,1 Hz, 1H; 6-H), 7,45-7,1 (m, 12H; MMTr), 6,83 (d, J=9 Hz, 2H; MMTr), 5,92 (d, J=3 Hz, 1H; 1′-H), 5,44 (d, J=8,1 Hz, 1H; 5-H), 4,6-4,0 (m, 5H; 2′-H, 3′-H, N-CH₂, 4′-H), 3,78 (s, 3H; MMTr OCH₃), 3,51 (m, 2H; 5′-H), 2,53 (t, J=7,2 Hz, 2H; CH₂CN). ¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ = 7.95 (d, J = 8.1 Hz, 1H, 6-H), 7.45 to 7.1 (m, 12H, MMTr), 6.83 (d, J = 9 Hz, 2H, MMTr), 5.92 (d, J = 3 Hz, 1H; 1'-H), 5.44 (d, J = 8.1 Hz, 1H; 5-H ), 4.6 to 4.0 (m, 5H, 2'-H, 3'-H, N-CH₂, 4'-H), 3.78 (s, 3H; MMTr OCH₃), 3.51 ( m, 2H; 5'-H), 2.53 (t, J = 7.2 Hz, 2H, CH₂CN).
¹³C-NMR (CDCl₃, 22,5 MHz): δ=161,89 (s, 4-C), 158,64 (s, arom., C-OCH₃), 150,99 (s, 2-C), 143,68/143,17 (arom.), 138,59 (d, 6-C), 134,48/132,25/128,19/127,81/127,11 (arom.), 117,52 (s, CN), 113,18 (arom.),101,37 (d, 5-C), 90,43 (d, 1′-C), 87,18 (s, C-(Ph)3), 83,66 (d, 4′-C), 75,26 (d, 2′-C), 69,84 (d, 3′-C), 62,09 (t, 5′-CH₂), 55,05 (q, OCH₃), 36,46 (t, N-CH₂) 15,98 (t, CH₂CN). ¹³C-NMR (CDCl₃, 22.5 MHz): δ = 161.89 (s, C-4), 158.64 (s, arom, C-OCH₃.), 150.99 (s, C-2), 143,68 / 143.17 (arom.), 138.59 (d, 6-C), 134.48 / 132.25 / 128.19 / 127.81 / 127.11 (arom.), 117.52 (s, CN), 113.18 (arom.), 101.37 (d, 5-C), 90.43 (d, 1'-C), 87.18 (s, C- (Ph) 3) , 83.66 (d, 4'-C), 75.26 (d, 2'-C), 69.84 (d, C-3 '), 62.09 (t, 5'-CH₂), 55 , 05 (q, OCH₃), 36.46 (t, N-CH₂), 15.98 (t, CH₂CN).

N³-Cyanoethyl-5′-O-dimethoxytrityluridin 24b N³-cyanoethyl-5'-O-dimethoxytrityluridin 24b

40 g (0,076 mol) 23b (hergestellt nach Schaller, H., et al. (1963) J. Am. Chem. Soc., 3821-27) wurden in Analogie zu oben mit 2,9 g (0,076 mol) Natriumhydridsuspension (60%ige Suspension, gewaschen mit wasserfreiem n-Hexan) versetzt. 40 g (0.076 mol) of 23b (manufactured by Schaller, H., et al. (1963) J. Am. Chem. Soc., 3821-27) were dissolved in analogy to the above, 2.9 g (0.076 mol) of sodium hydride ( 60% suspension, washed with anhydrous n-hexane) was added. Innerhalb von 12 h wurden 1,52 mol Acrylnitril zugegeben und das Reaktionsgemisch auf 110°C erwärmt. Were within 12 h 1.52 mol of acrylonitrile was added and the reaction mixture heated to 110 ° C. Aufarbeitung wie oben beschrieben und Reinigung durch SC (Kieselgel feinst, Eluens Dichlormethan/Aceton=30 : 1) ergaben 24,0 g (55%) 24b als weißen Schaum. Workup and purification as described above (very fine silica gel, eluent dichloromethane / acetone = 30: 1) by SC gave 24.0 g (55%) of 24b as a white foam.
¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ=7,95 (d, J=8 Hz; 1H; 6-H), 7,45-7,10 (m, 9H; DMTr), 6,83 (d, J=9 Hz, 4H; DMTr), 5,92 (d, J=3 Hz, 1H; 1′-H), 5,45 (d, J=8 Hz, 1H; 5-H), 4,60-4,00 (m, 5H; 2′-H, 3′-H, N-CH₂, 4′-H), 3,78 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,50 (m, 2H; 5′-H), 2,53 (t, J=7,2 Hz, 2H; CH₂CN). ¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ = 7.95 (d, J = 8 Hz, 1H, 6-H), 7.45 to 7.10 (m, 9H, DMTr), 6.83 (d , J = 9 Hz, 4H, DMTr), 5.92 (d, J = 3 Hz, 1H; 1'-H), 5.45 (d, J = 8 Hz, 1H, 5-H), 4, 60 to 4.00 (m, 5H, 2'-H, 3'-H, N-CH₂, 4'-H), 3.78 (s, 6H, DMTr OCH₃), 3.50 (m, 2H; 5'-H), 2.53 (t, J = 7.2 Hz, 2H, CH₂CN).
¹³C-NMR (CDCl₃, 22,5 MHz): δ=161,89 (s, 4-C), 158,64 (s, arom., C-OCH₃), 150,96 (s, 2-C) 143,65 (arom.), 138,54 (d, 6-C), 134,46/132,23/128,18/127,80 (arom.), 117,50 (s, CN), 113,18 (arom.) 101,36 (d, 5-C), 90,41 (d, 1′-C), 87,18 (s, C-(Ph)3), 83,66 (d, 4′-C), 75,24 (d, 2′-C), 69,82 (d, 3′-C), 62,09 (t, 5′-CH₂), 55,05 (q, DMTr OCH₃), 36,46 (t, N-CH₂), 15,95 (t, CH₂CN). ¹³C-NMR (CDCl₃, 22.5 MHz): δ = 161.89 (s, C-4), 158.64 (s, arom, C-OCH₃.), 150.96 (s, 2-C) 143 , 65 (arom.), 138.54 (d, C-6), 134.46 / 132.23 / 128.18 / 127.80 (arom.), 117.50 (s, CN), 113.18 (arom.), 101.36 (d, 5-C), 90.41 (d, 1'-C), 87.18 (s, C- (Ph) 3), 83.66 (d, 4'- C), 75.24 (d, 2'-C), 69.82 (d, C-3 '), 62.09 (t, 5'-CH₂), 55.05 (q, DMTr OCH₃), 36 , 46 (t, N-CH₂), 15.95 (t, CH₂CN).

N³-Cyanoethyl-2′-O-methyl-5′-O-monomethoxytrityluridin 25a N³-cyanoethyl-2'-O-methyl-5'-O-monomethoxytrityl 25a

a) 600 mg (1,05 mmol) 24a wurden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und auf -40°C abgekühlt. a) 600 mg (1.05 mmol) 24a were solved in 10 ml of dimethylformamide and cooled to -40 ° C. Nach der Zugabe von 25 mg (1,04 mmol) gewaschenem Natriumhydrid wurde noch weitere 45 Minuten bei dieser Temperatur gerührt und dann 284 mg (2 mmol) Methyljodid zugespritzt und innerhalb von 3 Stunden auf Raumtemperatur erwärmt. After the addition of 25 mg (1.04 mmol) of washed sodium hydride was stirred for a further 45 minutes at this temperature and then 284 mg (2 mmol) of methyl iodide was injected and heated to room temperature within 3 hours. Zur Aufarbeitung wurde Ammoniumchlorid zugegeben, das Reaktionsgemisch zur Trockene eingedampft und zwischen Wasser und Dichlormethan verteilt. For working up, ammonium chloride was added, the reaction mixture was evaporated to dryness and partitioned between water and dichloromethane. Die wäßrige Phase wurde mit Dichlormethan extrahiert. The aqueous phase was extracted with dichloromethane. Die gesammelten organischen Phasen wurden mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. The collected organic phases were dried, filtered and evaporated with sodium sulphate. Das Produktgemisch aus 2′-methyliertem 25a, 3′-methyliertem 28a und 2′,3′-dimethyliertem 29a wurde säulenchromatographisch (90 g Kieselgel, Eluens: Diethylether) getrennt. The product mixture of 2'-methylated 25a, 3'-methylated and 28a 2 ', 3'-dimethylated 29a was purified by column chromatography (90 g silica gel, eluent: diethyl ether) separately. Es wurden 200 mg (33%) 25a, 48 mg (8%) 28a und 80 mg (13%) 29a als farblose feste Öle erhalten. There were 200 mg (33%) of 25a, 48 mg (8%) 28a and 80 mg (13%) 29a as colorless solid oils. DC: Dichlormethan/Aceton=3,2/1,8, R f =0,80 für 25a, R f =0,74 für 28a, R f =0,87 für 29a. TLC: dichloromethane / acetone = 3.2 / 1.8, R f = 0.80 for 25a, R f = 0.74 for 28a, R f = 0.87 for 29a.
¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ=8,11 (d, J=8,1 Hz, 1H; 6-H), 7,65-7,3 (m, 12H; MMTr), 6,88 (d, J=9 Hz, 2H; MMTr), 6,0 (d, J=1,5 Hz, 1H; 1′-H), 5,35 (d, J=8,1 Hz, 1H; 5-H), 4,48 (m, 1H; 3′-H), 4,29 (t, J=6 Hz, 2H; N-CH₂), 4,08 (m, 1H; 4′-H), 3,95 (m, 1H; 2′-H), 3,82 (s, 3H; MMTr OCH₃, 3,75 (s, 3H; 2′-OCH₃), 3,60 (m, 2H; 5′-CH₂), 2,82 (t, J=6 Hz, 2H; CH₂CN). ¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ = 8.11 (d, J = 8.1 Hz, 1H, 6-H), 7.65 to 7.3 (m, 12H, MMTr), 6.88 (d, J = 9 Hz, 2H, MMTr), 6.0 (d, J = 1.5 Hz, 1H; 1'-H), 5.35 (d, J = 8.1 Hz, 1H, 5 -H), 4.48 (m, 1H; 3'-H), 4.29 (t, J = 6 Hz, 2H, N-CH₂), 4.08 (m, 1H; 4'-H), 3.95 (m, 1H; 2'-H), 3.82 (s, 3H; MMTr OCH₃, 3.75 (s, 3H, 2'-OCH₃), 3.60 (m, 2H; 5'- CH₂), 2.82 (t, J = 6 Hz, 2H, CH₂CN).
¹³C-NMR (CDCl₃, 22,5 MHz): δ=161,73 (s, 4-C), 158,64 (s, arom., C-OCH₃), 150,13 (s, 2-C), 143,69/143,41 (2s, arom.), 138,32 (d, 6-C), 134,42/130,25/128,24/127,81/127,05 (arom.), 116,81 (s, CN), 113,13 (arom.) 101,15 (d, 5-C), 87,61 (s, C-(Ph)₃), 87,18 (d, 1′-C), 83,82 d, 2′-C), 83,01 (d, 4′-C), 68,11 (d, 3′-C), 61,06 (t, 5′-CH₂), 58,52 (q, 2′-OCH₃), 55,05 (q, MMTr OCH₃), 36,03 (t, N-CH₂), 15,07 (t, CH₂CN). ¹³C-NMR (CDCl₃, 22.5 MHz): δ = 161.73 (s, C-4), 158.64 (s, arom, C-OCH₃.), 150.13 (s, C-2), 143.69 / 143.41 (2s, arom.), 138.32 (d, 6-C), 134.42 / 130.25 / 128.24 / 127.81 / 127.05 (arom.), 116 , 81 (s, CN), 113.13 (arom.), 101.15 (d, 5-C), 87.61 (s, C- (Ph) ₃), 87.18 (d, 1'-C ), 83.82 d, 2'-C), 83.01 (d, 4'-C), 68.11 (d, C-3 '), 61.06 (t, 5'-CH₂), 58 , 52 (q, 2'-OCH₃), 55.05 (q, MMTr OCH₃), 36.03 (t, N-CH₂), 15.07 (t, CH₂CN).

N³-Cyanoethyl-3′-O-methyl-5′-O-monomethoxytrityluridin 28a N³-cyanoethyl-3'-O-methyl-5'-O-monomethoxytrityl 28a

¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ=7,86 (d, J=8,4 Hz, 1H; 6-H), 7,54-7,2 (m, 12H; MMTr), 6,86 (d, J=9 Hz, 2H; MMTr), 5,91 (d, J=3,6 Hz, 1H; 1′-H), 5,48 (d, J=8,4 Hz, 1H; 5-H), 4,4-4,15 (m, 4H; 2′-H, 4′-H, N-CH₂), 4,03 (m, 1H; 3′-H), 3,80 (s, 3H; MMTr OCH₃), 3,64-3,39 (m, 2H; 5′-H), 3,44 (s, 3H; 3′-OCH₃), 2,72 (t, J=7,2 Hz, 2H; CH₂CN), 2,6 (s, 1H; OH). ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 7.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H, 6-H), 7.54 to 7.2 (m, 12H, MMTr), 6.86 (d, J = 9 Hz, 2H, MMTr), 5.91 (d, J = 3.6 Hz, 1H; 1'-H), 5.48 (d, J = 8.4 Hz, 1H, 5 -H), 4.4 to 4.15 (m, 4H, 2'-H, 4'-H, N-CH₂), 4.03 (m, 1H; 3'-H), 3.80 (s , 3H; MMTr OCH₃), 3.64 to 3.39 (m, 2H; 5'-H), 3.44 (s, 3H, 3'-OCH₃), 2.72 (t, J = 7.2 Hz, 2H, CH₂CN), 2.6 (s, 1H, OH).
¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ=161,61 (s, 4-C), 158,44 (s, arom., C-OCH₃), 150,31 (s, 2-C), 143,40/143,20 (arom.), 138,30 (d, 6-C), 134,19/129,99/127,92 127,66/126,93 (arom.), 116,87 (s, CN), 112,94 (arom.), 101,21 (d, 5-C), 90,13 (d, 1′-C), 86,96 (s, C(Ph)₃), 80,70 (d, 4′-C), 78,27 (d, 3′-C), 73,35 (d, 2′-C), 61,98 (t, 5′-CH₂), 57,96 (q, 3′-OCH₃), 54,88 (q, MMTr OCH₃), 35,99 (t, N-CH₂), 15,62 (t, CH₂CN). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 161.61 (s, C-4), 158.44 (s, arom, C-OCH₃.), 150.31 (s, 2-C), 143, 40 / 143.20 (arom.), 138.30 (d, 6-C), 134.19 / 129.99 / 127.92 127.66 / 126.93 (arom.), 116.87 (s, CN), 112.94 (arom.), 101.21 (d, 5-C), 90.13 (d, 1'-C), 86.96 (s, C (Ph) ₃), 80.70 (d, 4'-C), 78.27 (d, C-3 '), 73.35 (d, 2'-C), 61.98 (t, 5'-CH₂), 57.96 (q , 3'-OCH₃), 54.88 (q, MMTr OCH₃), 35.99 (t, N-CH₂), 15.62 (t, CH₂CN).

N³-Cyanoethyl-2′,3′-O-dimethyl-5′-O-monomethoxytrityluridin 29a N³-cyanoethyl-2 ', 3'-O-dimethyl-5'-O-monomethoxytrityl 29a

¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ=8,12 (d, J=7,7 Hz, 1H; 6-H), 7,45-7,21 (m, 12H; MMTr), 6,87 (d, J=9,3 Hz, 2H; MMTr), 5,95 (s, 1H; 1′-H), 5,35 (d, J=7,7 Hz, 1H; 5-H), 4,32-3,88 (m, 5H; 2′-H 3′-H 4′-H, N-CH₂), 3,8 (s, 3H; MMTr OCH₃), 3,66 (s, 3H; OCH₃), 3,6-3,39 (m, 2H; 5′-CH₂), 3,46 (s, 3H; OCH₃), 2,78 (t, J=7 Hz, 2H; CH₂CN). ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 8.12 (d, J = 7.7 Hz, 1H, 6-H), 7.45 to 7.21 (m, 12H, MMTr), 6.87 (d, J = 9.3 Hz, 2H, MMTr), 5.95 (s, 1H; 1'-H), 5.35 (d, J = 7.7 Hz, 1H, 5-H), four , 32 to 3.88 (m, 5H, 2'-H H 3'-4'-H, N-CH₂), 3.8 (s, 3H; OCH₃ MMTr), 3.66 (s, 3H; OCH₃ ), 3.6 to 3.39 (m, 2H; 5'-CH₂), 3.46 (s, 3H, OCH₃), 2.78 (t, J = 7 Hz, 2H, CH₂CN).
¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ=161,83 (s, 4-C), 158,60 (s, arom., C-OCH₃), 150,07 (s, 2-C), 143,67/143,36 (arom.), 138,40 (d, 6-C), 134,32/130,2/128,15/128,10 127,82/127,07 (arom.), 116,95 (s, CN), 113,1 (arom.), 101,07 (d, 5-C), 88,25 d, 1′-C), 87,1 (s, C(Ph)3), 81,75 d, 4′-C), 80,69 (d, 2′-C), 76,36 (d, 3′-C), 60,83 (t, 5′-CH₂), 58,31/58,07 (2q, 2′-/3′-OCH₃), 55,02 (q, MMTr OCH₃), 35,95 (t, N-CH₂), 15,86 (t, CH₂CN). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 161.83 (s, C-4), 158.60 (s, arom, C-OCH₃.), 150.07 (s, 2-C), 143, 67 / 143.36 (arom.), 138.40 (d, 6-C), 134.32 / 130.2 / 128.15 / 128.10 127.82 / 127.07 (arom.), 116, 95 (s, CN), 113.1 (arom.), 101.07 (d, 5-C), 88.25 d, 1'-C), 87.1 (s, C (Ph) 3), 81.75 d, 4'-C), 80.69 (d, 2'-C), 76.36 (d, C-3 '), 60.83 (t, 5'-CH₂), 58.31 / 58.07 (2q, 2 '- / 3'-OCH₃), 55.02 (q, MMTr OCH₃), 35,95 (t, N-CH₂), 15.86 (t, CH₂CN).

b) 500 mg (0,88 mmol) 24a wurden in 7 ml Dimethylformamid gelöst und bei Raumtemperatur mit insgesamt 10 ml Diazomethanlösung versetzt. b) 500 mg (0.88 mmol) of 24a was dissolved in 7 ml of dimethylformamide and treated at room temperature with 10 ml of diazomethane. Die Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt und nach 4 Stunden zwischen Dichlormethan und Natriumbicarbonatlösung verteilt. The reaction was followed by thin layer chromatography after 4 hours and distributed between dichloromethane and sodium bicarbonate solution. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet, filtriert und eingedampft. The combined organic phases were dried, filtered and evaporated. Nach säulenchromatographischer Reinigung (60 g Kieselgel, Eluens: Diethylether) wurden 330 mg (64%) 25a und 100 mg (19%) 28a erhalten. Purification by column chromatography (60 g silica gel, eluent: diethyl ether), 330 mg (64%) of 25a and 100 mg (19%) of 28a.

2′-O-Methyl-5′-O-monomethoxytrityluridin 26a 2'-O-methyl-5'-O-monomethoxytrityl 26a

100 mg (0,17 mmol) 25a wurden in Dichlormethan mit 38 mg (0,34 mmol) t-Kaliumbutylat versetzt. 100 mg (0.17 mmol) of 25a were dissolved in dichloromethane with 38 mg (0.34 mmol) of t-potassium butoxide. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch zwischen Dichlormethan und Natriumbicarbonatlösung verteilt, die gesammelten organischen Phasen mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. After 30 minutes at room temperature, the reaction mixture between dichloromethane and sodium bicarbonate solution was distributed, the collected organic phases dried, filtered and evaporated with sodium sulphate. Das Rohprodukt wurde mittels Flashchromatographie (4 g Kieselgel, Eluens: Dichlormethan/Aceton=9/1) gereinigt. The crude product was purified by flash chromatography (4 g silica gel, eluent: dichloromethane / acetone = 9/1) to give. Es wurden 80 mg (89%) 26a, weißer Schaum erhalten. There were 80 mg (89%) of 26a, a white foam obtained. DC: Dichlormethan/Aceton=3/2, R f =0,41. TLC: dichloromethane / acetone = 3/2, R f = 0.41.
¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ=9,2 (s br, 1H; NH), 8,02 (d, J=8,1 Hz, 1H; 6-H), 7,4-7,25 (m, 12H; MMTr), 6,85 (d, J=8,9 Hz, 2H; MMTr), 5,97 (s, 1H; 1′-H), 5,27 (d, J=8,1 Hz, 1H; 5-H), 4,5* (dd, J₁=5,3 Hz, J₂=9,3 Hz, 1H; 3′-H), 4,0* (d, J=8 Hz, 1H; 4′-H, 3,8 (s, 4H; MMTr OCH₃, 2′-H), 3,65 (s, 3H; 2′-OCH₃), 3,56 (d, J=2 Hz, 2H; 5′-CH₂). ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz): δ = 9.2 (s br, 1H, NH), 8.02 (d, J = 8.1 Hz, 1H, 6-H), 7.4 to 7, 25 (m, 12H, MMTr), 6.85 (d, J = 8.9 Hz, 2H, MMTr), 5.97 (s, 1H; 1'-H), 5.27 (d, J = 8 , 1 Hz, 1H, 5-H), 4.5 * (dd, J₁ = 5.3 Hz, J₂ = 9.3 Hz, 1H; 3'-H), 4.0 * (d, J = 8 Hz, 1H; 4'-H, 3.8 (s, 4H; MMTr OCH₃, 2'-H), 3.65 (s, 3H, 2'-OCH₃), 3.56 (d, J = 2 Hz , 2H; 5'-CH₂).
¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ=163,76 (s, 4-C), 158,55 (s, arom., C-OCH₃), 150,19 (s, 2-C), 143,75/143,42 (arom.) 139,85 (d, 6-C), 134,4/130,25/ 128,22/128,12/127,78/127,05/113,08 (arom.), 101,87 (d, 5-C), 87,06 (s, C-(Ph)3), 86,88 (d, 1′-C), 83,8 (d, 2′-C), 82,82 (d, 4′-C, 68,15 (d, 3′-C), 61,07 (t, 5′-CH₂), 58,43 (q, OCH₃), 54,98 (q, MMTr OCH₃). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 MHz): δ = 163.76 (s, C-4), 158.55 (s, arom, C-OCH₃.), 150.19 (s, 2-C), 143, 75 / 143.42 (arom.) 139.85 (d, 6-C), 134.4 / 130.25 / 128.22 / 128.12 / 127.78 / 127.05 / 113.08 (arom. ), 101.87 (d, 5-C), 87.06 (s, C- (Ph) 3), 86.88 (d, 1'-C), 83.8 (d, 2'-C) , 82.82 (d, 4'-C, 68.15 (d, C-3 '), 61.07 (t, 5'-CH₂), 58.43 (q, OCH₃), 54.98 (q , MMTr OCH₃).

5′-O-Dimethoxytrityl-2′-O-ethyluridin 26b 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-ethyluridine 26b

24 g (0,042 mol) 24b wurden analog zu 25a (Ansatz Methyljodidalkylierung) mit 1,6 g (42 mmol) 60% Natriumhydridsuspension (gewaschen mit wasserfreiem n-Hexan) versetzt und 1h bei -45°C gerührt. 24 g (0.042 mol) of 24b analogous to 25a (batch Methyljodidalkylierung) with 1.6 g (42 mmol) of 60% sodium hydride (washed with anhydrous n-hexane) and stirred for 1h at -45 ° C. Nun wurden 10,53 g (0,068 mol) Ethyljodid zugegeben und im weiteren wie bei 25a vorgegangen. Now 10.53 g (0.068 mol) of ethyl iodide were added and the procedure in the other as in 25a. SC (Kieselgel feinst, Eluens Dichlormethan/Aceton= 12/1) ergab 6,0 g 25b (verunreinigt mit Regioisomeren) als weißem Schaum. SC (silica gel, very fine eluent dichloromethane / acetone = 12/1) afforded 6.0 g of 25b (contaminated with regioisomers) as a white foam. Dieser wurde wie bei 26a getrocknet, in 60 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst, mit 4,2 g (18,2 mmol) Kalium-t-butylat versetzt und in gleicher Weise aufgearbeitet. This was dried as at 26a, dissolved in 60 ml of anhydrous dichloromethane, 4.2 g (18.2 mmol) of potassium t-butoxide and worked up in the same way. Das Rohprodukt wurde durch SC (Kieselgel feinst, Eluens: Dichlormethan/Aceton=9/1) gereinigt, wobei 4,1 g (17%) 26b als graubrauner Schaum erhalten wurden. The crude product was (finely silica gel, eluent: dichloromethane / acetone = 9/1) by SC to give 4.1 g (17%) of 26b as an off-brown foam.
¹H-NMR (CDCl₃, 250 MHz): δ=9,30 (s br, 1H; NH), 7,79 (d, J=8,1 Hz, 1H; 6-H), 7,5-7,08 (m, 9H; DMTr), 6,89 (d, J=8,9 Hz, 4H; DMTr), 5,80 (s, 1H 1′-H), 5,24 (d, J=8,1 Hz, 1H; 5-H), 4,30* (m, 1H; 2′-H), 3,94* (m, 2H; 3′-H, 4′-H), 3,75 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,45-3,20 (m, 4H; O-CH₂-CH₃, 5′-CH₂), 1,21 (t, J=7,4 Hz, 3H; O-CH₂-CH₃). ¹H-NMR (CDCl₃, 250 MHz): δ = 9.30 (s br, 1H, NH), 7.79 (d, J = 8.1 Hz, 1H, 6-H), 7.5 to 7, 08 (m, 9H, DMTr), 6.89 (d, J = 8.9 Hz, 4H, DMTr), 5.80 (s, 1 H 1'-H), 5.24 (d, J = 8, 1 Hz, 1H, 5-H), 4.30 * (m, 1H; 2'-H), 3.94 * (m, 2H, 3'-H, 4'-H), 3.75 (s , 6H, DMTr OCH₃), 3.45 to 3.20 (m, 4H, O-CH₂-CH₃, 5'-CH₂), 1.21 (t, J = 7.4 Hz, 3H; O-CH₂- CH₃).
¹³C-NMR (CDCl₃, 62.5 MHz): δ=163,95 (s, 4-C), 159,63 (s, arom.), 159,61 (s, C-OCH₃), 151,97 (s, 2-C), 145,69 (arom.), 141,10 (d, 6-C), 136,52/136,26/ 130,97/130,95/128,91/128,82/127,86 (arom.), 102,29 (d, 5-C), 88,52* (s, C-(Ph)3), 87,39* (d, 1′-C), 83,87 (d, 4′-C), 82,44 (d, 2′-C), 69,50 (d, 3′-C), 67,01 (t, O-CH₂-CH₃), 62,96 (t, 5′-CH₂), 55,81 (q, DMTr OCH₃), 15,41 (q, O-CH₂-CH₃). ¹³C-NMR (CDCl₃, 62.5 MHz): δ = 163.95 (s, C-4), 159.63 (s, arom.), 159.61 (s, C-OCH₃), 151.97 (s, 2-C), 145.69 (arom.), 141.10 (d, 6-C), 136.52 / 136.26 / 130.97 / 130.95 / 128.91 / 128.82 / 127, 86 (arom.), 102.29 (d, 5-C), 88.52 * (s, C (Ph) 3), 87.39 * (d, 1'-C), 83.87 (d , 4'-C), 82.44 (d, 2'-C), 69.50 (d, C-3 '), 67.01 (t, O-CH₂-CH₃), 62.96 (t, 5'-CH₂), 55.81 (q, DMTr OCH₃), 15.41 (q, O-CH₂-CH₃).

2′-O-Methyluridin 30a 2'-O-methyluridine 30a

8 g (14,3 mmol) 26a wurden in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 5 ml einer 10%igen methanolischen Salzsäure versetzt. 8 g (14.3 mmol) 26a were dissolved in 100 ml of methanol and treated at room temperature with 5 ml of a 10% methanolic hydrochloric acid. Das Reaktionsgemisch wurde eingedampft und der Rückstand zwischen Diethylether und Wasser verteilt, die organische Phase noch zweimal mit Wasser extrahiert, die vereinigten wäßrigen Phasen eingedampft und das Produkt mehrmals mit Benzol und Pyridin abgeschleppt. The reaction mixture was evaporated and the residue partitioned between diethyl ether and water, the organic phase extracted twice with water, evaporated, the combined aqueous phases and the product several times towed with benzene and pyridine. Es wurden 3,27 g (93%) 30a als weißer Schaum (DC: Dichlormethan/Methanol=3/1, R f =0,37) erhalten. There were 3.27 g (93%) of 30a as a white foam (TLC: dichloromethane / methanol = 3/1, R f = 0.37) was obtained.
¹H-NMR (DMSO, 90 MHz): δ=8,00 (d, J=8,1 Hz, 1H; 6-H), 6,0 (d, J=5,4 Hz, 1H; 1′-H), 5,78 (d, J=8,1 Hz, 1H; 5-H), 5,08 (s br, 3H; 5′-OH), 3′-OH, NH), 4,25 (ABX-System, J AB =4,5 Hz, J AX =5,4 Hz, 1H; 2′-H), 4,1-3,85 (m, 2H; 3′-H, 4′-H), 3,74 (m, 2H; 5′-H), 3,30 (s, 3H; 2′-OCH₃). ¹H-NMR (DMSO, 90 MHz): δ = 8.00 (d, J = 8.1 Hz, 1H, 6-H), 6.0 (d, J = 5.4 Hz, 1H; 1'- H), 5.78 (d, J = 8.1 Hz, 1H, 5-H), 5.08 (br s, 3H; 5'-OH), 3'-OH, NH), 4.25 ( ABX system, J AB = 4.5 Hz, J AX = 5.4 Hz, 1H; 2'-H), 4.1 to 3.85 (m, 2H, 3'-H, 4'-H) , 3.74 (m, 2H; 5'-H), 3.30 (s, 3H, 2'-OCH₃).
¹³C-NMR (DMSO, 22,5 MHz): δ=163,19 (s, 4-C), 150,62 (s, 2-C), 140,55 (d, 6-C), 101,91 (d, 5-C), 86,15 (d, 1′-C), 85,33 (d, 4′-C), 82,9 (d, 2′-C), 68,43 (d, 3′-C), 60,57 (t, 5′-CH₂), 57,60 (q, OCH₃). ¹³C-NMR (DMSO, 22.5 MHz): δ = 163.19 (s, C-4), 150.62 (s, 2-C), 140.55 (d, C-6), 101.91 (d, 5-C), 86.15 (d, 1'-C), 85.33 (d, 4'-C), 82.9 (d, 2'-C), 68.43 (d, 3'-C), 60.57 (t, 5'-CH₂), 57.60 (q, OCH₃).

2′-On-Butyl-5′-O-MMT-N-cyanoethyluridin 2'-On-butyl-5'-O-MMT-N-cyanoethyluridin

Ansatz: Approach:
2 g (3,51 mmol) 5′-O-MMT-N-Cyanoethyl-uridin 2 g (3.51 mmol) of 5'-O-MMT-N-cyanoethyl-uridine
150 mg (1,1 Äquivalente) NaH 150 mg (1.1 equivalents) of NaH
0,67 ml (1,8 Äquivalente) n-Butylbromid 0.67 ml (1.8 equivalents) of n-butyl bromide

2 g (3,51 mmol) 5′-O-MMT-N-Cyanoethyl-uridin wurde dreimal mit Benzol abgeschleppt, in absolutem DMF gelöst und auf minus 60°C abgekühlt. 2 g (3.51 mmol) of 5'-O-MMT-N-cyanoethyl-uridine was towed three times with benzene, dissolved in absolute DMF and cooled to minus 60 ° C. Dann wurde 150 mg einer 60% NaH-Suspension (1,1 Äquivalente) zugegeben und 30 Minuten bei -50°C gerührt. Then, 150 mg of a 60% NaH suspension (1.1 equivalents) was added and stirred at -50 ° C for 30 minutes. Nun wurde zu der Reaktionslösung langsam 0,52 ml (1,4 Äquivalente) Butylbromid zugetropft. Now to the reaction solution slowly 0.52 ml (1.4 equivalents) butyl bromide was added dropwise. Nach 20 Minuten wurde die Temperatur langsam (innerhalb von drei Stunden) auf 10°C angehoben. After 20 minutes, the temperature was slowly raised (within three hours) at 10 ° C. Die Reaktion wurde mittels DC-Chromatographie verfolgt. The reaction was monitored by TLC chromatography. Es wurden noch 0,15 ml (0,4 Äquivalente) Butylbromid zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, bevor die Reaktion abgebrochen wurde. There are 0.15 ml (0.4 equivalents) of butyl bromide were added and stirred for one hour at room temperature before the reaction was stopped. Die Lösung wurde mit ca. 1 g NH₄Cl versetzt und am Hochvakuum eingedampft. The solution was mixed with about 1 g NH₄Cl and evaporated under high vacuum. Der Rückstand wurde zwischen Dichlormethan und Natriumhydrogencarbonat verteilt, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. The residue was partitioned between dichloromethane and sodium bicarbonate, dried with sodium sulfate and evaporated. Das Rohprodukt wurde gereinigt: The crude product was purified:
Säule: 100 g Kieselgel, Laufmittel: Dichlormethan Column: 100 g of silica gel, eluent: dichloromethane
Ausbeute: 300 mg rein (15% der Theorie) Yield: 300 mg daily (15% of theory)
DC-Laufmittel: Dichlormethan : Aceton 9 : 1) DC eluent: dichloromethane: acetone 9: 1)
R f =0,65 (2′-O-butyl), R f =0,44 (3′-O-butyl). R f = 0.65 (2'-O-butyl), R f = 0.44 (3'-O-butyl).
¹H-NMR (CDCl₂): 8,05 (d, H6); ¹H NMR (CDCl₂): 8.05 (d, H6); 7,5-7,2 (m, MMT); 7.5-7.2 (m, MMT); 6,9-6,7 (m, MMT); 6.9 to 6.7 (m, MMT); 5,95 (d, H1′); 5.95 (d, H1 '); 5,3 (d, H5), 4,6-3,6 (m, H2′, H3′, H4′, OCH₂, NCH₂); 5.3 (d, H5), 4.6 to 3.6 (m, H2 ', H3', H4 ', OCH₂, NCH₂); 3,8 (S, OCH₃, MMT); 3.8 (s, OCH₃, MMT); 3,55 (d, C5′), 2,7 (t, CH₂CN), 1,8-1,2 (m, Butyl-CH₂CH₂ 4H); 3.55 (d, C5 '), 2.7 (t, CH₂CN), 1.8 to 1.2 (m, 4H butyl CH₂CH₂); 0,9 (t, CH₃-Butyl). 0.9 (t, CH₃-butyl).
C-NMR (CDCl₃): 161=(C4); C-NMR (CDCl₃): = 161 (C4); 158,8 (MMT); 158.8 (MMT); 150,3 (C2); 150.3 (C2); 143,9 (MMT); 143.9 (MMT); 143,5 (MMT); 143.5 (MMT); 138,5 (C6); 138.5 (C6); 134,6, 130,4, 128,4, 127,8, 127,3 (MMT), 117,0 (CN); 134.6, 130.4, 128.4, 127.8, 127.3 (MMT), 117.0 (CN); 113,3 (MMT), 101,3 (C5); 113.3 (MMT), 101.3 (C5); 88,1 (MMT); 88.1 (MMT); 87,4 (C1′); 87.4 (C1 '); 83,3 (C4′); 83.3 (C4 '); 62,4 (C2′); 62.4 (C2 '); 70,8 (2′-OCH₂); 70.8 (2'-OCH₂); 68,2 (C3′); 68.2 (C3 '); 61,1 (C5′); 61.1 (C5 '); 55,2 (O-CH₃-MMT); 55.2 (O-CH₃-MMT); 36,2 (N-CH₂); 36.2 (N-CH₂); 31,6 (Butyl-β-CH₂); 31.6 (butyl β-CH₂); 19,2 (Butyl-CH₂); 19.2 (butyl CH₂); 16,1 (CH₂CH); 16.1 (CH₂CH); 13,8 (CH₃ Butyl). 13.8 (CH₃ butyl). Chemische Verschiebung in ppm. Chemical shift in ppm.

Beispiele für die Phosphorylierung Examples of the phosphorylation

Nach dem Trocknen durch Abschleppen mit Pyridin, Toluol und THF werden 1-3 mmol des geschützten Nukleosids 3a, 3a′, 3b, 9a, 9b, 16a, 16b, 18a, 26a, 26b in 25 ml THF (im Fall von 3a, 16a in trockenem DCM) gelöst. After drying by towing with pyridine, toluene and THF are 1-3 mmol of the protected nucleoside 3a, 3a ', 3b, 9a, 9b, 16a, 16b, 18a, 26a, 26b in 25 mL of THF (in the case of Figure 3a, 16a dissolved in dry DCM). Unter Stickstoff wird die Lösung mit 2-3,6 moleq. Under nitrogen, the solution is moleq with 2 to 3.6. N,N-Diisopropylethylamin (Hünig's Base) und anschließend innert 5 Min. mit 1,2 bis 2,4 moleq. Moleq N, N-diisopropylethylamine (Hünig's base) and then within 5 min. With 1.2 to 2.4. 2-Cyanoethoxy-N,N-diisopropylmonochlorphosphoramidit bei Raumtemperatur versetzt. 2-cyanoethoxy-N, N-diisopropylmonochlorphosphoramidit added at room temperature. Die Reaktionsmischung wird dann während 2 Stunden gerührt und durch TLC beobachtet (das Phosphoramidit gibt mit Ninhydrinreagens eine gelbe Farbe). The reaction mixture is then stirred for 2 hours and monitored by TLC (the phosphoramidite is a yellow color with ninhydrin reagent). Wenn dann immer noch Ausgangsmaterial vorhanden ist, werden zusätzliche 0,3 moleq. If there is still starting material is present, additional 0.3 molar equivalents. Phosphorylierungsmittel zugesetzt. Phosphorylating added. Das überschüssige Reagens wird danach durch die Zugabe von 3-5 moleq. The excess reagent is then moleq by the addition of 3-5. Isopropanol, sec.-Butanol oder Methanol gequencht und die Reaktionsmischung wird während einer weiteren Stunde gerührt. Isopropanol, sec-butanol or methanol, and the quenched reaction mixture is stirred for a further hour. Durch Verdampfen im Vakuum wird das Reaktionsgemisch eingeengt und dann mit entgastem Ethylacetat (50 ml) versetzt. By evaporation in vacuo, the reaction mixture is concentrated and then treated with degassed ethyl acetate (50 ml). Die Lösung wird zweimal mit entgaster einmolarer wäßriger Natriumbicarbonatlösung (100 ml) unter Argon bei 0°C extrahiert. The solution is extracted twice with degassed one molar aqueous sodium bicarbonate (100 ml) under argon at 0 ° C. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. The organic phase is dried over sodium sulfate and evaporated. Der Rückstand wird zweimal mit Toluol abgeschleppt und in 3-5 ml entgastem Toluol (im Fall von Pyrimidinen) oder Ethylacetat (im Fall von Purinen) gelöst. The residue is washed twice with toluene and towed in 3-5 ml of degassed toluene (in the case of pyrimidines) or ethyl acetate (in the case of purines). Die Lösung wird tropfenweise trockenem Petrolether (200 ml, Siedebereich 40-60°C) zugesetzt und der farblose Niederschlag wird durch Filtrieren unter Stickstoff abgetrennt. The solution is added dropwise dry petroleum ether (200 ml boiling range 40-60 ° C) and the colorless precipitate is separated by filtration under nitrogen. Nach sorgfältigem Waschen mit Hexan wird das Phosphoramidit im Vakuum getrocknet und in trockenem Acetonitril zu einer 100-mM-Lösung gelöst, die direkt für die Oligonukleotidsynthese verwendet wird. After thorough washing with hexane the phosphoramidite was dried in vacuo and dissolved in dry acetonitrile to give a 100 mM solution, which is directly used for oligonucleotide synthesis. Der Gehalt an mitgefälltem Cyanoethyl-N,N-diisopropyl-H-phosphonat 31 wird durch ¹H und ³¹p-NMR erfaßt, stört jedoch die Kupplungseffizienz nicht (siehe folgende Tabelle). The content of the co-precipitated cyanoethyl-N, N-diisopropyl-H-phosphonate 31 is detected by ¹H and ³¹P NMR but not interfere with the coupling efficiency (see table below).

Tabelle: Phosphorylierung von geschützten 2′-Methyl- und 2′-Ethylnukleosiden Table: phosphorylation of protected 2'-methyl and 2'-Ethylnukleosiden

N⁴-Benzoyl-5′-O-dimethoxytrityl-2′-O-methylcytidin- 3′-O-[(2-cyanomethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] 4a N⁴-benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methylcytidine 3'-O - [(2-cyanomethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite] 4a

¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ=8,6, 8,5 (2d, J=7,5 Hz, 1H; 6-H, 2 diast.), 7,93-6,65 (m, 19H; NH, DMTr), 7,03, 6,95 (2d, J=7,5 Hz, 1H; 5-H, 2 diast.), 6,05, 6,01 (2d, 1H; 1′-H, 2 diast.), 4,72-4,03 (m, 2H; 2′-H, 3′-H), 3,94 (m, 1H; 4′-H), 3,94-3,3 (m, 4H; PO-CH₂, 2× (CH(CH₃)₂), 3,78 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,65 (s, 3H; 2′-OCH₃), 3,53 (m, 2H; 5′-CH₂), 2,68, 2,37 (2t, J=7,3 Hz, 2H; CH₂CN, 2 diast.), 1,4-1,0 (12H; 2× CH(CH₃)₂). ¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ = 8.6, 8.5 (2d, J = 7.5 Hz, 1H, 6-H, 2 diast.), 7.93 to 6.65 (m, 19H; NH, DMTr), 7.03, 6.95 (2d, J = 7.5 Hz, 1H, 5-H, 2 diast), 6.05, 6.01 (2d, 1H;. 1'- H, 2 diast), 4.72 to 4.03 (m, 2H;. 2'-H, 3'-H), 3.94 (m, 1H; 4'-H), 3.94 to 3, 3 (m, 4H, PO-CH₂, 2 × (CH (CH₃) ₂), 3.78 (s, 6H, DMTr OCH₃), 3.65 (s, 3H, 2'-OCH₃), 3.53 ( m, 2H; 5'-CH₂), 2.68, 2.37 (2t, J = 7.3 Hz, 2H, CH₂CN, 2 diast), 1.4 to 1.0 (12H;. 2 × CH ( CH₃) ₂).

N⁴-Benzoyl-2′-O-methyl-5′-O-monomethoxytritylcytidin- 3′-O-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl- phosphoramidit] 4a′ N⁴-benzoyl-2'-O-methyl-5'-O-monomethoxytritylcytidin- 3'-O - [(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] 4a '

TLC: 2 Diastereomere, R f =0,69, 0,55 (Ethylacetat) TLC: 2 diastereoisomers, R f = 0.69, 0.55 (ethyl acetate)
¹H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1 : 1-Mischung von 2 Diastereomeren, das Amidit enthält 3% 31 [d, 6,87 ppm, J=640 Hz, PH; t, 2,75 ppm, J=6 Hz, -CH₂CN]): 9,2 (br s, 1H; NH), 8,51, 8,40 (2d, J=8 Hz, 1H; 6-H, 2 diast.), 7,93 (m, 2H; Bz), 7,7-7,15 (m, 15H; MMTr, Bz), 7,06, 7,04 (2d, J=8 Hz, 1H; 5-H, 2 diast.), 6,9 (m, 2H; MMTr 3,5-H), 5,92 (d, J=5 Hz, 1H; 1′-H), 4,60, 4,46 (2m, 1H; 3′-H, 2 diast.), 4,18 (m, 2H; 4′-H), 3,96 (2d, 1H; 2′-H), 3,8-3,3 (m, 12H; 5′-CH₂, O-CH₂-CH₂CN, 2× CH-(CH₃)₂, MMTr OCH₃ [3,79; s, 3H], 2′-OCH₃ [3,57; s, 3H]), 2,64, 2,51 (2t, J=6 Hz; O-CH₂-CH₂CN 2 diast.), 1,3-0,8 (m, 12H; i-Pr CH₃, 2 diast.) ¹H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1: 1 mixture of 2 diastereomers, which contains 3% amidite 31 [d, 6.87 ppm, J = 640 Hz, PH; t, 2.75 ppm, J = 6 Hz , -CH₂CN]): 9.2 (br s, 1H; NH), 8.51, 8.40 (2d, J = 8 Hz, 1H, 6-H, 2 diast), 7.93 (m,. 2H; Bz), 7.7 to 7.15 (m, 15H, MMTr, Bz), 7.06, 7.04 (2d, J = 8 Hz, 1H;. 5-H, 2 diast), 6, 9 (m, 2H; 3,5-MMTr H), 5.92 (d, J = 5 Hz, 1H; 1'-H), 4.60, 4.46 (2m, 1H; 3'-H, 2 diast), 4.18 (m, 2H;. 4'-H), 3.96 (2d, 1H; 2'-H), 3.8 to 3.3 (m, 12H; 5'-CH₂, O-CH₂-CH₂CN, 2 × CH (CH₃) ₂, OCH₃ MMTr [3.79; s, 3H], 2'-OCH₃ [3.57; s, 3H]), 2.64, 2.51 ( 2t, J = 6 Hz, O-CH₂-CH₂CN 2 diast), 1.3 to 0.8 (m, 12H;. i-Pr CH₃, 2 diast).

³¹P-NMR (101,26 MHz, CD₃CN): 149,75, 149,05 (2 diast.); ³¹P NMR (101.26 MHz, CD₃CN): 149.75, 149.05 (2 diast.); 31: 13,71 31: 13.71

N⁴-Benzoyl-5′-O-dimethoxytrityl-2′-O-ethylcytidin-3′- O-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] 4b N⁴-benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-ethylcytidin-3'-O - [(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite] 4b

TLC: 2 Diastereomere R f =0,51, 0,61 (DCM/Ethylacetat 1 : 1) TLC: R f = 0.51 2 diastereomers, 0.61 (DCM / ethyl acetate 1: 1)
1H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1 : 1.1 Mischung von 2 Diastereomeren, das Amidit enthält 8% Hexan [m, 0,86 ppm] und 7% 31 [d, 6,87 ppm, J=635 Hz, PH; t, 2,76 ppm, J=6 Hz, -CH₂CN]): 9,25 (s, br, 1H; 4-NH-Bz), 8,54, 8,44 (2d, J=8 Hz, 1H; 6-H) 2 diast.), 7,95 (d, J=8 Hz, 2H; Bz 2,6-H), 7,7-7,2 (m, 12H; DMTr, Bz 3,4,5-H), 7,06, 7,03 (2d, J=8 Hz, 1H; 5-H, 2 diast.), 6,90 (m 4H; DMTr 3,5-H), 5,89 (d, J=4 Hz, 1H; 1′-H), 4,61, 4,47 (2m, 1H; 3′-H, 2 diast.), 4,19* (m, 1H; 4′-H), 4,06* (m 1H; 2′-H), 4,0-3,4 (m, 14H; DMTr 2× -OCH₃ [3,79 s, 6H, 2′-OCH₂-, 2× N-CH, PO-CH₂-, 5′-CH₂), 2,64, 2,52 (2t, J=6 Hz, 2H; -CH₂CN, 2 diast.), 1,3-1,0 (m, 15H; 2′-OCH₂CH₃, 2× CH(CH₃)₂) 1H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1: 1.1 mixture of two diastereomers, which contains 8% hexane amidite [m, 0.86 ppm] and 7% 31 [d, 6.87 ppm, J = 635 Hz, PH; t, 2.76 ppm, J = 6 Hz, -CH₂CN]): 9.25 (s, br, 1H; 4-NH-Bz), 8.54, 8.44 (2d, J = 8 Hz, 1H ; 6-H) 2 diast), 7.95 (d, J = 8 Hz, 2H;. 2.6 Bz-H), 7.7 to 7.2 (m, 12H, DMTr, 3.4 Bz, 5-H), 7.06, 7.03 (2d, J = 8 Hz, 1H, 5-H, 2 diast), 6.90 (m 4H;. DMTr 3,5-H), 5.89 ( d, J = 4 Hz, 1H; 1'-H), 4.61, 4.47 (2m, 1H; 3'-H, 2 diast), 4.19 * (m, 1H;. 4'-H ), 4.06 * (m 1H; 2'-H), 4.0 to 3.4 (m, 14H; DMTr 2 × -OCH₃ [3.79 s, 6H, 2'-OCH₂-, 2 × N -CH, PO-CH₂-, 5'-CH₂), 2.64, 2.52 (2t, J = 6 Hz, 2H, -CH₂CN, 2 diast), 1.3 to 1.0 (m, 15H. ; 2'-OCH₂CH₃, 2 × CH (CH₃) ₂)
³¹P-NMR (CD₃CN, 101,26 MHz): 149,64, 148,77 (2 diast.); ³¹P NMR (CD₃CN, 101.26 MHz): 149.64, 148.77, (2 diast.) 31: 13,72 31: 13.72

5′-O-Dimethoxytrityl-2′-O-methyl-N⁶-(phenoxyacetyl)- adenosin-3′-O-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl- phosphoramidit] 10a 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-N⁶- (phenoxyacetyl) - adenosine-3'-O - [(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] 10a

TLC: 2 Diastereomere R f =0,63, 0,56 (DCM/ethylacetat 1 : 1) TLC: R f = 0.63 2 diastereomers, 0.56 (DCM / ethyl acetate 1: 1)
¹H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1 : 1-Mischung von 2 Diastereomeren, das Amidit enthält 1% 31 [d, 6,87 ppm, J=640 Hz, PH; t, 2,75 ppm, J=6 Hz, -CH₂CN]): 9,3 (br s, 1H; NH), 8,59, 8,58 (2s, 1H; 2-H, 2 diast.), 8,31, 8,29 (2s, 1H; 8-H, 2 diast.), 7,45-7,15 (m, 11H, MMTr, PhOAc 2,6-H), 7,03 (m, 3H; PhOAc 3,4,5-H), 6,82 (m, 4H; DMTr 3,5-H), 6,11 (d, J=5 Hz, 1H; 1′-H), 4,98 (s, 2H; PhOAc-CH₂), 4,80 (m, 1H; 2′-H), 4,69 (m, 1H; 3′-H), 4,30 (m, 1H; 4′-H), 3,8-3,3 (m, 15H; 5′-CH₂, O-CH₂-CH₂CN, 2× CH-(CH₃)₂, 2× DMTr OCH₃ [3.74; s, 6H], 2′-OCH₃ [3,46, 3,44; 2s, 3H, 2 diast.]), 2,66, 2,51 (2t, J=6 Hz; O-CH₂-CH₂CN, 2 diast.), 1,3-0,8 (m, 12H; i-Pr CH₃, 2 diast.) ¹H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1: 1 mixture of 2 diastereomers, which contains 1% amidite 31 [d, 6.87 ppm, J = 640 Hz, PH; t, 2.75 ppm, J = 6 Hz , -CH₂CN]): 9.3 (br s, 1H; NH), 8.59, 8.58 (2s, 1H; 2-H, 2 diast), 8.31, 8.29 (2s, 1H. ; 8-H, 2 diast), 7.45-7.15 (m, 11H, MMTr, PhOAc 2,6-H), 7.03 (m, 3H;. PhOAc 3,4,5-H), 6.82 (m, 4H, DMTr 3,5-H), 6.11 (d, J = 5 Hz, 1H; 1'-H), 4.98 (s, 2H; PhOAc-CH₂), 4, 80 (m, 1H; 2'-H), 4.69 (m, 1H; 3'-H), 4.30 (m, 1H; 4'-H), 3.8 to 3.3 (m, 15H; 5'-CH₂, O-CH₂-CH₂CN, 2 × CH (CH₃) ₂, 2 × OCH₃ DMTr [3.74; s, 6H], 2'-OCH₃ [3.46, 3.44; 2s, 3H , 2 diast]), 2.66, 2.51 (2t, J = 6 Hz,. O-CH₂-CH₂CN, 2 diast), 1.3 to 0.8 (m, 12H;. i-Pr CH₃, 2 diast.)
³¹P-NMR (101,26 MHz, CD₃CN): 149,88, 149,57 (2 diast.); ³¹P NMR (101.26 MHz, CD₃CN): 149.88, 149.57 (2 diast.); 31: 13,71 31: 13.71

5′-O-Dimethoxytrityl-2′-O-ethyl-N⁶-(phenoxyacetyl)- adenosin-3′-O-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl- phosphoramidit] 10b 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-ethyl-N⁶- (phenoxyacetyl) - adenosine-3'-O - [(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] 10b

TLC: 2 Diastereomere R f =0,74, 0,81 (DCM/Ethylacetat 1 : 1) TLC: R f = 0.74 2 diastereomers, 0.81 (DCM / ethyl acetate 1: 1)
¹H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1 : 1-Mischung von 2 Diastereomeren, das Amidit enthält 1,5% 31 [d, 6,87 ppm, J=635 Hz, PH; t, 2,75 ppm, J=6 Hz, -CH₂CN]: 9,3 (s br, N6-NH), 8,59, 8,57 (2s, 1H; 2-H, 2 diast.), 8,30, 8,28 (2s, 1H; 8-H, 2 diast.), 7,5-7,2 (m, 11H; DMTr, PhOAc 2,6-H), 7,03 (m, 3H, PhOAc 3,4,5-H), 6,81 (m, 4H; DMTr, 3,5-H), 6,10 (d, J=4,5 Hz, 1H; 1′-H), 4,97 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,78 (m, 1H; 2′-H), 4,71 (m, 1H; 3′-H), 4,30 (m, 1H; 4′-H), 3,9-3,5 (m, 12H; DMTr 2× -OCH₃ [3,75 s, 6H], 2′-OCH₂-, 2× N-CH, PO-CH₂-), 3,38 (m, 2H; 5′-CH₂), 2,67, 2,48 (2t, J=6 Hz, 2H; -CH₂CN, 2 diast.), 1,18, 1,16 (2d, J=7 Hz, 12H; 2× CH(CH₃)₂), 1,10 (t, J=7 Hz, 3H; 2′-OCH₂CH₃) ¹H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1: 1 mixture of 2 diastereomers, which contains 1.5% amidite 31 [d, 6.87 ppm, J = 635 Hz, PH; t, 2.75 ppm, J = 6 Hz, -CH₂CN]: 9.3 (s br, N6-NH), 8.59, 8.57 (2s, 1H; 2-H, 2 diast.), 8.30, 8.28 (2s, 1H; 8-H, 2 diast), 7.5-7.2 (m, 11H;. DMTr, PhOAc 2,6-H), 7.03 (m, 3H, 3,4,5-H PhOAc) , 6.81 (m, 4H, DMTr, 3,5-H), 6.10 (d, J = 4.5 Hz, 1H; 1'-H), 4.97 (s, 2H; PhOAc CH₂) , 4.78 (m, 1H; 2'-H), 4.71 (m, 1H; 3'-H), 4.30 (m, 1H; 4'-H), 3.9 to 3.5 (m, 12H, -OCH₃ DMTr 2 × [3,75 s, 6H], 2'-OCH₂-, 2 x N-CH, PO-CH₂-), 3.38 (m, 2H; 5'-CH₂) , 2.67, 2.48 (2t, J = 6 Hz, 2H, -CH₂CN, 2 diast.), 1.18, 1.16 (2d, J = 7 Hz, 12H, 2 × CH (CH₃) ₂ ), 1.10 (t, J = 7 Hz, 3H, 2'-OCH₂CH₃)
³¹P-NMR (CD₃CN, 101,26 MHz): 149,71, 149,32 (2 diast.); ³¹P NMR (CD₃CN, 101.26 MHz): 149.71, 149.32, (2 diast.) 31: 13,72 31: 13.72

5′-O-Dimethoxytrityl-2′-O-methyl-O⁶-[2-(4-nitrophenyl)- ethyl]-N²-(phenoxyacetyl)guanosin-3′-O-[(2- cyanomethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] 17a 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-O⁶- [2- (4-nitrophenyl) - ethyl] -N (phenoxyacetyl) guanosine-3'-O - [(2-cyanomethyl) -N, N -diisopropylphosphoramidit] 17a

¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ=8,5 (s br, 1H; NH), 8,12 (d, J=9 Hz, 2H; NPE arom.), 8,02, 7,96 (2s, 1H; 8-H, 2 diast.), 7,5 (d, J=9 Hz, 2H; NPE arom.), 7,5-6,6 (m, 18H; DMTr, PhOAc), 6,1 (m, 1H; 1′-H), 4,85 (t, J=6,4 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4,68 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,7-4,0 (m, 3H; 2′-H, 3′-H, 4′-H), 4,0-3,18 (m, 8H; 5′-CH₂, NPE CH₂-Ph, 2×CHCCH₃)₂), PO-CH₂), 3,76 (s, 6H; DMTr OCH₃), 3,5 (s, 3H; 2′-OCH₃), 2,62, 2,45 (2t, J=6,3 Hz, CH₂CN, 2 diast.), 1,17, 1,04 (2d, J=7,2 Hz, 12H; 2× CH(CH₃)₂, 2 diast.) ¹H-NMR (CDCl₃, 90 MHz): δ = 8.5 (s br, 1H, NH), 8.12 (d, J = 9 Hz, 2H; NPE arom.), 8.02, 7.96 ( 2s, 1H; 8-H, 2 diast), 7.5 (d, J = 9 Hz, 2H;. NPE arom), 7.5 to 6.6 (m, 18H;. DMTr, PhOAc), 6, 1 (m, 1H; 1'-H), 4.85 (t, J = 6.4 Hz, 2H; NPE O-CH₂), 4.68 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4.7 to 4 , 0 (m, 3H, 2'-H, 3'-H, 4'-H), 4.0 to 3.18 (m, 8H, 5 'CH₂, NPE CH₂-Ph, 2 × CHCCH₃) ₂ ), PO-CH₂), 3.76 (s, 6H, DMTr OCH₃), 3.5 (s, 3H, 2'-OCH₃), 2.62, 2.45 (2t, J = 6.3 Hz, CH₂CN, 2 diast), 1.17, 1.04 (2d, J = 7.2 Hz, 12H, 2 × CH (CH₃). ₂, 2 diast).

5′-O-Dimethoxytrityl-2′-O-ethyl-O⁶-[2-(4-nitrophenyl)- ethyl]-N²-(phenoxyacetyl)guanosin-3′-O- [(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] 17b 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-ethyl-O⁶- [2- (4-nitrophenyl) - ethyl] -N (phenoxyacetyl) guanosine-3'-O- [(2-cyanoethyl) -N, N -diisopropylphosphoramidit] 17b

TLC: R f =0,87 (DCM/Ethylacetat 1 : 1) TLC: R f = 0.87 (DCM / ethyl acetate 1: 1)
¹H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1 : 1-Mischung von 2 Diastereomeren, das Amidit enthält 2% Hexan [m, 0,86 ppm] und 2% 31 [d, 6,87 ppm, J=635 Hz, PH; t, 2,75 ppm, J=6 Hz, -CH₂CN]: 8,79, 8,77 (2s, 1H; 2-NH, 2 diast.), 8,14 (d, J=9 Hz, 2H; PhNO₂ 3,5-H), 8,07, 8,04 (2s, 1H; 8-H, 2 diast.), 7,57 (d, J=9 Hz, 2H; PhNO₂ 2,6-H), 7,45-7,15 (m, 11H; DMTr, PhOAc, 2,6-H), 6,99 (m, 3H, PhOAc 3,4,5-H), 6,78 (m, 4H; DMTr 3,5-H), 6,02 (d, J=5 Hz, 1H; 1′-H), 4,91 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4,84 (t, J=7 Hz, 2H; O⁶-CH₂), 4,73 (m, 1H; 2′-H), 4,58 (m, 1H; 3′-H), 4,28 (m, 1H; 4′-H), 3,8-3,25 (m, 16H; DMTr 2× -OCH₃ [3,73 s, 6H], 2′-OCH₂-, 2× N-CH, PO-CH₂-, 5′-CH₂, NPE CH₂Ph[3,32 t, J=7 Hz, 2H], 2,63, 2,46 (2t, J=6 Hz, 2H; -CH₂CN 2 diast.), 1,2-1,0 (m, 15H; 2′-OCH₂CH₃, 2× CH(CH₃)₂ ¹H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1: 1 mixture of 2 diastereomers, which contains 2% amidite hexane [m, 0.86 ppm], and 2% 31 [d, 6.87 ppm, J = 635 Hz, PH t, 2.75 ppm, J = 6 Hz, -CH₂CN]: (. 2s, 1H; NH-2, 2 diast), 8.79, 8.77, 8.14 (d, J = 9 Hz, 2H ; PhNO₂ 3,5-H), 8.07, 8.04 (2s, 1H; 8-H, 2 diast), 7.57 (d, J = 9 Hz, 2H;. PhNO₂ 2,6-H) , 7.45-7.15 (m, 11H, DMTr, PhOAc, 2,6-H), 6.99 (m, 3H, PhOAc 3,4,5-H), 6.78 (m, 4H; DMTr 3,5-H), 6.02 (d, J = 5 Hz, 1H; 1'-H), 4.91 (s, 2H; PhOAc CH₂), 4.84 (t, J = 7 Hz, 2H; O⁶-CH₂), 4.73 (m, 1H; 2'-H), 4.58 (m, 1H; 3'-H), 4.28 (m, 1H; 4'-H), 3 , 8 to 3.25 (m, 16H, -OCH₃ DMTr 2 × [3,73 s, 6H], 2'-OCH₂-, 2 x N-CH, PO-CH₂-, 5'-CH₂, NPE CH₂Ph [ 3.32 t, J = 7 Hz, 2H], 2.63, 2.46 (2t, J = 6 Hz, 2H, -CH₂CN 2 diast.), 1.2 to 1.0 (m, 15H, 2 '-OCH₂CH₃, 2 × CH (CH₃) ₂
³¹P-NMR (CD₃CN, 101,26 MHz): 149,71, 149,49 (2 diast.); ³¹P NMR (CD₃CN, 101.26 MHz): 149.71, 149.49, (2 diast.) 31: 13,72 31: 13.72

5′-O-Dimethoxytrityl-2′-O-methyl-N²-(phenoxyacetyl)- guanosin-3′-O-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl- phosphoramidit] 18a 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-N²- (phenoxyacetyl) - guanosine-3'-O - [(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] 18a

TLC: R f =0,5 (Aceton/DCM 3 : 7) TLC: R f = 0.5 (acetone / DCM 3: 7)
¹H-NMR (250 MHz), CD₃CN; ¹H-NMR (250 MHz), CD₃CN; 1 :1-Mischung von 2 Diastereomeren, das Amidit enthält 2% O-2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylamino-H-phosphonat 31 [d, 6,87 ppm, J=640 Hz, PH; 1: 1 mixture of 2 diastereomers, which contains 2% amidite O-2-cyanoethyl-N, N-diisopropylamino-H-phosphonate 31 [d, 6.87 ppm, J = 640 Hz, PH; t, 2,75 ppm, J=6 Hz, -CH₂CN]): 7,89, 7,86 (2s, 1H; 8-H, 2 diast.), 7,5-7,1 (m, 11H; DMTr, PhOAc 2,6-H), 7,1-7,0 (m, 3H; PhOAc 3,4,5-H), 6,85-8,7 (m, 4H; DMTr 3,5-H), 5,94 (m, 1H; 1′-H), 4,74 (s, 2H; PhOAc-CH₂), 4,55-4,45 (m, 2H; 2′, 3′-H), 4,28 (m, 1H; 4′-H), 3,8-3,3 (m, 15H; 2× DMTr OCH₃ [3,73; s, 6H], 5′-CH₂, O-CH₂-CH₂CN, 2× CH-(CH₃)₂, 2′-OCH₃ [2 diast., 3,44, 3,42; 2s, 3H]), 2,66, 2,47 (2t, J=6 Hz; O-CH₂-CH₂CN, 2 diast.), 1,3-1,0 (m, 12H; i-Pr CH₃, 2 diast.) t, 2.75 ppm, J = 6 Hz, -CH₂CN]): 7.89, 7.86 (2s, 1H; 8-H, 2 diast), 7.5-7.1 (m, 11H;. DMTr, PhOAc 2,6-H), 7.1 to 7.0 (m, 3H; PhOAc 3,4,5-H), 6.85 to 8.7 (m, 4H, DMTr H 3,5- ), 5.94 (m, 1H; 1'-H), 4.74 (s, 2H; PhOAc-CH₂), 4.55 to 4.45 (m, 2H, 2 ', 3'-H), 4.28 (m, 1H; 4'-H), 3.8 to 3.3 (m, 15H, 2 × OCH₃ DMTr [3.73; s, 6H], 5'-CH₂, O-CH₂-CH₂CN , 2 × CH (CH₃) ₂, 2'-OCH₃ [2 diast, 3.44, 3.42;. 2s, 3H]), 2.66, 2.47 (2t, J = 6 Hz; O- CH₂-CH₂CN, 2 diast), 1.3 to 1.0 (m, 12H;. i-Pr CH₃, 2 diast).
³¹P-NMR (101,26 MHz, CD₃CN): 149,97, 149,86 (2 diast.); ³¹P NMR (101.26 MHz, CD₃CN): 149.97, 149.86 (2 diast.); O-(2-Cyanoethyl)-N,N-diisopropyl- amino-H-phosphonat 31: 13,71 O- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl amino-H-phosphonate 31: 13.71

2′-O-Methyl-5′-O-monomethoxytrityluridin-3′-O-[(2- cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] 27a 2'-O-methyl-5'-O-monomethoxytrityl-3'-O - [(2- cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite] 27a

TLC: 2 diastereomers R f =0,76, 0,70 (Ethylacetat/DCM 1 : 1) TLC: 2 diastereomer R f = 0.76, 0.70 (ethyl acetate / DCM 1: 1)
¹H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1 : 1-Mischung von 2 Diastereomeren, das Amidit enthält 3% 31 [d, 6,87 ppm, J=638 Hz, PH; t, 2,75 ppm, J=6 Hz, -CH₂CN]): 8,9 (br s, 1H; NH), 7,82, 7,69 (2d, J=8 Hz, 1H; 6-H, 2 diast.), 7,5-7,2 (m, 12H, MMTr), 6,9 (m, 2H; MMTr), 5,87 (d, J=5 Hz, 1H; 1′-H), 5,21, 5,18 (2d, J=8 Hz, 1H; 5-H, 2 diast.), 4,52 4,42 (2m, 1H; 3′-H, 2 diast.), 4,12 (m, 1H; 4′-H), 3,93 (m, 1H; 2′-H), 3,85-3,3 (m, 12H; 5′-CH₂, O-CH₂-CH₂CN, 2× CH-(CH₃)₂, MMTr OCH₃ [3,77; s, 3H], 2′-OCH₃ [3,50, 3,48; 2s, 3H, 2 diast.]), 2,67, 2,51 (2t, J=6 Hz; O-CH₂-CH₂CN 2 diast.), 1,3-1,0 (m, 12H; i-Pr CH₃, 2 diast.) ¹H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1: 1 mixture of 2 diastereomers, which contains 3% amidite 31 [d, 6.87 ppm, J = 638 Hz, PH; t, 2.75 ppm, J = 6 Hz , -CH₂CN]): 8.9 (br s, 1H; NH), 7.82, 7.69 (2d, J = 8 Hz, 1H, 6-H, 2 diast), from 7.5 to 7. 2 (m, 12H, MMTr), 6.9 (m, 2H, MMTr), 5.87 (d, J = 5 Hz, 1H; 1'-H), 5.21, 5.18 (2d, J = 8 Hz, 1H, 5-H, 2 diast), 4.52 4.42 (2m, 1H;. 3'-H, 2 diast), 4.12 (m, 1H;. 4'-H), 3.93 (m, 1H; 2'-H), 3.85 to 3.3 (m, 12H; 5'-CH₂, O-CH₂-CH₂CN, 2 × CH (CH₃) ₂, OCH₃ MMTr [3 , 77; s, 3H], 2'-OCH₃ [3.50, 3.48; 2s, 3H, 2 diast]), 2.67, 2.51 (2t, J = 6 Hz,. O-CH₂- CH₂CN 2 diast), 1.3 to 1.0 (m, 12H;. i-Pr CH₃, 2 diast).
³¹P-NMR (101,26 MHz, CD₃CN): 149,75, 149,41 (2 diast.); ³¹P NMR (101.26 MHz, CD₃CN): 149.75, 149.41 (2 diast.); 31: 13,70 31: 13,70

5′-O-Dimethoxytrityl-2′-O-ethyluridin-3′-O-[(2- cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] 27b 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-ethyluridine, 3'-O - [(2- cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite] 27b

TLC: R f =0,83 (Ethylacetat) TLC: R f = 0.83 (ethyl acetate)
¹H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1 : 1.1 Mischung von 2 Diastereomeren, das Amidit enthält 5% Hexan [m, 0,86 ppm] und 1,6% 31 [d, 6,86 ppm, J=635 Hz, PH; t, 2,75 ppm, J=6 Hz, -CH₂CN]: 9,0 (s, br, 1H; 3-NH), 7,82, 7,73 (2d, J=8 Hz, 1H; 6-H, 2 diast.), 7,5-7,2 (m, 9H; DMTr), 6,88 (m, 4H; DMTr 3,5-H), 5,85, 5,83 (2d, J=4 Hz, 2 diast.), 4,50, 4,40 (2m, 1H; 3′-H, 2 diast.), 4,14* (m, 1H; 4′-H), 4,05* (m, 1H; 2′-H), 3,8-3,5 (m, 12H; DMTr 2× -OCH₃ [3,77 s, 6H], 2′-OCH₂-, 2× N-CH, PO-CH₂-), 3,41 (m, 2H; 5′-CH₂), 2,67, 2,52 (2t, J=6 Hz, 2H; -CH₂CN, 2 diast.), 1,25-1,0 (m, 15H; 2′-OCH₂CH₃, 2× CH(CH₃)₂) ¹H-NMR (250 MHz, CD₃CN; 1: 1.1 mixture of two diastereomers, which contains 5% hexane amidite [m, 0.86 ppm] and 1.6% of 31 [d, 6.86 ppm, J = 635 Hz, PH; t, 2.75 ppm, J = 6 Hz, -CH₂CN]: 9.0 (s, br, 1H, 3-NH), 7.82, 7.73 (2d, J = 8 Hz, 1H; 6-H, 2 diast), 7.5-7.2 (m, 9H;. DMTr), 6.88 (m, 4H, DMTr 3,5-H), 5.85, 5.83 (2d, J = 4 Hz, 2 diast), 4.50, 4.40 (2m, 1H;. 3'-H, 2 diast), 4.14 * (m, 1H;. 4'-H), 4.05 * (m, 1H; 2'-H), 3.8-3.5 (m, 12H, -OCH₃ DMTr 2 × [3,77 s, 6H], 2'-OCH₂-, 2 x N-CH, PO-CH₂-), 3.41 (m, 2H; 5'-CH₂), 2.67, 2.52 (2t, J = 6 Hz, 2H, -CH₂CN, 2 diast), from 1.25 to 1. , 0 (m, 15H, 2'-OCH₂CH₃, 2 × CH (CH₃) ₂)
³¹P-NMR (CD₃CN, 101,26 MHz): 149,57, 149,18 (2 diast.); ³¹P NMR (CD₃CN, 101.26 MHz): 149.57, 149.18, (2 diast.) 31: 13,72 31: 13.72

Beispiele für modifizierte Oligoribonukleotide Examples of modified oligoribonucleotides 3′-Aminomodifizierte 2′-O-Methyloligoribonukleotide 3'-Amino-modified 2'-O-Methyloligoribonukleotide

Die am 3′-Ende mit (3-Amino-2-hydroxypropyl)phosphat modifizierten 19mer 2′-O-methylierten Oligoribonukleotide können mit einem ABI 380 B DNA-Synthesizer (Applied Biosystems) synthetisiert werden, wobei ein modifizierter LCAA-CPG (controlled pore glass) Feststoffträger verwendet wird, der 1-O-DMTr, 3-N-[Fluorenyl(methoxycarbonyl)]aminopropandiolgruppen (3′-Amin-ON CPG, Clontech) trägt. The 3 'end with (3-amino-2-hydroxypropyl) phosphate modified 19mer 2'-O-methylated oligoribonucleotides can with an ABI 380 B DNA synthesizer (Applied Biosystems) can be synthesized using a modified LCAA-CPG (controlled pore glass) solid carrier is used, the aminopropandiolgruppen bears 1-O-DMTr, 3-N- [fluorenyl (methoxycarbonyl)] (3'-Amine-ON CPG, Clontech). 2′-O- Methylnukleosid-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl- phosphoramidite mit folgenden Schutzgruppen werden verwendet: 2'-O- Methylnukleosid- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl- phosphoramidites having the following protecting groups are used:

A: A:
N⁶-Phenoxyacetyl N⁶-Phenoxyacetyl
5′-O-DMTr 5'-O-DMTr
C: C:
N⁴-Benzoyl N⁴-benzoyl
5′-O-MMTr 5'-O-MMTr
G: G:
N²-Phenoxyacetyl N² Phenoxyacetyl
5′-O-DMTr 5'-O-DMTr
U: U:
5′-O-MMTr 5'-O-MMTr

Standard DNA-Syntheseverfahren mit erhöhter Kopplungszeit (5 Min. statt 3 Min.) wird verwendet. Standard DNA synthesis method with increased coupling times (5 min., Instead of 3 min.) Is used. Das Oligonukleotid wird durch Behandeln mit 25%iger wäßriger NH₄OH-Lösung (15 h bei 55°C) von Schutzgruppen befreit und vom Träger getrennt. The oligonucleotide is deprotected and separated from the support by treatment with 25% aqueous NH₄OH solution (at 55 ° C for 15 h). Nach der abschließenden De-Tritylation wird das rohe Oligonukleotid durch Fällen mit Ethanol gereinigt. After the final de-Tritylation the crude oligonucleotide was purified by precipitation with ethanol.

Quantitative Bestimmung: Quantitative determination:
Die Oligonukleotide werden durch die UV-Absorption bei 260 nm quantitativ bestimmt, falls erforderlich wird der Wert durch Subtraktion der entsprechenden UV-Absorption des FITC, Dithiopyridin oder Puffers bei 260 nm korrigiert. The oligonucleotides are quantitatively determined by the UV absorption at 260 nm, if necessary, the value is corrected by subtracting the corresponding UV absorbance of the FITC, dithiopyridine or buffer at 260 nm. Der Wert der Dithiopyridin-Linker in modifiziertem Oligonukleotiden wird nach Reduktion einer Teilmenge mit Dithiotreitol durch Absorptionsmessung von freigesetztem Pyridin-2-thion bei 343 nm (molarer Extinktionskoeffizient 8,08 × 10³M⁻cm⁻¹) bestimmt. The value of the dithiopyridine linker in modified oligonucleotides after reduction of a subset with dithiothreitol by measuring the absorption of released pyridine-2-thione at 343 nm (molar extinction coefficient of 8.08 × 10³M⁻cm⁻¹).

Der Fluoresceingehalt wird spektrophotometrisch durch Absorption bei 495 nm bestimmt. The Fluoresceingehalt is determined spectrophotometrically by absorbance at 495 nm. Der Gehalt an PMDBD (Heinzerbase, Fluka) wird durch UV-Absorption bei 219 nm bestimmt; The content of PMDBD (Heinzerbase, Fluka) is determined by UV absorption at 219 nm; 1 µmol (als Hydrochlorid, in Wasser) entspricht ungefähr 16,3 AU₂₁₉. 1 .mu.mol (as hydrochloride in water) is approximately equal to 16.3 AU₂₁₉.

3′-Fluoreszeinmodifizierte 2′-O-Methyloligoribonukleotide 3'-2'-O-Fluoreszeinmodifizierte Methyloligoribonukleotide

Markieren mit FITC kann ähnlich der für 5′-aminomodifizierte Oligodeoxyribonukleotide beschriebenen Methode (Agrawal, S., Christodoulon, C., and Gait, MJ, (1986) Nucleic Acids Res. 14, 6227-45) erfolgen. Labeling with FITC can be made similar to the method (Agrawal, S., Christodoulon, C., and Gait, MJ, (1986) Nucleic Acids Res. 14, 6227-45) for 5'-amino-modified oligodeoxyribonucleotides described. Eine Lösung von 10,4 AU₂₆₀ (ca. 350 µg; 52 nmol) 2′-O-Methyloligoribonukleotid 19mer mit der Sequenz 5′-GAG CAC ACU UCA UGC AGUG-3′-modifiziert mit (3-Amino-2-hydroxypropyl)phosphat am 3′-Ende in 100 µl Wasser wird mit einer Lösung von 2,8 mg (7,2 µmol, 150 Äquivalente) Fluoreszeinisothiocyanat (Sigma) in 300 µl 1M wäßriger Natriumbicarbonatlösung (pH 8,5) für 4 h bei Raumtemperatur behandelt. A solution of 10.4 AU₂₆₀ (about 350 ug; 52 nmol) of 2'-O-Methyloligoribonukleotid 19mer with the sequence 5'-GAG CAC ACU UCA UGC AGUG-3'-modified with (3-amino-2-hydroxypropyl) phosphate at the 3 'end in 100 .mu.l of water is added a solution of 2.8 mg (7.2 .mu.mol, 150 equivalents) fluorescein isothiocyanate (Sigma) in 300 .mu.l 1M aqueous sodium bicarbonate (pH 8.5) for 4 h at room temperature, treated , Die Mischung wird einer Gelfiltration unterworfen (Sephadex G 25-PD 10, Pharmacia) mit Wasser als Eluent. The mixture was subjected to gel filtration (Sephadex G-25 PD 10, Pharmacia) with water as eluent. Das erste Eluat, das Oligoribonukleotidfraktionen enthält, wird im Vakuum (eventuell mit Speedvac, Savant) eingedampft, der Rückstand wird in 200 µl eines 100 mM Triethylammoniumacetatpuffers (pH 7) aufgenommen. The first eluate containing Oligoribonukleotidfraktionen is, (possibly with Speedvac, Savant) evaporated in vacuo, the residue is taken up in 200 ul of a 100 mM Triethylammoniumacetatpuffers (pH 7). Das Auftrennen erfolgt durch RP-HPLC (Nukleosil RP-18, 250×4 mm; The separation is carried out by RP-HPLC (Nucleosil RP-18, 250 x 4 mm;
Puffer A: 100 mM Triethylammoniumacetat, pH 7 Buffer A: 100 mM triethylammonium acetate, pH 7
Puffer B: Acetonitril, Gradientenelution: 0-50 Min., 0-50% B, Nachweis durch UV-Absorption bei 260 nm und Fluoreszenznachweis bei 490 nm Excitation, 520 nm Emission) ergibt 3,3 AU₂₆₀ (32%) Oligoribonukleotid in nicht FITC-modifizierter Form bei einer Gradientenkonzentration von ungefähr 18-19% Acetonitril, und 4,1 AU₂₆₀ (auch 1,1 AU₄₉₆; der AU₂₆₀-Wert entspricht ungefähr 3,75 AU₂₆₀ unmarkierten Oligoribonukleotid, 36%) an fluoresceinmodifiziertem Oligoribonukleotid bei einer Gradientenkonzentration von 19-20,5% Acetonitril. Buffer B: acetonitrile, gradient elution:. 0-50 min, 0-50% B, detection by UV absorption at 260 nm and fluorescence detection at 490 nm excitation, 520 nm emission) yields 3.3 AU₂₆₀ (32%) in non-oligoribonucleotide FITC-modified form, at a gradient concentration of approximately 18-19% acetonitrile and 4.1 AU₂₆₀ (also 1.1 AU₄₉₆; AU₂₆₀ the value corresponds to about 3.75 AU₂₆₀ unlabeled oligoribonucleotide, 36%) of the fluorescein-oligoribonucleotide at a gradient concentration of 19 to 20.5% acetonitrile.

Synthese von thiocholesterinmodifizierten Oligoribonukleotiden Synthesis of oligoribonucleotides thiocholesterinmodifizierten

a) Modifikation mit Dithiopyridingruppen: a) modification with dithiopyridine:
Eine Lösung von 14,1 AU₂₆₀ (ungefähr 450 µg; 67 nmol) von 2-O-Methyloligoribonukleotid 19mer mit der Sequenz 5′-CUA AAA GAG CUG UAA CACU-3′ modifiziert mit (3-Amino-2-hydroxypropyl)phosphat am 3′-Ende, in 0,75 ml 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,9) wird mit einer Lösung von 4,2 mg (13,4 µmol, 200 Äquivalente) N-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)propionat (SPDP, Pharmacia) in 300 µl Ethanol während 4 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. A solution of 14.1 AU₂₆₀ (about 450 ug; 67 nmol) of 2-O-Methyloligoribonukleotid 19mer with the sequence 5'-AAA GAG CUA CUG UAA CACU-3 'modified with (3-amino-2-hydroxypropyl) phosphate at 3'-end, in 0.75 ml of 50 mM HEPES buffer (pH 7.9) is added a solution of 4.2 mg (13.4 .mu.mol, 200 equivalents) of N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP, Pharmacia) treated in 300 .mu.l of ethanol for 4 hours at room temperature. Die Mischung wird einer Gelfiltration unterworfen (Sephadex G25-PD10, Pharmacia) mit 20 mM HEPES-Puffer (pH 7,3) als Eluent. The mixture is subjected to gel filtration (Sephadex G25 PD10, Pharmacia) with 20 mM HEPES buffer (pH 7.3) as the eluent. Das erste Eluat, das Oligoribonukleotid enthaltende Fraktionen enthält, wird im Vakuum eingedampft (Speedvac, Savant), aufgelöst in 200 µl Wasser, und weiter durch Reverse-Phase-HPLC gereinigt. The first eluate containing oligoribonucleotide containing fractions, evaporated in vacuo (Speedvac, Savant), dissolved in 200 .mu.l of water, and further purified by reverse phase HPLC. (Nukleosil RP-18, 250-4 mm; (Nucleosil RP-18, 250-4 mm;
Puffer A: 100 mM Triethylammoniumacetat, pH 6,5; Buffer A: 100 mM triethylammonium acetate, pH 6.5;
Puffer B: Acetonitril. Buffer B: acetonitrile.
Gradientenelution: 0-40 Min., 0-40% B) ergibt 12,2 AU₂₆₀ Oligoribonukleotid (entspricht etwa 11,9 AU₂₆₀ (57 nmol) der Ausgangsverbindung, 85%) modifiziert mit ungefähr 52 nmol Dithiopyridingruppen (nach einer UV-Bestimmung für Pyridin (1H)2-thion, freigesetzt von einer Teilmenge eines Musters durch Dithiothreitolbehandlung und AU-Wert bei 343 nm). Gradient elution. 0-40 min, 0-40% B) yields 12.2 AU₂₆₀ oligoribonucleotide (corresponding to about 11.9 AU₂₆₀ (57 nmol) of the starting compound, 85%) modified with about 52 nmol of dithiopyridine (after UV determination for pyridine (1H) 2-thione released from a subset of a pattern by Dithiothreitolbehandlung and AU-value at 343 nm).

b) PMDBD-Salzbildung: Eine wäßrige Lösung von 8,1 AU₂₆₀ (ungefähr 255 µg, 37 nmol) von 2′-O-methyliertem 19mer Oligoribonukleotid, das am 3′-Ende mit Pyridyldithiogruppen modifiziert ist (ungefähr 35 nmol nach UV-Bestimmung) in 250 µl Wasser wird mit 250 µl einer Lösung von 4 mg PMDBD-Carbonat (PMDBD): 3,3,6,9,9-Pentamethyl- 2,10-diazabicyclo[4.4.0]dec-1-en, Heinzer Base, Fluka, Heinzer, F., Soukup, M., und Eschenmoser, A. (1978) Helv. Chim. b) PMDBD salt formation: An aqueous solution of 8.1 AU₂₆₀ (about 255 ug, 37 nmol) of 2'-O-methylated 19mer oligoribonucleotide that is modified at the 3 'end with pyridyldithio groups (about 35 nmol after UV determination ) in 250 .mu.l of water is charged with 250 .mu.l of a solution of 4 mg PMDBD carbonate (PMDBD): 3,3,6,9,9-pentamethyl-2,10-diazabicyclo [4.4.0] dec-1-ene, Heinzer base, Fluka, Heinzer, F., Soukup, M., and Eschenmoser, A. (1978) Helv. Chim. Acta 61, 2851-74) in 50% wäßrigem Methanol behandelt, danach mit Wasser auf ein Volumen von 3 ml verdünnt und gefriergetrocknet. Acta 61, 2851-74) treated in 50% aqueous methanol and then diluted to a volume of 3 ml with water and freeze-dried. Das Lyophylisat wird in 1 ml Methanol/Wasser (1 : 4) gelöst und einer Gelfiltration unterworfen (Sephadex G25 PD10: Elution mit Methanol/Wasser 1 : 4). The lyophilisate is dissolved in 1 ml of methanol / water (1: 4) and subjected to gel filtration chromatography (Sephadex G25 PD10: elution with methanol / water 1: 4). Die Oligoribonukleotid enthaltende Fraktion (7,1 AU₂₆₀, gemäß Absorption des Nukleotids) 15 AU₂₁₉ (vorwiegend gemäß Absorption von etwa 0,65 µmol BMDBD; 88%) wird teilweise im Vakuum eingeengt (Speedvac), um das Methanol zu entfernen, gefriergetrocknet und dann in 1,0 ml Methanol/Dichlormethan (1 : 2) aufgelöst. The oligoribonucleotide containing fraction (7.1 AU₂₆₀, according to the absorption of the nucleotide) 15 AU₂₁₉ (mainly according to absorption of about 0.65 .mu.mol BMDBD; 88%) is partially concentrated in vacuo (vac) to remove the methanol, and then freeze-dried in 1.0 ml of methanol / dichloromethane (1: 2) dissolved.

c) Konjugation mit Thiocholesterin: c) conjugation with thiocholesterol:
Zu der Hälfte der obigen Lösung (0,5 ml, die etwa 16 nmol des Oligoribonukleotids entspricht) werden 200 µl Methanol, 30 µl 180 mM methanolischer PMDBD Trifluoracetatpuffer (pH 9) und 600 µg (1,5 µmol) Thiocholesterin (Sigma) in 300 µl Dichlormethan gegeben. To the half of the above solution (0.5 ml, corresponding to about 16 nmol of the oligoribonucleotide), 200 .mu.l of methanol, 30 ul 180 mM methanolic PMDBD Trifluoracetatpuffer (pH 9) and 600 micrograms (1.5 .mu.mol) thiocholesterol (Sigma) in added 300 .mu.l of dichloromethane. Die Reaktionsmischung wird unter Argon während 20 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. The reaction mixture is kept under argon for 20 hours at room temperature. Die Lösung wird im Vakuum eingedampft (Speedvac), der Rückstand in 400 µl Methanol/Chloroform (1 : 1) gelöst und extrahiert (zunächst mit 4 × 100 µl Wasser, dann weiter mit 4 × 100 µl Wasser. Die beiden wäßrigen Extrakte (die 1,6 AU₂₆₀ und 0,7 AU₂₆₀ an Oligoribonukleotid enthalten) werden vereinigt und zur Entfernung des Methanols im Vakuum (Speedvac) auf ein Volumen von ungefähr 500 µl eingeengt. Fraktionieren durch Reverse-Phase-HPLC (Nukleosil RP-18, 250 × 4 mm; Puffer A: 100 mM Triethylammoniumacetat pH 7, Puffer B: Acetonitril; Gradientenelution: 0-50 Min., 0-50% B; 50-70 Min., 50-100% B) ergibt 0,84 AU₂₆₀ (24%) Oligoribonukleotid in nicht-cholesterinmodifizierter Form bei einer Gradientenkonzentration von etwa 25% Acetonitril, und 1,5 AU₂₆₀ (42%) von thiocholesterinmodifiziertem Oligoribonukleotid bei einer Gradientenkonzentration von 55-68% Acetonitril. The solution is evaporated in vacuo (vac), the residue dissolved in 400 ul methanol / chloroform (1: 1). And extracted (first with 4 × 100 .mu.l of water, then with 4 × 100 .mu.l of water The two aqueous extracts (the 1.6 and 0.7 AU₂₆₀ AU₂₆₀ at oligoribonucleotide included) are combined and to remove the methanol under reduced pressure (Speedvac) concentrated to a volume of about 500 .mu.l. fractionation by reverse-phase HPLC (Nucleosil RP-18, 250 × 4 mm; buffer A: 100 mM triethylammonium acetate pH 7, Buffer B: acetonitrile; gradient elution:.. 0-50 min, 0-50% B; 50-70 min, 50-100% B) yields 0.84 AU₂₆₀ (24% ) oligoribonucleotide in non-cholesterol-modified form, at a gradient concentration of about 25% acetonitrile, and 1.5 AU₂₆₀ (42%) of thiocholesterinmodifiziertem oligoribonucleotide at a gradient concentration of 55-68% acetonitrile.

d) In analoger Weise wird ein 2′-O-methyliertes Oligoribonukleotid 19mer, das ein aminomodifiziertes 3′-Ende enthält, mit der Sequenz 5′-GAG CAC ACU UCA UGC AGVG-3′ an Thiocholesterin gebunden. d) In an analogous manner, a 2'-O-methylated oligoribonucleotide 19mer containing an amino-modified 3'-end, tied with the sequence 5'-GAG CAC ACU UCA UGC AGVG-3 'to thiocholesterol. Das durch Pyridyldithiopropionat modifizierte Oligoribonukleotid (12 Au₂₆₀; etwa 60 nmol) als PMDBD-Salz wird als Rohprodukt der Umsetzung des aminomodifizierten Oligoribonukleotids mit 200 Äquivalenten von SPDP und Umwandlung zu dem PMDBD-Salz erhalten. The modified oligoribonucleotide by pyridyldithiopropionate (12 Au₂₆₀; about 60 nmol) as PMDBD salt is obtained as a crude product of the reaction of the amino-modified oligoribonucleotide with 200 equivalents of SPDP and conversion to the PMDBD salt. Gemäß der Reverse-Phase-HPLC-Analyse enthält das Rohprodukt ungefähr 75% dithiopyridinmodifiziertes Produkt (eluiert bei 20% Acetonitril), verunreinigt mit 25% nicht dithiopyridin-modifiziertem Material (eluiert bei etwa 19% Acetonitril). According to the reverse phase HPLC analysis, the crude product contains about 75% dithiopyridinmodifiziertes product (eluting at 20% acetonitrile), contaminated with 25% non-dithiopyridine-modified material (eluted at about 19% acetonitrile). Das Rohprodukt wird mit 100 Äquivalenten Thiocholesterin behandelt (Umsetzung in einem Totalvolumen von 2 ml Methanol/Dichlormethan (2 : 3), das 5 mM PMDBD-trifluoracetat enthält, pH 8,5). The crude product is treated with 100 equivalents thiocholesterol (reaction in a total volume of 2 ml of methanol / dichloromethane (2: 3) containing 5 mM PMDBD trifluoroacetate, pH 8.5). Aufarbeiten und HPLC-Reinigung ergibt 4,7 AU₂₆₀ (etwa 160 µg; 39%) von Oligoribonukleotid in nicht-thiocholesterin modifizierter Form (eluiert bei etwa 18% Acetonitril), und 5,7 AU₂₆₀ (etwa 190 µg; 48%) der thiocholesterinmodifizierten Form (eluiert bei 55-69% Acetonitril). Workup and HPLC purification yields 4.7 AU₂₆₀ (about 160 ug; 39%) of oligoribonucleotide in non-modified form thiocholesterol (eluted at about 18% acetonitrile), and 5.7 AU₂₆₀ (about 190 ug; 48%) of thiocholesterinmodifizierten form (eluted at 55-69% acetonitrile).

Fig. A1 und A2 Fig. A1 and A2

Reduzierende Spaltung des thiocholesterimodifizierten Oligoribonukleotids: Eine Lösung von 0,1 AU₂₆₀ (46 nmol) thiocholesterinmodifiziertem Oligoribonukleotid (hergestellt gemäß obigem Punkt (d)) in 900 µl 25 mM HEPES-Puffer (pH 7,3) wird auf eine Konzentration von 10 mM Dithiothreitol (durch Zusatz von 1,4 mg DTT) gebracht und unter Argon bei 37°C für 18 Stunden gehalten. Reductive cleavage of the thiocholesterimodifizierten oligoribonucleotide: A solution of 0.1 AU₂₆₀ (46 nmol) thiocholesterinmodifiziertem oligoribonucleotide (prepared according to the above item (d)) in 900 .mu.l 25 mM HEPES-buffer (pH 7.3) is adjusted to a concentration of 10 mM dithiothreitol brought (by adding 1.4 mg DTT) and kept under argon at 37 ° C for 18 hours. Die Analyse durch Reverse-Phase-HPLC (bei Bedingungen wie oben beschrieben worden ist) zeigt vollständige Spaltung des gesamten Oligoribonukleotids. The analysis (has been under conditions as described above) by reverse-phase HPLC shows complete cleavage of the entire oligoribonucleotide. Eine ähnliche reduzierende Spaltung mit β-Mercaptoethanol (BME) als Reduktionsmittel ergibt dasselbe Spaltungsprodukt. A similar reductive cleavage with β-mercaptoethanol (BME) as a reducing agent gives the same cleavage product. Der Peak des neuen Produktes, vermutlich des abgespaltenen thiocholesterinfreien Oligoribonukleotids, eluiert bei einer Gradientenkonzentration von etwa 18% Acetonitril. The peak of the new product, presumably the cleaved thiocholesterinfreien oligoribonucleotide, eluted at a gradient concentration of approximately 18% acetonitrile. Die übrigen früheren Eluierungspeaks sind durch das Reduktionsmittel bedingt. The other earlier elution peaks are caused by the reducing agent.

Inkorporierung von thiocholesterinmodifizierten 2′-O-Methyloligoribonukleotiden in Liposomen Thiocholesterinmodifizierten incorporation of 2'-O-Methyloligoribonukleotiden in liposomes Markieren der Oligoribonukleotide Highlight of the oligoribonucleotides

Thicholesterin-modifiziertes 2′-O-Methyloligoribonukleotid und ein nicht-modifiziertes 2′-O-Methyloligoribonukleotid als Kontrolle werden 5′-³²-P-markiert, wobei man einen Inkubationspuffer mit einer minimalen Menge von Reduktionsmittel einsetzt. Thicholesterin-modified 2'-O-Methyloligoribonukleotid and a non-modified 2'-O-Methyloligoribonukleotid as a control are 5'-³²-P-labeled, with incubation buffer used is one with a minimal amount of reducing agent. 1 pmol Oligoribonukleotid wird inkubiert in 10 µl Puffer [50 nM Tris · HCl pH = 7,5, 10 mM MgCl₂, 100 nM NaCl, 1 mM Dithioerythritol (DTE)] mit 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase (Boehringer Mannheim) und 2 pmol g-³²-P-ATP während 30 Minuten bei 37°C. 1 pmol oligoribonucleotide is incubated in 10 ul buffer [50 mM Tris · HCl, pH = 7.5, 10 mM MgCl₂, 100 nM NaCl, 1 mM dithioerythritol (DTE)] with 10 units of T4 polynucleotide kinase (Boehringer Mannheim) and 2 pmol g- ³²-P-ATP for 30 minutes at 37 ° C. Das markierte Oligoribonukleotid wird dann durch Gelfiltration gereinigt unter Zugabe von 10 pmol unmarkiertem Oligoribonukleotid, um die unspezifische Absorption zu minimieren (Sephadex G-25 (Pharmacia), 1,8 ml Bettvolumen, 50 mM HEPES pH 7,3; der erste radioaktive Peak, der im Durchfluß erscheint, wird gesammelt). The labeled oligoribonucleotide is then purified by gel filtration with the addition of 10 pmol unlabeled oligoribonucleotide in order to minimize the nonspecific absorption (Sephadex G-25 (Pharmacia), 1.8 ml bed volume, 50 mM HEPES pH 7.3; the first radioactive peak, appears in the effluent is collected).

Herstellung von Liposomen Preparation of Liposomes

Die Liposomen werden durch REV (reverse phase evaporation) hergestellt. The liposomes prepared by REV (reverse phase evaporation). Wäßrige Phase: 175 µl 50 mM HEPES (pH 7,3), 1 mM Calcein, 1 µM 2′-O-Methyl-RNA(thiocholesterin- modifiziert oder nicht-modifiziert als Kontrolle), versehen mit einer Spurmenge von 5′-³²-P-markiertem Material. Aqueous phase: 175 .mu.l of 50 mM HEPES (pH 7.3), 1 mM calcein, 1 uM 2'-O-methyl RNA (thiocholesterin- modified or unmodified as a control), provided with a trace amount of 5'-³² -P-labeled material. Organische Phase: Lösung von 5 µmol L-α-Lecithin (von Eigelb, vorwiegend Palmitoyloleoyl-phosphatidylcholin; Avanti Polar Lipids) in 600 µl Diethylether (extrahiert mit 50 mM HEPES-Puffer). Organic phase: solution of 5 .mu.mol L-α-lecithin (egg yolk, mainly Palmitoyloleoyl phosphatidylcholine; Avanti Polar Lipids) in 600 .mu.l diethyl ether (extracted with 50 mM HEPES buffer). Die beiden Phasen werden sorgfältig in einer Glasröhre durch Aufwirbeln gemischt und 5 Min. bei 0°C in einem badähnlichen Beschallungsgerät beschallt. The two phases are thoroughly mixed in a glass tube by swirling and sonicated for 5 min. At 0 ° C in a badähnlichen sonicator. Die anfallende stabile Emulsion wird langsam in einem rotierenden Verdampfer unter gelegentlichem Aufwirbeln der Mischung eingedampft. The resulting stable emulsion is slowly evaporated in a rotary evaporator with occasional vortexing the mixture. Nach dem vollständigen Entfernen des Diethylethers (etwa 30 Minuten bei 200 mbar) wird die Liposomenlösung nochmals 20 Min. bei 0°C beschallt. After complete removal of the diethyl ether (about 30 minutes at 200 mbar) is sonicated for another 20 min. At 0 ° C, the liposome solution. Die erhaltene Lösung wird mit 175 µl 50 mM HEPES pH 7,3 verdünnt und bei 2°C gelagert. The resulting solution is diluted with 50 mM HEPES pH 7.3 175 .mu.l and stored at 2 ° C.

Gelfiltration der Liposomen Gel filtration of the liposomes

Die Liposome (eine Teilmenge von 200 µl) werden von uninkorporiertem Material durch Gelfiltration [Sephadex G-75 superfine (Pharmacia), 10 ml Bettvolumen, 50 mM HEPES pH 7,3] getrennt. The liposomes (a subset of 200 ul) are of uninkorporiertem material by gel filtration [Sephadex G-75 superfine (Pharmacia), 10 ml bed volume, 50 mM HEPES pH 7.3] separately. Fraktionen von 600 µl werden gesammelt und UV-Analyse und Scintillationszählung unterworfen. Fractions of 600 .mu.l are collected and subjected to UV analysis and scintillation counting. Die Calcein- Absorption (493 nm) wird für die unspezifische Absorption der Liposome bei 600 nm gemessen. Calcein the absorbance (493 nm) is measured for the non-specific absorption of the liposomes at 600nm. Als Kontrolle wird eine Teilmenge des markierten Oligoribonukleotids, das nicht durch Thiocholesterin modifiziert ist, analog chromatographiert. As a control, an aliquot of the labeled oligoribonucleotide that is not modified by thiocholesterol, chromatographed as described.

Die Effizienz der Einkapselung wird aus der Calceinabsorption, die mit den Liposomfraktionen (in den Fraktionen 4-7) assoziiert ist, und dem nicht-inkorporierten Calcein, das mit den Fraktionen (10-25) mit niedrigem Molekulargewicht eluiert wird, berechnet. The efficiency of encapsulation is calculated from the Calceinabsorption associated with the Liposomfraktionen (in fractions 4-7), and the non-incorporated Calcein, which is eluted with the fractions (10-25) with low molecular weight. Die Inkorporation des Oligoribonukleotids wird bestimmt durch Vergleichen der Radioaktivität der Liposomfraktionen (4-7) mit der gesamten eluierten Radioaktivität im Fall von unmodifizierten Oligoribonukleotiden und der Radioaktivität in den Oligonukleotidfraktionen (8-16, siehe Fig. 13 und 14) im Fall der thiocholesterinmodifizierten Oligoribonukleotide. The incorporation of the oligoribonucleotide is determined by comparing the radioactivity of the Liposomfraktionen (4-7) with the total eluted radioactivity in the case of unmodified oligoribonucleotides and the radioactivity in the oligonucleotide fractions (8-16, see Fig. 13 and 14) in the case of oligoribonucleotides thiocholesterinmodifizierten , (Der Wert der Radioaktivität, die mit den Liposomen assoziiert ist, wird korrigiert, um den Wert der unspezifisch inkorporierten ³²-P-phosphate oder Nukleotide, die vom Abbau markierter Oligoribonukleotide stammen). (The amount of radioactivity associated with the liposomes is corrected to the value of the non-specifically incorporated ³²-P-phosphate, or nucleotides derived from the degradation of labeled oligoribonucleotides). Die Verteilung der Radioaktivität ist folgende: unmodifizierte Oligoribonukleotide: Liposome assoziiert 8%, Oligoribonukleotid 31%, Phosphate 61%; The distribution of the radioactivity is as follows: unmodified oligoribonucleotides: liposomes associated 8%, 31% oligoribonucleotide, phosphates, 61%; thiocholesterin-modifizierte Oligoribonukleotide: Liposome assoziiert 46%; thiocholesterol-modified oligoribonucleotides: liposomes associated 46%; Oligoribonukleotid 19%; Oligoribonucleotide 19%; Phosphat 34%. Phosphate 34%.

Fig. A3: Gelfiltration der Liposompräparation mit thiocholesterinmodifizierter 2′-O-Methyl-RNA. Fig. A3: gel filtration of the liposome with thiocholesterinmodifizierter 2'-O-methyl-RNA.

Fig. A4: Gelfiltration der Liposompräparation mit unmodifizierter 2′-O-Methyl-RNA. Fig. A4: gel filtration of the liposome with unmodified 2'-O-methyl-RNA. Als Kontrolle wird das 5′-markierte Oligoribonukleotid, (mit unterbrochener Linie) mit einem Maximum in Fraktion 14 gezeigt. As a control, the 5'-labeled oligoribonucleotide (dotted line) are shown with a maximum in fraction 14. Der zweite Peak der Radioaktivität (in den Fraktionen 16-24, mit niedrigem Molekulargewicht) der in der Liposompräparation auftritt (gefüllte Dreiecke in der Zeichnung) ist vermutlich durch den Abbau durch Nuklease oder durch Schaden durch die Beschallung während der Herstellung des Liposoms bedingt. The second peak of radioactivity (in fractions 16-24, with low molecular weight) in the liposome occurs (filled triangles in the drawing) is probably due to the degradation by nuclease or damaged by the sonication for the preparation of the liposome.

Die Effizienz der Inkorporation der Oligoribonukleotide in Liposompräparation wird in der folgenden Tabelle zusamengefaßt: The efficiency of incorporation of the oligoribonucleotides in liposome together is shown in the following table:

Abbau durch alkalische Phosphatase Degradation by alkaline phosphatase

Eine Teilmenge (400 µl) der vereinigten Liposomfraktionen, die die thiocholesterin-modifizierten Oligoribonukleotide enthalten (Sephadex G 75, Fraktionen 5+6, in 50 mM HEPES pH 7,3) wird mit 5 Einheiten (aus Kälberdarm, Boehringer Mannheim) während 2 Stunden bei 37°C behandelt. An aliquot (400 ul) of the combined Liposomfraktionen containing the thiocholesterol-modified oligoribonucleotides (Sephadex G 75, fractions 5 and 6, in 50 mM HEPES pH 7.3) is mixed with 5 units (from calf intestine, Boehringer Mannheim) for 2 hours treated at 37 ° C.

Als Kontrolle wird dieselbe Menge von Liposomen mit 5 Einheiten Alkaliphosphatase in Gegenwart von 1 µl Triton X-100 für 1 Stunde bei 37°C behandelt. As a control, the same amount of liposomes with 5 units of alkaline phosphatase in the presence of 1 .mu.l Triton X-100 for 1 hour at 37 ° C is treated. Die Abbauprodukte werden durch Gelfiltration analysiert (Sephadex G-25 PD-10 Säulen) und die erhaltenen Fraktionen (800 µl) werden wie oben beschrieben charakterisiert. The degradation products are analyzed by gel filtration (Sephadex G-25 PD-10 column) and the resulting fractions (800 ul) characterized as described above.

Die Resultate der Gelfiltration der Alkaliphosphataseabbauprodukte werden in Fig. 5 zusammengefaßt: The results of gel filtration of the Alkaliphosphataseabbauprodukte are summarized in Fig. 5:

Das 5′-markierte von etwa der Hälfte des an die Membran assoziierten Oligoribonukleotids wird entfernt (³²PO₄ 2- , Fraktionen 7-12). The 5'-labeled of about half of the associated membrane to the oligoribonucleotide is removed (³²PO₄ 2-, fractions 7-12). Dem entspricht, daß die Hälfte des Oligoribonukleotids an der Außenseite der Liposommembran assoziiert ist. This corresponds to that half of the oligoribonucleotide is associated on the outside of the liposome membrane.

Die Daten der Gelfiltration des Alkaliphosphataseabbaus in Gegenwart von Triton X-100, der den Zusammenbruch des Liposoms verursacht, sind in Fig. A6 zusammengefaßt: alle Oligoribonukleotide sind angreifbar und werden durch Phosphatase abgebaut (die ganze Radioaktivität ist in den Phosphatfraktionen 7-12). The data from the gel filtration of Alkaliphosphataseabbaus in the presence of Triton X-100, which caused the collapse of the liposome are summarized in Figure A6:. All oligoribonucleotides are vulnerable and are degraded by phosphatase (all the radioactivity in the phosphate fractions 7-12). Das Calcein tritt ebenfalls aus den Liposomen aus und eluiert als breiter Peak in den Fraktionen 7-17, die niedrige Molekulargewichte zeigen. The calcein also passes out of the liposomes and eluted as a broad peak in fractions 7-17, which show low molecular weights.

Diese Beispiele zeigen deutlich, daß der Grad der Inkorporation der thiocholesterin-modifizierten Oligoribonukleotide wesentlich höher ist als der der unmodifizierten. These examples clearly show that the level of incorporation of thiocholesterol-modified oligoribonucleotides is substantially higher than that of the unmodified.

Analog den obigen Beispielen können auch mehrere cholesterin- oder thiocholesterin-modifizierte 2′-O-Alkyloligoribonukleotide in Liposomen inkorporiert werden. Analogously to the above examples, plurality of cholesterol or thiocholesterol-modified 2'-O-Alkyloligoribonukleotide can be incorporated into liposomes.

Citations hors brevets
Référence
1 *Chemical Reviews, 90 (4), 1990, 543-584
2 *Nucleic Acids Res., 17 (9), 1989, 3373-86
Référencé par
Brevet citant Date de dépôt Date de publication Déposant Titre
EP0651759A1 *20 juil. 199310 mai 1995Isis Pharmaceuticals, Inc.Novel 2'-o-alkyl nucleosides and phosphoramidites processes for the preparation and uses thereof
EP0651759A4 *20 juil. 199325 oct. 1995Isis Pharmaceuticals IncNovel 2'-o-alkyl nucleosides and phosphoramidites processes for the preparation and uses thereof.
EP1223173A2 *20 juil. 199317 juil. 2002Isis Pharmaceuticals, Inc.Novel 2'-O-alkyl nucleosides and phosphoramidites processes for the preparation and uses thereof
EP1223173A3 *20 juil. 199316 avr. 2003Isis Pharmaceuticals, Inc.Novel 2'-O-alkyl nucleosides and phosphoramidites processes for the preparation and uses thereof
EP1820804A1 *20 févr. 200622 août 2007Humboldt-Universität zu BerlinLipidated oligonucleotides
US5525719 *24 mai 199311 juin 1996Chemgenes CorporationN-protected-2'-O-methyl-and N-protected-3'-O-methyl-ribonucleosides and their phosphoramidite derivatives
US5587469 *30 août 199524 déc. 1996Isis Pharmaceuticals, Inc.Oligonucleotides containing N-2 substituted purines
US5623065 *23 déc. 199222 avr. 1997Isis Pharmaceuticals, Inc.Gapped 2' modified oligonucleotides
US5646265 *23 mars 19958 juil. 1997Isis Pharmceuticals, Inc.Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5652355 *23 juil. 199229 juil. 1997Worcester Foundation For Experimental BiologyHybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5670633 *12 août 199123 sept. 1997Isis Pharmaceuticals, Inc.Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5700922 *24 nov. 199323 déc. 1997Isis Pharmaceuticals, Inc.PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5808027 *10 déc. 199615 sept. 1998Isis Pharmaceuticals, Inc.N-2 substituted purines in oligonucleotides
US5855911 *29 août 19955 janv. 1999Board Of Regents, The University Of Texas SystemLiposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
US5856455 *21 avr. 19975 janv. 1999Isis Pharmaceuticals, Inc.Gapped 2'-modified oligonucleotides
US5856466 *7 juil. 19975 janv. 1999Isis Pharmaceuticals, Inc.Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5859221 *6 juin 199512 janv. 1999Isis Pharmaceuticals, Inc.2'-modified oligonucleotides
US5872232 *6 juin 199516 févr. 1999Isis Pharmaceuticals Inc.2'-O-modified oligonucleotides
US5914396 *20 juil. 199322 juin 1999Isis Pharmaceuticals, Inc.2'-O-modified nucleosides and phosphoramidites
US5955589 *6 juin 199521 sept. 1999Isis Pharmaceuticals Inc.Gapped 2' modified oligonucleotides
US5965722 *30 avr. 199712 oct. 1999Isis Pharmaceuticals, Inc.Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides
US6005087 *5 mars 199821 déc. 1999Isis Pharmaceuticals, Inc.2'-modified oligonucleotides
US6015886 *5 févr. 199718 janv. 2000Chemgenes CorporationOligonucleotide phosphate esters
US6042846 *9 juil. 199828 mars 2000Board Of Regents, University Of Texas SystemLiposomal phosphodiester, phosphorothioate, and p-ethoxy oligonucleotides
US6133438 *2 oct. 199817 oct. 2000Isis Pharmaceuticals, Inc.Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US6143881 *7 juin 19957 nov. 2000University Of Massachusetts WorcesterHybrid oligonucleotide phosphorothioates
US6146829 *31 août 199814 nov. 2000Isis Pharmaceuticals, Inc.Gapped 2' modified oligonucleotides
US6166197 *6 mars 199526 déc. 2000Isis Pharmaceuticals, Inc.Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
US6166199 *4 août 199826 déc. 2000Isis Pharmaceuticals, IncN-2 substituted purines
US62220256 mars 199624 avr. 2001Isis Pharmaceuticals, Inc.Process for the synthesis of 2′-O-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
US62425929 déc. 19995 juin 2001Isis Pharmaceuticals, Inc.Process for the preparation of 2′-O-alkyl-guanosine, cytidine, and uridine phosphoramidites
US62622413 févr. 199517 juil. 2001Isis Pharmaceuticals, Inc.Compound for detecting and modulating RNA activity and gene expression
US62776031 juil. 199821 août 2001Isis Pharmaceuticals, Inc.PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US630704023 sept. 199723 oct. 2001Isis Pharmaceuticals, Inc.Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US63261991 déc. 19994 déc. 2001Isis Pharmaceuticals, Inc.Gapped 2′ modified oligonucleotides
US634661414 mars 200012 févr. 2002Hybridon, Inc.Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US635912412 févr. 199919 mars 2002Isis Pharmaceuticals, Inc.Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides
US639975417 août 19984 juin 2002Isis Pharmaceuticals, Inc.Sugar modified oligonucleotides
US65315842 sept. 199911 mars 2003Isis Pharmaceuticals, Inc.2'modified oligonucleotides
US662429312 févr. 199823 sept. 2003Hybridon, Inc.Modified protein kinase A-specific oligonucleotides and methods of their use
US664236722 déc. 20004 nov. 2003Isis Pharmaceuticals, Inc.Process for the synthesis of 2′-O-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
US66704683 janv. 200130 déc. 2003Novartis Ag2′-substituted nucleosides and oligonucleotide derivatives
US668316722 juin 200127 janv. 2004University Of Massachusetts WorcesterHybrid oligonucleotide phosphorothioates
US70153156 juin 199521 mars 2006Isis Pharmaceuticals, Inc.Gapped oligonucleotides
US70456098 oct. 200216 mai 2006University Of Massachusetts WorcesterHybrid oligonucleotide phosphorothioates
US70747685 oct. 199911 juil. 2006Idera Pharmaceuticals, Inc.Modified protein kinase A-specific oligonucleotides and methods of their use
US710199327 oct. 19925 sept. 2006Isis Pharmaceuticals, Inc.Oligonucleotides containing 2′-O-modified purines
US71191844 oct. 200110 oct. 2006Isis Pharmaceuticals, Inc.Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US713851728 nov. 200121 nov. 2006Isis Pharmaceuticals, Inc.Sugar modified oligonucleotides
US717630216 juin 200313 févr. 2007Board Of Regents, The University Of Texas SystemLiposomal phosphodiester, phosphorothioate, and p-ethoxy oligonucleotides
US72852883 oct. 199723 oct. 2007Board Of Regents, The University Of Texas SystemInhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US769590220 févr. 200213 avr. 2010Isis Pharmaceuticals, Inc.Oligoribonucleotides and ribonucleases for cleaving RNA
US770496218 févr. 200027 avr. 2010Board Of Regents, The University Of Texas SystemSmall oligonucleotides with anti-tumor activity
US775487213 févr. 200713 juil. 2010Board Of Regents, The University Of Texas SystemLiposomal phosphodiester, phophorothioate, and p-ethoxy oligonucleotides
US78121494 nov. 200312 oct. 2010Isis Pharmaceuticals, Inc.2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US782081019 mars 200826 oct. 2010Isis Pharmaceuticals, Inc.Process for the synthesis of 2′-O-substituted purine nulceosides
US78840867 sept. 20058 févr. 2011Isis Pharmaceuticals, Inc.Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
US83949473 mars 200412 mars 2013Isis Pharmaceuticals, Inc.Positionally modified siRNA constructs
US85694744 mars 200529 oct. 2013Isis Pharmaceuticals, Inc.Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US86041834 nov. 200310 déc. 2013Isis Pharmaceuticals, Inc.Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
US90966364 nov. 20034 août 2015Isis Pharmaceuticals, Inc.Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US93812088 mai 20125 juil. 2016Rheinische Friedrich-Wilhelms-UniversitätStructure and use of 5′ phosphate oligonucleotides
US939965828 mars 201226 juil. 2016Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität BonnPurification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags
US940994120 mai 20099 août 2016Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn5′ triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof
US973868020 mai 200922 août 2017Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn5′ triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof
WO1995008556A1 *21 sept. 199430 mars 1995Amersham International PlcReagents comprising chimeric molecules of nucleic acids and nucleic acid analogs
WO1997006662A2 *16 août 199627 févr. 1997Hybridon, Inc.Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
WO1997006662A3 *16 août 199619 juin 1997Hybridon IncInverted chimeric and hybrid oligonucleotides
WO1997007784A2 *26 août 19966 mars 1997Board Of Regents, The University Of Texas SystemLIPOSOMAL PHOSPHODIESTER, PHOSPHOROTHIOATE, AND p-ETHOXY OLIGONUCLEOTIDES
WO1997007784A3 *26 août 199624 avr. 1997Univ TexasLIPOSOMAL PHOSPHODIESTER, PHOSPHOROTHIOATE, AND p-ETHOXY OLIGONUCLEOTIDES
WO2007096134A1 *20 févr. 200730 août 2007Humboldt-Universität Zu BerlinLipidated oligonucleotides
Classifications
Classification internationaleC07H19/16, C07H19/20, C07H21/00, C07H19/06, C07H19/10
Classification coopérativeC07H19/20, C07H19/16, C07H19/06, C07H19/10, C07H21/00
Classification européenneC07H19/20, C07H19/16, C07H21/00, C07H19/06, C07H19/10
Événements juridiques
DateCodeÉvénementDescription
1 oct. 1992OP8Request for examination as to paragraph 44 patent law
8 avr. 19938130Withdrawal