DE60003006T2

DE60003006T2 - Mineralisierung und zelluläre strukturierung von biomaterialoberflächen

Info

Publication number: DE60003006T2
Application number: DE60003006T
Authority: DE
Inventors: William L. Murphy; Martin C. Peters; J. David MOONEY; H. David KOHN
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1999-03-19
Filing date: 2000-03-17
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2020-03-18
Also published as: CA2370063C; DK1163018T3; CA2370063A1; ATE241397T1; DE60003006D1; EP1163018B1; US20030203002A1; WO2000056375A3; US6541022B1; WO2000056375A2; ES2199815T3; AU4173000A; EP1163018A2

Description

Allgemeiner Stand der Technik
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die unterschiedlichen Gebiete der Lithografie, der Chemie, der Biomaterialien und des Tissue-Engineerings. Insbesondere betrifft sie das Mustern und/oder die Mineralisierung von Biopolymeren. Diese bereitgestellten Verfahren eignen sich besonders für die Erzeugung von oberflächenmodifizierten, dreidimensionalen Biomaterialien zur Verwendung in der Zellkultur, der Transplantation und dem Tissue-Engineering.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Viele biomedizinische Verfahren erfordern das Bereitstellen von gesundem Gewebe, um dem behandelten Erkrankungsprozess oder Trauma entgegenzuwirken. Diese Arbeit ist häufig durch die erhebliche Knappheit von Geweben behindert, die für eine Transplantation und/oder ein Grafting verfügbar sind. Tissue-Engineering könnte letztendlich Alternativen zu der Transplantation von ganzen Organen oder Geweben bieten.
Um Gewebe künstlich herzustellen (engineerte Gewebe herzustellen), werden derzeit verschiedene Kombinationen von Biomaterialien und lebenden Zellen untersucht. Obgleich sich die Aufmerksamkeit häufig auf die zellulären Aspekte des Engineering-Verfahrens richtet, stellen auch die Designkennzeichen der Biomaterialien in diesem Gebiet eine große Herausforderung dar.
In den letzten Jahren wurde die Fähigkeit zur Regenerierung von Geweben und zur Kontrolle der Eigenschaften des regenerierten Gewebes untersucht, indem versucht wurde, die mechanischen oder chemischen Eigenschaften des Biomaterialgerüstes spezifisch abzustimmen (Kim et al. 1997; Kohn et al. 1997). Der Großteil die ser Arbeit umfasste den Einbau chemischer Faktoren in das Material während der Verarbeitung oder die Abstimmung von mechanischen Eigenschaften durch Veränderung der Bestandteile des Materials.
Die vorigen Verfahren wurden für den Versuch verwendet, chemisches oder mechanisches Signaling zu nutzen, um Veränderungen der Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen während der Geweberegeneration zu bewirken. Trotz dieser Bemühungen bleibt im Stand der Technik ein Bedarf für verbesserte Biomaterialien bestehen, besonders für solche, die komplexes Gewebewachstum in vitro (in der Zellkultur) und in vivo (nach Implantation) besser unterstützen können.
EP-A-O 891 783 offenbart ein Verfahren der Präkalzifizierung eines biokompatiblen Polyestermaterials, indem es in einer CaCl₂/Na₂HPO₄-Lösung inkubiert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung überwindet verschiedene Nachteile aus dem Stand der Technik durch Bereitstellen einer Reihe von verbesserten Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtung für die Verwendung in der Zellkultur, der Zelltransplantation und dem Tissue-Engineering. Die Verfahren, Zusammensetzungen und Apparate der Erfindung umfassen gemusterte und/oder mineralisierte Biomaterialoberflächen. Die bereit-gestellten Techniken und Produkte sind nützlich für das Erzeugen von dreidimensionalen oder konturierten Bioimplantatmaterialien mit modifizierten Oberflächenmerkmalen und für das Erzeugen von Biomaterialien, in die bioaktive Faktoren und/oder Zellen eingebaut sind. Die verschiedenen Verfahren des Verwendens der mineralisierten und/oder gemusterten Biomaterialien im Tissue-Engineering, einschließlich Tissue-Engineering von Knochengewebe und Vaskularisierung, gewährleisten damit mehr Kontrolle über die biologischen Abläufe.
Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Die Erfindung umfasst die Oberflächenbehandlung oder Funktionalisierung eines biokompatiblen Materials, vorzugsweise ein poröses, abbaubares Polymer wie beispielsweise einen Film oder einen Schwamm, um die Keimbildung und das Wachstum einer ausgedehnten Mineralschicht auf der Oberfläche anzuregen. Eine solche Behandlung kann kontrolliert werden, um eine homogene Oberflächenmineralschicht oder eine gemusterte Mineralschicht, wie beispielsweise Inseln von Mineralien, bereitzustellen. Jede dieser ausgedehnten Mineralschichten erlaubt das Wachstum von kontinuierlichen, knochenähnlichen Mineralschichten, selbst auf inneren Porenoberflächen des Polymergerüstes.
Solche extensiv mineralisierten, gemustert mineralisierten und/oder hypermineralisierten Polymere der Erfindung haben vorteilhafte Verwendung im Tissue-Engineering und der Regeneration von Knochengewebe und der Gewebevaskularisierung. Die Bildung von ausgedehnten Mineralinseln und/oder im wesentlichen homogenen „kontinuierlichen" Mineralschichten, besonders solchen auf den inneren Porenoberflächen dreidimensionaler Matrizen, ist vorteilhaft, da sie einfach (durch eine aus einem Schritt bestehende Inkubation), schnell (in etwa fünf Tagen), bei Raumtemperatur erreicht werden kann, ohne zu einer wesentlichen Verringerung der Gesamtporosität oder Porengröße des Gerüstes zu führen, und ist zugänglich für den weiteren Einbau von bioaktiven Substanzen.
Der weitere Einbau von bioaktiven Substanzen wird durch die Bildung und Verwendung von Polymeren, vorzugsweise biologisch abbaubaren Polymeren, die sowohl mineralisiert sind als auch eine anhaltende Freisetzung bioaktiver Faktoren, wie beispielsweise Proteinwachstumsfaktoren, gewährleisten, veranschaulicht. In diesen Aspekten der Erfindung kann die Art der Mineralschicht durch Verändern des Molekulargewichts des Polymers, der Zusammensetzung des Polymers, der für die Herstellung des Polymers angewandten Verarbeitungstechnik (Lösungsmittelguss (solvent casting), Hitzepressen, Gasaufschäumen (gas foaming)), der Art und/oder Dichte von Fehlern auf der Polymeroberfläche und/oder durch Variieren der Inkubationsdauer kontrolliert werden.
Die funktionalisierte Vorbehandlung vor der Mineralisierung kann eine gemusterte Behandlung von Polymerbiomaterialoberflächen mithilfe eines besonderen „Beugungslithografieverfahrens" umfassen. Vorhergehende lithografische Verfahren der Oberflächenmusterung waren auf flache, zweidimensionale Oberflächen beschränkt, was eine wesentliche Einschränkung ist, die durch die hierin bereit gestellten Verfahren überwunden wird. Die vorliegende Erfindung ist daher auf das Mustern von Oberflächen auf komplexen dreidimensionalen Biomaterialien mit Oberflächenkonturen anwendbar.
Dies ist besonders insofern erstaunlich, als daß es Muster mit ausreichender Auflösung bereitstellt, die in biologischen Ausführungsformen nützlich sind. Weitere Vorteile der Erfindung gegenüber Verfahren aus dem Stand der Technik umfassen den sofortigen Einbau biologisch aktiver Bestandteile in die gemusterten Biomaterialien und das verringerte Kontaminationsrisiko. Andere wesentliche Merkmale der Erfindung sind die Kosteneffektivität und die arbeitssparende Art der Techniken.
Die verschiedenen, verbesserten Biomaterialien der Erfindung haben vorteilhafte Verwendungen in der Zell- und Gewebekultur und in Engineering-Verfahren, sowohl in vitro als auch in vivo. Beispielsweise stellt die Erfindung Biomaterialverfahren und – zusammensetzungen mit gemusterten Mineraloberflächen für die Verwendung beim Mustern der Adhäsion von Knochenzellen bereit.
Entsprechend sind die allgemeinen Verfahren der Erfindung solche, die sich für die Oberflächenmodifikation auf wenigstens einem ersten biokompatiblen Material oder einer ersten biokompatiblen Vorrichtung eignen, umfassend:
Erzeugung einer ausgedehnten, mineralisierten Oberfläche auf einem biokompatiblen Material oder einer bio kompatiblen Vorrichtung, wobei das Verfahren die Funktionalisierung wenigstens einer ersten Oberfläche eines biokompatiblen Materials oder einer biokompatiblen Vorrichtung zur Darstellung mehrerer polarer Sauerstoffgruppen an einer funktionalisierten Oberfläche sowie das Inkontaktbringen der funktionalisierten Oberfläche mit einer Menge einer mineralhaltigen Lösung, womit eine ausgedehnte Mineralisierung auf der wenigstens einen ersten Oberfläche des biokompatiblen Materials oder der biokompatiblen Vorrichtung erzeugt wird.
Die Vorbehandlung kann das Erzeugen einer gemusterten Oberfläche eines biokompatiblen Materials oder einer biokompatiblen Vorrichtung umfassen, wobei mindestens eine erste lichtempfindliche Oberfläche eines biokompatiblen Materials oder einer biokompatiblen Vorrichtung mit vorgemusterter elektromagnetischer Strahlung bestrahlt wird und damit ein Muster auf mindestens einer ersten Oberfläche eines biokompatiblen Materials oder einer biokompatiblen Vorrichtung erzeugt wird.
Die Bestrahlung, lithografische oder beugungslithografische Methoden umfassen im Allgemeinen das Erzeugen einer gemusterten Oberfläche auf einem biokompatiblen Material durch ein Verfahren umfassend das Funktionalisieren wenigstens einer ersten lichtempfindlichen Oberfläche eines biokompatiblen Materials durch Bestrahlen der lichtempfindlichen Oberfläche mit einer Menge einer vorgemusterten elektromagnetischen Strahlung, die wirksam ist, um ein gemustertes biokompatibles Material umfassend ein Muster auf wenigstens einer ersten Oberfläche des biokompatiblen Materials zu erzeugen. In diesen Verfahren ist die funktionalisierte Oberfläche funktionalisiert, um mehrere polare Sauerstoffgruppen an der Oberfläche zu erzeugen, so daß die funktionalisierte Oberfläche im Allgemeinen weiter modifiziert werden kann, z. B. mit Mineralen, Zellen oder dergleichen.
Es wird darauf hingewiesen, daß die Verfahren zum Erzeugen einer gemusterten Oberfläche auf einem Biomaterial oder auf einer Vorrichtung das „direkte" Auftragen vorgemusterter Strahlung auf eine lichtempfindliche Oberfläche eines Biomaterials oder einer Vorrichtung umfassen. Das „direkte" Auftragen vorgemusterter Strahlung ist ein wesentlicher Vorteil, da es ohne die Einwirkung einer „Maske" erfolgt, was bei der Kontaktlithografie einen wesentlichen Nachteil darstellt. Die vorliegende Erfindung stellt daher eine „maskenfreie" bzw. „nackte" Lithografie für das Mustern von Biomaterialien bereit, in der vorgemusterte Strahlung in Abwesenheit einer intervenierenden Maske direkt auf eine lichtempfindliche Oberfläche eines Biomaterials auftrifft.
„Elektromagnetische Strahlung", wie hierin verwendet, umfasst alle Arten von Strahlung elektromagnetischen Ursprungs, d. h. Strahlungen, die aus senkrechten elektrischen und magnetischen Feldern bestehen. Bei der vorgemusterten Strahlung zur Verwendung in der Erfindung handelt es sich vorzugsweise um konstruktiv und destruktiv interferierende elektromagnetische Strahlung.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung aller konstruktiv und destruktiv interferierenden Strahlungen, wie beispielsweise konstruktive und destruktive Interferenz auf Amplitudenbasis sowie Phasenhologramme, die sich auf konstruktive und destruktive Interferenz nur auf der Basis der Phase stützen. Ein Vorteil der Hologramme, die nur auf der Phase beruhen, ist der, daß mehr Licht durchkommt und ein komplexeres Muster geformt werden kann. Die Verwendung von Beugungsgittern, um konstruktive und destruktive Interferenz auf der Basis der Amplitude bereit zu stellen, ist hinsichtlich der Konstruktion und der Kosten vorteilhaft.
Die vorgemusterte Strahlung kann konstruktiv und destruktiv interferierende Strahlung aus jedem effektiven Teil des sichtbaren Spektrums sein. Konstruktiv und destruktiv interferierende Strahlung im UV-Spektrum, im Infrarot-Spektrum und im sichtbaren Spek trum sind bevorzugte Beispiele, wobei das UV-Spektrum und das sichtbare Spektrum am meisten bevorzugt sind.
Die vorgemusterte, konstruktiv und destruktiv interferierende Strahlung kann erzeugt werden, indem monochromatische Strahlung auf ein optisches Beugungselement auftrifft, das die monochromatische Strahlung in konstruktiv und destruktiv interferierende Strahlung umwandelt.
Die monochromatische Strahlung kann aus jeder geeigneten Quelle erzeugt werden. Beispielsweise einem Laser bzw. mehreren Lasern oder einer Quecksilberlampe bzw. mehreren Quecksilberlampen. Die monochromatische Strahlung kann zuerst aus einer elektromagnetischen Strahlenquelle erzeugt werden und dann durch einen geeigneten Filter geleitet werden.
In der Erfindung können viele verschiedene, optische Beugungselemente verwendet werden. „Optische Beugungselemente" ist ein Begriff, der Beugungsgitter, Hologramme und andere Mustererzeuger umfasst. Es gibt praktisch keine Einschränkung in Bezug auf diese Aspekte der Erfindung, da jeder Bestandteil des Spektrums durch jede Art von optischem Element gemustert werden kann, indem das Design des optischen Elements variiert wird. Es gibt beispielsweise einen gut definierten Zusammenhang zwischen dem Merkmal des Abstands in einem Beugungsmuster und dem Abstand der Schlitze in dem Beugungsmuster plus der Wellenlänge der Strahlung. Die Schlitzbreiten können daher variiert werden, um mit jeder Wellenlänge der Strahlung jeden Musterabstand zu erzeugen.
In der Erfindung können daher eine Beugungslinse bzw. mehrere Beugungslinsen, Deflektor/Array-Generatoren, hemisphärische Linsen, Kinoformen, Beugungsgitter, Fresnel-Mikrolinsen und/oder Nur-Phasen-Hologramme verwendet werden. Ein durchschnittlicher Fachmann weiß, daß ein „Beugungsgitter" eigentlich ein „Interferenzmuster" und kein „Beugungsmuster" erzeugt, was eine Sache der Semantik ist, die auf den ursprünglichen Namen „Beugungsgitter" zurückzuführen ist.
Das optische Beugungselement bzw. die optischen Beugungselemente können auch aus allen anderen geeigneten Materialien gemacht sein, wie beispielsweise einem transparenten Polymer oder Glas. Beispiele von transparenten Polymeren sind die, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem Polymethylmethacrylat, Polystyrol und einem Polyethylen mit hoher Dichte. Beispiele der Beugungsgitter sind die aus Metall oder Glas, Metall auf Polymer oder Metall mit Transmissionsöffnungen (Schlitze oder Löcher) Gefertigten. Andere geeignete optische Beugungselemente sind die aus fusioniertem Kieselgel oder Saphir Gefertigten. Die Wahl des Elements und das Abstimmen des Elements auf die Verfahrensbedingungen sind für Fachleute Routine.
Ein durchschnittlicher Fachmann versteht, daß UV-Licht weniger geeignet ist zur Verwendung mit Zellen. Wenn sichtbares Licht verwendet wird, wird keine Beeinträchtigung der Zellfunktion erwartet. Nur als Vorsichtsmaßnahme kann eine obere Grenze bei etwa 6 W/cm² (Watt pro Quadratzentimeter) liegen. Bei Infrarotlicht kann eine obere Grenze als Vorsichtsmaßnahme bei etwa 2,2 MW/cm² (Megawatt pro Quadratzentimeter) liegen.
Bei der Verwendung für Proteine kann eine obere Grenze als Vorsichtsmaßnahme bei etwa 8 mW/cm² (Milliwatt pro Quadratzentimeter) liegen. Es wird nicht angenommen, daß eine obere Grenze der Intensität sichtbaren Lichts die Anwendung der vorliegenden Erfindung für die Verwendung mit Proteinen einschränkt. Für die Verwendung mit Proteinen und Zellen kann eine lokale Erwärmung während der Polymerisierung sofort minimiert werden, z. B durch Verwendung von Harzen mit hohem Molekulargewicht und durch Verringern der Gesamtdauer der Polymerisierung.
Das Erzeugen eines Musters mit vorgemusterter elektromagnetischer Strahlung umfasst die direkte Erzeugung einer gemusterten Oberfläche, die natürlicherweise als ein Ergebnis der elektromagnetischen Strahlung auftritt, welche die Oberfläche des biokompatiblen Materials berührt. Die „lichtempfindliche Oberfläche" des biokompatiblen Materials kann daher einfach die „nicht modifizierte" Oberfläche des biokompatiblen Materials sein. Das „dabei Erzeugen" des Verfahrens kann daher ein dem Verfahren eigenes Merkmal sein.
„Dabei Erzeugen" kann auch Verfahren umfassen, bei denen die bestrahlte lichtempfindliche Oberfläche „entwickelt" wird, um die gemusterte Oberfläche bereit zu stellen. wo die lichtempfindliche Oberfläche nicht mit einem bestimmten lichtempfindlichen Material beschichtet ist, umfasst das Erzeugen der gemusterten Oberfläche nach der Bestrahlung vorzugsweise das „Entwickeln" des bestrahlten lichtempfindlichen Biomaterials, um die gemusterte Oberfläche zu erzeugen. „Entwickeln" umfasst in diesem Sinn vorzugsweise das Waschen oder Spülen in einer geeigneten Flüssigkeit oder einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise Wasser oder ein organisches Lösungsmittel.
Die Erfindung umfasst des weiteren indirektere Verfahren des Erzeugens gemusterter Oberflächen, d. h. bei denen die zu bestrahlende, lichtempfindliche Oberfläche nicht die nicht modifizierte Biomaterialoberfläche ist. Bei diesen Verfahren wird die lichtempfindliche Oberfläche hergestellt, indem eine lichtempfindliche Zusammensetzung, Mischung, Kombination, Beschichtung oder Schicht auf wenigstens eine erste Oberfläche des biokompatiblen Materials aufgetragen wird.
Die lichtempfindliche Zusammensetzung kann auf wenigstens eine erste Oberfläche des biokompatiblen Materials aufgetragen werden, indem das biokompatible Material mit einer Formulierung der lichtempfindlichen Zusammensetzung in einem flüchtigen Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird und das Lösungsmittel verdampft wird, um die lichtempfindliche Zusammensetzung auf die wenigstens eine erste Oberfläche als Schicht aufzubringen. Die lichtempfindliche Zusammensetzung kann auch auf wenigstens eine erste Oberfläche des biokompatiblen Materials aufgetragen werden, indem das biokompatible Material in einer wässrigen oder kolloidalen Lösung mit einer Formulierung der lichtempfindlichen Zusammenset zung in Kontakt gebracht wird, um die lichtempfindliche Zusammensetzung auf die wenigstens eine erste Oberfläche zu adsorbieren.
Eine funktionalisierende Vorbehandlung kann daher alternativ die folgende Schritte umfassen:
Alternative I:

(a) Auftragen einer lichtempfindlichen Schicht auf wenigstens eine erste Oberfläche eines Biomaterials;
(b) Erzeugen vorgemusterter Strahlung:
(c) Bestrahlen der lichtempfindlichen Schicht mit der vorgemusterten Strahlung, um eine bestrahlte Schicht zu bilden; und
(d) Entwickeln der bestrahlten Schicht, um ein Muster an der wenigstens einen ersten Oberfläche des Biomaterials zu erzeugen.

Alternative II:

(a) Auftragen einer lichtempfindlichen Schicht auf wenigstens eine erste Oberfläche eines Biomaterials;
(b) Erhalten einer monochromatischen Strahlungsquelle;
(c) Auftreffen der monochromatischen Strahlungsquelle auf ein Element, das die monochromatische Strahlung in eine gemusterte Strahlung umwandelt.
(d) Bestrahlen der lichtempfindlichen Schicht mit der vorgemusterten Strahlung, um eine bestrahlte Schicht zu bilden; und
(e) Entwickeln der bestrahlten Schicht, um ein Muster an der wenigstens einen ersten Oberfläche des Biomaterials zu erzeugen.

Alternative III:

(a) Auftragen einer lichtempfindlichen Schicht auf wenigstens eine erste Oberfläche eines Biomaterials;
(b) Erhalten einer monochromatischen Strahlungsquelle;
(c) Hindurch-Schicken der monochromatischen Strahlungsquelle durch ein Element, das die monochromatische Strahlung in eine gemusterte Strahlung umwandelt;
(d) Auftreffen der hindurch geschickten, gemusterten Strahlung auf die lichtempfindliche Schicht des Biomaterials, um eine bestrahlte Schicht zu bilden; und
(e) Entwickeln der bestrahlten Schicht, um ein Muster an der wenigstens einen ersten Oberfläche des Biomaterials zu erzeugen.

Es kann Jede aus einer großen Vielzahl von lichtempfindlichen Zusammensetzungen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen eine kombinierte wirksame Menge von wenigstens einem ersten Lichtauslöser und wenigstens einem ersten polymerisierbaren Bestandteil.
Geeignete lichtempfindliche Zusammensetzungen können eine die Polymerisierung auslösende Menge von wenigstens einem ersten, durch UV-Licht anregbaren Lichtauslöser umfassen, wie beispielsweise ein durch UV-Licht anregbarer Lichtauslöser ausgewählt aus der Gruppe besteht aus einem Benzoinderivat, Benzilketal, Hydroxyalkylphenon, Alpha-Aminoketon, Acylphosphinoxid, Benzophenonderivate und einem Thioxanthonderivat.
Andere lichtempfindliche Zusammensetzungen können eine die Polymerisierung auslösende Menge von mindestens einem ersten, durch sichtbares Licht anregbaren Lichtauslöser umfassen, wie beispielsweise einen durch sichtbares Licht anregbaren Lichtauslöser ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Eosin, Methylenblau, Bengalrosa, Dialkylphenacylsulfonium-butyltriphenylborat, ein fluoriertes Diaryltitanocen, ein Cyanin, ein Cyaninborat, ein Ketocoumarin und ein Fluoronfarbstoff. Die lichtempfindlichen Zusammensetzungen können des weiteren eine mitauslösende Menge von mindestens einem ersten Co-Initiator oder Beschleuniger umfassen, wie beispielsweise einen Co-Initiator oder Beschleuniger ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem tertiären Amin, Peroxid, Organotinverbindung, Borsalz und einem Imidazol.
Die Auswahl von Bestandteilen zur Verwendung in den lichtempfindlichen Zusammensetzungen ist für einen Fachmann offensichtlich. Im wesentlichen können alle Lichtauslöser oder Auslösesysteme und alle „Harze" (Arten von Verbindungen oder Monomere, die durch Licht polymerisiert werden können) kombiniert werden. Die Auswahl des Harzes ist daher groß. Beispielsweise ist ein geeignetes „multifunktionelles Acrylat" jedes Monomer, das acryliert werden kann.
Die Harzbestandteile werden in durch Licht polymerisierbaren Mengen, wie beispielsweise durch Licht polymerisierbare Mengen wenigstens eines ersten, monomeren, oligomeren oder polymeren polymerisierbaren Bestandteils, verwendet. Geeignete polymerisierbare Monomere umfassen die, die aus der Gruppe bestehend aus einem ungesättigten Fumarpolyester, Maleinsäurepolyester, Styrol, einem multifunktionellen Acrylatmonomer, einem Epoxid und einem Vinylether ausgewählt sind.
Eine derzeit bevorzugte, lichtempfindliche Zusammensetzung umfasst eine kombinierte wirksame Menge eines Eosinlichtauslösers, eines durch Polyethylenglycoldiacrylat polymerisierbaren Bestandteils und eines Triethanolaminbeschleunigers.
Die Vorbehandlungen der Erfindung erzeugen Muster mit einer Auflösung zwischen etwa 1 μm und etwa 500 μm; zwischen etwa 1 μm und etwa 100 μm; zwischen etwa 10 μm und etwa 100 μm; zwischen etwa 1 μm und etwa 10 μm; und zwischen etwa 10 μm und etwa 20 μm. Diese sind gut geeignet für biomedizinische Ausführungsformen, obgleich im wesentlichen ungeeignet für mikroelektronische Ausführungsformen, wie beispielsweise eine einzelne Zelle in dem Bereich zwischen 10 μm und 20 μm. Muster mit einer Auflösung von etwa 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 oder etwa 600 μm oder so können erzeugt und vorteilhaft eingesetzt werden.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß alle Verfahren bei einer biokompatiblen Temperatur durchgeführt werden können. Beispielsweise kann ein biokompatibles Material während der Bestrahlung auf einem temperaturgesteuerten Träger bleiben.
Die biokompatiblen Materialien werden entweder vor, während oder nach dem Mustern in Kontakt mit einer Menge einer mineralhaltigen Lösung gebracht, die wirksam ist, um wenig, moderate oder vorzugsweise ausgedehnte Mineralisierung auf wenigstens einer ersten Oberfläche des biokompatiblen Materials zu erzeugen. Solche Verfahren sind mit den Mineralisierungsverfahren verknüpft und umfassen das vorherige Inkontaktbringen mit einer mineralhaltigen Lösung.
Vorzugsweise wird das biokompatible Material während oder gleich nach der Erzeugung der gemusterten Oberfläche mit der mineralhaltigen Lösung in Kontakt gebracht, wobei ein mineralisiertes biokompatibles Material umfassend ein Muster von Mineralien auf wenigstens einer ersten Oberfläche gebildet wird. Des weiteren kann wenigstens eine erste mineraladhärente, biologische Zelle daraufhin an das mineralisierte, biokompatible Material gebunden werden, um auf wenigstens einer ersten Oberfläche des biokompatiblen Materials ein Muster von biologischen Zellen zu bilden.
Die Mineraladhärenz und/oder die Zelladhärenz können beide durch Aussetzen des biokompatiblen Materials und/oder des mineralisierten, biokompatiblen Materials gegenüber einer Population von Mineralien und/oder Zellen entweder in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Das Aussetzen kann entweder sequenziell oder simultan erfolgen.
In den Mineralisierungsverfahren der Erfindung wird eine ausgedehnte mineralisierte Oberfläche auf einem biokompatiblen Material durch ein Verfahren erzeugt, das das Funktionalisieren wenigstens einer ersten Oberfläche eines biokompatiblen Materials, um meh rere polare Sauerstoffgruppen an einer funktionalisierten Oberfläche darzustellen, und das Inkontaktbringen der funktionalisierten Oberfläche mit einer für die Erzeugung einer ausgedehnten Mineralisierung auf der wenigstens einen ersten Oberfläche des biokompatiblen Materials wirksamen Menge einer mineralhaltigen Lösung umfasst.
Das Verfahren kann das Erzeugen der funktionalisierten Oberfläche durch Aussetzen wenigstens einer ersten Oberfläche des biokompatiblen Materials gegenüber einer funktionalisierenden Vorbehandlung vor dem Kontakt mit der mineralhaltigen Lösung umfassen. wirksame funktionalisierende Vorbehandlungen umfassen das Aussetzen gegenüber einer wirksamen Menge elektromagnetischer Strahlung, wie beispielsweise UV-Strahlung; Aussetzen gegenüber einer wirksamen Menge einer Elektronenstrahl- (E-Strahl-) Bestrahlung; und Aussetzen gegenüber funktionalisierenden, biokompatiblen Chemikalien, wie beispielsweise einer wirksamen Menge einer NaOH-Lösung.
Die Verfahren umfassen auch Ein-Schritt-Verfahren, in denen die funktionalisierte Oberfläche während des Kontaktes mit der mineralhaltigen Lösung erzeugt wird. Solche aus einem Schritt bestehenden Verfahren zum Bilden eines mineralisierten Biomaterials, das eine ausgedehnte Mineralbeschichtung auf einer Biomaterialoberfläche umfasst, umfassen das Inkubieren eines mineralisierbaren Biomaterials mit einer für die Erzeugung einer funktionalisierten Biomaterialoberfläche, auf der sich während der Inkubation eine ausgedehnte Mineralbeschichtung bilden kann, wirksamen Menge einer mineralhaltigen Lösung, wie beispielsweise einer wässrigen Minerallösung. Diese Verfahren sind für die Verwendung mit Polymer- oder Copolymerbiomaterialien wie beispielsweise Polymilchsäure-(Polylactic Acid, PLA-)Polymer-, Polyglykolsäure-(Polyglycolic Acid, PGA-)Polymer- oder Polymilchsäure/Glykolsäure-(Polylactic-Co-Glycolic acid, PLG)-Copolymer-Biomaterialien, bevorzugt.
Alle Mineralisierungsverfahren, ob gemustert oder nicht, können eine mineralhaltige Lösung, die Calcium umfasst, verwenden, wobei die resultierende Mineralisierung bzw. ausgedehnte Mineralisierung eine ausgedehnte Calciumbeschichtung umfasst. Mineralhaltige Lösungen können auf wenigstens ein erstes und zweites Mineral umfassen, wobei die resultierende Mineralisierung bzw. ausgedehnte Mineralisierung eine Mischung der ersten und zweiten Minerale umfasst. Mineralhaltige Lösungen können des weiteren mehrere unterschiedliche Minerale umfassen, wobei die resultierende Mineralisierung bzw. ausgedehnte Mineralisierung eine heterogene, polymineralisierte Beschichtung umfasst.
Die Verfahren sind kontrollierbar, um Mineralisierung, ausgedehnte Mineralisierung, gemusterte Mineralisierung, ausgedehnte gemusterte Mineralisierung, im wesentlichen homogene Mineralbeschichtungen, hypermineralisierte Anteile oder Bereiche, innere Porenoberflächen poröser Materialien bereit zu stellen, wobei eine Mineral- bzw. eine ausgedehnte Mineralbeschichtung auf der inneren Porenoberfläche und/oder mehreren eigenständigen Mineralinseln erzeugt wird.
Verfahren zum Kontrollieren der Oberflächenmineralisierung von Biomaterialpolymeren umfassen das Verändern des Molekulargewichtes, der Polymerzusammensetzung, dem Verhältnis der Bestandteile in dem Polymer, der Herstellungstechnik oder der Oberflächeneigenschaften des Biomaterialpolymers vor dem Ausführen wenigstens eines ersten Oberflächenmineralisationsvorgangs. Die Verfahren erlauben die Kontrolle der Art der Oberflächenmineralisierung und den Grad der Oberflächenmineralisierung, beispielhaft dargestellt durch die Anzahl bzw. Größe von Mineralinseln an der Oberfläche des Biomaterialpolymers.
In einem Beispiel ist das Biomaterialpolymer ein Polymilchsäure/Polyglykolsäure (Polylactic-co-glycolic acid)-Copolymer-Biomaterial und das Verhältnis von Laktid- und Glykolidbestandteilen in der Copolymerzusammensetzung ist verändert. In einem anderen Bei spiel ist wenigstens eine erste Oberflächeneigenschaft der Polymerzusammensetzung verändert. Des weiteren können gesteuerte Oberflächendefekte für die Polymerzusammensetzung bereit gestellt sein, um eine kontrollierte Keimbildung der eigenständigen Mineralinseln an der Oberfläche des Biomaterialpolymers bereit zu stellen. Die Dichte solcher Oberflächendefekte kann verändert werden.
Die zeitliche Dauer des Oberflächenmineralisierungsprozesses kann ebenso verändert werden. Beispielsweise kann die Dauer des Oberflächenmineralisierungsprozesses ausgedehnt werden, bis sich eigenständige Mineralinseln an der Oberfläche des Biomaterialpolymers ausdehnen, um eine im wesentlichen homogene Mineralbeschichtung an der Oberfläche des Biomaterialpolymers zu bilden.
In allen diesen Verfahren kann die mineralhaltige Lösung eine Körperflüssigkeit oder ein synthetisches Medium sein, das sich wie eine Körperflüssigkeit verhält. Das biokompatible Material kann mit der mineralhaltigen Lösung durch Aussetzen gegenüber einer natürlichen oder synthetischen mineralhaltigen Lösung in vitro oder gegenüber einer mineralhaltigen Körperflüssigkeit in vivo in Kontakt gebracht werden.
Alle vorherigen Verfahren, sei es zum Mustern oder zur Mineralisierung oder für beide, sind für die direkte Verwendung bzw. für die Adaption für die Verwendung mit praktisch jedem biokompatiblen Material bzw. jeder biokompatiblen Vorrichtung geeignet. Beispielsweise können die biokompatiblen Materialien wenigstens einen ersten Anteil umfassen, der biologisch abbaubar, nicht biologisch abbaubar, 3-dimensional, gerüstähnlich, im wesentlichen 2-dimensional, 2-dimensional oder filmähnlich ist. Die biokompatiblen Materialien können wenigstens einen ersten Anteil umfassen, der eine zusammenhängende oder offene Porenstruktur hat.
Die biokompatiblen Materialien können des weiteren wenigstens einen ersten Anteil umfassen, der aus Metall, Bioglas, Aluminat, Biomineral, Biokeramik, Titan, biomineralbeschichtetes Titan, Hydroxylapatit, kohlensäurehaltiges Hydroxylapatit, Calciumcarbonat oder aus einem natürlich vorkommenden oder synthetischen Polymeranteil gefertigt ist. Die Polymere können ausgewählt sein aus Kollagen, Alginat, Fibrin, Matrigel, modifiziertem Alginat, Elastin, Chitosan, Gelatine, Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol, Pluronic, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyethylenterphthalat, Polyanhydrid, Polypropylenfumarat, einem Polymer, das mit Carboxylsäure angereichert ist, Polymilchsäure-(Polylactic Acid, PLA-)Polymer, Polyglykolsäure-(Polyglycolic Acid, PGA-)Polymer, Polymilchsäure/Glykolsäure-(Polylactic-Co-Glycolic acid, PLG)-Copolymer und PLG-Copolymeren mit einem Verhältnis von etwa 85 Prozent Lactid zu etwa 15 Prozent Glykolid.
Die biokompatiblen Materialien können des weiteren wenigstens einen ersten Anteil umfassen, der durch einen Prozess hergestellt ist, das Aufschäumen mit Gas (gas foaming) und das Auslaugen von Teilchen (particle leaching) umfasst, wobei optional wenigstens eine erste bioaktive Substanz mit dem biokompatiblen Material während des Gasaufschäum- und Teilchenauslaugprozesses operativ assoziiert ist.
Der Gasaufschäum- und Teilchenauslaugprozess kann die folgenden Schritte umfassen:

(a) Herstellen einer Mischung, die wenigstens ein auslaugbares Teilchenmaterial sowie zur Bildung eines porösen, abbaubaren Polymerbiomaterials fähige Partikel enthält;
(b) Anwenden eines Gasaufschäumprozesses auf die Mischung, so daß ein poröses abbaubares Polymerbiomaterial entsteht, das auslaugbares Teilchenmaterial enthält; und
(c) Anwenden eines das auslaugbare Teilchen- material aus dem porösen abbaubaren Polymerbiomaterial entfernenden Auslaugprozesses auf das poröse ab baubare Polymerbiomaterial, wodurch zusätzliche Porosität geschaffen wird.

Der Auslaugprozess kann das Inkontaktbringen des porösen abbaubaren Polymerbiomaterials mit einem mineralhaltigen Auslaugmaterial umfassen.
Die biokompatiblen Materialien können des weiteren mindestens einen ersten Anteil umfassen, der im wesentlichen eine ebene Oberfläche oder eine konturierte Oberfläche ist. Als solche kann das biokompatible Material als wenigstens ein Anteil einer implantierbaren Vorrichtung gefertigt sein.
Die vorhergehenden Verfahren und resultierenden biokompatiblen Materialien und Vorrichtungen können des weiteren eine biologisch wirksame Menge wenigstens einer ersten bioaktiven Substanz, eines bioaktiven Arzneimittels oder einer biologischen Zelle, zweier solcher bioaktiver Substanzen, Arzneimittel oder biologischen Zellen oder mehrerer solcher bioaktiver Substanzen, Arzneimittel oder biologischen Zellen, umfassen.
Gemusterte biokompatible Materialien können deshalb gegenüber wenigstens einem ersten zur Bindung fähigen Mineral, einer ersten zur Bindung fähigen, bioaktiven Substanz oder einer ersten zur Bindung fähigen, biologischen Zelle ausgesetzt sein, wobei ein biokompatibles Material umfassend ein Mineral, eine bioaktive Substanz oder eine biologische Zelle, die in einem Muster an wenigstens eine erste Oberfläche davon gebunden sind, gebildet wird. Alle resultierenden, gemusterten, mineralisierten, biokompatiblen Materialien können gegenüber wenigstens einer ersten mineraladhärenten Zelle ausgesetzt werden, wobei ein mineralisiertes biokompatibles Material mit wenigstens einer, in einem Muster an wenigstens eine erste Oberfläche des biokompatiblen Materials gebundenen, ersten Zelle gebildet wird.
Es können Wachstumsfaktoren und/oder Adhäsionsliganden verwendet werden, um mit Wachstumsfaktor oder Adhäsionsligand beschichtete biokompatible Materialien mit wenigstens einem, in einem Muster an wenigstens eine erste Oberfläche des biokompatiblen Materials gebun denen, ersten Wachstumsfaktor oder Adhäsionsliganden, zu bilden. Solche mit Wachstumsfaktor oder Adhäsionsligand beschichtete biokompatible Materialien können gegenüber wenigstens einer ersten an Wachstumsfaktor- oder Adhäsionsligand-adhärente Zelle ausgesetzt werden, wobei ein mineralisiertes biokompatibles Material mit wenigstens einer ersten in einem Muster an wenigstens eine erste Oberfläche des biokompatiblen Materials gebunden Zelle gebildet wird.
Die bioaktive(n) Substanz(en) umfassen DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, Antisense-Nukleinsäuren, Ribozyme, Plasmide, Expressionsvektoren, virale Vektoren, rekombinante Viren, Markerproteine, Transkriptions- oder Elongationsfaktoren, Zellzyklusregulierungsproteine, Kinasen, Phosphatasen, DNA-Reparaturproteine, Onkogene, Tumorsuppressoren, angiogene Proteine, antiangiogene Proteine, Zelloberflächenrezeptoren, akzessorische Signalmoleküle, Transportproteine, Enzyme, antibakterielle Agenzien, antivirale Agenzien, Antigene, Immunogene, Apoptosis induzierende Agenzien, Antiapoptosisagenzien und Zytotoxine.
Die bioaktive(n) Substanz(en) umfassen des weiteren Hormone, Neurotransmitter, Wachstumsfaktoren, Hormon-, Neurotransmitter- bzw. Wachstumsfaktorrezeptoren, Interferone, Interleukine, Chemokine, Zytokine, koloniestimulierende Faktoren, chemotaktische Faktoren, Bestandteile der extrazellulären Matrix oder Adhäsionsmoleküle, Liganden und Peptide, wie beispielsweise Wachstumshormon, PTH (Parathyroid Hormone), BMP (Bone Morphogenetic Protein), TGF-a (Transforming Growth Factor-a), TGF-bl, TGF-b2, FGF (Fibroblast Growth Factor), GMCSF (Granulocyte/Macrophage Colony Stimulating Factor), EGF (Epidermal Growth Factor), PDGF (Platelet Derived Growth Factor), IGF (Insulin-like Growth Factor), HGF (Scatter Factor/Hepatocyte Growth Factor), Fibrin, Kollagen, Fibronectin, Vitronectin, Hyaluronsäure, ein RGD-haltiges Peptid bzw. Polypeptid, ein Angiopoietin oder VEGF (Vascular Endothelial Cell Growth Factor).
Die biologischen Zellen umfassen Knochenvorläuferzellen, Fibroblasten, Endothelvorläuferzellen, Stammzellen, Makrophagen, Fibroblasten, Gefäßzellen, Osteoblasten, Chondroblasten, Osteoklasten und rekombinante Zellen, die ein exogenes Nukleinsäuresegment bzw. exogene Nukleinsäuresegmente exprimieren, das in den Zellen transkribierte oder translatierte Produkte herstellt, die in den Zellen transkribierte oder translatierte Produkte herstellen.
Die biokompatiblen Materialien können des weiteren eine kombinierte, biologisch wirksame Menge wenigstens einer ersten bioaktiven Substanz und wenigstens einer ersten biologischen Zelle umfassen. Beispielsweise eine kombinierte, biologisch wirksame Menge wenigstens eines ersten osteotropen Wachstumsfaktors oder einer Nukleinsäure eines osteotropen Wachstumsfaktors und eine Zellpopulation umfassend Knochenvorläuferzellen; oder eine kombinierte, biologisch wirksame Menge von VEGF oder eine VEGF-Nukleinsäure und eine Zellpopulation umfassend.
Die wenigstens eine erste bioaktive Substanz, das wenigstens eine erste Arzneimittel bzw. die wenigstens eine erste biologische Zelle können vor, während oder nach dem Oberflächen modifizierenden Prozess in das biokompatible Material eingebaut werden. Der Einbau in gemusterte Oberfläche(n) ist ein Vorteil, da die bioaktive Substanz, das Arzneimittel bzw. die biologische Zelle in einem Muster an die gemusterte Oberfläche gebunden sind. Das biokompatible Material kann wenigstens eine erste mineralisierte Oberfläche umfassen, wobei eine mineraladhärente bioaktive Substanz, ein mineraladhärentes Arzneimittel oder eine mineraladhärente biologische Zelle an die mineralisierte Oberfläche gebunden sein können.
Die vorliegende Erfindung deckt ferner alle oberflächenmodifizierten, biokompatiblen Materialien, Kits, Strukturen, Vorrichtungen und implantierbare, biomedizinische Vorrichtungen mit wenigstens einem ersten Anteil ab, die durch eines der vorhergehenden Ver fahren, Prozesse oder Mittel und Kombinationen davon hergestellt sind. Solche oberflächenmodifizierten, biokompatiblen Materialien können in der Zellkultur, Zelltransplantation, im Tissue-Engineering und/oder der gesteuerten Geweberegeneration und bei der Herstellung von einem Arzneimittel oder therapeutischen Kit bzw. mehreren Arzneimitteln oder therapeutischen Kits zur Verwendung für die Behandlung eines eine Zelltransplantation, ein Tissue-Engineering und/oder eine gesteuerte Geweberegeneration erfordernden Krankheitszustandes verwendet werden.
Verfahren der Erfindung umfassen die Verfahren für das Kultivieren von Zellen, zu denen das Züchten einer Zellpopulation in Kontakt mit einem oberflächenmodifizierten, biokompatiblen Material gemäß der vorliegenden Erfindung gehört. Die Zellpopulation kann mit dem oberflächenmodifizierten, biokompatiblen Material unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die zur Bildung einer zwei- bzw. dreidimensionalen, gewebeähnlichen Struktur, wie beispielsweise knochenähnlichen Gewebe oder neovaskularisiertem oder vaskularisierten Gewebe, führen, in Kontakt gehalten werden.
Solche Verfahren können in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Die kultivierten Zellen können von einem oberflächenmodifizierten, biokompatiblen Material getrennt werden und für ein Tier bereit gestellt werden bzw. für ein Tier bereit gestellt werden, während sie sich noch immer in Kontakt mit dem oberflächenmodifizierten, biokompatiblen Material befinden.
Zu den medizinischen Verwendungen gehört die Verwendung für das Transplantieren von Zellen in ein Tier, umfassend das Auftragen einer biologisch wirksamen Menge einer zell-biokompatiblen Materialzusammensetzung auf eine Gewebestelle eines Tieres, die eine sich in operativer Assoziation mit einem oberflächenmodifizierten, biokompatiblen Material gemäß der vorliegenden Erfindung befindende Zellpopulation umfasst.
Zu den weiteren Verwendungen gehört die Verwendung für das Tissue-Engineering in einem Tier, umfas send das Auftragen einer biologisch wirksamen Menge einer biokompatiblen Materialzusammensetzung, die ein Gerüst für Gewebewachstum darstellt und die ein oberflächenmodifiziertes, biokompatibles Material gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, auf eine Gewebevorläuferstelle eines Tieres.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Beschreibung und sind enthalten, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung ausführlicher zu demonstrieren. Die Erfindung kann durch Bezugnahme auf eine dieser Zeichnungen bzw. mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der hierin dargestellten Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen besser verstanden werden.
1. FTIR-Spektren, die die Entwicklung von Phosphat(*)- und Carbonat(^)-Spitzen mit ansteigender Inkubationsdauer in SKF darstellen. Die Polymilchsäure/Glykolsäure-Copolymer wiedergebenden Spitzen sind ebenfalls markiert (o). Die Inkubationsdauer ist auf der rechten Seite jedes Spektrums angezeigt.
2. Prozentuale Erhöhung der Masse gegenüber der Inkubationsdauer von in SKF inkubierten Gerüsten (o) und in Tris-Puffer (pH = 7,4) inkubierten (|) Kontrollproben. Der Graph zeigt einen Trend hinsichtlich einem Massezuwachs von SKF-inkubierten Gerüsten, was zu einem Massezuwachs von 11 ± 2% nach 16-tägiger Inkubation führt.
3. Die Masse von in den Gerüsten vorhandenem Phosphat im Vergleich zur Inkubationsdauer.
4. Kompressionsmodul im Vergleich zur Inkubationsdauer für in SKF inkubierte Gerüste (o) und in Tris-Puffer (pH = 7,4) inkubierte (x) Kontrollproben.
5. Prozentanteil der Erhöhung der Masse gegenüber der Inkubationsdauer für in simulierter Körperflüssigkeit (SKF) inkubierte PLG-Gerüste. Die Werte stellen Mittelwerte und Standardabweichung dar (n = 3).
6. Die Massen an Phosphat, die in den Gerüsten vorhanden ist, im Vergleich zu der Inkubationsdauer in SKF. Die Werte stellen Mittelwerte und Standardabweichung dar (n = 3).
7. Kumulative Freisetzung von VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) aus mineralisierten (X) und nicht mineralisierten (n) Gerüsten. Die Werte stellen Mittelwerte und Standardabweichung dar (n = 5).
8A. Stimulatorischer Effekt der VEGF-Freisetzung aus mineralisierten (n) und nicht mineralisierten (p) Gerüsten auf menschliche, mikrovaskuläre Hautendothelzellen. Die Zellzahlen für jedes Freisetzungs-Zeitintervall sind als Prozentanteile des Kontrollwerts (gestreifter Balken) für das jeweilige Intervall angegeben. Werte, die signifikant größer sind als ihre entsprechende Kontrolle sind durch *s angezeigt. Die Werte stellen Mittelwerte und Standardabweichung dar (n = 5).
8B. Dosis-Wirkungskurven der Proben, die die mitogene Wirkung von VEGF auf menschliche mikrovaskuläre Hautendothelzellen zeigen. Die Werte stellen Mittelwerte und Standardabweichung dar (n = 5).
9. Einbau von VEGF in PLG-Gerüste während einer Inkubation in SKF (⎞) und Tris-HCl-Puffer (1).
Beschreibung von veranschaulichenden Ausführungsformen
Der Schwerpunkt orthopädischer Strategien des Tissue-Engineering lag häufig auf der Verwendung natürlicher oder synthetischer, abbaubarer Materialien als Gerüste für die Zelltransplantation (Langer and Vacanti, 1993; Crane et al. 1995; Putnam and Mooney, 1996) oder als ein Mittel für die Steuerung der Regeneration durch native osteogene Zellen (konduktive Strategien) (Minabe, 1991). Beim Engineering von Knochengewebe waren konduktive Strategien und Zelltransplantationsstrategien in gewissem Maß erfolgreich (Ripamonti, 1992; Ishaug-Riley, 1997; Shea et al., „Bone formation from pre-osteoblasts on 3-D scaffolds", eingereicht). Der Grad des Erfolgs dieser Tissue-Engineering-Verfahren hängt von den Eigenschaften des Gerüstes ab.
Grundlegende Maßgaben an das Design eines Gerüstes umfassen Abbaubarkeit, Biokompatibilität, hohes Verhältnis von Oberflächenbereich zu Volumen, Osteokonduktivität und mechanische Integrität. Ein biokompatibles Gerüstmaterial, das über einen kontrollierbaren Zeitraum zu ungiftigen Abbauprodukten abgebaut werden kann, würde gleichzeitig mit der Bildung neuen Gewebes verschwinden und Gewebe so natürlich ersetzen. Ein hohes Verhältnis von Oberflächenbereich zu Volumen erlaubt einen Massetransport zwischen Zellen innerhalb des Gerüstes und dem umliegenden Wirtsgewebe und bietet Platz für das Einwachsen von fibrovaskulärem Gewebe.
Osteokonduktivität ist wichtig für das Binden und die Migration transplantierter und/oder nativer osteogener Zellen. Mechanische Integrität ist erforderlich, um zellulären, kontraktilen Kräften während der Gewebeentwicklung Stand zu halten, um die Erhaltung der ursprünglichen Form des Gerüstes sicherzustellen (Kim and Mooney, 1998).
Die Abbaubarkeit, Biokompatibilität und das hohe Verhältnis von Oberflächenbereich zu Volumen von Gerüsten kann durch die geeignete Wahl von synthetischem oder natürlichem Material und des Verarbeitungsansatzes erreicht werden. Polymilchsäure, Polyglykolsäure und deren Copolymere wurden bei Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt, da bei ihnen ein kontrollierbarer, hydrolytischer Abbau zu natürlichen Metaboliten stattfindet (Gilding, 1981; Li et al., 1990) und sie durch eine Vielzahl von Verfahren zu hoch porösen Gerüsten verarbeitet werden können (Harris et al., 1998; Lo et al., 1995; Mikos and Thorsen, 1994).
Eine Einschränkung hinsichtlich des Engineering vieler Gewebetypen einschließlich Knochengewebe ist die Unfähigkeit, schnelles vaskuläres Einwachsen während der Gewebeentwicklung zu induzieren (Mooney et al., 1997). Die Lebensfähigkeit transplantierter Zellen und/oder von Wirtszellen, die aus dem nativen Gewebe in das Gerüst einwandern, hängt vom Transport von Nährstoffen und Abfallprodukten zwischen den Zellen und dem Wirtsgewebe ab.
Transport ist zu Beginn allein auf Diffusion zurückzuführen und Zellen mit einem Abstand von mehr als einigen hundert Mikron zu den Blutgeweben in den umliegenden Geweben wandern nicht in das Transplantat ein oder sterben aufgrund von Sauerstoffmangel (Colton, 1995). Studien zeigen, daß Blutgefäße ein makroporöses Gerüst infiltrieren, um einen verstärkten Transport zu engineerten Geweben zu gewährleisten, aber der Prozess läuft mit einer Geschwindigkeit von weniger als 1 mm pro Tag ab und es dauert typischerweise ein bis zwei Wochen für die vollständige Penetration vaskulären Gewebes in relativ dünne (z. B. 3 mm dicke) Gerüste (Mikos et al., 1993; Mooney et al., 1994).
Die vorliegende Erfindung stellt verbessere Biomaterialien für die Verwendung im Tissue-Engineering bereit. Durch die Entwicklungen der Erfindung werden verschiedene der früheren Nachteile überwunden. Bestimmte, bereitgestellte Materialien sind biologisch abbaubare, poröse Polymere mit homogenen Oberflächenschichten von Mineralen und mineralisierten inneren Poren. Es sind auch poröse Polymermaterialien bereit gestellt, die kontinuierliche Mineralschichten in Kombination mit bioaktiven Faktoren aufweisen. Andere, bereitgestellte Materialien sind gemusterte Materialien, an die jeder mineralische und/oder biologische Bestandteil in einer räumlich kontrollierten Art und Weise gebunden werden kann.
Die gemusterten und/oder mineralisierten Polymere mit bioaktiven Faktoren sind bereitgestellt, um mehr Kontrolle über die Prozesse der Bildung und Regeneration von Gewebe zu erhalten bzw. diese zu unterstützen. Es können beispielsweise Wachstumsfaktoren verwendet werden, die Zellen dazu veranlassen, sich in einer spezifischen Art und Weise zu verhalten (Giannobile, 1996). Es sind mehrere Faktoren identifi ziert worden, die Chemotaxis, Proliferation, Differenzierung und Matrixsynthese spezifischer Zelltypen induzieren, von denen jeder bzw. mehrere in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Obgleich bestimmte Systeme für den Transport von Faktoren vorgeschlagen worden sind (Langer, 1990; Whang et al., 1998; Wheeler et al., 1998: Shea et al., 1999; Sheridan et al., J. Cont. Rel., in Druck), müssen makroporöse Matrizen für das Tissue-Engineering weiter verbessert werden. Die Erfinder argumentierten, daß der Einschluss bioaktiver Faktoren in ein Gerüst ein höheres Maß an Kontrolle über die Zellfunktion in und angrenzend zu einem Gerüstkonstrukt erlauben würde, womit spezifische Einschränkungen in Bezug auf konduktive und zellbasierte Tissue-Engineering-Verfahren angesprochen werden.
Bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung stellen daher Gerüste bereit, die die Abbaubarkeit, Biokompatibilität und Osteokonduktivität mineralisierter Gerüste mit den gewebeinduktiven Eigenschaften bioaktiver Polypeptide kombinieren. Mustern erlaubt ein zusätzliches Maß an Kontrolle. Die Erfindung erreicht das Wachstum von knochenähnlichem Mineral auf den inneren Porenoberflächen eines Gerüstes, das einen Wachstumsfaktor enthält, ohne die Bioaktivität des Faktors oder die Porosität des Gerüstes zu beeinträchtigen. Der Wachstumsfaktor ist beispielsweise VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), ein potentes Mitogen für menschliche mikro- und makrovaskuläre Endothelzellen, der keine mitogenen Auswirkungen auf andere Zellarten hat (Leung et al., 1989).
Die mineral- und VEGF-haltigen Matrizen der vorliegenden Erfindung werden besonders für die Verwendung beim Induzieren einer gleichzeitig mit dem Engineering von Knochengeweben stattfindenden Neovaskularisierung in Betracht gezogen. Verstärkte Bildung von vaskulärem Gewebe während der Gewebeentwicklung führt zu einer verstärkten Lebensfähigkeit nativer und/oder transplantierter osteogener Zellen in einem Gerüst, was das Engineering eines größeren Volumens von Knochengewebe ermöglicht.
Andere bioaktive Faktoren für die Verwendung in dieser Erfindung umfassen Wachstumshormon (Growth Hormone, GH), PTH, einschließlich PTH1-34 (Parathyroid Hormone), BMPs (Bone Morphogenetic Proteins), wie beispielsweise BMP-2A, BMP-2B, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 und BMP-8; TGF-a (Transforming Growth Factor-a), TGF-bl und TGF-b2, FGF (Fibroblast Growth Factor), GMCSF (Granulocyte/Macrophage Colony Stimulating Factor), EGF (Epidermal Growth Factor), PDGF (Platelet Derived Growth Factor), ein IGF (Insulin-like Growth Factor) und LIF (Leukemia inhibitory factor).
Tatsächlich können praktisch alle Proteine oder Polypeptide eines Hormons, Neurotransmitters, Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezeptors, Interferons, Interleukins, Chemokins, Zytokins, koloniestimulierenden Faktors und/oder chemotaktischen Faktors verwendet werden. Weitere Beispiele umfassen Transkriptions- oder Elongationsfaktoren, Zellzyklusregulierungsproteine, Kinasen, Phosphatasen, DNA-Reparaturproteine, Onkogene, Tumorsuppressoren, angiogene Proteine, anti-angiogene Proteine, eine Immunantwort stimulierende Proteine, Zelloberflächenrezeptoren, akzessorische Signalmoleküle, Transportproteine, Enzyme, antibakterielle und/oder antivirale Proteine oder Polypeptide und dergleichen, je nach beabsichtigter Verwendung der letztendlichen Zusammensetzung.
Die Biomaterialien der Erfindung mit dreidimensional gemusterten Oberflächen erlauben die hinsichtlich der jeweiligen Stelle kontrollierte Mineralisierung und zelluläre Ablagerung. Die dreidimensionalen, oberflächengemusterten Biomaterialien der vorliegenden Erfindung sind „intelligente" Biomaterialien, die biologische Moleküle und Zellen vorzugsweise an spezifischen Stellen binden. Die bereichsspezifischen Oberflächeneigenschaften erlauben die Kontrolle über die Stelle und die Aktivität von Zellen, die sich an das Bioma terial anheften, wenn sie sowohl bei der Zellkultur als auch bei der Implantation in vivo verwendet werden.
Diese Aspekte der Erfindung stellen einen wichtigen Vorteil dar, da die Kontrolle über die „Stellen" der Zellablagerung und -aktivität als mindestens genauso wichtig wie das Kontrollieren der „Eigenschaften" der Zellaktivität angesehen wird. Das Kontrollieren der Stelle auf der Oberfläche eines Biomaterials, an der aktive Zellen vorhanden sind, könnte sich als wichtigste Determinante bei der Geweberegeneration erweisen. Die Techniken der vorliegenden Erfindung sind besonders vorteilhaft, da sie die Fähigkeit zur Kontrolle der Stellen des Vorhandenseins und der Aktivität von Zellen auf der Oberfläche eines Biomaterials im Mikronbereich vermitteln.
A. Ausgedehnte Mineralbildung
Bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung sind Prozesse für das Verändern von Biomaterial durch Züchten einer ausgedehnten bzw. homogenen Mineralschicht auf der Oberfläche. Poröse degradierbare Polymerbiomaterialien sind bevorzugt für solche Prozesse, wie z. B. Polymilchsäure (Polylactic Acid, PLA), Polyglykolsäure (Polyglycolic Acid, PGA) und Polymilchsäure/Polyglykolsäure (Polylactic-Co-Polyglycolic Acid, PLGA).
Der Grund der Erfinder für das Beschichten dieser Materialien mit Mineralen ist, daß mineralähnliche Beschichtungen für das Wachstum von Knochen in ein poröses Material und/oder für die Adhäsion an ein Substrat wichtig sind. Dieser Prozess beruht auf der Beobachtung, daß Organismen in der Natur verschiedene Makromoleküle verwenden, um Keimbildung und Wachstum von Mineralphasen zu kontrollieren (Campbell et al., 1996; Lowenstein and Weiner, 1989). Diese Makromoleküle enthalten in der Regel funktionelle Gruppen, die beim Kristallisations-pH-Wert negativ geladen sind (Weiner, 1986). Es besteht die Hypothese, daß diese Gruppen in dem umgebenden Medium vorhandene Ionenarten chelieren, was die Kristallkeimbildung stimuliert (Campbell et al., 1996).
Beobachtungen im Hinblick auf natürliche Mineralisierungsprozesse wurden vorher nicht auf die Verwendung in Verbindung mit Biomaterialien oder Tissue-Engineering-Prozessen abgestimmt. Die vorliegenden Erfinder erkannten jedoch, daß ein Biomaterialsubstrat im Labor funktionalisiert werden kann, um die Induktion einer Mineralablagerung zu erlauben.
Die Erfinder erkannten weiter, daß das Vorhandensein einer ausgedehnten bzw. homogenen Mineralschicht auf der Oberfläche eines Biomaterials die Fähigkeit zur wirksamen Regenerierung von Knochengewebe unterstützt. Hierin beschrieben sind verschiedene Verfahren, um eine solche ausgedehnte bzw. homogene Oberflächenmineralisierung zu erreichen. Es wird jedoch auch eine gemusterte (bzw. heterogene) Oberflächenmineralisierung für die Verwendung in bestimmten Ausführungsformen in Betracht gezogen und kann vorteilhaft durch die hierin offenbarten Musterungstechniken erreicht werden.
B. Kontrollieren der Stellen, an denen Zellaktivität vorhanden ist
Kürzlich erzielte Fortschritte bei der Kontrolle zellulärer Prozesse haben gezeigt, wie nützlich das Kontrollieren der Eigenschaften von Zellaktivität ist. Diese Arbeiten befassten sich jedoch nicht mit der spezifischen Kontrolle der Stellen der Adhäsion von Zellen an ein Biomaterial. Die vorliegenden Erfinder sehen die Kontrolle über „Stellen", an denen Zellaktivität vorhanden ist, als genauso wichtig an, wie die Kontrolle der Kennzeichen der Zellaktivität.
Speziell auf dem Gebiet der Regenerierung von Knochengewebe ist die Bildung einer knochenähnlichen Mineralschicht auf dem Biomaterial im Körper eine Voraussetzung dafür, daß Biomaterialien an lebenden Kno chen binden. Diese Beobachtung war für die Erfinder Anlass für die Annahme, daß das Vorhandensein bzw. Nicht-vorhandensein des Minerals bestimmen könnte, ob sich Knochenzellen an ein Biomaterial anheften und danach darauf einwirken oder nicht. Sie argumentierten also, daß die spezifische Kontrolle über die Stelle, an der das Mineral auf einer Biomaterialoberfläche vorhanden ist, die Kontrolle über Stellen, an denen Knochenzellaktivität vorhanden ist, erlaubt. Die Musterung von Mineralen auf der Oberfläche eines Biomaterials sollte daher einen grundlegenden Effekt auf die Eigenschaften des regenerierten Knochengewebes haben.
Um die Stellen der Zelladhäsion an eine dreidimensionale Polymeroberfläche zu kontrollieren, stellt die vorliegende Erfindung des weiteren mehrere neue Verfahren zum Behandeln von Biopolymeren vor dem Aussäen von Zellen bereit. In einem erstaunlich einfachen Verfahren führt das Vorbehandeln nur bestimmter Bereiche oder Unterabschnitte von Biopolymermaterialien oder Gerüsten mit mineralhaltigen, wässrigen Lösungen zu einer lokalisierten Mineralisierung nur in den Bereichen, die in Kontakt mit der mineralisierenden Lösung sind. Das Behandeln der Polymerbiomaterialien im Mikronbereich wird vorzugsweise durch Verwendung eines Prozesses oder zweier unterschiedlicher Prozesse erreicht: Oberflächenfotolyse und/oder Oberflächenelektrolyse.
Die gemusterten Fotolyse- und Elektrolyseverfahren der vorliegenden Erfindung sind für die Verwendung mit porösen, biologisch abbaubaren Polymergerüsten geeignet. Die Verfahren zur Oberflächenmanipulation der vorliegenden Erfindung sind insofern erstaunlich, als daß die Anpassung der Techniken aus der Elektronenstrahllithografie der Erfinder es erstmals ermöglicht hat, Muster auf dreidimensionalen Biomatrizen aufzutragen und nicht auf zwei Dimensionen beschränkt zu sein. Dreidimensionale Matrizen sind im Allgemeinen wirksamer, wenn ein Biomaterialgerüst zur Verwendung für die Geweberegeneration erzeugt werden soll.
Mit den unterschiedlichen Musterungstechniken der Erfindung können daher Stellen speziell für Knochenzellen (Mineralmusterung) und generell für alle Zellarten (Polymeroberflächenbehandlung ohne Mineralbildung) kontrolliert werden. Die Unterschiede der Verarbeitung für eine Kontrolle von Knochenzellen gegenüber einer Kontrolle anderer Zelltypen sind hierin beschrieben.
Wie auch in den ausführlichen Beispielen beschrieben ist, handelt es sich bei allen Prozessen der vorliegenden Erfindung um Prozesse, die bei Raumtemperatur ablaufen. Es können daher spezifische bioaktive Substanzen, Arzneimittel und Proteine, wie beispielsweise Adhäsionsmoleküle, Zytokine, Wachstumsfaktoren und dergleichen in den Musterungsprozess und das resultierende Biomaterial eingebaut werden. Proteine können auch in das Zellkulturmedium aufgenommen werden und so die Materialoberfläche mustern und eine Anheftung spezifischer Zellen verursachen.
C. Fotolyse
Bestimmte Verfahren der Erfindung für das Funktionalisieren der Oberfläche eines Biomaterials, um eine Mineralisierung und/oder die Kontrolle über den Ort der Zellen zu ermöglichen, beruhen auf Bestrahlungsprozessen (mit oder ohne Musterung). Um auf einer Biomaterialoberfläche eine homogene Mineralschicht zu erhalten, werden Bestrahlungsprozesse ohne Musterung verwendet. Um eine Kontrolle des Ortes der Zellen oder die Mineralisierung zu erhalten, werden gemusterte Bestrahlungsprozesse verwendet.
Die Behandlung von Polymerbiomaterialien mit elektromagnetischer Strahlung (EM-Strahlung) verursacht einen Oberflächenabbau über eine Fotolysereaktion. Geeignete Strahlung umfasst alle Wellenlängen von EM-Strahlung, einschließlich ultraviolette Strahlung, sichtbares Licht, Infrarotstrahlung, etc. Diese Art des Oberflächenabbaus, wie der mit NaOH erreichte, verur sacht einen Anstieg der Menge an funktionalen, polaren Sauerstoffgruppen auf der Oberfläche des Materials.
Unter Interpretation von Ergebnissen aus eigenständigen Studien über knochenbindende Polymere (Li et al. 1997) argumentieren die Erfinder, daß die gebildeten, polaren Sauerstoffgruppen eine Mineralkeimbildung auf der Oberfläche des Biomaterials auslösen würden, wenn es sich in einer Körperflüssigkeit befindet. Die Erfinder erkannten daher, daß die Fähigkeit, eine dreidimensionale Oberfläche mit funktionellen Gruppen zu mustern, die Möglichkeit eröffnen würde, die Oberfläche eines Biomaterials durch Mineralbildung und Zelladhäsion zu mustern.
Leider waren die früher verfügbaren EM-Bestrahlungstechniken alle auf Anwendungen mit zweidimensionalen Objekten beschränkt. Herkömmliche, optische „Kontakt"-Lithografietechniken sind deshalb auf zwei Dimensionen beschränkt, weil ein enger Kontakt zwischen einer Maske oder einem Kontaktgitter und dem zu musternden Objekt vorhanden sein muss. Vor der vorliegenden Erfindung gab es daher keinen Mechanismus für das Herstellen von Oberflächenmustern auf der Art von dreidimensionalen, oberflächenkonturierten Materialien, die beim Tissue-Engineering von größtem Nutzen sind.
Lithografietechniken basieren auf dem Passieren monochromatischer EM-Strahlung durch ein optisches Gitter, um ein Strahlungsmuster auf einer Fläche herzustellen, die sich auf der anderen Seite des Musters von der EM-Strahlenquelle befindet. Das gebildete Muster kann einfach aus Rändern bestehen, die gleichmäßigen Abstand zueinander haben und von einem Gitter mit Schlitzen, die einen gleichmäßigen Abstand zu einander haben, gebildet wird, oder es kann so kompliziert wie ein komplexes Hologramm sein.
Die vorliegende Erfindung stellt einen signifikanten Fortschritt für die Technik des Tissue-Engineering dar, indem Verfahren für die Verwendung von EM-Strahlung zum Mustern von dreidimensionalen Biopolymeren bereitgestellt werden. In den erfindungsgemäßen Verfahren ist die „Fläche" das Polymerbiomaterial. Dieses System läuft auf den Ansatz einer „Beugungslithografie" hinaus, allerdings unterscheidet sich der Prozess von der herkömmlichen, optischen Kontaktlithografie insofern, als daß das Gitter nicht als eine Maske für das Polymer dient, so daß ein naher Kontakt zwischen dem Gitter und dem Polymer nicht erforderlich ist.
In den vorliegenden Verfahren stellt das Gitter ein Muster aus konstruktiver und destruktiver Interferenz auf der Polymeroberfläche her. Da sich das Gitter während der Behandlung nicht in nahem Kontakt mit dem Biomaterial befinden muss, kann dieser Beugungslithografieprozess verwendet werden, um Materialien mit komplexen dreidimensionalen Konturen zu behandeln. Dies ist außerdem eine überraschende Anwendung der früheren Technologie, da die nun angewandte Technik die Linienbreite aufgeben würde, wenn sie in früheren Ausführungsformen verwendet werden würde, so daß es ohne die besonderen Einblicke der Erfinder in Bezug auf das Mustern einer dreidimensionalen Matrix keine Veranlassung zur Entwicklung dieser Verfahrensweise gäbe. Des Weiteren muss die „Kontaktmaske" nicht entfernt werden, was die sterile Natur der Biotechnik verbessert.
Bestimmte Arten von dreidimensionalen Biomatrizen, die zum Mustern mithilfe dieser Erfindung vorgesehen sind, sind Mikrokügelchenmatrizen und zylindrische Matrizen. Obgleich eine Veranlassung für das Entwickeln der vorliegenden Erfindung das Ziel der Erfinder war, einen Prozess für dreidimensionale und konturierte Musterung zu entwickeln, ist der Prozess nun, da er entwickelt wurde, in gleichem Maß auch für die Verwendung für zweidimensionale Polymere geeignet.
D. Elektrolyse
Die Behandlung von Polymerbiomaterialien mit Elektronenstrahl(E-Strahl)-Bestrahlung kann auch verwendet werden, um einen Oberflächenabbau über eine Elektrolysereaktion auszulösen. Oberflächenabbau bewirkt eine Erhöhung der Menge von polaren, funktionellen Sauerstoffgruppen auf der Oberfläche des Materials, die dieselben, hierin beschriebenen, vorteilhaften Eigenschaften für die Hydrolyse- und die Fotolysereaktionen besitzen.
Oberflächenelektrolyse kann mithilfe eines Rasterelektronenmikroskops mit einfachen E-Strahl-Lithografiemöglichkeiten auf einer Polymeroberfläche gemustert werden. Wie in den ausführlichen Beispielen gezeigt ist, kann dieser Prozess auch verwendet werden, um Materialien mit flachen Oberflächen oder komplexe, dreidimensionale Oberflächenkonturen zu behandeln.
E. Chemische Hydrolyse
Andere Verfahren für das Funktionalisieren von Oberflächen eines Biomaterials zum Ermöglichen einer Mineralablagerung nutzen chemische Vorbehandlung, um eine Oberflächenhydrolyse zu erreichen, z. B. mithilfe einer NaOH-Lösung. Oberflächenabbau mit dieser Technik verursacht eine Erhöhung der Menge von polaren, funktionellen Sauerstoffgruppen auf der Oberfläche des Materials. Die funktionalisierte Oberfläche wird dann mit einer mineralhaltigen Lösung inkubiert. Die Erfinder haben solche Funktionalisierungstechniken verwendet, um die Erzeugung einer Mineralbeschichtung bzw. eine „Hypermineralisierung" zu erlauben.
Gao et al. (1998) haben kürzlich die Oberflächenhydrolyse von Polyglykolsäurenetzen zur Erhöhung der Aussaatdichte und Verbesserung der Anheftung von vaskulären, glatten Muskelzellen berichtet. Obgleich ihr Verfahren auch auf der Hydrolyse von PGA in NaOH beruhte, wurde das Polymergerüst dann direkt für die Zellaussaat-Experimente verwendet (Gao et al., 1998). Die vorliegende Erfindung setzt das oberflächenhydrolysierte Biopolymer dagegen einer calciumreichen Lösung aus, um Oberflächenmineralisierung zu induzieren.
F. Kombinierte chemische Hydrolyse und Mineralisierung
In einer unerwarteten Entwicklung der oberflächenfunktionalisierenden Verfahren fanden die Erfinder überraschenderweise heraus, daß wirksame Mineralablagerung auf Biomaterialoberflächen ohne chemische Vorbehandlung erreicht werden kann. In diesen Verfahren kommt es zu einem für eine Mineralisierung ausreichenden Grad der Oberflächenhydrolyse, indem das Biomaterial einfach mit einem wässrigen, mineralisierenden Medium getränkt wird. Obgleich trotzdem eine Vorbehandlung, wie beispielsweise das Aussetzen gegenüber einer NaOH-Lösung, verwendet werden kann bzw. in manchen Ausführungsformen sogar bevorzugt ist, haben die aus einem Schritt bestehenden Mineralisierungsprozess den Vorteil der Einfachheit und sind in bestimmten Ausführungsformen bevorzugt.
Die aus einem Schritt bestehenden Mineralisierungsverfahren nutzen die gleiche Art von mineralhaltigen, wässrigen Lösungen wie oben beschrieben, wie beispielsweise Körperflüssigkeiten und synthetische Medien, die sich wie Körperflüssigkeiten verhalten. Funktionalisierung ist gefolgt von einer Mineralisierung in situ, ohne äußere Manipulation. Obgleich diese Verfahren für die Verwendung einer breiten Vielzahl von Biopolymeren geeignet sind, wird derzeit eine Verwendung in Verbindung mit PLG-Copolymeren mit einem Verhältnis im Bereich von 85 : 15 PLG-Copolymeren und mit Biomaterialgerüsten, die durch Gasaufschäum/Teilchenauslaugprozesse hergestellt sind, bevorzugt. Die Verwendung von 85 : 15-PLG-Copolymergerüsten, die durch Gasaufschäum/Teilchenauslaugprozesse hergestellt sind, ist besonders bevorzugt.
Die Verwendung von 85 : 15 PLG-Copolymeren ist vorteilhaft, da angenommen wird, daß eine Abnahme des Lactid-Glykolid-Verhältnisses des Copolymers die Rate der Oberflächenhydrolyse erhöht. Vor der vorliegenden Erfindung war jedoch die Verwendung von 85 : 15-PLG-Copolymeren nicht bevorzugt, da die mechanische Unver sehrtheit des Polymers mit steigendem Glykolidgehalt abnimmt. Diese Erfindung zeigt, daß 85 : 15-PLG-Copolymere wirksam verwendet werden können, da die schnelle Oberflächenhydrolyse zum Ausgleich der Möglichkeit einer abnehmenden Unversehrtheit eine ausreichende Mineralbildung erlaubt, was zu einer ausreichenden oder sogar erhöhten Gesamtfestigkeit des Verbundmaterials führt.
Die Erfolge der vorliegenden, aus einem Schritt bestehenden Mineralisierungsverfahren (Beispiel V), selbst ohne Aufschäumen/Teilchenauslaugen, stehen in deutlichem Kontrast zu früheren Ansätzen, Minerale auf Polyesteroberflächen zu züchten. Die früheren Verfahren führen nicht zum Wachstum kontinuierlicher, knochenähnlicher Mineralschichten, nicht einmal nach einer 6-tägigen Inkubation in Flüssigkeiten mit einer um 50% höheren Ionenkonzentration als derzeit verwendet wird (Tanahashi et al., 1995). Auch eine 15-tägige Inkubation in im Wesentlichem derselben Medienflüssigkeit wie derzeit verwendet, konnte keine Kontinuität der Mineralmikroteilchen herstellen (Zhang and Ma, 1999).
Die Erfinder sind der Ansicht, daß Matrixherstellung durch Gasaufschäum/Teilchenauslaugtechniken mehr Carbonsäuregruppen auf der Oberfläche ergibt als die Matrixherstellung mit anderen Verfahren (z. B. Lösungsmittelguss/Teilchenauslaugen). Diese größere Oberflächenfunktionalisierung soll zu der schnelleren Keimbildung und dem schnelleren Wachstum von Apatitmineralen beitragen, die während den aus einem Schritt bestehenden Mineralisierungsverfahren beobachtet werden. Außerdem verwenden die Auslaugschritte der Gasaufschäum/Teilchenauslaugverfahren typischerweise Minerallösungen wie beispielsweise 0,1 M CaCl₂, die die Ca²⁺-Chelierung und eine schnellere, knochenähnliche Mineralkeimbildung weiter erleichtern.
Die Techniken der Matrixbildung durch Gasaufschäumen/Teilchenauslaugen mit oder ohne zusätzliche bioaktive Mittel, sind in den folgenden Anmeldungen, bei denen die Erfinder Mitinhaber sind, beschrieben, US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 09/402, 119, angemeldet am 20. September 1999, die Priorität gegenüber PCT-Anmeldung Nr. PCT/US98/06188 (WO 98/44027), angemeldet am 31. März 1998, in Anspruch nimmt, welche die Vereinigten Staaten benennt und Priorität gegenüber der vorläufigen US-Anmeldung mit der Seriennr. 60/042,198, angemeldet am 31. März, 1997, in Anspruch nimmt; und US-Anmeldung mit der Seriennr. 09/310,802, angemeldet am 12. Mai, 1999, die Priorität gegenüber der zweiten vorläufigen Anmeldung mit der Seriennr. 60/109,054, angemeldet am 19. November 1998, und gegenüber der ersten vorläufigen Anmeldung mit der Seriennr. 60/085,305, angemeldet am 13. Mai, 1998, in Anspruch nimmt.
Die Studien in Beispiel IX zeigen, daß das knochenähnliche Mineral vorteilhaft auf den inneren Porenoberflächen von Matrizen gebildet werden kann, die durch Gasaufschäumen/Teilchenauslaugen hergestellt worden sind. PLG-Gerüste, die durch einen Gasaufschäum/Teilchenauslaugprozess hergestellt wurden, wurden in einer aus einem Schritt bestehenden Inkubation in simulierter Körperflüssigkeit (SKF) ohne nennenswerte Abnahme der Gesamtporosität des Gerüstes erfolgreich mineralisiert.
Bei der Verwendung von durch einen Gasaufschäum/Teilchenauslaugprozess hergestellten PLG-Gerüsten ist eine 5-tägige Inkubation in SKF für ein kontinuierliches Wachstum von knochenähnlichem Material auf den inneren Porenoberflächen des Gerüstes ausreichend (Beispiel IX). Die Quantifizierung des prozentualen Massezuwachses und des Phosphatgehalts lässt vermuten, daß der Großteil des Mineralwachstums in dieser Aspekten der Erfindung zwischen Tag 2 und Tag 4 der Inkubation erfolgt. Diese Ergebnisse stellen einen noch größeren Fortschritt gegenüber den früheren Versuchen zur Herstellung von knochenähnlichen Mineralen auf Polyesteroberflächen dar (Tanahashi et al., Zhang and Ma, 1999).
Da diese aus einem Schritt bestehenden Mineralisierungsprozesse bei Raumtemperatur wirksam sind, er streckt sich ihre Verwendung zur Herstellung mineralisierter bzw. hypermineralisierter Polymergerüste auf die Herstellung mineralisierter Materialien, die andere bioaktive Substanzen umfassen. Es ist hierin gezeigt, daß solche Prozesse die Aktivität biologischer Moleküle wie beispielsweise Wachstumsfaktoren nicht mindern. Die zeit- und arbeitssparende Art dieser Prozesse macht sie daher ideal für das Herstellen von Matrizen zur Verwendung in vielen biologischen Prozessen, besonders zum Stimulieren von Knochenwachstum, wo Minerale und Wachstumsfaktoren gemeinsam wirken. Die Phase, Morphologie und der Zustand des abgelagerten Minerals kann durch Variierung des im Prozess verwendeten pH-Wertes, der Ionenkonzentrationen und/oder der Temperatur kontrolliert werden.
Diese Mineralisierungstechniken sind besonders geeignet für die Verwendung mit biologisch abbaubaren Materialien. Die Möglichkeit, in den Poren eines dreidimensionalen porösen abbaubaren Gerüstes eine kontinuierliche knochenähnliche Mineralschicht zu erhalten, stellt einen Durchbruch bei der Verarbeitung von Biomaterialien dar. Das Wachstum einer solchen kontinuierlichen knochenähnlichen Mineralschicht ist nicht nur bei Aussäen von Zellen wichtig, sondern erhöht über einen Verstärkungsmechanismus auch die mechanische Unversehrtheit dieser synthetischen Konstrukte.
Für Tissue-Engineering-Anwendungen verwendete Polymerkonstrukte sind im Allgemeinen hoch porös und ihre mechanischen Eigenschaften liegen nicht im gleichen Bereich wie die von Knochen. Das Erzeugen einer zusammenhängenden Mineralbeschichtung über den inneren Porenoberflächen eines Polymerkonstruktes gemäß dieser Aspekte der vorliegenden Erfindung ist daher ein deutlicher Vorteil. Diese Verfahren erlauben die Herstellung eines harten und steifen Exoskeletts, was den Wert eines Biomaterials erhöht und dessen Widerstand gegenüber zellulären, kontraktilen Kräften während der Gewebeentwicklung verstärkt.
Die beispielsweise wie in Beispiel V hergestellten, mineralisierten Gerüstmaterialien der vorliegenden Erfindung haben tatsächlich nach der Behandlung einen größeren Kompressionsmodul als andere, für das Engineering von Knochengeweben verwendete Poly-a-Hydroxylsäure-Materialien und einen größeren Kompressionsmodul als PLLA-gebundene Polyglykolsäure (PGA)-Matrizen, die für einen Widerstand gegenüber zellulären Kräften während der Entwicklung vom glattem Muskelgewebe ausreichend sind. Die Materialien dieser Erfindung verfügen daher über einen Formspeicher, was bei der Geweberegeneration ein wichtiger Faktor ist. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren bereit, mit denen ein Anstieg des Kompressionsmoduls ohne nennenswerte Abnahme der Gerüstporosität oder Porengröße erreicht wird, was ebenfalls einen seit Langem gesuchten Designvorteil darstellt, der zelluläre Migration und vaskuläre Infiltration erlaubt.
G. Mineralisierung und Freisetzung von Wachstumsfaktor
Außer, daß sie eine erfolgreiche Mineralisierung mit einer aus einem Schritt bestehenden, fünftägigen Inkubation zeigen, demonstrieren die Studien von Beispiel IX auch die anhaltende Freisetzung eines bioaktiven Faktors (VEGF) aus mineralisierten PLG-Gerüsten. Dreidimensionale, poröse Gerüste des Copolymers 85 : 15- Polymilchsäure/Polyglykolsäure wurden hergestellt, indem der Wachstumsfaktor in einen Gasaufschäum/Teilchenauslaugprozess eingeschlossen wurde. Das Gerüst wurde dann über Inkubation einer simulierten Körperflüssigkeit mineralisiert.
Zusammenfassend wird das Wachstum eines knochenähnlichen Mineralfilms auf den inneren Porenoberflächen des porösen Gerüstes durch Messungen der Masseerhöhung und Quantifizierung des Phosphatgehalts in Gerüsten bestätigt. Die Freisetzung von ¹²⁵I-markiertem VEGF wurde über einen Zeitraum von 15 Tagen verfolgt, um die Kinetik der Freisetzung aus den mineralisierten Gerüsten zu bestimmen. Es wurde eine anhaltende Freisetzung aus den mineralisierten Gerüsten erreicht und das Wachstum des Mineralfilms veränderte die Kinetik der Freisetzung aus den Gerüsten, indem der anfängliche Burst-Effekt abgeschwächt und die Freisetzungskurve linearer gemacht wurde. Das aus den mineralisierten und nicht mineralisierten Gerüsten freigesetzte VEGF war bis zu 12 Tage lang nach der Mineralisierungsbehandlung aktiv und das Mineralwachstum hatte geringe Auswirkungen auf die Gesamtporosität des Gerüstes.
In näheren Einzelheiten ausgeführt wurde gezeigt, daß das Vorhandensein von Mineral die Freisetzung des Wachstumsfaktors aus dem Gerüst verlangsamt, was zu einer Freisetzung einer größeren Menge eines Faktors über einen längeren Zeitraum führt (z. B. Tag 3 bis 10). Nach einer anfänglichen Burst-Freisetzung von 44 ± 2% des eingebauten Faktors in den ersten 36 Stunden wird das Profil der Freisetzung aus den mineralisierten Schwämmen bis zu 10 Tage in SKF aufrechterhalten (7). Im Gegensatz dazu zeigt die Freisetzung aus den nicht mineralisierten Gerüsten einen relativ großen anfänglichen Burst von 64 ± 2% während der ersten 60 Stunden, gefolgt von einer anhaltenden Freisetzung für ~5 Tage.
Die Freisetzung eines bioaktiven Faktors aus einem mineralisierten Gerüst ist ein wichtiges Ergebnis beim Tissue-Engineering, besonders für das Engineering von Knochengewebe, da es die osteokonduktiven Qualitäten eines knochenähnlichen Minerals mit den gewebeinduktiven Qualitäten eins bioaktiven Faktors wie beispielsweise einem Proteinwachstumsfaktor kombiniert. Die Freisetzung von VEGF ist besonders nützlich bei der Induktion des Einwachsens von vaskulärem Gewebe für das Tissue-Engineering. Dieses System könnte auch mit unterschiedlichen anderen induktiven Proteinwachstumsfaktoren verwendet und leicht auf die Zell- und Gewebearten abgestimmt werden, die stimuliert werden sollen.
Beispiel IX lässt vermuten, daß das Wachstum von Mineral auf der Oberfläche von porösem PLG die Fak torfreisetzung moduliert. Es gibt eine deutliche Korrelation zwischen dem Beginn des Mineralwachstums und der Divergenz der Freisetzungsprofile für in SKF und PBS (Kontrolle) inkubierten Proben. Ersteres findet zwischen Tag 2 und Tag 4 der Inkubation statt (6), während Letzteres zum 3-Tages-Zeitpunkt stattfindet (7). Der Nettoeffekt des Vorhandenseins von Mineral ist die Abschwächung der anfänglichen Burst-Freisetzung aus dem Gerüst und eine anhaltende Freisetzung einer größeren Menge von Faktor über einen längeren Zeitraum.
Der modifizierende Effekt auf die Freisetzung ist auch in den Bioaktivitätsdaten erkennbar (8A). Freisetzung aus den mineralisierten Gerüsten hat einen signifikant größeren Effekt auf die Zellproliferation als die Freisetzung aus nicht-mineralisierten Gerüsten während des Faktorfreisetzungsintervalls von 8–10 Tagen. Die Untersuchung der Freisetzungsprofile (7) zeigt, daß die mineralisierten Gerüste in diesem Zeitraum eine größere Menge VEGF freisetzen als die nicht mineralisierten Gerüste.
Vorherige Formulierungen für kontrollierte Freisetzungen unter Verwendung von Poly-a-Hydroxylsäure zeigen häufig einen beträchtlichen anfänglichen Burst in den ersten 1–5 Tagen der Freisetzung, gefolgt von einer minimalen Freisetzung zu späteren Zeitpunkten (Cohen et al., 1991; Kwong et al., 1986). Das Erreichen einer relativ konstanten Freisetzung über einen längeren Zeitraum ist ein wesentliches Ziel beim Arzneimitteltransport durch Polymere. Vorherige Versuche, den „Burst-Effekt" anzusprechen, haben doppelwandige Polymermikrokügelchen (Pekarek et al., 1994) und Mikrokügelchen, die in mikroporösen Membranen verkapselt sind (Kreitz et al., 1997), verwendet. Das knochenähnliche Mineral in dieser Studie erreicht einen funktionellen Effekt, der der äußeren Schicht in Arzneimitteltransportsystemen aus doppelwandigen Polymeren gleicht.
Die Bildung einer Mineralschicht in den Poren von PLG-Gerüsten führt nicht zu einer nennenswerten Verschlechterung der Fähigkeit von freigesetztem Wachstumsfaktor zur Stimulation der Proliferation menschlicher, mikrovaskulärer Hautendothelzellen. Die Möglichkeit der Proteindenaturierung und -aggregation bei Aussetzen gegenüber Feuchtigkeit ist ein Punkt, der bei der kontrollierten Freisetzung von Proteinen aus bestimmten Polymersystemen bedacht werden muss (Ishaug-Riley et al., 1998). In diesem Fall ist das Protein nach der Mineralisierungsbehandlung elf Tage lang (16 Tage nach der Probenherstellung) eindeutig bioaktiv.
Die 11-tägige Zeitskala wurde für die Analyse in dieser Studie ausgewählt, weil ein großer Prozentanteil transplantierter Zellen innerhalb dieses Zeitraums ohne die Entwicklung eines vaskulären Trägers zur Unterstützung von Massetransport nicht anwächst und stirbt (Mooney et al., 1997; Ishaug-Riley et al., 1998). Anhaltende Freisetzung über diesen Zeitraum induziert eine verstärkte Proliferation von Endothelzellen und unterstützt somit die Angiogenese während der anfänglichen Stadien der Entwicklung von Knochengewebe in vivo.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein System für die anhaltende Freisetzung bioaktiver Faktoren, wie beispielsweise Polypeptide, Wachstumsfaktoren und Hormone, aus mineralisierten PLG-Gerüsten bereit. Die Mineral-Biofaktor-Gerüste haben besondere Verwendung beim orthopädischen Tissue-Engineering. Das Vorhandensein eines knochenähnlichen Materials ist eine Voraussetzung für die Konduktion osteogener Zellen in verschiedene, poröse, synthetische Konstrukte (Hench, 1991; Kokubo, 1991) und das Mineral ist so mit einer erhöhten Bioaktivität assoziiert (LeGeros and Daculzi, 1990). Das Mineralwachstum durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung gewährleistet daher über den induktiven (z. B. angiogenen) Effekt der Proteinfreisetzung hinaus außerdem eine verstärkte Osteokonduktivität. Das Wachstum des Minerals wird durch einen erstaunlich einfachen, nur aus einem einzigen Schritt bestehenden und bei Raumtemperatur ablaufenden Prozess erreicht, der wichtigerweise die Bioaktivität des Wachstumsfaktors oder die Gesamtporosität des Gerüstes nicht beeinträchtigt.
Die folgenden Beispiele zeigen bestimmte, bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.
BEISPIEL I
Mineralisierung einer homogenen Oberfläche
Ein poröses abbaubares Polymerbiomaterial wird entweder durch Vorbehandlung zur Induktion einer Oberflächenhydrolyse und der Exposition gegenüber einer mineralisierenden Lösung (Beispiele II bis IV) oder durch Durchführen eines aus einem Schritt bestehenden Oberflächenhydrolyse- und Mineralisierungsprozesses (Beispiel V) für eine im wesentlichen homogene Mineralisierung behandelt.
Vorbehandlung zur Herstellen einer homogenen Oberflächenhydrolyse kann entweder durch Tränken mit einer NaOH-Lösung (Beispiele II) oder durch Behandeln mit elektromagnetischer (EM-) Strahlung (Beispiel III) erreicht werden. Das behandelte Biomaterial wird in einer mineralreichen, vorzugsweise einer calciumreichen Flüssigkeit wie einer Körperflüssigkeit oder synthetischen Medien inkubiert, die sich wie Körperflüssigkeit verhalten, um Keimbildung und das Wachstum eines homogenen Mineralfilms auf der Oberfläche anzuregen (Beispiel IV).
Funktionalisierung und gleichzeitige Mineralisierung kann auch durch einfaches Tränken in mineralhaltigen, wässrigen Lösungen, vorzugsweise in Körperflüssigkeiten oder synthetischen Medien, die sich wie Körperflüssigkeiten verhalten, erreicht werden. Herstellung der Polymerbiomaterialien mithilfe eines Gasaufschäum/Teilchenauslaugprozesses ist im Allgemeinen für eine solche aus einem Schritt bestehende Mineralisierung bevorzugt (Beispiel V).
Ist das Biomaterial einmal mineralisiert, werden Vorläufer osteogener Zellen in vitro in einem Zellkulturmedium auf das Biomaterial gesät. In vivo haften Knochenzellen an das Biomaterial an, wenn es implantiert wird.
BEISPIEL II
Vorbehandlung mit NaOH für oberflächenmineralisierte Filme
PLGA-Filme (Stärke ~25 μm) wurden durch eine Druckgusstechnik hergestellt. Rohe Polymerpellets wurden in eine Form geladen und bei 200 Grad Celsius in einen Konvektionsofen gestellt. Die Formen wurden unter Druck (~22 N) 30 Sekunden lang erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
Für die Erzeugung der funktionellen Oberflächengruppen durch NaOH-Behandlung wurden die Filme gereinigt und unterschiedlich lange bis zu 10 Minuten lang in 1,0 N NaOH-Lösung getaucht, um funktionelle Oberflächengruppen zu erzeugen. Nach der Immersion wurde die Proben 3X in destilliertem Wasser gespült.
BEISPIEL III
Vorbehandlung mit UV für oberflächenmineralisierte Filme
PLGA-Filme (Stärke –25 μm) wurden durch eine Druckgusstechnik hergestellt. Rohe Polymerpellets wurden in eine Form geladen und bei 200 Grad Celsius in einen Konvektionsofen gestellt. Die Formen wurden unter Druck (–22 N) 30 Sekunden lang erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
Für die Erzeugung der funktionellen Oberflächengruppen durch UV (Ultraviolett)-Behandlung, wurden die Membranen bis zu 8 Stunden lang einer Oberflächenbestrahlung ausgesetzt.
BEISPIEL IV
Oberflächenmineralisierung nach Vorbehandlung
Entweder mit NaOH-Behandlung oder UV-Behandlung behandelte Membranen wurden daraufhin bei 37 Grad Celsius in 50 ml einer simulierten physiologischen Flüssigkeit (SKF, Na: 142 mM, K: 5 mM, Ca: 2,5 mM, Mg: 1,5 mM, Cl: 148 mM, HCO₃: 4,2 mM, HPO₄: 1 mM, SO₄: 0,5 mM), gepuffert auf pH 7,4, inkubiert. Die Lösungen wurden alle 48 Stunden erneuert, um sicherzustellen, daß ausreichend Ionen in der Flüssigkeit waren, um die Mineralkeimbildung und das Mineralwachstum zu induzieren. Nach der Immersion für Zeiträume zwischen 120 und 240 Stunden wurden die Proben getrocknet.
Fourier-Transformation-Infrarot (FTIR)-Analyse zeigt das Vorhandensein eines amorphen Apatits auf der Oberfläche. FTIR-Spektren von Gerüsten, die 0, 2, 6, 10 und 16 Tage lang behandelt wurde, zeigen das Wachstum eines kohlensäurehaltigen Apatitminerals in dem Gerüst (1). Mit den UV-behandelten Filmen wurden äquivalente Spektren erstellt. Die breite Bande bei 3570 cm^–1 zeigt die Valenzschwingung von Hydroxylionen in absorbiertem Wasser an. Die Spitze bei 1454 cm^–1 zeigt CO₃ ^2–v₃ an, während die Spitze bei 867 cm^–1 CO₃ ^2–ν₂ darstellt. Die Spitze bei 1097 cm^–1 zeigt anti-symmetrische Dehnung (ν3) und die bei 555 cm^–1 anti-symmetrische Krümmung (ν4) von PO₄ ^3– an. Die Spitze bei 1382 cm^–1 stellt eine NO₃-Bande dar.
Das Vorhandensein von OH^–, CO₃ ^2– und PO₄ ^3– zeigt an, daß eine Apatitschicht gebildet wurde. Andere, Apatite darstellende Banden sind aufgrund der starken Absorption des PLGA maskiert.
Die Hauptspitzen bei 1755 cm^–1 und 1423 cm^–1 stellen PLGA dar und die Spitze bei 1134 cm^–1 zeigt C-O-Dehnung in dem Ester an. Die Spitzen bei 756 cm^–1 und 956 cm^–1 zeigen die amorphen Domänen des Polymers an.
Die Gerüste wiesen einen Zuwachs der Masse über die Zeit auf, was am Ende der 16-tägigen Inkubation einen Massezuwachs von 11 ± 2% ergab (2). ANOVA der prozentualen Masseveränderungen von Testgerüsten ergibt einen signifikanten Unterschied der Gerüstmasse über die Zeit (p < 0,05), während ANOVA der prozentualen Masseveränderungen von Kontrollgerüsten keinen signifikanten Unterschied der Gerüstmasse über die Zeit ergibt (p > 0,05). Die prozentualen Masseveränderungen der Testproben und Kontrollproben waren für jeden Zeitpunkt nach 8 Tagen signifikant unterschiedlich (p < 0,05).
Um zu bestätigen, daß der Massezuwachs durch Ablagerung eines Apatitminerals verursacht wurde, wurde als Nächstes die Masse von Phosphat in den Gerüsten analysiert. Der Phosphatgehalt in den behandelten Gerüsten stieg ebenfalls signifikant mit der Behandlungsdauer an (3). Ein Vergleich der Phosphatmassen über ANOVA zeigt einen statistisch signifikanten Zuwachs über die Zeit (p < 0,05) und die Unterschiede in der Phosphatmasse zwischen Tag 8 und 12 (p < 0,05) und zwischen Tag 12 und 14 (p = 0,05) waren ebenfalls statistisch signifikant. Nach einer 14-tägigen Inkubation ergibt die Schätzung der Masse von Mineral auf dem Gerüst anhand der Phosphatmassedaten 0,76 mg Hydroxylapatit, während der gemessene Massezuwachs des Gerüstes 1,02 ± 0,40 mg beträgt. Die Tatsache, daß der gemessene Wert größer ist als der geschätzte Wert deutet auf signifikante Carbonatsubstitution in dem Mineralkristall hin.
Wachstum der BLM-Schicht erhöht den Kompressionsmodul von 85 : 15-PLG-Gerüsten signifikant (4) ohne eine signifikante Abnahme der Gerüstporosität. Der Kompressionsmodul erhöhte sich von 60 ± 20 Kpa vor der Behandlung auf 320 ± 60 Kpa nach einer 16-tägigen Behandlung, d. h. es ergibt sich ein 5-facher Anstieg des Moduls. ANOVA der Veränderungen des Moduls von Testgerüsten ergibt einen signifikanten Unterschied des Gerüstmoduls über die Zeit (p < 0,05), während ANOVA der Kontrollmoduldaten keinen signifikanten Unterschied über die Zeit ergibt (p > 0,05). Die Unterschiede zwischen dem Modul von Testgerüsten und dem Modul von Kontrollgerüsten waren für Behandlungszeiträume von 10 Tagen oder länger statistisch signifikant (p < 0,05). Die Porosität der Gerüste nahm nach Inkubation in SKF nicht nennenswert ab. Unbehandelte Gerüste waren zu 95,6 ± 0,2% porös, während die in SKF für 16 Tage behandelten Gerüste zu 94,0 ± 0,30% porös waren (n = 3). Dies stimmt mit den Elektronenmikrografien überein, welche nur eine dünne (1–10 μm) Mineralbeschichtung anzeigen und daher keine signifikante Veränderung der Porengröße aufgrund von Mineralwachstum.
Dieses Beispiel zeigt die erfolgreiche Verwendung dieses bei Raumtemperatur ablaufenden Prozesses, um eine Oberflächenapatitschicht auf einer behandelten Polymeroberfläche zu erhalten. Die Bedeutung der Verarbeitung bei Raumtemperatur ist, daß Anheftung biologischer Faktoren sofort ohne das Risiko einer Denaturierung erreicht werden kann.
BEISPIEL V
Aus einem Schritt bestehende Mineralisierung
Es können auch aus einem Schritt bestehende und bei Raumtemperatur ablaufende Prozesse verwendet werden, um Keimbildung und Wachstum von Mineralschichten auf Polymeroberflächen auszulösen. Dies wird durch Inkubieren der Polymergerüste in mineralhaltigen, wässrigen Lösungen wie beispielsweise Körperflüssigkeiten und synthetischen Medien, die sich wie Körperflüssigkeiten verhalten, erreicht. Diese Prozesse sind in der Lage, mit erstaunlich einfachen und billigen Verfahren knochenähnliche Mineralien innerhalb von Polymergerüsten wachsen zu lassen. Durch ihre Wirksamkeit bei Raumtemperaturbedingungen tragen diese Verfahren zu dem Einschluss bioaktiver Proteine und anderer Materialien in die ablaufende Mineralisierung bei.
Ein erstes Beispiel einer aus einem Schritt bestehenden Mineralisierung betrifft die Mineralablagerung auf porösen Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Schwämmen durch Inkubation in einer simulierten Körperflüssigkeit. Die einfache Inkubationstechnik wurde ver wendet, um Keimbildung und Wachstum eines kontinuierlichen, kohlensäurehaltigen Apatitminerals auf den inneren Porenoberflächen eines porösen, abbaubaren Polymergerüstes zu erhalten.
Ein 3-dimensionales poröses Gerüst aus 85 : 15-PLG wurde durch einen Lösungsmittelguss/Teilchenauslaugprozess hergestellt und in simulierter Körperflüssigkeit (SKF; NaCl: 141 mM, KCl: 4,0 mM, MgSO₄: 0,5 mM, MgCl₂: 1,0 mM, NaHCO₃: 4,2 mM, CaCl₂: 2,5 mM und KH₂PO₄: 1,0 mM in entionisiertem H₂O, mit Trisma-HCl gepuffert auf pH 7,4) inkubiert. Fourier-Transformation-IR-Spektroskopie und REM-Analysen nach unterschiedlicher Inkubationsdauer zeigten das Wachstum einer kontinuierlichen knochenähnlichen Apatitschicht innerhalb der Poren des Polymergerüstes.
Das Mineralwachstum erfolgte vorwiegend zwischen Tag 8 und Tag 12. Mineralwachstum zu einer kontinuierlichen Schicht erfolgt wahrscheinlich ab Tag 12 und ist an Tag 16 oder davor abgeschlossen. Das kontinuierliche Mineralwachstum ist daher ähnlich wie das Mineralwachstum in Knochen und Zähnen.
Die Gerüste zeigten einen Massezuwachs über die Zeit, wobei nach 16 Tagen ein Zuwachs von 11 ± 2% stattgefunden hatte. Der Massezuwachs ist auf die Ablagerung eines Apatitmaterials zurückzuführen. Quantifizierung von Phosphat auf dem Gerüst ergab das Wachstum und die Entwicklung des Mineralfilms über die Zeit mit einem Einbau von 0,43 mg Phosphat (äquivalent zu 0,76 mg Hydroxylapatit) pro Gerüst nach 14 Tagen in SKF. Der gemessene Gesamtzuwachs an Masse des Gerüstes betrug nach 14 Tagen 1,02 ± 0,4 mg. Dies deutet auf Carbonatsubstitution in dem Mineralkristall hin.
Die Kompressionsmodule von Polymergerüsten sind mit der Bildung eines Mineralfilms nach einer 16-tägigen Inkubationsdauer im Vergleich zu Kontrollgerüsten ebenfalls erhöht. Dies wurde ohne eine signifikante Abnahme der Gerüstporosität erreicht. Die dünne Mineralschicht ist deshalb funktionell wichtig, obgleich die Mineralisierung nicht die Porengröße verändert.
Wie in den Mineralisierungs- und Wachstumsfaktorstudien von Beispiel IX gezeigt, zeigen durch Gasaufschäum/Teilchenauslaugprozesse hergestellte 85 : 15-PLG-Gerüste noch schnellere Keimbildung und schnelleres Wachstum von Apatitmineral. Die durch Lösungsmittelguss/Teilchenauslaugen hergestellten 85 : 15-PLG-Gerüste zeigten nach einer 6-tägigen Inkubation in SKF einen Massezuwachs von 3 ± 1%. Im Vergleich dazu zeigen durch Gasaufschäum/Teilchenauslaugprozesse hergestellte 85 : 15-PLG-Gerüste zeigten nach einer 4-tägigen Inkubation in SKF einen Massezuwachs von 6 ± 1%.
Es wird angenommen, daß die noch schnellere Keimbildung und das noch schnellere Wachstum auf durch Gasaufschäumen/Teilchenauslaugen hergestellten 85 : 15-PLG-Gerüsten auf den Anstieg der Carbonsäuregruppen, d. h. die größere Oberflächenfunktionalisierung, zurückzuführen ist, was durch den Gasaufschäum/Teilchenauslaugprozess verursacht wird. Auslaugen mit 0,1 M CaCl₂ wird wahrscheinlich auch die Chelierung von Ca²⁺-Ionen erleichtern, was eine schnellere Keimbildung von knochenähnlichem Mineral ergibt.
BEISPIEL VI
Knochenzellkontrolle
Polymerbiomaterial wird behandelt, um eine gemusterte Biooberfläche zu formen, vorzugsweise entweder unter Verwendung von gemusterter EM-Strahlung oder Elektronenstrahlbestrahlung. Behandeltes Biomaterial wird mit destilliertem Wasser gewaschen, um aus der Oberflächenfotolyse oder -elektrolyse übriggebliebene Monomere zu entfernen.
Das behandelte Biomaterial wird in einer mineralreichen, vorzugsweise einer calciumreichen Flüssigkeit, wie beispielsweise einer Körperflüssigkeit oder synthetischen Medien, die sich wie Körperflüssigkeit verhalten, inkubiert, um Keimbildung und Wachstum von Mineral auf den behandelten Bereichen des Polymers an zuregen. Dies ergibt ein Mineralmuster auf der Oberfläche des Polymers. Dieser Schritt kann entweder in vitro mithilfe einer Körperflüssigkeit oder einer simulierten Körperflüssigkeit oder in vivo durchgeführt werden, wo die natürliche Körperflüssigkeit diese Funktion übernimmt.
Knochenzellvorläufer werden in vitro in einem Zellkulturmedium auf dem Biomaterial ausgesät. In vivo haften Knochenzellen an das Biomaterial an, wenn es implantiert wird. In jedem Fall haften Zellen vorzugsweise an mineralisierte Abschnitte des Substrats an.
BEISPIEL VII
Beugungslithografie
Bei früheren Studien über die Kontrolle der Stellen der Zelladhäsion an eine Biomaterialoberfläche wurde herkömmliche UV-Lithografie verwendet, um eine zweidimensionale Polymeroberfläche zu mustern (Pierschbacher & Ruoslathi, 1984; Ruoslathi & Pierschbacher, 1987; Matsuda et al., 1990; Britland et al., 1992; Dulcey et al., 1991; Lom et al., 1993; Lopez et al., 1993, Healy et al., 1996).
In den vorhergehenden Techniken wird die zweidimensionale Biomaterialoberfläche mit einer dünnen Schicht eines Fotolacks beschichtet, der Fotolack wird durch eine Metallmaske ausgesetzt und der ausgesetzte Fotolack wird in Lösungsmittel entfernt, wobei eine Fotolackmaske auf der Oberfläche der Biomaterialprobe übrig bleibt. Die Oberfläche des Polymerbiomaterials wird den chemisch oder biologisch durch die Fotolackmaske hindurch behandelt und die Maske wird mit einem Lösungsmittel nach der Behandlung entfernt.
Die vorhergehenden Prozesse erforderten ein flaches, zweidimensionales Biomaterial, das ausreicht, um die Effekte einer Oberflächenbehandlung auf die Zellaktivität zu untersuchen, jedoch nicht ausreichend ist für die Behandlung typischer Biomaterialien, die dreidimensionale Oberflächenkonturen haben.
In den vorliegenden Verfahren, geeignet für die Verwendung mit dreidimensionalen Polymeren, stellt das Gitter auf der Polymeroberfläche ein Muster konstruktiver und destruktiver Interferenz her. Da das Gitter während der Behandlung nicht in engem Kontakt mit dem Biomaterial stehen muss, kann dieser Beugungslithografieprozess zum Behandeln von Materialien mit komplexen dreidimensionalen Oberflächenkonturen verwendet werden. Der Prozess ist jedoch gleichermaßen geeignet in Verbindung mit zweidimensionalen Biomaterialien.
BEISPIEL VIII
Kontrolle anderer Zellarten
Polymerbiomaterial wird behandelt, um eine gemusterte Biooberfläche zu formen, vorzugsweise entweder mithilfe von gemusterter EM-Strahlung oder Elektronenstrahlbestrahlung. Behandeltes Biomaterial wird mit destilliertem Wasser gewaschen, um aus der Oberflächenfotolyse oder -elektrolyse übriggebliebene Monomere zu entfernen.
Das behandelte Biomaterial wird in einer Lösung mit bioaktiven Molekülen oder Proteinen, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmoleküle, Zytokine und dergleichen, inkubiert, die Adhäsion einer spezifischen Zellart fördern. Zellen werden in vitro in einem Zellkulturmedium auf dem Biomaterial ausgesät. In vivo haften Zellen an das Biomaterial an, wenn es implantiert wird. In jedem Fall haften Zellen vorzugsweise an die behandelten Abschnitte des Substrats an.
Die Verwendung spezifischer Mittel oder Proteine, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, die die Anheftung von bestimmten Zellarten fördern, ermöglicht das Mustern jeder Zellart auf der dreidimensionalen Oberfläche des Polymers, sowohl in vitro als auch in vivo.
BEISPIEL IX
Freisetzung von Wachstumsfaktor aus mineralisierten Matrizen
A. Material und Verfahren
1. Gasaufschäumen-Teilchenauslaugen
Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Pellets mit einem Lactid-Glykolid-Verhältnis von 85 : 15 stammten von Medisorb, Inc. (I.V. = 0,78 dl/g) und wurden auf eine Teilchengröße zwischen 106 und 250 μm gemahlen. Gemahlene PLG-Teilchen wurden dann mit 250 μl einer 1%igen Alginat (MVM, ProNova; Oslo, Norwegen)-Lösung in ddH₂O und 3 μg VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor; Intergen; Purchase, NY) kombiniert und auf dem Vortex gemischt. Diese Lösungen wurden lyophilisiert, mit 100 mg NaCl-Teilchen (250 μm < d < 425 μm) gemischt und bei 1500 psi 1 Minute lang in einer Modellform mit einem Durchmesser von 4,2 mm formgepresst. Dies ergab Scheiben mit einer Stärke von 2,8 mm und einem Durchmesser von 4,2 mm.
Die Scheiben wurden in einem isolierten Druckbehälter 850 psi CO₂-Gas ausgesetzt und konnten 20 Stunden lang äquilibrieren. Der Druck wurde innerhalb von 2 Minuten auf Umgebungsdruck verringert, was thermodynamische Instabilität und die darauf folgende Bildung von Gasporen in den Polymerteilchen verursachte. Die Polymerteilchen dehnen sich aus und lagern sich zusammen, um ein kontinuierliches Gerüst mit darin eingeschlossenem Alginat, VEGF und NaCl-Teilchen zu bilden. Nach dem Gasaufschäumen wurden die Scheiben 24 Stunden lang in 0,1 M CaCl₂ inkubiert, um die Salzteilchen auszulaugen und die Gelierung des Alginats in der Polymermatrix zu induzieren. Alginat wurde in die Gerüste aufgenommen da gezeigt wurde, daß es die Freisetzung von VEGF aus PLG-Gerüsten herabsetzt (Wheeler et al., 1998).
2. Mineralisierung
Bestimmte Gerüste wurden in einer 5-tägigen Inkubation in einer simulierten Körperflüssigkeit (SKF) mineralisiert. Simulierte Körperflüssigkeit wurde hergestellt, indem die folgenden Reagenzien in entionisiertem H₂O aufgelöst wurden: NaCl: 141 mM, KCl: 4,0 mM, MgSO₄: 0,5 mM, MgCl₂: 1,0 mM, NaHCO₃: 4,2 mM, CaCl₂: 2,5 mM und KHP₂O₄: 1,0 mM. Die resultierende SKF wurde mit Trisma-HCl auf pH 7,4 gepuffert und während der Inkubationsdauer bei 37°C gehalten. Die SKF-Lösungen wurden täglich erneuert, um eine adäquate Ionenkonzentration für das Mineralwachstum sicherzustellen.
Die Porosität von Gerüsten wurde vor und nach der Mineralisierungsbehandlung anhand der bekannten Dichte des festen Polymers, der bekannten Dichte von kohlensäurehaltigem Apatit, der gemessenen Masse von Mineral und Polymer in den Gerüsten und dem Volumen des Gerüstes berechnet.
3. Charakterisierung des Mineralwachstums
Um das Mineralwachstum auf mit Gas aufgeschäumten PLG-Gerüsten zu analysieren, wurden Sätze mit je drei Gerüsten für eine Dauer zwischen 0 und 10 Tagen in SKF inkubiert. Die Proben wurden nach 0, 2, 4, 8 und 10 Tagen aus der Lösung genommen und analysiert. Die Trokkenmasse jedes Gerüstes wurde vor und nach der Inkubation in SKF gemessen und der prozentuale Massezuwachs wurde berechnet und anhand von ANOVA und einem Student-t-Test verglichen, um signifikante Unterschiede der Masse für unterschiedliche SKF-Inkubationszeiten zu ermitteln.
Die in den Gerüsten nach den zuvor erwähnten Inkubationszeiten vorhandene Phosphatmenge wurde mithilfe eines zuvor beschriebenen kolorimetrischen Tests bestimmt (Murphy et al., J. Biomed. Mat. Res., in Druck). Die Phosphatmassedaten wurden ebenfalls anhand von ANOVA und einem Student-t-Test verglichen, um si gnifikante Unterschiede der Masse für unterschiedliche SKF-Inkubationszeiten zu ermitteln.
Um die nach einer 6-tägigen Inkubation auf dem Gerüst vorhandene Apatitmenge zu schätzen, wurde die gemessene Phosphatmasse mit dem bekannten Verhältnis der Hydroxylapatitmasse [Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, f.w. = 1004,36 g] zu der Phosphatmasse in Hydroxylapatit (569,58 g) multipliziert. Es handelt sich dabei um eine konservative Schätzung, da angenommen wird, daß das gesamte Phosphat stöchiometrisch in Hydroxylapatit eingebaut ist. Diese Schätzung der Mineralmasse steigt, wenn einer erhöhte Substitution von Carbonat in den Mineralkristall angenommen wird.
4. Messungen der VEGF-Freisetzung
Um die Effizienz des Einbaus von VEGF in die PLG-Gerüste zu bestimmen und die Kinetik der Freisetzung von VEGF aus den Gerüsten zu verfolgen, wurde ¹²⁵I-markiertes, humanes VEGF von Rezeptorqualität (90 μCi/μg; Biomedical Technologies Inc.; Stoughton, MA) als ein Tracer eingesetzt. Anstatt der 3 μg VEGF in einer normalen Probenherstellung wurden jeder Matrix 0,5 μCi radioaktiv markiertes VEGF zugegeben. Um die Effizienz des Einbaus von VEGF zu bestimmen, wurde die gesamte, eingebaute Aktivität mit der Aktivität der ursprünglichen ¹²⁵I-VEGF-Probe vor dem Einbau in die Gerüste verglichen.
Um die Effekte von Mineralwachstum auf die Faktorfreisetzung zu bestimmen, wurde sowohl in SKF während der Mineralbildung als auch in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) die Freisetzungskinetiken gemessen. Die mit radioaktiv markiertem VEGF hergestellten Gerüste wurden in 4 ml SKF oder PBS gestellt und bei 37°C gehalten. Die Gerüste wurden zu unterschiedlich eingestellten Zeiten aus der Lösung genommen und ihre Radioaktivität wurde mit einem Gammazähler bestimmt. Nach jeder Analyse wurden die Lösungen erneuert und die Gerüste zurück in die Lösung gegeben.
An jedem Zeitpunkt wurde die Menge an aus den Gerüsten freigesetztem radioaktiv markiertem VEGF durch Vergleichen des restlichen ¹²⁵I-VEGF mit dem gesamten ursprünglich auf jedes Gerüst geladenen ¹²⁵I-VEGF bestimmt. Die prozentuale Freisetzung von VEGF aus in SKF inkubierten Gerüsten wurde an jedem Zeitpunkt mit der von in PBS inkubierten Gerüsten mit Hilfe eines Student-t-Tests verglichen, um signifikante Unterschiede der kumulativen Freisetzung zu ermitteln.
5. Biologische Aktivität von freigesetztem VEGF
Die biologische Aktivität von in Polymermatrizen eingebautem und freigesetztem VEGF wurde durch Testung seiner Fähigkeit zur Stimulation des Wachstums von kultivierten menschlichen mikrovaskulären Hautendothelzellen bestimmt, die aus neonataler Dermis isoliert wurden (HMVEC(nd), Cascade Biologics; Portland, OR).
HMVEC(nd) wurden vor der Verwendung bis zu Passage 7 in MCDB 131-Medium (Cascade Biologics) ergänzt mit mikrovaskulärem Wachstumsergänzungsmittel von Cascade Biologics (5% fetales Rinderserum, Hydrokortison, humaner Fibroblastenwachstumsfaktor, Heparin, humaner epidermaler Wachstumsfaktor und dibutyryl-zyklisches AMP) kultiviert. Die Zellen wurden in einer Dichte von 5 × 10³ Zellen/cm² auf Zellkulturplatten mit 12 Vertiefungen (Corning; Cambridge, MA), die mit 1 μg/cm² humanem Plasmafibronektin (Life Technologies, Grand Island, NY) vorbeschichtet waren, ausgestrichen. Die Zellen konnten sich 24 Stunden lang anheften, bevor das Medium in jeder Vertiefung durch 3 ml serumfreies Medium (Cell Systems; Kirkland, WA) ergänzt mit 50 μg/ml Gentamycin (Life Technologie) ersetzt wurde.
Ein entweder mineralisierte oder nicht mineralisierte, VEGF freisetzende Matrix enthaltendes 12 mm-Transwell (Porendurchmesser 3 μm; Corning) wurde in jede Testvertiefung gegeben (n = 5 für jede Gruppe), während mineralisierte Matrizen ohne VEGF in die Kontroll vertiefungen (n = 5) gegeben wurden. Um die Dosiswirkung auf bekannte VEGF-Konzentrationen zu bestimmen, wurden weitere Vertiefungen (n = 4 pro Konzentration) mit 40, 20, 10 und 5 ng/ml löslichem VEGF, das nicht in Matrizen eingebaut war, ergänzt.
Nach 72 Stunden wurden alle Zellen in den Testvertiefungen und in den Kontrollvertiefungen mit einer Lösung von 0,05 Trypsin/0,53 mM EDTA (Life Technologies) entfernt und mithilfe eines ZM-Coulter Counters (Coulter, Miami, FL) gezählt. Die die Matrizen enthaltenden Transwells wurden sofort in neue fibronektinbeschichete (1 μg/cm²) Vertiefungen übertragen, in welche 24 Stunden zuvor Zellen (5 × 10³ Zellen/cm²) ausgesät wurden, und konnten weitere 72 Stunden inkubieren, bevor die Zellen entfernt und gezählt wurden. Gleichzeitig zu dem Transfer der Transwells wurde ein neuer Satz von Vertiefungen für VEGF-Dosis-Wirkungsmessungen eingerichtet. Die 72-Stunden-Zyklen wurden 12 Tage lang fortgesetzt.
Zellzahlen in Testvertiefungen wurden in jedem 72 Stunden-Intervall mit Zellzahlen in den Kontrollvertiefungen anhand eines Student-t-Tests verglichen, um signifikante Unterschiede der HMVEC-Proliferation zu ermitteln.
B. Ergebnisse
1. Mineralisierung
Inkubation von mit Gas aufgeschäumten 85 : 15-Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Gerüsten mit VEGF resultierte in dem Wachstum von knochenähnlichem Mineral auf den inneren Porenoberflächen. Varianzanalyse zeigte, daß Unterschiede des prozentualen Massezuwachses je nach SKF-Inkubationsdauer signifikant waren (p < 0,05). Die Gerüste zeugten einen Masseanstieg mit der Inkubationsdauer, mit einem Massezuwachs von 6 ± 1% nach einer viertägigen Inkubation in SKF (5). Die Gerüstmasse blieb danach relativ konstant. Der Massezuwachs zwi schen zweitägigen und viertägigen Inkubationszeiten war signifikant (p < 0,05), während es zwischen der viertägigen Inkubation und längeren Inkubationszeiten keinen signifikanten Unterschied des prozentualen Massezuwachses gab (p > 0,05).
Um zu verifizieren, daß der Massezuwachs durch die Ablagerung eines Apatitminerals verursacht wurde, wurde die Phosphatmasse in den Gerüsten analysiert. Der Phosphatgehalt in Gerüsten stieg mit der Dauer der Inkubation in SKF (6). Varianzanalyse zeigte, daß Unterschiede des Phosphatgehalts je nach Dauer der Inkubation in SKF signifikant waren (p < 0,05). Der Unterschied des Phosphatgehalts zwischen zweitägigen und sechstägigen Inkubationszeiten war signifikant (p < 0,05), während es zwischen der sechstägigen Inkubation und längeren Inkubationszeiten keinen signifikanten Unterschied der Phosphatmasse gab (p > 0,05).
Die Erfinder haben zuvor gezeigt, daß der Zuwachs an Masse und des Phosphatgehalts in diesen Gerüsten das Wachstum eines kontinuierlichen, knochenähnlichen Mineralfilms auf den inneren Porenoberflächen anzeigt (Murphy et al., J. Biomed. Mat. Res., in Druck).
Die Gesamtporosität der Gerüste nach einer 10-tägigen Inkubation in SKF betrug 92 ± 1%, was der Ausgangsporosität der Gerüste ähnlich ist (93 ± 1%).
Nach einer 6-tägigen Inkubation ergibt die Schätzung der Mineralmasse auf dem Gerüst anhand von Phosphatmassedaten 0,10 mg Hydroxylapatit, während der gemessene Massezuwachs des Gerüstes 0,39 ± 0,03 mg beträgt. Die Tatsache, daß der gemessene Wert größer als der geschätzte Wert ist weist auf signifikante Carbonatsubstitution in dem Mineralkristall hin.
2. VEGF-Freisetzung und -Aktivität
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) wurde mit einer Effizienz von 44 ± 9% in PLG-Gerüste eingebaut und über einen Zeitraum von 15 Tagen in SKF- und PBS-Lösungen freigesetzt. Während der ersten 12–36 Stunden wurde eine anfängliche Burst-Freisetzung des eingebauten Wachstumsfaktors beobachtet, gefolgt von einer anhaltenden Freisetzung im verbleibenden Studienzeitraum (7).
Die kumulative Freisetzung aus in SKF inkubierten Gerüsten wurde nach 3 Tagen signifikant geringer als die Freisetzung aus in PBS inkubierten Gerüsten und dieser Unterschied der Freisetzung blieb 10 Tage lang signifikant (p < 0,05). Nach 10 Tagen gibt es keinen signifikanten Unterschied der kumulativen Freisetzung aus in SKF inkubierten Gerüsten gegenüber in PBS inkubierten Gerüsten (p > 0,05).
Aus mineralisierten und nicht mineralisierten Gerüsten freigesetztes VEGF hatte eine mitogene Wirkung auf menschliche, mikrovaskuläre Hautendothelzellen (HMVEC).
Zellen wurden in Vertiefungen gezüchtet, die drei unterschiedliche Gerüste enthielten: 1) Mineralisierte, VEGF enthaltende Gerüste (MV-Gerüste); 2) nicht mineralisierte, VEGF enthaltende Gerüste (NV-Gerüste); und 3) mineralisierte Kontrollgerüste ohne VEGF (MK-Gerüste). Zellen, die in Vertiefungen mit MV- und NV-Gerüsten gezüchtet wurden, zeigten eine signifikant erhöhte Proliferation im Vergleich zu Zellen, die in Vertiefungen mit MK-Gerüsten gezüchtet wurden (8A). Mit Ausnahme der Vertiefungen mit NV-Gerüsten im Laufe des 14-16-Tage-Intervalls der Faktorfreisetzung waren die Zellzahlen in allen Zeitintervallen in Vertiefungen mit MV- und NV-Gerüsten signifikant erhöht (p < 0,05).
Während des 8-10-Tage-Intervalls der Faktorfreisetzung zeigten MV-Gerüste einen signifikant größeren mitogenen Effekt auf HMVEC als NV-Gerüste (p < 0,05). In allen anderen Zeitintervallen gab es keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf den stimulatorischen Effekt von MV-Gerüsten gegenüber NV-Gerüsten (p > 0,05).
Eine für die HMVEC erstellte Dosis-Wirkungskurve (8B) wurde verwendet, um eine wirksame Konzentration für den freigesetzten Wachstumsfaktor zu berechnen. Ein Vergleich dieser wirksamen Kon zentration mit der Menge an VEGF, die bekannterweise in jedem Zeitintervall freigesetzt wird (7), zeigt, daß das freigesetzte VEGF in allen Zeitintervallen mehr als 70% aktiv ist.
Beispiel X
Effekte von Wachstumsfaktoren auf Mineralisierung
A. Material und Verfahren
Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Pellets mit einem Lactid-Glykolid-Verhältnis von 85 : 15 stammten von Medisorb, Inc. (I.V. = 0,78 dl/g) und wurden zu einer Teilchengröße zwischen 106 und 250 μm gemahlen. Gemahlene PLG-Teilchen wurden dann mit 250 μl einer 1%igen Alginat (MVM, ProNova; Oslo, Norwegen)-Lösung in ddH₂O kombiniert und auf dem Vortex gemischt. Diese Lösungen wurden lyophilisiert, mit 100 mg NaCl-Teilchen (250 μm < d < 425 μm) gemischt und bei 1500 psi 1 Minute lang in einer Modellform mit einem Durchmesser von 4,2 mm formgepresst. Dies ergab Scheiben mit einer Stärke von 2,8 mm und einem Durchmesser von 5 mm.
Die Scheiben wurden in einem isolierten Druckbehälter 850 psi CO₂-Gas ausgesetzt und konnten 20 Stunden lang äquilibrieren. Der Druck wurde innerhalb von 2 Minuten auf Umgebungsdruck verringert, was thermodynamische Instabilität und die darauf folgende Bildung von Gasporen in den Polymerteilchen verursachte. Die Polymerteilchen dehnen sich aus und lagern sich zusammen, um ein kontinuierliches Gerüst mit darin eingeschlossenem Alginat und NaCl-Teilchen zu bilden. Nach dem Aufschäumen mit Gas wurden die Scheiben 24 Stunden lang in 0,1 M CaCl₂ inkubiert, um die Salzteilchen auszulaugen und die Gelierung des Alginats in der Polymermatrix zu induzieren. Alginat wurde in die Gerüste aufgenommen da gezeigt wurde, daß es dazu beiträgt, die Freisetzung von VEGF aus PLG-Gerüsten herabzusetzen,¹¹ und es war erforderlich, die Gerüstbedingungen während der Studien zur Faktorfreisetzung genau zu kopieren.
Die Gesamtporosität von Gerüsten wurde anhand der bekannten Dichte des festen Polymers, der gemessenen Polymermasse in dem Gerüst und dem gemessenen Volumen des Gerüstes berechnet. Elektronenmikrografien des Querschnitts von Gerüsten wurden erhalten, indem die Gerüste durch Gefrierfraktionierung geteilt und die Bilder mit einem Hitachi S3200N Rasterelektronenmikroskop aufgenommen wurden.
Um die Wirkung von VEGF in Lösung auf den Mineralwachstumsprozess zu bestimmen, wurden Gerüste in SKF mit 0,2 μCi ¹²⁵I-VEGF (humanes VEGF von Rezeptorqualität, 90 μCi/μg, Biomedical Technologies Inc.; Stoughton, MA) inkubiert (n = 5). Die Proben wurden fünf Tage lang inkubiert, da dies der für das Wachstum einer signifikanten Menge von knochenähnlichem Mineral in den inneren Porenoberflächen von mit Gas aufgeschäumten/durch Auslaugen von Teilchen hergestellten 85 : 15-PLG-Gerüsten^l4 erforderliche Zeitraum ist. Nach der Inkubation wurden die Gerüste dreimal in ddH₂O gewaschen und mit Hilfe eines Gammazählers auf Radioaktivität untersucht. Es wurde der prozentuale Einbau von VEGF in die Polymergerüste berechnet (Radioaktivität (Counts) des Gerüsts/Radioaktivität (Counts) der Lösung * 100) und gegen die Inkubationsdauer aufgetragen.
Die Inkubation erfolgte in Röhrchen, die mithilfe von Sigmacote silikonisiert worden und dann 30 Minuten lang mit einer Lösung mit 1% Rinderserumalbumin vorgetränkt worden waren, um die Innenfläche des Röhrchens mit Rinderserumalbumin zu beschichten und damit die Bindung von VEGF an die Innenfläche der Röhrchen zu vermindern. Die Lösungen wurden täglich erneuert, um eine für Mineralwachstum ausreichende Ionenkonzentration und eine konstante Konzentration für den iodierten Wachstumsfaktor in der Lösung zu gewährleisten.
Simulierte Körperflüssigkeit (SKF) wurde täglich durch Auflösen der folgenden Reagenzien in entio nisiertem H₂O hergestellt: NaCl: 141 mM, KCl: 4,0 mM, MgSO₄ : 0,5 mM, MgCl₂ : 1,0 mM, NaHCo₃ : 4,2 mM, CaCl₂ : 2,5 mM und KHP₂O₄: 1,0 mM. Die resultierende SKF wurde mit Trisma-HCl auf pH 7,4 gepuffert und während der Inkubationszeiträume auf 37°C gehalten.
B. Ergebnisse
Mit einem Gasaufschäum/Teilchenauslaufprozess hergestellte 85 : 15-Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Gerüste waren zu 93 ± 1% porös und hatten eine offene Porenstruktur mit einem Porendurchmesser von –200 μm.
Der Einbau von radioaktivem VEGF in die Gerüste war zu allen Zeitpunkten nach 2 Tagen für Kontrollgerüste größer als für Testgerüste (p < 0,05). Die Kontrolldaten zeigten auch einen Trend eines zunehmenden Einbaus von VEGF mit länger werdender Inkubationsdauer (9). Diese Daten zeigen, daß VEGF in die Kontrollgerüste wirksamer eingebaut wird als in die Testproben und die Menge von VEGF in den Testgerüsten steigt während der Mineralisierungsbehandlung nicht.
Die Daten zeigen, daß VEGF während der Inkubation in SKF nicht signifikant in PLG-Gerüste eingebaut wird. Auch während der anfänglichen Stadien des Mineralwachstums findet kein signifikanter Einbau des Wachstumsfaktors in das Mineral statt. Die zuvor gezeigte Abschwächung der VEGF-Freisetzung aus PLG-Gerüsten während des Mineralwachstums kann daher nicht durch den Einbau von Protein in den Mineralfilm, durch Bindung des Proteins an die Gerüstoberfläche oder durch Rückdiffusion des Proteins in das Gerüst während der Proteinfreisetzung erklärt werden.
Die bei dem Mineralwachstumsprozess auf PLG-Gerüsten postulierten Schritte sind: 1) Oberflächenfunktionalisierung über eine Hydrolysereaktion; 2) Chelierung von Ca²⁺-Ionen durch Oberflächencarboxylatanionen; 3) Keimbildung und Wachstum von Mineralkristallen auf der Polymeroberfläche. Der Mangel an Einbau von VEGF in PLG-Gerüste, die in SKF inkubiert werden, zeigt, daß das Protein nicht mit Calciumionen für Bindungsstellen auf den inneren Porenoberflächen konkurriert oder nach der Freisetzung wirksam in die Gerüste zurück diffundiert.
In diesem Fall war die Menge an in die Gerüste eingebautem Protein signifikant größer für in Tris-HCl inkubierte Kontrollproben und der Einbau nahm mit der Zeit zu. Die erhöhte Effizienz des Einbaus von VEGF in Kontrollproben kann auf die effizientere Diffusion des Faktors in die Kontrollgerüste oder auf eine verstärkte Bindung des Faktors an die inneren Porenoberflächen der Kontrollgerüste zurückzuführen sein. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Auswirkungen von Mineralwachstum auf die VEGF-Freisetzung aus PLG-Gerüsten nicht durch den Rückeinbau von VEGF in die PLG-Gerüste nach der Freisetzung oder durch Bindung von VEGF an die inneren Porenoberflächen erklärt werden können.
Während der anfänglichen Stadien des Mineralwachstums kommt es nicht zu einem signifikanten Einbau von Protein in den Mineralfilm. Während der Inkubation von PLG-Gerüsten in SKF mit ¹²⁵I-VEGF veränderte sich die in den Gerüsten gemessene Menge an VEGF ab Tag 2 nicht signifikant. Die vorliegende Studie begrenzte die zeitliche Dauer der SKF-Inkubation auf 5 Tage, da dies ein Zeitraum war, in dem Mineralwachstum begann und in einer vorhergehenden Studie mit 85 : 15-PLG-Gerüsten, die durch Gasaufschäumen/Teilchenauslaugen hergestellt wurden, signifikantes Mineralwachstum stattfand.
Vorhergehende Studien mit mineralisierten PLG-Gerüsten zeigen, daß das Mineralwachstum in vitro mindestens zwei Wochen dauert und es besteht die Möglichkeit, daß sich bioaktive Faktoren bei längeren Inkubationszeiträumen in den Mineralfilm einbauen. Insbesondere kann die durch Mineralbildung verursachte Abschwächung der Freisetzung von VEGF aus PLG-Gerüsten nicht durch Einbau des Proteins in den Mineralfilm erklärt werden, da diese Abschwächung vorwiegend innerhalb der ersten 5 Tage der Inkubation in SKF auftritt und es in diesem Zeitraum zu keinem signifikanten Einbau kommt.
Da die Abschwächung der Freisetzung von Wachstumsfaktor aus PLG-Gerüsten nicht durch Rückeinbau von Proteinen in die Gerüste nach der Freisetzung oder einen Einbau von Proteinen in die wachsenden Mineralkristalle erklärt werden kann, ist es wahrscheinlich, daß die Abschwächung einfach auf einen Barriereeffekt zurückzuführen ist. Die auf den inneren Porenoberflächen wachsenden Mineralkristalle könnten die Freisetzung von Proteinen aus der Polymermatrix physisch blockieren. Dieser Barriereeffekt wurde ausführlich in kontrollierten Arzneimitteltransportanwendungen, in denen geschichtete polymere Mikrokügelchen und in mikroporöse Membranen eingebaute Mikrokügelchen verwendet wurden, untersucht und das Wachstum von knochenähnlichem Mineral stellt ein neues Verfahren zum Blockieren der Proteindiffusion aus polymeren Materialien heraus dar.
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) wird daher während der Inkubation von PLG in SKF nicht in den Mineralfilm oder signifikant in das Polymergerüst eingebaut. Der zuvor beobachtete Effekt von Mineralwachstum auf VEGF-Freisetzung aus PLG-Gerüsten wird wahrscheinlich dadurch verursacht, daß das Mineral als eine physische Barriere für die Diffusion von Protein aus dem Gerüst heraus wirkt. Es besteht die Überlegung, daß dieser Mechanismus bei kontrollierten Arzneimitteltransportanwendungen nützlich ist, da das Freisetzungsprofil aus diesen Materialien durch die Stärke und Dichte des Mineralfilms vorhersagbar kontrolliert werden könnte.
LITERATURVERWEISE
Abe, Kokubo, Yamamuro. "Apatite coating on ceramics, metals, and polymers utilizing a biological process". J. Mater. Sci. Mater. Med., 1: 233 (1990).
Britland, Perez-Arnaud, Clark, McGinn, Connolly, Moores, "Micropatterning proteins and synthetic peptides on solid supports: a novel application for microelectro nics fabrication technology,"Biotechnol. Prog., 8: 155– 160, 1992.
Byung-Soo and Mooney, "Engineering smooth muscle tissue with a predefinedstructure," J. Biomed. Mat. Res., 1997.
Campbell, Fryxell, Linehan, Graff, "Surface-induced mineralization: a new method for producing calcium phosphate coatings," J Biomed. Mat. Res., 32: 111–118, 1996.
Cohen, Yoshioka, Lucarelli, Hwang, Langer, "Controlled delivery systems for proteins based on Poly (Lactic/Glycolic Acid) microspheres,"Pharmaceutical Research, 8: 713–720, 1991.
Colton,"Implantable biohybrid artificial organs,"Cell Transplant, 4: 415–436, 1995.
Crane, Ishaug, Mikos,"Bone Tissue Engineering, "Nat. Med., 1: 1322–1324, 1995.
Dulcey, Georger, Krauthamer, Stenger, Fare, Calvert, Deep, "Photochemistry of chemisorbed monolayers: patterned coplanar molecular assemblies, "Science, 252: 551–554, 1991.
Gao, Niklason, Langer, "Surface hydrolysis of poly (glycolic acid) meshes increases the seeding density of vascular smooth muscle cells,"J. Biomed. Mat. Res., 42: 417–424, 1998.
Giannobile, "Periodontal tissue engineering by growth factors, "Bone, 19: 23S–37S, 1996.
Gilding, "Biodegradable Polymers, "In: Biocompatibility of Clinical Implant Materials, Williams, DF, (ed.), CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 209–232,1981.
Harris, Kim, Mooney "Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming," J. Biomed. Mat. Res., 42: 396–402, 1998.
Healy, Thomas, Rezania, Kim, McKeown, Lom, Hockberger, "Kinetics of bone cell organization and mineralization on materials with patterned surface chemistry," Biomat., 17: 195–208, 1996.
Hench, "Bioceramics: from concept to clinic," J. Am. Ceram. Soc., 74: 1487–1510, 1991.
Hench, "Bioceramics: From concept to clinic," J. Am. Ceram. Soc., 74: 1487–1510, 1991; Kokubo, "Recent progress in glass based materials for biomedical applications," J. Ceram. Soc. Jpn., 99: 965–973, 1991.
Ishaug-Riley, Crane, Gurlek, Miller, Yaszemski, Yasko, Mikos, "Ectopic bone formation by marrow stromal osteoblast transplantation using poly (DL-lactic-co-glycolic acid) foams implanted into the rat mesentery," J. Biomed. Mat. Res., 36: 1–8, 1997.
Ishaug-Riley, Crane-Kruger, Yaszemski, Mikos"Threedimensional culture of rat calvarial osteoblasts in porous biodegradable polymers, "Biomaterials, 19: 1405– 1412, 1998. Kim and Mooney,"Engineering smooth muscle tissue with a predefined structure," J. Biomed. Mat. Res., 41: 322–332, 1998.
Kohn, Renier, Eaton, Carter, "Environmentally-Responsive Polyamide-Acrylate Grafts Modulate Ion-Exchange," J. Biomed. Mat. Res, 1997.
Kokubo, "Recent progress in glass-based materials for biomedical applications," J. Ceram. Soc. Jpn., 99: 965-973, 1991.
Kreitz, Webber, Galletti, Mathiowitz,"Controlled deli very of therapeutics from microporousmembranes: II. In vitro degradation and release of heparin-loaded poly (D, L-lactide-co-glycolide),"Biomaterials, 18: 597-603, 1997.
Kwong, Chou, Sun, Sefton, Goosen, "In vitro and in vivo release of insulin from poly (lactic acid) microbeads and pellets," Cont. Rel., 4: 47–62, 1986.
Langer, "New methods of drug delivery," Science, 249: 1527–1532, 1990.
Langer and Vacanti, "Tissue Engineering," Science, 260: 920–926, 1993.
LeGeros and Daculzi, "In vivo transformation of biphasic calcium phosphate ceramics: Ultrastructural and physicochemical characterizations," In : Handbook of Bioactive Ceramics, CRC Press, Inc., Boca Raton, p. 17– 28, 1990.
Leung, Cachianes, Kuang, Goeddel, Ferrara, "Vascular endothelial growth factor is a secretedangiogenic mitogen," Science, 246: 1306–1309, 1989.
Li, Garreau, Vert, "Structure property relationships in the case of the degradation of massive poly (a-hydroxy acids) in aqueous media," J Mat. Sci. Mat. Med., 1: 123– 139, 1990.
Li, Bakker, van Blitterswijk, "The bone bonding polymer Polyactive 80/20 induces hydroxycarbonate apatite formation in vitro," J. Biomed. Mat. Res., 34: 79–86, 1997.
Lo, Ponticiello, Leong, "Fabrication of controlled release biodegradable polymer foams by phase separation," Tissue Engineering, 1: 15–28, 1995.
Lom, Healy, Hockberger, "A versatile technique for patterning biomolecules onto glass substrates," J. Neurosci. Meth., 50: 385–397, 1993.
Lopez, Albers, Schreiber, Carroll, Peralat, Whitesides, "Convenient methods for patterning the adhesion of mammalian cells to surfaces using self assembled monolayers of alkanethiolates on gold," J. Am. Chem. Soc., 115: 5877–5878, 1993.
Lowenstein and Weiner, "On Biomineraliztion," Oxford Univ. Press, Oxford, 1989.
Mikos, Sarakinos, Ingber, Vacanti, Langer, "Prevascularization of porous biodegradable polymers," Biotechnology and Bioengineering, 42: 716– 723, 1993.
Mikos and Thorsen, "Preparation and characterization of poly (L-lactic acid) foams," Polymer, 35: 1068–1077, 1994.
Minabe, "A critical review of the biologic rationale for guided tissue regeneration," J. Periodontol, 62: 171– 179, 1991.
Mooney, Kaufmann, Sano, McNamara, Vacanti, Langer, "Transplantation of hepatocytes using porous, biodegradable sponges," Transplant Proc., 26: 3425– 3426, 1994.
Mooney, et al., "Long term engraftment of hepatocytes transplanted on biodegradable polymer sponges," J. Biomed. Mat. Res., 37: 413–420, 1997.
Murphy, Kohn, Mooney "Growth of continuous bone-like mineral within porous poly (lactide-co-glycolide) scaffolds in vitro," J. Biomed. Mat. Res., In Press.
Pekarek, Jacob, Mathiowitz, "Double-walled polymer microspheres for controlled drug release," Nature, 367: 258–260, 1994.
Pierschbacher and Ruoslahti, "Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule," Nature, 309: 30–33, 1984.
Poss, R., Ed. Orthopaedic Knowledge Update, Vol. 3. (American Academy of Orthopaedic Surgeons, Chicago, 1990.) Putnam and Mooney, "Tissue engineering using synthetic extracellular matrices, " Nat. Med., 2: 824–826, 1996.
Ripamonti, "Calvarial reconstruction in baboons with porous hydroxyapatite," J. Craniofac.
Surg., 3: 149–159, 1992.
Ruoslahti and Pierschbacher, "New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins," Science, 238: 491–497, 1987.
Shea, Smiley, Bonadio, Mooney, "DNA delivery from polymer matrices for tissue engineering," Nat. Biotech., 17: 551–554, 1999r Shea, Wang, Francheschi, Mooney, "Bone formation from pre-osteoblasts on 3-D scaffolds," Submitted.
Sheridan, Shea, Peters, Mooney, "Bioabsorbable polymer scaffolds for tissue engineering capable of sustained growth factor delivery," J. Cont. Rel., In Press.
Tanahashi, Yao, Kokubo, Minoda, Miyamoto, Nakamura, Yamamuro, "Apatite coated on organic polymers by biomimetic process: Improvement in adhesion to substrate by glow discharge treatment," J Biomed Mat. Res., 29: 339– 347, 1995.
Weiner, "Organization of extracellularly mineralized tissues: a comparative study of biological crystal growth," CRC Crit. Rev. Biochem., 20: 365–408, 1986.
Whang, Tsai, Nam, Aitken, Sprague, Patel, Healy, "Ectopic bone formation via rhBMP-2 delivery from porous bioabsorbable polymer scaffolds," J. Biomed, Mat. Res., 42: 491–499, 1998.
Wheeler, Chamberland, Schmitt, Buck, Brekke, Hollinger, Joh, Suh, "Radiomorphometry and biomechanical assessment of recombinant human bone morphogenetic protein 2 and polymer in rabbit radius ostectomy model, 43: 365– 373, 1998.
Zhang and Ma, "Porous poly (L-lactic acid)/apatite composites created by biomimetic process," J. Biomed. Mat. Res., 45: 285–293, 1999.

Claims

Verfahren zur Erzeugung einer ausgedehnten, mineralisierten Oberfläche auf einem biokompatiblen Material, wobei das Verfahren die Funktionalisierung wenigstens einer ersten Oberfläche eines biokompatiblen Materials zur Darstellung mehrerer polarer Sauerstoffgruppen an einer funktionalisierten Oberfläche sowie das Inkontaktbringen der funktionalisierten Oberfläche mit einer für die Erzeugung einer ausgedehnten Mineralisierung auf der wenigstens einen ersten Oberfläche des biokompatiblen Materials wirksamen Menge einer mineralhaltigen Lösung in vitro umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die funktionalisierte Oberfläche dadurch erzeugt wird, daß wenigstens eine erste Oberfläche des biokompatiblen Materials einer funktionalisierenden Vorbehandlung vor dem Kontakt mit der mineralhaltigen Lösung ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die funktionalisierende Vorbehandlung das Aussetzen gegenüber einer wirksamen Menge an elektromagnetischer Strahlung, UV-Strahlung oder Elektronenstrahl(e-beam)-Bestrahlung umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die funktionalisierende Vorbehandlung eine funktionalisierte, gemusterte Oberfläche erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die funktionalisierende Vorbehandlung das Aussetzen gegenüber einer wirksamen Menge einer NaOH-Lösung umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die funktionalisierte Oberfläche während des Kontakts mit der mineralhaltigen Lösung erzeugt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mineralhaltige Lösung Calcium enthält und wobei die ausgedehnte Mineralisierung eine ausgedehnte Calciumbeschichtung umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mineralhaltige Lösung wenigstens ein erstes und zweites Mineral enthält und wobei die ausgedehnte Mineralisierung ein Gemisch aus dem ersten und dem zweiten Mineral umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mineralhaltige Lösung mehrere verschiedene Minerale enthält und wobei die ausgedehnte Mineralisierung eine heterogene polymineralisierte Beschichtung umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die ausgedehnte Mineralisierung wenigstens einen ersten hypermineralisierten Anteil umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der wenigstens einen ersten Oberfläche des biokompatiblen Materials um eine innere Porenoberfläche eines porösen biokompatiblen Materials handelt und wobei eine ausgedehnte Mineralbeschichtung auf der inneren Porenoberfläche erzeugt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die ausgedehnte Mineralisierung eine weitgehend homogene Mineralbeschichtung umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die ausgedehnte Mineralisierung mehrere eigenständige Mineralinseln umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der mineralhaltigen Lösung um eine Körperflüssigkeit in vitro oder ein sich wie eine Körperflüssigkeit verhaltendes synthetisches Medium handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material wenigstens einen ersten biologisch abbaubaren, nicht biologisch abbaubaren oder 3-dimensionalen Gerüstanteil bzw. wenigstens einen ersten Anteil mit einer zusammenhängenden oder offenen Porenstruktur umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material wenigstens einen ersten Anteil mit einem weitgehend 2-dimensionalen Biomaterialfilm umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material wenigstens einen ersten Metall-, Bioglas-, Aluminat-, Biomineral-, Biokeramik-, Titan- oder mit Biomineralen beschichteten Titananteil umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material wenigstens einen ersten Anteil umfaßt, der ein aus der Gruppe bestehend aus Hydroxylapatit, kohlensäurehaltigem Hydroxylapatit und Calciumcarbonat ausgewähltes Biomaterial enthält, oder wobei das biokompatible Material wenigstens einen ersten Oberflächenanteil, der mit Carbonsäuregruppen angereichert ist, umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material wenigstens einen ersten Anteil mit einem natürlich vorkommenden oder synthetischen Polymer umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material wenigstens einen ersten Anteil umfaßt, der ein aus der Gruppe bestehend aus Kollagen, Alginat, Fibrin, Matrigel, modifiziertem Alginat, Elastin, Chitosan und Gelatine ausgewähltes natürlich vorkommendes Polymer; oder ein aus der Gruppe bestehend aus einem Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol, Pluronic, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyethylenterephthalat, Polyanhydrid und Polypropylenfumarat ausgewähltes synthetisches Polymer enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material wenigstens einen ersten Anteil umfaßt, der ein Polymilchsäure-(Polylactic Acid, PLA-)Polymer, ein Polyglykolsäure-(Polyglycolic Acid, PGA-)Polymer oder ein Polymilchsäure/Glykolsäure-(PLG-)Copolymer enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material wenigstens einen ersten Anteil umfaßt, der in einem das Aufschäumen mit Gas (gas foaming) bzw. das Auslaugen von Teilchen (particulate leaching) umfassenden Prozeß hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei wenigstens eine erste bioaktive Substanz mit dem biokompatiblen Material während des Gasaufschäum- und Teilchenauslaugprozesses operativ assoziiert ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das biokompatible Material in einem Gasaufschäum- und Teilchenauslaugprozeß, der die folgenden Schritte umfaßt: a) Herstellen einer Mischung, die zumindest ein auslaugbares Teilchenmaterial sowie zur Bildung ei nes porösen, abbaubaren Polymer-Biomaterials fähige Partikel enthält; b) Anwenden eines Gasaufschäumprozesses auf die Mischung, so daß ein poröses, abbaubares Polymer-Biomaterial entsteht, das das auslaugbare Teilchenmaterial enthält; und c) Anwenden eines das auslaugbare Teilchenmaterial aus dem porösen, abbaubaren Polymer-Biomaterial entfernenden Auslaugprozesses auf das poröse, abbaubare Polymer-Biomaterial, wodurch zusätzliche Porosität geschaffen wird, hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Auslaugprozeß das Inkontaktbringen des porösen, abbaubaren Polymer-Biomaterials mit einem mineralhaltigen Auslaugmaterial umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der wenigstens einen ersten Oberfläche des biokompatiblen Materials um eine weitgehend ebene Oberfläche handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei es sich bei der wenigstens einen ersten Oberfläche des biokompatiblen Materials um eine konturierte Oberfläche handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material als wenigstens ein Teil einer implantierbaren Vorrichtung hergestellt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material weiterhin eine biologisch wirksame Menge an wenigstens einer ersten bioaktiven Substanz, einem ersten bioaktiven Medikament oder einer ersten biologischen Zelle enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material weiterhin eine biologisch wirksame Menge an wenigstens zwei bioaktiven Substanzen, Medikamenten oder biologischen Zellen enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material weiterhin eine biologisch wirksame Menge an wenigstens einer ersten an Mineral anhaftenden bioaktiven Substanz, einem ersten an Mineral anhaftenden bioaktiven Medikament oder einer ersten an Mineral anhaftenden biologischen Zelle enthält.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei durch Erzeugung der ausgedehnten mineralisierten Oberfläche die Freisetzung der bioaktiven Substanz, des bioaktiven Medikaments oder der biologischen Zelle aus dem biokompatiblen Material kontrolliert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material weiterhin eine biologisch wirksame Menge an wenigstens einem ersten DNA-Molekül, RNA-Molekül, einer ersten Antisense-Nukleinsäure, einem ersten Ribozym, Plasmid, Expressionsvektor, viralen Vektor oder rekombinanten Virus enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material weiterhin eine biologisch wirksame Menge an wenigstens einem ersten Markerprotein, Transkriptions- bzw. Elongationsfaktor, Zellzyklusregulierungsprotein, einer ersten Kinase, Phosphatase, einem ersten DNA-Reparaturprotein, Onkogen, Tumorsuppressor, angiogenen Protein, antiangiogenen Protein, Zelloberflä chenrezeptor, akzessorischen Signalmolekül, Transportprotein, Enzym, antibakteriellen Agens, antiviralen Agens, Antigen, Immunogen, Apoptosis induzierenden Agens, Antiapoptosisagens oder Cytotoxin enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material weiterhin eine biologisch wirksame Menge an wenigstens einem ersten Hormon, Neurotransmitter, Wachstumsfaktor, Hormon-, Neurotransmitter- bzw. Wachstumsfaktorrezeptor, Interferon, Interleukin, Chemokin, Cytokin, Koloniestimulierenden Faktor, chemotaktischen Faktor, Bestandteil der extrazellulären Matrix oder einem Adhäsionsmolekül, Liganden oder Peptid enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material weiterhin eine biologisch wirksame Menge an Wachstumshormon, PTH (Parathyroid Hormone), BMP (Bone Morphogenetic Protein), TGF-a (Transforming Growth Factor-a), TGF-bl, TGF-b2, FGF (Fibroblast Growth Factor), GMCSF (Granulocyte/Macrophage Colony Stimulating Factor), EGF (Epidermal Growth Factor), PDGF (Platelet Derived Growth Factor), IGF (Insulin-like Growth Factor), HGF (Scatter Factor/Hepatocyte Growth Factor), Fibrin, Kollagen, Fibronectin, Vitronectin, Hyaluronsäure, einem RGD-haltigen Peptid bzw. Polypeptid, einem Angiopoietin oder VEGF (Vascular Endothelial Cell Growth Factor) enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material weiterhin eine biologisch wirksame Menge an wenigstens einer ersten Knochenvorläuferzelle, einem ersten Fibroblasten, einer ersten Endothelzelle, Stammzelle, einem ersten Makrophagen, einer ersten Gefäßzelle, einem ersten Osteoblasten, Chondroblasten oder Osteoklasten enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material weiterhin eine biologisch wirksame Menge an wenigstens einer ersten rekombinanten Zelle, die wenigstens ein erstes exogenes Nukleinsäuresegment exprimiert, von dem ein Transkriptions- bzw. Translationsprodukt in der Zelle produziert wird, enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material weiterhin eine gemeinsame biologisch wirksame Menge an wenigstens einer ersten bioaktiven Substanz und wenigstens einer ersten biologischen Zelle enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material weiterhin eine gemeinsame biologisch wirksame Menge an wenigstens einem ersten osteotropen Wachstumsfaktor bzw. einer ersten Nukleinsäure eines osteotropen Wachstumsfaktors und einer Knochenvorläuferzellen umfassenden Zellpopulation enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material weiterhin eine gemeinsame biologisch wirksame Menge an VEGF bzw. einer VEGF-Nukleinsäure und einer Endothelzellen umfassenden Zellpopulation enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei wenigstens eine erste bioaktive Substanz, ein erstes bioaktives Medikament oder eine erste biologische Zelle vor Beginn des Oberflächenmodifikationsprozesses in das biokompatible Material eingebaut wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei wenigstens eine erste bioaktive Substanz, ein erstes bioaktives Medikament oder eine erste biologische Zelle während des Oberflächenmodifikationsprozesses bzw. nach dem Oberflächenmodifikationsprozeß in das biokompatible Material eingebaut wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biokompatible Material wenigstens eine erste gemusterte Oberfläche umfaßt und wobei wenigstens eine erste bioaktive Substanz, ein erstes bioaktives Medikament oder eine erste biologische Zelle in einem Muster an der gemusterten Oberfläche gebunden wird.
Oberflächenmodifiziertes biokompatibles Material, umfassend wenigstens eine erste, durch ein Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche hergestellte, modifizierte Oberfläche.
Oberflächenmodifiziertes biokompatibles Material gemäß Anspruch 45 zur Verwendung in der Zellkultur.
Oberflächenmodifiziertes biokompatibles Material gemäß Anspruch 45 zur Verwendung in der Zelltransplantation.
Oberflächenmodifiziertes biokompatibles Material gemäß Anspruch 45 zur Verwendung beim Tissue Engineering oder der gesteuerten Geweberegeneration (Guided Tissue Regeneration).
Verwendung eines oberflächenmodifizierten biokompatiblen Materials gemäß Anspruch 45 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines eine Zelltransplantation erfordernden Krankheitszustandes.
Verwendung eines oberflächenmodifizierten biokompatiblen Materials gemäß Anspruch 45 bei der Herstel lung eines Arzneimittels für die Behandlung eines ein Tissue Engineering oder eine gesteuerte Geweberegeneration erfordernden Krankheitszustandes.
Zellkulturvorrichtung, umfassend ein oberflächenmodifiziertes biokompatibles Material gemäß Anspruch 45.
Implantierbare biomedizinische Vorrichtung, umfassend ein oberflächenmodifiziertes biokompatibles Material gemäß Anspruch 45.
Verfahren zur Zellkultivierung, umfassend das Züchten einer in Kontakt mit einem oberflächenmodifizierten biokompatiblen Material gemäß Anspruch 45 stehenden Zellpopulation in vitro.
Verfahren nach Anspruch 53, wobei die Zellpopulation mit dem oberflächenmodifizierten biokompatiblen Material unter Bedingungen und über eine Zeitdauer, die zur Bildung einer zwei- oder dreidimensionalen gewebeähnlichen Struktur führen, in Kontakt gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 53, wobei die Zellpopulation mit dem oberflächenmodifizierten biokompatiblen Material unter Bedingungen und über eine Zeitdauer, die zur Bildung von knochenähnlichem Gewebe, neovaskularisiertem oder vaskularisiertem Gewebe führen, in Kontakt gehalten wird.