-
Hintergrund der Erfindung
-
(a) Erfindungsgebiet
-
Die Erfindung betrifft die Herstellung
und Verwendung injizierbarer selbstbildender Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzungen
zum Reparieren, Ersetzen oder therapeutischen Behandeln von Geweben und
Körperteilen.
Genauer gesagt, schlägt
die vorliegende Erfindung selbstgelierende Mineral-Polymer-Hybridformulierungen
vor. Noch spezifischer umfaßt
die vorliegende Erfindung selbstgelierende Mineral-Polymer-Hybridformulierungen,
die osteokonduktive oder osteoinduktive Mittel, Medikamente oder
therapeutische und/oder heilungsbeschleunigende Bestandteile umfassen.
-
(b) Beschreibung des Standes
der Technik
-
Eine große Anzahl an Biomaterialien
sind für
die Reparatur und Bildung von Hartgewebe eingeführt worden, einschließlich natürlicher
und synthetischer Materialien, reiner organische oder anorganischer
Materialien und organisch-anorganischer Biohybrid- oder Hybridmaterialien.
-
Konduktive Hartgewebsimplantate sind
passive Biomaterialien, die eine Matrix zur Verfügung stellen, um das neue Einwachsen
und die Reparatur von hartem Gewebe unterstützen. Sie stellen im allgemeinen
keine osteogene Eigenschaft zur Verfügung, in dem Sinne, daß solche
Materialien als solche keine Osteogenese oder hartgewebsinduzierende
Faktoren oder irgendwelche hartgewebsheilenden Beschleuniger liefern.
Konduktive Strukturen haben das eigene Einwachsen und die Reorganisierung
von Hartgeweben typischerweise zu begünstigen (Bsp.: osteokonduktive
Materialien).
-
Der Hauptbestandteil von Hartgeweben
ist biologisches Apatit, das für
gewöhnlich
in Knochen und Zähnen
gefunden wird (65–98%).
Calcium- und Phosphationen sind für gewöhnlich in Körperflüssigkeiten und Mineralbestandteilen
von Hartgeweben enthalten, einschließlich Knochen, Dentin und Zahnschmelz.
Sie können
zusätzlich
auch weitere Bestandteile wie beispielsweise Carbonate, Magnesium
oder Natrium enthalten. Hydroxyapatit ist allgemein als ein Calciumphosphat-Material
mit einer Kristallstruktur anerkannt, die biologischem Apatit sehr ähnlich ist.
Calciumphosphate und einige andere Keramiken wurden als sehr nützliche
biokompatible Materialien für
die Reparatur von Hartgeweben befunden. Heute ist eine große Familie
keramischer Biomaterialien mit verschiedenen Formen zum Reparieren
von Hartgeweben erhältlich
und schließt
Calciumphosphat, Calciumcarbonate, Bioglas und reine natürliche Mineralien
ein.
-
Knochenreparatur
und -bildung
-
Konduktive Materialien für die Hartgewebsreparatur
sind darauf ausgerichtet, adäquate
Zusammensetzungen und Architekturen zur Verfügung zu stellen, die das Einwachsen
von Hartgewebe selbst begünstigen.
Diese Matrizes werden in einen Defekt eingebaut, wodurch reife Hartgewebszellen
kontaktiert werden, die in der Lage sind, die Reparaturmatrix zu
invadieren und Mineralnetzwerke zu bilden, um das Einwachsen des
Gewebes zu vollenden. Typische Beispiele werden im allgemeinen als
osteokonduktive Materialien für Knochengewebe
bezeichnet.
-
Konduktive Hartgewebsimplantate haben
eine beträchtliche
Aufmerksamkeit erfahren, insbesondere in der Knochenchirurgie. Das
Transplantieren von Materialien zum Füllen von Defekten und die Knochenreparatur
schließen
Autotransplantate, Xenotransplantate, demineralisierte Knochenmatrix,
poröse
Keramiken wie beispielsweise Calciumphosphate, Calciumcarbonate,
Koralle, Perlmutt, Bioglas, organische Matrizes (Polymere, Collagen
und andere biologische Makromoleküle) wie auch anorganische Biohybride
oder Hybridmaterialien wie beispielsweise Organoapatite ein.
-
Implantate zum Füllen und Reparieren von Defekten
sind gegenwärtig
Feststoffe, manchmal Gele und Hydrogele, die das Einwachsen und
die Leitung des Hartgewebes ermöglichen.
Poröse
oder glatte Feststoffe können
verwendet werden. Glatte feste Implantate stimulieren das Einwachsen
von Hartgewebe durch ihre eigene Resorption. Die Porosität kann der
Materialarchitektur inhärent
sein (echte Porosität),
oder intestiell sein.
-
Calciumphosphate sind Knochenbiomaterialien
bevorzugt worden. In einer großen
Anzahl von Tier- und Menschenstudien haben sie sich als biokompatibel
und als Knochenwachstumspromotoren erwiesen. Gezielte Calciumphosphatkeramiken
sind Tricalciumphosphat, amorphes Calciumphosphat, Octacalciumphosphat
und Apatit-Verbindungen. Hydroxyapatit [Ca10(PO4)6(OH2],
Calcium-defizientes Apatit, fluoriertes Apatit [Ca10(PO4)6F2]
und carboniertes Apatit [Ca10–xHax(PO4)6–x(CO)3)x(OH)2] sind die
repräsentativsten
Apatit-Verbindungen. Synthetische oder gesinterte Apatite können hergestellt
werden.
-
Die meisten Calciumphosphatkeramiken
werden als Granula oder Blockmaterialien hergestellt. Blockmaterialien
können
mit zahlreichen geometrischen Formen wie beispielsweise Stäben, Zylindern,
rechteckigen Formen etc. hergestellt werden.
-
Keramikblocks müssen jedoch vor der Implantierung
wieder in Form gebracht werden, um exakt die defekte Größe und Geometrie
auszumachen, was die Handhabung und klinische Anwendung schwerer
und länger
macht. Außerdem
sind Calciumphosphat-Blöcke
sehr zerbrechlich und schwierig zu formen, und dadurch ist die Kontaktregion
zwischen dem Knochengewebe und dem Keramikimplantat nicht perfekt
kontinuierlich was die Osteokonduktionswirkung stören kann.
Calciumphosphat-Granula werden gegenwärtig in einer breiten Größenverteilung
hergestellt und sind von 10 μm
bis 2,5 mm erhältlich,
aber bevorzugt werden sie mit einer Größe zwischen 90 und 400 μm verwendet.
Granula können
injiziert werden oder mindestens durch weniger invasive Techniken
verabreicht werden, um den Gewebedefekt zu füllen. Granula haben aber in
situ ein Mobilitätsproblem,
was ihre Verwendung und Effizienz einschränkt.
-
Keramiken wie beispielsweise Calciumcarbonate,
Koralle oder Perlmutt werden ebenfalls in granulärer oder Blockform vorgeschlagen,
und weisen ähnliche
Probleme auf. Bioglas liegt im allgemeinen in granulärer oder
Mikrosphären-Form
vor (Bioglass®,
USBio-materials; Bigran®, Orthovita, Perioglass®).
-
Typische kommerzielle Keramikmaterialien,
die als osteokonduktive Materialien verwendet werden, sind z.B.
Apatit wie beispielsweise SurgiBone® (Unilbab),
Osteogen® HA,
Resorb (Implandent), Periograf®, Aleograft®, ProOsteon® (Interpore),
Cerapatite® (Ceraver-Osteal);
Ossatite® (MCP),
Synatite® (SBM),
Ceros, Interpore® 200 (Interpore), OrthoMatrixTM, HA-1000TM und
HA-500TM, Bio-Oss® (Osteohealth),
Calcitite 2040®,
Ceros 80® (Matthys),
Durapatite®,
Apafil-G® (Biomat),
HAP Coralina®,
Endobon® (Merk),
Pyrost® (Osteo)
oder Tricalciumphosphat wie beispielsweise Ceros 82®, Synthograft®,
Biosorb® (SBM),
Calciresorb® (Ceraver-Osteal) oder ein
Gemisch aus Hydroxyapatit und Tricalciumphosphat (biphasisches Calciumphosphat)
wie Triosite® (Zimmer),
Ceraform® (Teknimed),
Eurocer® (Bioland),
BCP® (Bioland),
Ostilit® (Howmedica)
oder Koralle wie beispielsweise BioCoral® (Inoteb).
-
Collagen, ein Bestandteil von weichen
und harten Geweben, und Bone Demineralized Matrix (BDM) sind die
geläufigen
organischen Materialien zum Füllen
von Hartgewebsdefekten. Collagen wurde mit Mineral zusammengegeben,
um Hybridmaterialien wie beispielsweise Collagraft® (NeuColl),
Cerapatite-Collagen® (Ceraver-Osteal), Ossatite®-Zusammensetzung (MCP
oder Collapal® (Osteo)
zu bilden.
-
Polymermaterialien wie beispielsweise
Polymilchsäure,
Polyglykolsäure,
Polymilch-co-glykolsäure-Mikrosphären und ähnliche
wurden ebenfalls für
das Füllen
und die Reparatur von Knochendefekten vorgeschlagen, sind aber weniger
geläufig
als Calciumphosphat-Granulatmaterialien. Eine neue Entwicklung ist
Immix® (Osteobilogics),
ein Knochentransplantationsmaterial, das auf Polymilchsäure/Glykolsäure (PLA/GA)
basiert.
-
Osteoinduktion
-
Osteogene Faktoren werden im allgemeinen
durch das umgebende lebende Gewebe und die Blutzufuhr in der Nähe des Hartgewebsimplantats
angeliefert. Es wäre
höchst
wünschenswert,
eine Hartgewebsreparaturmatrix vorzuschlagen, die die Einwachsförderung
von neugebildetem Hartgewebsgewebe und die Induktionswirkung, kombiniert,
z.B. ein Implantatmaterial, das eine Osteokonduktion und Osteoinduktion
erlaubt. Der genaue Mechanismus der Hartgewebsbildung ist komplex
und nicht vollkommen verstanden, aber es ist klar, daß eine bestimmte
Anzahl an biochemischen Faktoren an der Hartgewebsbildung und Mineralisierung beteiligt
sind. Die Reparatur von Hartgeweben wird durch die Reifung von Vorläuferzellen
in die erwarteten funktionalen Gewebezellen induziert. Für den Knochen
wird eine Osteogenese erreicht, wenn die Osteovorläuferzellen
in Knochenzellen umgewandelt sind, die aktiv sind, Mineralisierung
und Knochengewebe zu bilden. Es kann gesagt werden, daß die Osteogenese
in situ durch verschiedene Faktoren erhalten werden kann: a) die
Osteovorläuferzellen,
die sobald sie umgewandelt sind knochenreparaturbildende Zellen
bilden; b) das induzierende biochemische Umfeld, das die Umwandlung
und Reifung von Osteovorläuferzellen
stimuliert und die Knochenbildung und die Reparaturantwort moduliert;
und c) die konduktive Knochenreparaturmatrix, die die Bildung von
neuen Knochengeweben und Mineralisierungsnetzwerke unterstützt.
-
Eine osteogene Stimulierung kann
zuerst durch Knochenvorläuferzellen
(Osteovorläufer)
hervorgerufen werden. Markstromazellen (MSCs) sind als Vorläuferzellen
von harten und Bindegeweben anerkannt. Hämatopoetische Stammzellen aus
dem Knochenmark sind auch Lieferanten von Osteovorläuferzellen
und Förderer
der Osteogenese. Die Injektion von Knochenmarkpräparaten, mit oder ohne Träger wurde
als die Osteogenese und Knochenreparatur stimulierend, beschrieben.
Die Fähigkeit
des Knochenmarks, Knochen zu bilden, ist gut bekannt und wird klinisch
verwendet. Die Verabreichung von Knochenmark durch eine demineralisierte
Knochenmatrix, Collagen oder Hydroxyapatit-Materialien wird ebenfalls
für das
Reparieren von Knochendefekten beobachtet. Eine Retransplantierung
von MSCs in schlecht heilenden Knochen wird gegenwärtig als
möglicherweise
den Reparaturprozeß steigernd,
angesehen.
-
Cytokine sind bioaktive Proteine,
die auf Zellen wirken, die nahe der Zelle sind, wo es hergestellt
wird, Cytokine und Knochenproteine sind im Hinblick auf die induktiven
oder heilungsbeschleunigenden Wirkungen von Hartgeweben intensiv untersucht
worden, und insbesondere im Hinblick auf Knochen, einschließlich "bone-derived osteogenesis proteins" (bOP), "bone morphogenic proteins" (BMP) und "Wachstums- und Differentierungsfaktoren" (GDF) BMPs und GDFs
aus der Transforming Growth Factor-beta-Gen-Superfamilie sind umfangreich
untersucht worden und werden für
die Knochenbildung und -reparatur verwendet. Transforming Growth
Factor-beta (TGF-beta), Fibroblast Growth Factors (GFG, a–b) und
Plated-Derived Growth Factors (PDGF, A–B) haben sich als nützlich während der
Heilung einer Fraktur herausgestellt, da sie in verschiedenen Schritten
der Heilung der Fraktur wirken, einschließlich der anfänglichen
Antwort auf die Verletzung, der Intramembranossifizierung, der Chondrogenese
oder der endochondrealen Ossifizierung.
-
Kommerzielle Entwicklungen in osteoinduktiven
oder osteoregulierenden Mitteln umfassen rhBMP-2 (Genetic Institute),
Ne-Osteo (Sulzer Orthopedics, Biologics), OP-1 (Styker Biotech),
Indian Hedgehog inducing muolecule (Ontogeny) and Plasmid DNA (Martigen).
-
Ein Hauptschritt beim Verwenden biologischer
induktiver Faktoren ist die klinische Verabreichung und die Dosierung.
Außerdem
hält die
Entwicklung von Biomaterialien zum Erreichen einer minimal invasiven
Verabreichung, einer leichten Verabreichung und einer optimalen
Induktion-Konduktion
von Hartgeweben noch immer an, und ist eine Sache von großem Interesse.
-
Die Verabreichung von DNA oder genetisch
modifizierten Zellen wie beispielsweise MSCs in den Knochen sind
potentielle Wege, um Hartgewebsdefizite dauerhaft zu behandeln.
Wenn sie in situ freigesetzt wird, wird DNA durch die Granulierungszellen
aufgenommen, die medikamentenverteilende Mittel werden und die Bildung
von Hartgeweben stimulieren. Die DNA kann während des Granulierungsvorgangs
der Heilung abgegeben werden, wodurch die Kontrolle der Proteinexpression über Tage
und Wochen kontrolliert wird, und eine Kontrolle der Abfolge an
Ereignissen erlaubt, die normalerweise bei der Hartgewebsbildung
stattfinden. Es kann besonders attraktiv für Patienten mit schwer zu heilenden
Frakturen oder schlechter Knochenheilung sein. Die genetische Reprogrammierung
von MSCs, so daß sie
spezifische Proteine exprimieren, kann therapeutisch für Hartgewebe
verwendet werden, wie auch für
andere Bindegewebe, wie im Falle von Defiziten der zirkulierenden
Proteine. Eine Re-Transplantierung
in genetisch modifizierter MSC-Zellen ist ein Weg, Krankheiten auf
dem genetischen Niveau zu kontrollieren oder zu heilen.
-
Erkrankungen und/oder Defizite, die
mit Hartgeweben assoziiert sind, können sowohl eine Füllung, eine
Reparatur und eine lokale therapeutische Behandlung, z.B. eine teilweise
Resektion von Knochengewebe und/oder eine lokalisierte Anwendung
von Therapeutika notwendig machen. Antibiotika, antiinflammatorische, Antikrebs-,
antimikrobielle und/oder antibakterielle Mittel können den
Hartgewebsstellen verabreicht werden, z.B. Antikrebs/Antitumormittel,
die chirurgisch in einen Defekt eingeschleust werden, der für das Herausschneiden
eines Knochentumors gemacht wurde. Das Mittel wird auch so wirken,
daß es
das Wiederauftreten des Tumors im Knochen verhindert oder kontrolliert.
-
Injizierbare
Knochenersatze
-
Injizierbare Systeme wurden zum Heilen,
der Reparatur und Bildung von Knochen durch weniger invasive oder
traumatische Techniken wie beispielsweise perkutane Verfahren eingeführt. Verschiedene
Biomaterialkonzepte sind vorgeschlagen worden und können wie
folgt klassifiziert werden: a) pharmazeutische Träger für Knochenbehandlung
(z.B.: Gele); b) Hybridknochenfüll-/Transplantationsmaterialien
(z.B.: injizierbare Keramik/Polymerzusammensetzungen); und c) ein
selbstpassendes Knochensubstitut (z.B.: injizierbare Knochenzemente).
-
Auf Hyaluronsäure basierende Gele wurden
zum Zuführen
von Wachstumsfaktoren (OSSiGelTM) wie beispielsweise
basischem FGF vorgeschlagen, wodurch auf das beschleunigte Heilen
der Fraktur bewirkt wird. Matrigel und Collagengele wurden eingeführt, um
zu stützen
und DNA (Gen-Therapie) in Hartgewebe (MartigenTM)
einzuschleusen. Diese Materialien sind reine organische Träger, ohne
Mineralgehalt, und ohne selbstbildende Wirkung.
-
Partikelförmige Feststoffe, die aus Polymeren,
Keramiken oder anorganischen Stoffen gemacht sind, sind gegenwärtig als
potentiell injizierbare Materialien zum Füllen von Defekten bekannt und
in gewissem Ausmaß zum
Tragen und Beliefern von Systemen für Weich- und Hartgewebe. Injizierbare
granuläre
Materialien sind aber hochmobil und verursachen in situ Probleme.
-
Injizierbare Hybridknochenmaterialien
aus granulären
Feststoffen wurden vorgeschlagen, wie beispielsweise und insbesondere
mit Calciumphosphatkeramiken, die in einer organischen Flüssigmatrix
dispergiert und homogenisiert sind. Blut und physiologische Flüssigkeit
wurde gegenwärtig
als Träger
verwendet, aber bildet nicht schnell eine Matrix. Biologische Versiegelungsmittel
wie beispielsweise Fibrinkleber wurden als Matrix vorgeschlagen,
um ein zusammengesetztes Keramikknochenmaterial zu entwickeln (Sedel
et al., J. Biomed. Mat. Res. (Appl. Biomat.), 43. 38–45, 1998;
und Wilson et al., Bio materials, 15: 601–608, 1993). Auf Poly(propylenfumarat)
[PPF] basierte Matrix wurde ebenfalls angepriesen, um Keramiken
zu tragen und um zusammengesetzte Knochenmaterialien zu bilden (Mikos
et al., J. Biomed. Mat. Res., 44: 314–321, 1999). Gelatin wurde ähnlich in
Ossatite
® verwendet
(Medical Calcium Phosphate Laboratories, Frankreich), das ein injizierbares
Knochenprodukt ist (Griffet et al., Bio-materials, 20: 511–515, 1999).
Celluloseartige und insbesondere Celluloseether wie beispielsweise
Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), werden gegenwärtig als
vielversprechende Träger/Matrix
in injizierbaren zusammengesetzten Knochenmaterialien untersucht
(Daclusi et al., J. Biomed. Mat. Res. 47: 28–35, 1999; Dupraz et al., Bio-materials,
20; 663–673,
1999 und Grimandi et al., J. Biomed. Mat. Res. 39: 660–666, 1998).
Daculsi et al. (US-Patent
Nr.
5 717 006 ) pries
zelluloseartige Materialien zum Verarbeiten von zusammengesetzten
Biomaterialien an, die 40 bis 75 Gew.-% Mineralgehalt enthalten.
Dieser Mineralgehalt war eine Mischung aus Hydroxyapatit [Ca
10(PO
4)
6(OH)
2] und beta-Tricalciumphosphat, oder Calciumtitanphosphat
[Ca(Ti)
4(PO
4)
6].
-
Injizierbare Hybridzusammensetzungen
für Hartgewebe
wurden vorgeschlagen (US-Patent Nr.
5
352 715 ) in denen eine Keramikmatrix, die Partikel zwischen
50 und 250 μm
umfaßt,
in dem Flüssigträger dispergiert
sind. Flüssigträger und
Nicht-Keramikbestandteile
wurden aus Collagen, Polyethylenglykol, Glycerol oder sukzinyliertem
Collagen ausgewählt.
Collagen wurde in vielen Systemen angepriesen (US-Patent Nr.
6 027 742 ). Keramik war
im allgemeinen Calciumphophat wie beispielsweise Apatit oder Trichalciumphosphat (US-Patent
Nr.
6 027 742 ). Bioaktive
Mittel waren potentiell in den Hybridzusammensetzungen inkorporiert.
Ein weiteres injizierbares System wurde durch Hench et al. (US-Patent
Nr.
5 840 290 ) vorgestellt,
das aus einer Suspension aus Bioglasen in einer wäßrigen Dextran-Lösung besteht.
Bioglas-Partikel
waren 90 bis 250 μm groß und bestanden
aus 45S5 (Orthovita)-Glaszusammensetzung. Fibrinkleber und PPF-Organmatrizes waren
in situ selbstbildend, aber keine dieser Zusammensetzungen waren
in situ selbst-einpassende oder sich selbst-härtende Materialien.
-
Chitosan wurde zu vielen Flüssigbestandteilen
von Calciumphosphatzement-Zusammensetzungen hinzugemixt. Chitosan
in wäßrigen Zitronen-,
Malein- oder Phosphorsäuremedium
war der Flüssigbestandteil eines
sich selbst einfügenden
Tricalciumphosphats (TCP) oder Tricalciumphosphat/Tetracalciumphosphat (TCP/TTCP)-Zement
(US-Patent Nr.
5 281 404 und
5 180 426 ). Chitosan wurde
in Knochenzementen oder -substituten ebenfalls in der wissenschaftlichen
Literatur untersucht, wie von Leroux et al. (Bone, Bd. 25, Nr. 2,
supplement, 1999: 31S–34S),
Hidaka et al. (J. Biomed. Mat. Res., 46: 418–423, 1999) und Ito (Bio-materials, 12:
41–45,
1991) berichtet wurde.
-
Osteokonduktion und osteogene Leistungen
von Chitosan-basierten
Materialien wurden beobachtet und in der Entwicklung von Biomaterialien
angewendet. Chitosan mit immobilisierten Polysacchariden wie beispielsweise
Heparin, Heparansulfat, Chondroitinsulfat und Dextransulfat wurden
als die Hartgewebsregeneration stimulierten von Hansson et al. (Internationale
Patentveröffentlichung
WO 96/02259) berichtet. Osteoinduktive Zusammensetzungen wurden
auch durch das Mischen von Hydroxyapatit und aus Knochen stammenden
osteoinduktiven Gelatine in Chitosan-Lösungen entwickelt (US-Patent Nr.
5 618 339 ).
-
Die Osteokonduktion und die ostogenen
Leistungsfähigkeiten
von Chitosan wurden ebenfalls in vitro und in vivo untersucht (Hideka
et al., J. Biomed. Mat. Res., 46. 418–423, 1999; und Klokkevold
et al., J. Periondot., 67: 1170–1175,
1996).
-
WO 99/07416 offenbart Chitosan/Organophosphat-wäßrige Systeme
zum Reparieren oder Füllen
von Gewebsdefekten oder Höhlungen.
Die Zugabe eines dibasischen Monophosphatsalzes des Polyols oder
von Zucker, wie beispielsweise Dinatriumglycerophosphat zu der Chitosan-Lösung führt zu einer
weiteren Kontrolle der Geliertemperatur. Das dibasische Monophosphatsalz
kann ein Phosphatcalcium sein. Dieses Dokument setzt auch die Zugabe
von festen partikelförmigen
Additiven vor der Gelierung voraus und offenbart ein Chitosan/Glycerophosphatgel,
das dispergierte feste Kieselerde-Partikel einschließt. Die
nicht-löslichen
Festbestandteile gemäß der vorliegenden
Erfindung sind darin jedoch nicht erwähnt.
-
Es wäre äußerst wünschenswert, wenn einem eine
in situ-selbstbildende
Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzung zur Verfügung gestellt würde, die
genetisch modifizierte MSCs zum Behandeln spezifischer Hartgewebedefizite
oder -erkrankungen enthält,
wie beispielsweise Knochenbrüchigkeit,
Osteoporose, Paget-Krankheit, Dysplasie, Osteogenesis imperfecta
und ähnliche.
-
Es wäre auch höchst wünschenswert, wenn einem selbstbildende
Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzungen zur Verfügung gestellt würden, die
auf Substanzen aufgetragen werden kann, auf die Defekte oder Höhlungen
in (Weich- oder Hart-) Geweben oder auf jede anatomische Struktur
der Gewebe oder irgendeine Körperhöhlung, was
dadurch in situ die Bildung einer Gruppe an Biomaterialien mit verschiedenen
Zusammensetzungen, Funktionen und Eigenschaften ermöglichte.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung
ist das Zurverfügungstellen
von selbstbildenden Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzungen, die auf Substanzen,
Defekte oder Höhlungen
von (Wichteil- oder harten) Geweben oder auf jede anatomische Struktur
von Geweben oder in jede Körperhöhlung eingebracht
werden, die die Bildung in situ von einer Gruppe von Biomaterialien
mit verschiedenen Zusammensetzungen, Funktionen und Eigenschaften
ermöglichen.
-
Erfindungsgemäß werden neue injizierbare
in situ-selbstbildende
Mineral-Polymer-Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die günstig für die Gewebsreparatur,
den Ersatz oder die Behandlung von Säugetieren oder Menschen verwendet
werden. Die einfachste Form ist eine wäßrige Polymerlösung, die
sich aus einem säurelöslichen
Polymer und einer wasserlöslichen
organischen Monophosphatquelle zusammensetzt, die die spezielle
Eigenschaft hat, daß sie
endothermisch empfindlich ist. Sie bildet die Basis des Flüssigbestandteils
von in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Zusammensetzungen
und daraus entstandenen Materialien. Diese endothermisch sensitive
Eigenschaft führt
zu einer intrinsischen thermogelierenden Eigenschaft, die jegliche
Verwendung eines kovalenten Vernetzungsmittels oder eine organischen
Lösungsmittels ausschließt, und
wurde von Chaput et al. vorgestellt.
-
Erfindungsgemäß wird eine sich in situ selbstbildende
Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die umfaßt:
- a) einen auf Wasser basierenden und thermogelierenden
Flüssigbestandteil,
umfassend mindestens ein wasserlösliches
kationisches Polymer, eine organische Monophosphatquelle und gegebenenfalls
ein wasserlösliches
organisches Monosulfonat-, Monosulfat- oder eine Monocarboxylat-Quelle;
wobei dieser Flüssigbestandteil
einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,4 hat; und
- b) einen wasserunlöslichen
Feststoffbestandteil, der mindestens eines aus Calcium-, Fluorid-,
Strontium-, Carbonat- und Phosphatsalzen umfaßt,
wobei dieser
Flüssigbestandteil
und der Feststoffbestandteil eng miteinander vermischt werden, um
eine nicht-härtende
thermogelierende Hybridzusammensetzung zu bilden; diese Hybridzusammensetzung
geliert bei Körpertemperatur.
-
Der Flüssigbestandteil kann aus organischen
und/oder anorganischen Säuren
hergestellt werden, einschließlich
Maleinsäure,
Propionsäure,
Phosphorsäure,
Organophosphorsäure,
Glycerophosphorsäure, Milchsäure, Salzsäure, Ascorbinsäure, Ameisensäure, Essigsäure und ähnlicher.
-
Das Polymer kann ein kationisches
hydrophiles Polysaccharid sein, das Amino-Gruppen trägt, einschließlich teilweise
deacetyliertem Chitosan und reinen Chitosanen.
-
Das Polymer kann teilweise deacetyliertes
Chitosan mit einem Deacetylierungsgrad zwischen 30 und 99% sein.
-
Der Flüssigbestandteil kann ein zweites
lösliches
Polymer umfassen, das ausgewählt
wird aus zelluloseartigen und synthetischen Polymeren, einschließlich Collagen,
Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose,
Hydroxyethylpropylcellulose, Hydroxymethylpropylcellulose, Poly(ethylenoxid),
Poly(propylenoxid), Poly(ethylenglykol), Poly(vinylpyrrolidon),
Poly(vinylalkohol) oder Derivate davon, oder Gemische daraus.
-
Die organischen Monophosphat-, Monosulfonat-,
Monosulfat- und Monocarboxylat-Quellen dieses Flüssigbestandteils können einen
basischen Charakter und einen pKa-Wert zwischen 6,0 und 7,4 haben.
-
Die organische Monophosphat-Quelle
kann ausgewählt
werden aus der Gruppe bestehend aus Na2PO4C3H5(OH)2, Fe2PO4C3H5(OH)2, K2PO4C3H5(OH2), MgPO4C3H5(OH)2, MnPO4C3H5(OH)2, Ca2PO4C3H5(OH)2, Na2PO7C3H7, Na2PO7C4H7, K2PO7C4H7,
NaPO7C4H8, K2PO7C4H9, Na2PO8C5H9,
K2PO8C5H9, NaPO8C5H10, KPO8C5H10, Na2PO9C6H11,
NaPO9C6H12, K2PO9C6H11, KPO9C6H12,
Na2PO8C6H13, K2PO8C6H13, NaPO8C6H14,
KPO8C6H14,
Na2PO9C6H12, K2PO9C6H12, NaPO9C6H13,
KPO9C6H13,
Na2PO8C10H11, K2PO8C10H11, NaPO8C10H12 und
KPO8C12H12 und ähnlichen
und Derivaten und Gemischen daraus.
-
Die organische Monophosphat-Quelle
kann alpha-Glycerophosphat,
beta-Glycerophosphat, Glucose-1-phosphat, Glucose-6-phosphat, Fructose-1-phosphat
oder Fructose-6-phosphatsalz
oder Gemische daraus.
-
Die organische Monosulfonat-Quelle
kann sein N-[Carbamoylmethyl]-2-aminoethansulfonat (ACES), N,N-Bis[2-hydroxyethyl]-2-aminoethansulfonat
(BES), 3-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropansulfonat
(DIPSO), N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-3-propansulfonat (HEPES), 2-[N-Morpholino]ethansulfonat (MES),
4-[N-Morpholino]butansulfonat (MOBS), 3-[N-Morpholino]-2-hydroxypropansulfonat
(MOPSO) oder N-Tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethansulfonat (TES)
oder ähnliche
oder Gemische daraus.
-
Der Flüssigbestandteil kann außerdem Bis[2-hydroxyethyl]iminotris[hydroxymethyl]methan (BIS-TRIS)
oder tris[hydroxymethyl]aminomethan (TRIZMA) oder ähnliche
oder Gemische umfassen.
-
Der Flüssigbestandteil kann außerdem Aminosäurereste
oder -sequenzen, einschließlich
Histidin- (HIS) oder Lysin- (LYS) -reste oder -sequenzen umfassen.
-
Der Flüssigbestandteil kann organische
Polyolinhaltsstoffe umfassen, einschließlich Zuckerpolyolen, Saccharid-Polyolen oder
Glykolen wie beispielsweise Glycerol, Mannit, Sorbit, Ethylenglykol-Oligomere,
Propylenglykol-Oligomere, Fructose, Glucose, Maltose und ähnliche.
-
Der Flüssigbestandteil kann wasserlösliche Phosphat-
oder Carbonatsalze oder Gemische daraus umfassen.
-
Der Flüssigbestandteil hat bevorzugt
eine intrinsische Viskosität
die von 5 und 100000 mPa·s
bei 21°C reicht.
-
Der Flüssigbestandteil bildet bei
einer Temperatur zwischen 25 und 60°C bevorzugt ein homogenes wäßriges festes
gelartiges Material.
-
Der Flüssigbestandteil kann umfassen
Calciumphosphat-, Calciumsulfat-, Calciumcarbonat-, Calciumtitanat-,
Calciumacetat-, Calciumglycerophosphat-, Calciumgluconat-, Calciumpropionat-Verbindungen,
oder ähnliche
oder ein Gemisch daraus.
-
Der feste Bestandteil kann mindestens
ein Calciumphosphat umfassen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Ca(H2PO4)2·H2O, CaHPO4·2H2O, CaHPO4, CaZn3(PO4)2,
CaZnPO4, CaNaPO4, Ca2PO4Cl, alpha-Ca3(PO4)2,
beta-Ca3(PO4)2, Ca3(PO4)2-H2O,
Ca4(PO4)20, Ca8H2(PO4)6·5H2O, Ca9(HPO4)(PO4)5OH,
Ca10(PO4)6(OH)2–2xOx und
Ca10(PO4)6(OH)2 und Derivate
davon.
-
Der Feststoffbestandteil kann Hydroxyapatit
und Tricalciumphosphat umfassen.
-
Der Feststoffbestandteil kann Hydroxyapatit
und alpha- oder beta-Tricalciumphosphat, oder jede Kombination daraus
umfassen.
-
Der Feststoffbestandteil von 5 bis
95 Gew.% Hydroxyapatit und 90 bis 5 Gew.% alpha- oder beta-Tricalciumphosphat
umfassen.
-
Der Feststoffbestandteil umfaßt bevorzugt
45 bis 65 Gew.% Hydroxyapatit und 35 bis 55 Gew.% alpha- oder beta-Tricalciumphosphat.
-
Der Feststoffbestandteil kann natürliche Mineralbestandteile
umfassen, einschließlich
Hartgewebe, Emaile oder Dentalapatit, Koralle oder Perlmutt.
-
Der Feststoffbestandteil kann zusätzlich eine
Carbonat-Verbindung
umfassen, die ausgewählt
wird aus Na2CO3,
CaCO3, K2CO3, MgCO3, ZnCO3, Ca9K(PO4)5(CO3)2, Ca8,5Na1,5(PO4)4,5(CO3)2,5, Ca9(PO4)4,5(CO3)1,5 und ähnliche.
-
Der Feststoffbestandteil kann zusätzlich ein
carboniertes Calciumphosphat umfassen.
-
Der Feststoffbestandteil zusätzlich eine
Fluor-Verbindung umfassen, die ausgewählt ist aus NaF, Na2Si6F, KF, KSi6F, CaF2, MgF2, ZnF2, Natriumfluorphosphaten
und ähnliche.
-
Der Feststoffbestandteil zusätzlich ein
fluoriertes Calciumphosphat umfassen.
-
Der Feststoffbestandteil zusätzlich eine
Strontium-Verbindung umfassen.
-
Der Feststoffbestandteil zusätzlich ein
strontiumhaltiges Calciumphosphat umfassen.
-
29. Der Feststoffbestandteil umfaßt bevorzugt
natürliche
oder synthetische feste Bestandteile einschließlich Mineral- oder Keramikmaterialien,
Bioglase, polymere oder biopolymere Materialien und ähnliche.
-
Der Feststoffbestandteil und dieser
Flüssigbestandteil
haben bevorzugt ein Feststoff/Flüssig-Gewichtsverhältnis zwischen
0,05 und 2,0 g/ml.
-
Der Feststoffbestandteil aus trockenen
Inhaltsstoffen mit einer Größe die von
5 bis 1.000 μm
reicht, bestehen.
-
Die Hybridzusammensetzung ist bevorzugt
mindestens teilweise in situ über
eine Zeit, wie beispielsweise über
eine Dauer von 18 Monaten, resorbierbar.
-
Die Hybridzusammensetzung oder der
Flüssigbestandteil
oder Feststoffbestandteil können
mit autologen Materialien gemischt werden, die ausgewählt werden
aus der Gruppe bestehend aus kortikalen oder kortiko-spongiösen Knochen,
Vollblut und Blutbestandteilen, Knochenmark, Zellen, die aus Geweben
isoliert wurden, Stromazellen oder hämatopoietischen Zellen.
-
Die Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung kann außerdem
osteoinduktive Mittel umfassen, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend
aus Wachstumsfaktoren, Hormonen, individuellen osteoinduktiven Proteinen
und Gemischen osteoinduktiver Proteine.
-
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann außerdem aus
Knochen stammende Materialien einschließlich demineralisiertem Knochenmatrix
(DBM) oder Pulver (DBP) umfassen.
-
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann außerdem mindestens
einen Wachstumsfaktor umfassen, der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend
aus IGF, EGF, a-FGF, b-FGF, PDGF-A, PDGF-B und TGF-beta.
-
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann außerdem mindestens
ein Knochenmorphogeneseprotein (BMP), Sialoproteine, Osteonectin,
Osteopontin, Osteocalcin, Calcitonin oder ein Gemisch daraus umfassen.
-
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann außerdem antiresorptive,
antibiotische, antivirale, Antitumor- und/oder immunsupprimierende Mittel
umfassen.
-
Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung
zur Verfügung
gestellt, die oben definiert wurde, zur Verwendung in einer gelierenden
Zusammensetzung, um einen Defekt, eine Höhlung oder eine Grenzfläche eines
Gewebes oder in einer Körperhöhlung zu
korrigieren, und in situ in ein gelartiges Füllmaterial umgewandelt werden
kann.
-
Die Zusammensetzung kann auch als
gelartiges Material verwendet werden, um einen Defekt, eine Höhlung oder
eine Kontaktfläche
eines Gewebes oder eine Körperhöhle zu füllen.
-
Die Hybridzusammensetzung wird bevorzugt
verabreicht und bildet sich in einem Defekt, einer Höhlung oder
einer Grenzfläche
von einem oder mehreren Knochen selbst.
-
Die Hybridzusammensetzung wird bevorzugt
verabreicht und ist vollständig
selbstbilden in einem Defekt, einer Höhlung oder einer Kontaktfläche eines
kortikalen, eines kortiko-spongiösen Teils
eines Knochens.
-
Die Hybridzusammensetzung kann verabreicht
werden und in einem Defekt, einer Höhlung oder einem Kontaktbereich
zwischen den Gewebsteilen oder Fragmenten eines gebrochenen Knochens
vollständig selbstbildend
sein.
-
Die Hybridzusammensetzung kann verabreicht
werden und in einem Defekt, einer Höhlung oder einer Kontaktstelle
im Metaphysen- oder Diaphysen-Bereich eines Körpers vollständig selbstbildend
sein.
-
Die Hybridzusammensetzung kann verabreicht
werden und sich in einem Defekt, einer Höhlung oder einer Kontaktstelle
von hyalinen Knorpelgewebe vollständig selbst bilden.
-
Die Hybridzusammensetzung kann sich
in einem Defekt, einer Höhlung
oder einer Kontaktstelle eines fibrösen Knorpelgewebes vollständig selbst
bilden.
-
Die Hybridzusammensetzung wird bevorzugt
injiziert oder perkutan oder endoskopisch in einem Defekt, einer
Höhlung
oder einem Kontaktbereich eines Gewebes oder in eine Körperhöhle durch
eine Kanüle, einen
Katheter, einen Trokar oder eine Nadel extrudiert.
-
Die Hybridzusammensetzung kann im
Verlaufe einer offenen chirurgischen Operation angewendet und geliert
werden.
-
Die Hybridzusammensetzung kann im
Verlaufe einer Reparatur-, Rekonstruktions- oder Ersatzbehandlung
in der Dental-, plastischen, cranio-maxillofacialen- oder orthopädischen
Chirurgie verabreicht werden.
-
Erfindungsgemäß wird eine sich in situ selbstbildende
Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die umfaßt:
- a) einen thermogelierenden Flüssigbestandteil,
der mindestens 0,55 W/V an Chitosan umfaßt, 2,0% W/V Glycerophosphat;
wobei der Flüssigbestandteil
einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,4 hat; und
- b) einen festen Bestandteil, der mindestens ein Apatit und/oder
ein Tricalciumphosphat umfaßt,
wobei
dieser Flüssigbestandteil
und dieser feste Bestandteil gut miteinander vermischt werden, um
eine nichthärtende
thermogelierende Hybridzusammensetzung zu bilden, wobei die Hybridzusammensetzung
bei Körpertemperatur
geliert.
-
Der Flüssigbestandteil kann zusätzlich 0
bis 10% W/V mindestens eines aus Glycerol-, Sorbitol-, Mannitol-,
Ethylenglykol-Oligomeren oder -Polymeren und Propylenglykol-Oligomeren oder -Polymeren
umfassen.
-
Der Flüssigbestandteil kann mit autologem
Blut, Blutbestandteilen oder Knochenmark gemischt werden, wobei
das autologe Blut, der Blutbestandteil oder das Knochenmark in einer
Konzentration vorliegt, die von 0 bis 25% W/V reicht.
-
Der Feststoffbestandteil ist bevorzugt
ein trockenes Gemisch aus mindestens Hydroxyapatit und beta-Tricalciumphosphat.
-
Der Feststoffbestandteil kann zusätzlich mindestens
ein strontiumhaltiges Calciumphosphat umfassen.
-
Der Feststoffbestandteil kann zusätzlich 0
bis 25% W/V trockenen, zerbrochenen, autologen, spongiösen Knochen
umfassen.
-
Der Feststoffbestandteil kann zusätzlich 0
bis 55% W/V trockenes demineralisiertes Knochenmaterial umfassen.
-
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Herstellen
einer sich in situ selbstbildenden Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzung
zur Verfügung
gestellt, die zuvor beschrieben worden ist. Das Verfahren besteht aus
dem Schritt des•
- a) Herstellen eines ersten auf Wasser basierenden
Flüssigunterbestandteils
umfassend mindestens ein wasserlösliches
kationisches Polymer, und bevorzugt mindestens 0,5% W/V Chitosan,
wobei der erste Unterbestandteil bei unter 10°C stabil ist und aufbewahrt
werden kann,
- b) Herstellen eines zweiten auf Wasser basierenden flüssigen Unterbestandteils
umfassend mindestens eine organische Monophosphat-Quelle, und gegebenenfalls
eine wasserlösliche
organische Monosulfonat-, Monosulfat- oder Monocarboxylat-Quelle,
- c) Herstellen eines Feststoffbestandteils, umfassend mindestens
einen aus Calcium-, Fluorid-, Strontium-, Carbonat- und Phosphatsalzen,
wie beispielsweise Apatit und ein Tricalciumphosphat,
- d) homogenes Mischen dieses zweiten Flüssigunterbestandteils mit dem
Feststoffbestandteil in eine stabile auf Wasser basierende Dispersion,
wobei die Dispersion bei Raumtemperatur oder darunter stabil ist
und aufbewahrt werden kann, und
- e) Mischen des ersten Flüssigbestandteils
und der stabilen Dispersion zusammen, um eine nichthärtende thermogelierende
Hybridzusammensetzung zu bilden,
wobei die Hybridzusammensetzung
einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,4 hat, injizierbar ist, bei Körpertemperatur
geliert und bei jedem Defekt, Höhlung
oder anatomischen Struktur der Körpergewebe
anwendbar ist.
-
Zum Zweck der vorliegenden Erfindung
werden die folgenden Begriffe unten definiert.
-
In der vorliegenden Erfindung bedeutet
der Begriff "endothermisch
sensitive" Lösung eine
Lösung,
die sich mit ansteigender Temperatur in ein Gel-Material umwandelt,
gemäß dieser
Bedeutung kann endothermisch sensitiv leicht durch endothermisch
gelierend ersetzt werden.
-
"Wasserlöslich" betrifft jede Chemikalie
oder Verbindung, die sich leicht in einem auf Wasser basierenden
(wäßrigen)
Medium auflöst.
-
In der vorliegenden Erfindung umfaßt die Zusammensetzung
eine Flüssigbestandteil
und einen festen Bestandteil, so daß die Bestandteile gut miteinander
vermischt werden, wobei der Flüssigbestandteil
wie zuvor definiert endodermisch empfindlich ist.
-
Der Begriff "Mineral-Polymerzusammensetzung" betrifft hier eine
biphasisches System, in dem ein Mineralbestandteil mit einem Polymerbestandteil
assoziiert ist, egal ob diese Mineral- oder Polymerbezstandteile flüssig oder
fest sind.
-
Der Begriff "Flüssigbestandteil" betrifft hier eine
auf Wasser basierende Lösung,
und insbesondere eine auf Wasser basierende Polymerlösung.
-
Der Begriff "Feststoffbestandteil" betrifft hier ein festes Material,
wobei feste Materialien bevorzugt ein Pulver, Partikel, Mikrosphären oder
granuläres
Material sind. Für
den Feststoffbestandteil wird auch der Begriff "Mineralbestandteil" verwendet.
-
Der Begriff "trockener Inhaltsstoff" betrifft trockenes
festes Material, das bei der Herstellung des festen Bestandteils
und der Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzung eingefügt wird.
In den meisten Fällen
sind es feste Partikel, die aus Mineralien oder organischem Material
einem Gemisch daraus bestehen.
-
"Bioaktives
Mittel" betrifft
hier eine Substanz, die eine etablierte biologische Wirkung von
Interesse für die
Verwendung der Hybridzusammensetzung aufweist.
-
"Nicht-bioaktives
Mittel" entspricht
jeder Substanz, die ohne Betrachtung auf eine mögliche biologische Aktivität in der
Hybridzusammensetzung verwendet wird.
-
"Selbstgelierend" betrifft hier die
Sol-Gel-Transition, die mit dem Flüssigbestandteil assoziiert
ist, was zur Bildung eines uniformen dreidimensionalen Hydratnetzwerks
führt (hauptsächlich organisch).
Die selbstgelierende Reaktion ist eine intrinsische Reaktion des
Polymers und des Flüssigbestandteils.
Hier schließt
Gelieren das Härten
aus.
-
"Gelartig" betrifft eine Substanz,
die das Erscheinungsbild eines homogenen hochhydratierten Gels hat.
Gelartige schließen
Feststoffe in der Hinsicht aus, daß sie kaum oder gar keine hydratierten
Festmaterialien (harte Feststoffe) sind.
-
In der vorliegenden Erfindung betrifft
der Begriff "polykationisch" oder "kationisches Polymer" ein Polymer, natürlich (biologisch),
künstlich
oder synthetisch, das positiv geladene chemische Gruppen hat. Die
bevorzugten Gruppen schließen
Amine (freie Amine) ein. Typische Polykationen der Erfindung schließen nicht ausschließlich Polyamine
wie beispielsweise Polylysin, Chitosan oder Polyethylenimid oder
zwitterartige Polymere wie beispielsweise Collagene ein.
-
In der vorliegenden Erfindung betrifft
die neue sich selbstbildende Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzung
insbesondere eine injizierbare selbstbildende Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzung
und Biomaterial in dem die Materialbildung in situ mit denen gelartiger
Materialien verwandt ist; die Materialbildung betrifft eine Sol-Gel-Transition, die intrinsisch
innerhalb des Flüssigbestandteils
auftritt (selbstgelierend); die Zusammensetzungen oder Biomaterialien
werden hier als "selbstgelierende
Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzung
oder Biomaterialen" oder "selbstgelierende
Hybridzusammensetzung" oder "selbstgelierende
Zusammensetzung" definiert.
Diese Zusammensetzung kann jedoch vor dem Gelieren oder in einem
gelierten Stadium verwendet werden.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
1 stellt
den Blick durch ein Lichtmikroskop auf CaP-Partikel wie beispielsweise Durapatit
(>125 mic) (1A), Durapatit (125–250 mic)
(1B), TCP (1C), synthetisches HAP (100–300 mic)
(1D), Corallen-HAP (300
mic) (1E) und DAP Mikrosphären die
in die CGP-Systeme
eingefügt
werden können;
-
2 stellt
die Viskosität
von DAP-CGP-Hybridsystemen (Chitosan 2% G/V; GP 8,2% G/V) als Funktion
der Scherrate (20°C)
dar;
-
3 stellt
die Viskosität
von TCP-CGP-Hybridsystemen (Chitosan 2% G/V; GP 8,2% G/V) als Funktion
der Scherrate (20°C)
dar;
-
4 stellt
die Sedimentierungstendenz von DAP-Partikeln in einer CGP-Lösung und
Wasser dar in dem CGP 2,3% G/V Chitosan und die DAP Beladung 3 g
war;
-
5 stellt
die Sedimentierungstendenz von DAP-Partikeln in einer CGP-Lösung und
Wasser dar in dem CGP 2,3% G/V Chitosan und die DAP Beladung 1 g
war;
-
6 stellt
das Thermogelieren des elastischen Modus mit der Temperatur (6A) und den Phasenwinkel
mit der Temperatur (6B)
zwischen zwei verschiedenen Flüssigbestandteilen
dar, das Chitosan-Glycerophosphat-System, das um 40°C spontan geliert und das Hydroxypropylmethylcellulose
(HPMC)-System, das um 60°C
geliert, wobei Chitosan-Glycerophosphat-Systeme stärker gelieren
als HPMC;
-
7 stellt
die rheologischen Eigenschaften von DAP-CGP-Hybridsystemen (Chitosan 2% G/V; GP 8,2%
G/V) dar, der elastische Modus (G') wird während des Gelierens angegeben
(37°C);
-
8 stellt
die rheologischen Eigenschaften von DAP-CGP-Hybridsystemen (Chitosan 2% G/V; GP 8,2%
G/V) dar, der Viskositätsmodus
(G'') wird während des
Gelierens angegeben (37°C);
-
9 stellt
die Entwicklung des G'-Modus
der CGP-Systeme dar, die mit TCP beladen sind (Chitosan 2% G/V;
GP 8,2 G/V) beim Gelieren bei 37°C;
-
10 stellt
die Entwicklung des G'-Modus
der HAP-Systeme dar, die mit TCP beladen sind (Chitosan 2% G/V;
GP 8,2% G/V) beim Gelieren bei 37°C;
-
11 stellt
die Entwicklung des G'-Modus
der BCP-Systeme dar, die mit TCP beladen sind (Chitosan 2% G/V;
GP 8,2% G/V) beim Gelieren bei 37°C;
-
12 stellt
den Kompressionsmodus DAP-CGP Hybridsystemen dar, der aus Stress-Entspannungstests
wie beispielsweise vergleichender Modus beim Höchstwert (maximal 25 Kompression,
1%/s Rate) (12A) und
vergleichender Modus bei Gleichgewicht (12B);
-
13 stellt
die Kompressionslast einer 10 ml Spritzen-Injizierbarkeit für eine Zusammensetzung aus Chitosan
1,5%, GP 8,0%, HAP 30% dar;
-
14 stellt
das Gelieren mit ansteigender Temperatur der Hybridformulierung
dar, nachdem sie durch Mischung einer Zusammensetzung enthaltend
5 g BCP in 5 ml H2O/GP (14A) und 5 ml Chitosan 4% G/V (14B), wobei die endgültigen Konzentrationen
2,0% Chitosan, 9,0% GP und 50% G/V BCP waren, in zwei Spritzen hergestellt
wurde;
-
15 stellt
den Anblick von BCP-Granula durch ein Rasterelektronenmikroskop
dar, die auf 100 bis 250 μm
(15A) gesiebt wurden
und die entsprechenden Hybridmaterialien mit einem flüssigen Chitosan-Glycerophosphat-Bestandteil
(15B), wobei die Konzentrationen
2,0% Chitosan, 8,0% G/V GP waren;
-
16 stellt
den makroskopischen Blick auf die thermogelierende Polymer-Mineralzusammensetzung
dar (Chitosan-Glycerophosphat-BCP), die in einer Spritze fertig
zur Verwendung ist, wobei die Zusammensetzung gut injizierbar ist,
wenn sie im flüssigen
(nicht-gelierten) Zustand ist, wobei die Zusammensetzung leicht
geformt werden kann, und in jedem Empfänger geliert werden kann (Gelzustand
in der Petrischale); und
-
17 stellt
die Gelstabilität
dar, die durch den Modus G' und
G'' gegenüber der
Frequenz dargestellt wird, was beweist, daß die Gelbildung eines Chitosan-Glycerphosphat-Systems,
das mit Vollblut eines Kaninchens gemischt wird (Blutgehalt: 15%
V/V) und das Gelieren rheologisch auf 37°C kontrolliert wird.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
In der Erfindung werden selbstbildende
Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzungen
als Füllträgermittel
hergestellt, die hauptsächlich
auf einer sich selbstbildenden neutralen wäßrigen Polymerzusammensetzung
beruhen. Sie sind hauptsächlich
thermogelierende Polymersysteme, die einen festen Mineralstoff (oder Keramik)-Bestandteil
umfassen, und erst bei Körpertemperatur
in Keramik/gelartige Materialien umgewandelt werden. Die Polymerzusammensetzungen
können
ideal angewendet werden, um Defekte, Höhlungen oder anatomische Strukturen
wie auch die Kontaktzone zwischen Prothesen oder Implantaten zu
füllen.
Die Zusammensetzung trägt
osteokonduktive Materialien, osteoinduktive Mittel, Medikamente,
Therapeutika und/oder Heilungsbeschleuniger wie beispielsweise Wachstumsfaktoren,
synthetische Moleküle
oder Gewebsproteine.
-
Diese Zusammensetzung kann einen
nicht zu vernachlässigenden
Mineral- oder Keramikgehalt haben, der die Mineralisierung ermöglicht und
die Bildung von Hartgewebsmineralien stimuliert, z.B. durch die Umwandlung
in situ in Knochenapatit, aber es härtet in situ nicht selbst aus,
und muß nicht
als sich selbsteinfügendes
Biomaterial angesehen werden. Die Hybridzusammensetzung wird in
situ als indizierbare selbstgelierende flüssige Aufschlämmung oder
eine extrudierbare hybridgelartige Paste verabreicht.
-
Herstellung
des Flüssigbestandteils
-
In der Erfindung ist der Flüssigbestandteil
eine endothermisch sensible Lösung,
und umfaßt
eine wäßrige Polymerlösung. In
einer Ausführungsform,
umfaßt
der Flüssigbestandteil
Wasser, eine organische und/oder anorganische Säure, mindestens ein wasserlösliches
kationisches Polymer und mindestens eine wasserlösliche Phosphat-Quelle. In
einer weiteren Ausführungsform
umfaßt
die Zusammensetzung Wasser, eine organische und/oder anorganische
Säure,
mindestens ein wasserlösliches
kationisches Polymer, mindestens eine wasserlösliche Phosphat-Quelle und
mindestens ein wasserlösliches
Sulfonat- oder Carboxylatsalz. Das wasserlösliche kationische Polymer
ist ein hydrophiles Polymer, das geladene kationische Gruppen hat und
in einem wäßrigem Medium
löslich
ist. Dieses Polymer ist bevorzugt in wäßrigem Medium mit einem pH-Wert
unter 6,5 löslich.
Typische wasserlösliche
kationische Polymere schließen
Polysaccharide, z.B. Chitin- oder Citosan-Derivate ein, wie beispielsweise
teilweise deacetylierte Chitine und Chitosane, nicht-substituierte teilweise
deacetylierte Chitine und Chitosane, teilweise deacetylierte Chitine
und Chitosane, die mit spezifischen Gruppen substituiert sind, typischerweise
N-Alkylchitosane,
N,O-Alkylchitosane, N,N-Dialkylchitosane, N-Halochitosane, Chitosane,
die mit hydrophilen Gruppen substituiert sind etc. Wasserlösliche kationische
Polymere umfassen auch solche, die mit Polypeptiden, Collagenen
und synthetischen Polymeren zusammenhängen.
-
Der Flüssigbestandteil wird durch
sein endothermische Sensitivität
charakterisiert, was im allgemeinen bedeutet, daß er eine Sol-Gel-Transitionstemperatur
(SGTT), einen Flüssigzustand
(Sol-Zustand) bei einer Temperatur unter der des SGTT hat, und einen
Gelzustand, in dem ein Gel im wesentlichen wasserunlöslich bei
einer Temperatur höher
als die SGTT ist.
-
In dem Flüssigbestandteil wird das Polymer
unter Verwendung organischer und/oder anorganischer Säuren gelöst, einschließlich Maleinsäure, Propionsäure, Phosphorsäure, Milchsäure, Salzsäure, Ascorbinsäure, Ameisensäure, Essigsäure und ähnliche.
Polysäuren
wie beispielsweise Polyacrylsäure
werden in der vorliegenden Erfindung nicht verwendet. Das Polymer
wird in einem wäßrigen sauren
Medium mit einem pH-Wert der zwischen 1,0 und 5,0, bevorzugt zwischen
1,0 und 4,0 liegt, gelöst.
Das Polymer ist ein wasserlösliches
kationisches Polymer, typischerweise ein wasserlösliches hydrophiles Polysaccharid,
das Amino-Gruppen trägt,
einschließlich
Chitin, teilweise deacetylierte Chitine und Chitosan oder aminierte
Polysaccharide mit den beschriebenen Eigenschaften. Der Gehalt im
Polymer reicht von 0,1% bis 10% G/V, bevorzugt zwischen 0,5 und
5% G/V und mehr bevorzugt zwischen 0,5 und 3,0% G/V. Das Polymer
kann optional mit einem weiteren Polymer kombiniert werden, das
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Polysacchariden, Polypeptiden, celluloseartigen
und synthetischen Polymeren, einschließlich modifizierten Chitin,
modifizierten Chitosanen, Collagen, Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose,
Hydroxypropylcellulose, Hydroxyethylcellulse, Hydroxymethylpropylcellulose,
Poly(ethylenoxid), Poly(propylenoxid), Poly(vinylalkohol) und ähnliche
oder Gemische daraus. Der Gehalt in dem zweiten Polymer variiert
zwischen 0,01% und 5,0% G/V, bevorzugt zwischen 0,01% und 2,5% G/V
und mehr bevorzugt zwischen 0,01 und 1,0% G/V. Ein typisches Beispiel
des zweiten Polymers ist N,O-Carboxymethylchitosan oder NO-Glykolchitosan,
Poly(ethylenoxid), Poly(ethylenoxid-Co-Propylenoxid-Co-Ethylenoxid), oder
Methyl Cellulose. In einer weiteren Ausführungsform ist das bevorzugt
andere Polymer Collagen, das in einer Konzentration zwischen 0,5
bis 10% G/V gelöst
ist.
-
Die wasserlösliche Phosphat-Quelle des
Flüssigbestandteils
wird als ein organisches Monophosphatbasensalz definiert. Es hat
einen moderaten basischen Charakter und einen pKa (der als Säurekonstante
bezeichnet wird) zwischen 6,0 und 7,4. Diese Phosphat-Quelle ist
bevorzugt einer (Di)natrium, (Di)kalium, Magnesium oder Mangan oder
(Di)eisensalz, und mehr bevorzugt ein Dinatrium-, Dikalium- oder
Magnesiumsalz oder ein Gemisch daraus. Die Konzentration der Phosphat- Quelle des Flüssigbestandteils
liegt zwischen 0,1 und 20% G/V und idealerweise zwischen 1,0 und
10% G/V. Diese Phosphat-Quelle wird bevorzugt ausgewählt aus
der Gruppe, umfassend Na2PO4C3H5(OH)2,
Fe2PO4C3H5(OH)2, K2PO4C3H5(OH2), MgPO4C3H5(OH)2, MnPO4C3H5(OH)2,
Ca2PO4C3H5(OH)2, Na2PO7C3H7, Na2PO7C4H7, K2PO7C4H7,
NaPO7C4H8, K2PO7C4H8, Na2PO8C5H9,
K2PO8C5H9, NaPO8C5H10, KPO8C5H10,
Na2PO9C6H11, NaPO9C6H12, K2PO9C6H11,
KPO9C6H12, Na2PO8C6H13, K2PO8C6H13, NaPO8C6H14,
KPO8C6H14,
Na2PO9C6H12, K2PO9C6H12, NaPO9C6H13,
KPO9C6H13, Na2PO8C10H11, K2PO8C10H11, NaPO8C10H12 und
KPO8C12H12 und ähnliche,
Derivate oder ein Gemisch daraus. Idealerweise ist die Phosphat-Quelle
alpha- oder beta-Glcerophosphat (Glycerol-2-phosphat, Glycerol-2-phophatat),
Glucose-1-phosphat,
Glucose-6-phosphat, Fructose-1-phosphat oder Fructose-6-phosphatdinatrium oder
-dikalium, Magnesium oder ein Gemisch daraus.
-
Der Flüssigbestandteil kann optional
mindestens eine Sulfonat-Quelle umfassen, in einem Anteil von 0,1
bis 10 G/V, ausgewählt
aus N-[Carbamoylmethyl]-2-aminoethansulfonat (ACES), N,N-Bis[2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonat
(BES), 3-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropansulfonat
(DIPSO), N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-3-propansulfonat (EPPS), N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-3-propansulfonat (HEPES),
2-[N-Morpholino]ethansulfonat (MES), 4-[N-Morpholino]butansulfonat (MOBS), Piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonat] (PIPES),
Piperazin-N,N'-bis[2-hydroxypropansulfonat]
(POPSO), N-Tris[hydroxymethyl]methyl-2-minoethansulfonat (TES) und ähnliche
oder Gemische daraus.
-
Der Flüssigbestandteil kann optional
weitere Moleküle
wie beispielsweise wasserlösliche
Moleküle
mit einer Säure
und mindestens zwei Amino-Gruppen oder mehreren Amino-Gruppen als
Säuregruppen,
oder mindestens eine Amino-Gruppe mehrere Alkohol-Gruppen umfassen,
wobei diese Moleküle
einen moderat basischen Charakter haben und eine pKa zwischen 6,0
und 7,4.
-
Dieses Molekül ist im allgemeinen ausgewählt aus
Aminosäure-Resten oder Sequenzen,
einschließlich
Histidin (HIS)- oder Lysin (LYS)-Resten oder Sequenzen und/oder
aus einer Gruppe umfassend Bis[2-hydroxyethyl]iminotris[hydroxymethyl]methan
(BIS-TRIS), Tris[hydroxymethyl]aminomethan (TRIZMA) und ähnliche,
und jedes Gemisch daraus.
-
Der endgültige auf Chitosan basierende
Flüssigbestandteil
hat einen pH über
den pKa über
Chitosan (6,3–6,4)
im allgemeinen zwischen 6,5 und 7,4 und einen reduzierten Säuregehalt.
Typischerweise enthalten Chitosan-Glycerophosphat-Lösungen bei
einen pH-Wert von 7,0, die aus Chitosan, Salzsäure und Dinatriumglycerophosphat
hergestellt wurden, hauptsächlich
Wasser, Chitosan-Glycerophosphat und NaCl.
-
Alle vorgeschlagenen Flüssigbestandteile
haben einen pH-Wert der von 6,5 bis 7,4 reicht und eine intrinsische
Viskosität,
die von 5 bis 100000 mPa·s
bei 21°C
reicht. Alle Flüssigbestandteile
haben, da sie endothermisch sensitiv sind, eine Sol-Gel-Transitionstemperatur
und bilden bei einer Temperatur zwischen 15°C und 60°C, bevorzugt zwischen 25 und
45°C und
mehr bevorzugt bei 35 bis 40°C
homogene feste wäßrige Gele.
-
Der Flüssigbestandteil kann auch eine
bestimmte Menge wasserlöslicher
Salze wie beispielsweise Phosphatsalze oder Carbonatsalze oder ein
Gemisch daraus umfassen. Typische Salze sind Natriumphosphat oder
Carbonatsalze. Diese Phosphat- oder Carbonatsalz-Konzentration reicht
im allgemeinen von 0 bis 0,1 mol/l, im allgemeinen unter 0,05 mol/l.
-
Andere organische Bestandteile, die
nicht bioaktiv sind, können
zu dem Flüssigbestandteil
zugemischt werden, um spezifische chemische oder physikalische Eigenschaften
zu verleihen. Repräsentative
Verbindungen schließen
Polyole, Zuckerpolyole, Saccharidpolyole und Glykole, einschließlich Glucose,
Fructose, Maltose, Saccharose, Glycerol, Mannitol, Sorbitol, Ethylenglykol-Oligomere,
Propylenglykol-Oligomere und ähnliche ein.
-
Inkorporierung der bioaktiven
Mittel in den Flüssigbestandteil
-
Andere Inhaltsstoffe können in
den Flüssigbestandteil
inkorporiert werden, um Hartgeweben spezifische biologische Wirkungen
zu verleihen, entweder zum Behandeln von Defiziten oder Erkrankung,
zum Induzieren oder Beschleunigen der Hartgewebsbildung und zur
Reparatur und ähnlichem.
Sie sind Pharmazeutika, Chemikalien oder biologisch wirksame Mittel
oder Gemische aus Mitteln, die teilweise oder vollständig in
dem Flüssigbestandteil
gelöst
werden können,
oder wasserunlösliche
artifizielle Materialien oder lebende biologische Substanzen sind,
die in dem Flüssigbestandteil
dispergiert werden können.
Diese Mittel vermitteln dem Flüssigbestandteil
nicht die endothermische Sensitivität.
-
In einer Ausführungsform sind die Mittel
induzierende, schützende
oder therapeutische Mittel, die wasserlöslich oder teilweise wasserlöslich sind
und osteoinduktive Mittel wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, Wachstumshormone,
osteoinduktive Proteine und Gemische aus osteoinduktiven Proteinen,
Genen und Pharmazeutika oder Medikamenten sind. Cytokine und Wachstumsfaktoren
(GF) können
typischerweise aus epidermalen GF, saurem Fibroblasten GF, basischem
Fibroblasten GF, Platelet-Derived GF AA, Platelet-Derived GF BB,
Platelet-Derived GF AG und Tumor GF-beta sein. Osteoinduktive Mittel
können
auch demineralisierte Knochenmatrix, Osteprotein, Osteocalcin, Sialoprotein,
Calcitonin oder Gemische daraus sein oder aus Hartgewebe (Knochen)
stammende organische Präparate,
bevorzugt nicht-immunologische
organische Präparate.
-
Außerdem kann eine Suspension
aus lebenden Zellen verwendet werden, um den Flüssigbestandteil herzustellen.
Lebende Zellen können
auch auf dem festen Bestandteil adhärieren und kultiviert werden,
wie beispielsweise auf Calcium-, Fluorid-, Strontium-, Carbonat-
und Phosphatsalzen in graunlärer
Form. Sie können
auch auf anderen festen Materialien adhäriert und kultiviert werden,
die zu dem Flüssigbestandteil
hinzugegeben werden (bsp.: Bioglas). Sie können auch aus der Körperflüssigkeit
kommen oder einen Bestandteil wie beispielsweise Blut, Knochenmark.
Lebende Zellen können
aus den Zellen ausgewählt
werden, die Gewebe bilden oder Vorläufer der Gewebszellen sind.
-
Biologische Zellquellen mit Bioaktivität können von
allogenen oder bevorzugt autogenen Gewebe oder Flüssigkeit
stammen, wie beispielsweise kortikale oder kortiko-spongiöse Knochen,
Vollblut und Blutbestandteile, Knochenmark, Zellen, die aus Geweben
isoliert sind, Stromazellen oder hämapoetische Zellen und ähnliche.
-
Optional können Moleküle, die phosphorylierte Aminosäuren oder
Sequenzen von Kohlenhydraten mit phosphorylierten Aminosäuren in
dem Flüssigbestandteil
inkorporiert sein.
-
Bioaktive Mittel können in
flüssigem
oder nicht-flüssigem
Zustand eingeschlossen werden. Sie können mit anderen chemischen
Molekülen
in einem Feststoff komplexiert werden, der im Flüssigbestandteil inkorporiert
ist. Sie können
zu dem Flüssigbestandteil
als nicht-löslicher
oder kaum löslicher
Inhaltsstoff hinzugegeben werden.
-
Repräsentative biologische Additive
des Flüssigbestandteils
sind die Vollblut- oder Blutbestandteile des Patienten (autolog,
löslich
oder nicht-löslich),
das Knochenmark des Patienten (autolog, löslich oder nicht-löslich),
die zerstoßenen
spongiösen
Knochen des Patienten (autolog, nicht-löslich)
und Antibiotika (Gentamycin, Vancomycin, Tobramycin, etc.).
-
Herstellen
des festen Bestandteils
-
Der feste Bestandteil umfaßt mindestens
eines aus Calcium-, Fluorid-, Strontium-, Carbonat- und Phosphatsalzen,
die nicht leicht löslich
sind (kaum oder noch besser unlöslich)
in wäßrigem Medium.
-
In der Erfindung ist der Feststoffbestandteil
im allgemeinen trockene Mineralpulver oder Partikel oder jede Gemische
aus trockenen Mineralpulvern oder Gemischen, auch als "trockene Inhaltsstoffe" bezeichnet. Er hat
eine Calcium-Zusammensetzung
und bevorzugt eine Calciumphosphat-Zusammensetzung mit einer guten Stabilität in wäßriger Umgebung
bei pH 6,5–7,4.
-
Die Größe der Partikel ist nicht besonders
bedeutend in der Erfindung, obwohl es bevorzugte Größenbereiche
gibt, um einen optimalen Partikeloberflächenbereich, eine Oberflächenreaktivität, biologische
Reaktion, Auflösungsrate
etc. zu haben. Die Partikelgröße, die
hier als durchschnittliche Partikelgröße definiert ist, kann von
0,1 μm bis
1000 μm,
bevorzugt unter 500–600 μm und mehr
bevorzugt von 100 bis 300 μm
reichen. Trockene Inhaltsstoffe werden durch physikomechanische
Mahl-/Mischtechniken und -Instrumente zerkleinert und zusammengegeben.
Das kann durch einen einzelnen Mahl-/Misch- und Siebschritt erreicht
werden oder durch eine Reihe an Mahl-/Misch- und Siebschritten.
Das physikomechanische Mischen ist nicht kritisch, kann mit zahlreichen
Techniken und Instrumenten betrieben werden, muß aber ein feines Zerkleinern
und Mischen der trockenen Inhaltsstoffe ermöglichen.
-
Physikomechanische Mahl-/Mischtechniken
schließen
Mörser- oder Planetenwalzen-Mischen
und ähnliche
ein. Eine Auswahl des trockenen Pulvergemischs kann nach dem trockenen
Mahlen/Mischen z.B. durch Sieben in einer geeigneten Inhaltsstoffgröße betrieben
werden. Schüttel
(Rotations)-Mischen
und Kugellager-Mischen wurden in der vorliegenden Erfindung bevorzugt
verwendet. Es ist wichtig, daß das
Mahlen/Mischen des trockenen Inhaltsstoffs erreicht wird ohne die
Reaktivität
des Inhaltsstoffes chemisch zu verändern und ohne eine Kontaminierung
erreicht wird. Das Mischen muß bis
zum Auftreten eines gleichförmigen trockenen
Gemisches durchgeführt
werden. Um wasserfreie Bedingungen zu sichern, kann das Mischen
der trockenen Inhaltsstoffe unter strikt wasserfreien Bedingungen
(Gas, Umweltkontrolle), oder in wasserfreien nicht-wäßrigen Flüssigkeiten,
z.B. Lösungsmittel
wie beispielsweise Hexan oder absoluten Alkoholen durchgeführt werden,
wobei alle Spuren an Wasser vorübergehend
aus dieser Flüssigkeit
eliminiert sind. Gleichermaßen
wird das trockene Gemisch ebenfalls bevorzugt unter strikt wasserfreien
Bedingungen aufbewahrt, um jede Kontaminierung oder Kreuzreaktion
mit Wasser zu verhindern. Feste Additive, die organisch oder anorganisch
sind, können
mit dem trockenen Inhaltsstoff im trockenen Mahlschritt gemischt
werden. Das Einschließen
bioaktiver Mittel in dem Feststoffbestandteil kann während des
trockenen Mischens oder später
während eines
zweiten Mischschrittes durchgeführt
werden.
-
Die Sterilisierung des trockenen
Inhaltsstoffs kann durch geläufige
industrielle Sterilisierungstechniken wie beispielsweise Röntgenbestrahlung
in Dosen von 2,0 bis 3,5 Mrad erreicht werden. Andere Sterilisierungstechniken
und Bedingungen können
ebenfalls durchgeführt
werden, wie beispielsweise eine hohe Temperatur (>175°C) oder eine Dampfsterilisierung.
-
Selbstbildende Hybridzusammensetzungen/Biomaterialien:
-
Herstellung
-
In der vorliegenden Erfindung werden
selbstbildende Hybridzusammensetzungen zuerst durch das gute Vermischen
des Flüssigbestandteils
und des Feststoffbestandteils hergestellt. Das Mischen kann manuell durch
Kneten, oder physikomechanisch unter Verwendung von Homogenisatoren,
Mischern oder Mühlen
oder ähnlichem
durchgeführt
werden. Alternativ dazu können
zwei Spritzen mit oder ohne Mischschritte verwendet werden, um Flüssigkeit
und feste Bestandteile der Zusammensetzung zu mischen. Es gibt keinen
speziellen Vorzug der für
die Mischinstrumente, aber die Zusammensetzung muß homogen
sein, mit so wenig Agglomeraten wie möglich, so daß sie eine
Dispersion der feinen Mineralpartikel des Feststoffbestandteils
in der Flüssigkomponente
ist.
-
Die Flüssigkomponente ist eine, die
aus den oben beschriebenen ausgewählt wird. Eine bevorzugte basische
Flüssigkomponente
umfaßt
Wasser, Säure,
Chitosan und eine lösliche
Quelle eines organischen Monophosphatsalzes. Säure wird im allgemeinen ausgewählt aus
Salzsäure,
Phosphorsäure,
Essigsäure,
Milchsäure
und ähnlichen.
Das saure wäßrige Ausgangsmedium
ist im allgemeinen eine 0,05 bis 1N Säure/Wasserlösung, und bevorzugt eine 0,05
bis 0,5N Lösung.
Citosan wird im allgemeinen ausgewählt aus teilweise N-deacetylierten
Poly(glucosamin) mit einem Deacetylierungsgrad zwischen 60 und 100%,
bevorzugt zwischen 30 und 99% und mehr bevorzugt zwischen 84 und
98%. Chitosan ist in dem Flüssigbestandteil
in einer Konzentration vorhanden, die von 0,1% bis 10% G/V reicht,
bevorzugt zwischen 0,5 bis 5,0% G/V und mehr bevorzugt zwischen
0,5 und 3,0% G/V. Die Phosphat-Quelle ist im allgemeinen ein organisches
dibasisches Monophosphatsalz, wie beispielsweise Glycerol-2-phosphat
und/oder Glycerol-3-phosphatnatrium- oder -magnesiumsalze in einer
Konzentration zwischen 0,1% und 20% G/V, und idealerweise zwischen
1,0 und 10% G/V. Der pH-Wert
dieser Flüssigkomponente
variiert zwischen 6,5 und 7,4 und bevorzugt zwischen 6,8 und 7,2.
Die Viskosität
dieses Flüssigbestandteils
reicht von 5 mPa·s
bis 100000 mPa·s
und bevorzugt zwischen 10 mPa·s
und 1000 mPa·s.
-
Wie zuvor beschrieben, können zusätzliche
Reagenzien ein organisches Monosulfonatsalz und/oder eine zweites
hydrophiles Polymer und/oder ein organisches Mittel und/oder ein
bioaktives Mittel sein. Der Flüssigbestandteil
wird bevorzugt bei kühlen
Temperaturen aufbewahrt, idealerweise zwischen 0 und 4°C. Wasserlösliche Salze
wie beispielsweise Carbonat- oder Phosphatsalze, oder ein Gemisch
daraus, kann zu dem Flüssigbestandteil
in Konzentrationen unter 0,1 mol/l zugegeben werden.
-
Der feste Bestandteil ist ein fester
Mineralinhaltsstoff oder ein Gemisch aus festen Mineralinhaltsstoffen,
das mindestens einen aus Calcium-, Fluor-, Strontium-, Carbonat-
und Phosphatsalzen und bevorzugt mindestens ein Calciumphosphat
enthält.
Das Calciumphosphat kann bestehen aus Ca(H2PO4)2·H2O (MCPM), CaHPO4·2H2O (DCPD), CaHPO4 (DCPA),
CaZn3(PO4)2, CaZnPO4, CaNaPO4, Ca2PO4Cl,
alpha-Ca3(PO4)2 (alpha-TCP), beta-Ca3(PO4)2 (beta-TCP), Ca3(PO4)2·H2O (ACP), Ca4(PO4)2O (TTCP), Ca8H2(PO4)6·5H2O (OCP), Ca9(HPO4)(PO4)5OH
(CDA), Ca10(PO4)6(OH)2–2xOx (SHA),
Ca10(PO4)6(OH)2 (PHA), und ähnlichen
und Derivaten davon. Der Pulverbestandteil ist ein Calciumphosphat
wie beispielsweise ein Hydroxyapatit [Ca10(PO4)6(OH)2],
oder eine Apatit-Derivat (calciumfreies Apatit, carboniertes Apatit
und ähnliche)
oder ein Tricalciumphosphat [alpha-Ca3(PO4)2 oder beta-Ca3(PO4)2]
oder ein Octacalciumphosphat [Ca8H2(PO4)6·5H2O] oder ein amorphes Calciumphosphat [Ca3(PO4)2·H2O] und ähnliche
oder Gemische daraus. Jede der carbonierten und fluorierten und
strontiumhaltigen Calciumphosphate, die zuvor beschrieben wurden
und ähnliche oder
Gemische daraus können
ebenfalls verwendet werden, einschließlich carbonierte fluorinierter
und strontiumhaltiger, carbonierter strontiumhaltiger, fluorierter
strontiumhaltiger, und carbonierter fluorierter Calciumphosphate.
Jede amorphe Form der zuvor beschriebenen Calciumphosphate und ähnliche
und Gemische daraus kann ebenfalls eingeschlossen sein.
-
Andere Minerale oder anorganische
feste Bestandteile können
aus Nicht-Phosphatcalciumsalzen wie beispielsweise typischen Calciumsulfaten,
Calciumtitanaten, Calciumcarbonaten, Calciumacetat, Calciumglycerophosphat,
Calciumgluconat und ähnlichen
ausgewählt
sein.
-
Andere Mineralien können zu
der Calcium-Verbindung des Feststoffbestandteils hinzugegeben werden.
Solche anderen Mineralien können
Sein Calcium-, Strontium-, Barium-, Magnesium-Verbindungen und ähnliche,
oder Titanat-, Sulfat-, Kieselerde-Verbindungen und ähnliche,
oder fluorierte, carbonierte, strontiumhaltige Verbindungen und ähnliche
oder Gemische daraus. Beispiele solcher festen Bestandteilzusammensetzungen
können
ein Calciumphosphat mit einer Natriummonofluorphosphat-Zugabe oder
ein Apatit mit einer bestimmten Menge eines fluorierten oder strontiumhaltigen
Apatits sein.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Feststoffbestandteil bevorzugt 100% HAP [Ca10(PO4)6(OH)2]
oder 100% TCP [Ca3(PO4)2] oder 100% OCT [Ca8H2(PO4)6·5H2O] oder ein trockenes Gemisch aus HAP, TCP
und/oder OCP. Eine typische trockene Mischung des Pulverbestandteils
ist eine HAP/TCP-Pulvermischung (von 10:90 bis 90 10). Bevorzugt
enthält
HAP/TCP die beta-Phase von TCP, aber die alpha-Phase kann ähnlich verwendet
werden.
-
Die Größe der mineralischen Feststoffe
variiert zwischen 0,1 und 1000 μm,
im allgemeinen zwischen 20 und 300 μm und wird bevorzugt ausgewählt aus
100 bis 300 μm.
Für Calciumphosphate,
variiert das Calcium- zu Phosphatverhältnis des Feststoffbestandteils
von 1,0 bis 2,0 und im allgemeineren von 1,3 bis 1,7, und mehr bevorzugt
von 1,5 bis 1,7. Der Feststoff ist ein Pulver, ein Partikel, Granula
jeder Form, oder Mikrosphären
oder ähnliche.
-
Der Feststoffbestandteil und der
Flüssigbestandteil
werden gut miteinander vermischt mit einem Flüssig/Feststoff (US)-Gewichtsverhältnis zwischen
0,05 g/ml und 2,0 g/ml und bevorzugt zwischen 0,1 g/ml und 1,2 g/ml
und mehr bevorzugt zwischen 0,1 g/ml und 0,9 g/ml. Die erhaltene
nicht-gelierte Aufschlämmung
ist injizierbar und hat eine Viskosität, die von 5 bis 1000 000 mPa·s reicht,
und bevorzugt von 5 bis 200000 mPa·s. Die Hybridzusammensetzung
kann teilweise geliert sein und injizierbar bleiben. Vollständige thermische
Gelierung einer solchen Mineral-Polymerzusammensetzung schließt in keiner
Weise die Injizierbarkeit und Extrudierbarkeit aus.
-
Der Flüssigbestandteil ist endothermisch
sensitiv, und die erhaltene Aufschlämmung ist gleichermaßen endothermisch
sensitiv. Dies wird durch das Überwachen
der rheologischen und viskoelastischen Parameter der Aufschlämmung gezeigt,
und noch typischer durch das Überwachen
der viskosen und elastischen Modi, und tan δ, des Flüssigbestandteils und der erhaltenen
Aufschlämmung.
Selbstbildende Hybridzusammensetzungen sind hauptsächlich selbstgelierende
Systeme ohne selbsthärtende
Eigenschaften. Die Hybridzusammensetzungen bilden bei 37°C und 100%
Feuchtigkeit ein Hybridmaterial, das wie ein konsistentes gelartiges
Material aussieht. Die Kompressionsstärke der erhaltenen gelartigen
Materialien ist niedrig, typischerweise unter 1,0 MPa. Dieses Hybridgel-artige
Material kann in situ remodelliert werden und ist so resorbierbar wie
seine konstitutiven Inhaltsstoffe.
-
Die erhaltene thermogelierende Aufschlämmung kann
der Körperstelle
verabreicht werden:
- a) in einem nicht-gelierten
Zustand, als eine Flüssigkeit,
und sie wird in situ gelieren.
- b) in einem teilweise gelierten Zustand, und sie wird ihre Gelierung
in situ beenden.
- c) in einem gelierten Zustand, wobei sie in vitro geliert wird,
und an die Stelle im Körper
verabreicht wird.
-
Verabreichungsmodus – Anwendung
-
Die Verabreichung der Zusammensetzungen
in Hartgewebsdefekte, Höhlungen
oder jede anatomische Struktur, wird perkutan durch Injektion durch
einen Katheter, eine Kanüle,
einen Trokar oder eine Nadel einer Gauge, die von 7 bis 27 reicht,
bevorzugt von 14 bis 22 und idealerweise von 16 bis 22, und unter
Verwendung einer Spritze oder jedem Druckinjektionsgerät, oder
durch die Verwendung einer endoskopischen Technik und eines Instruments
oder während
des Verlaufs einer offenen chirurgischen Operation.
-
Die Zusammensetzungen können für medizinische
und dentale Indikationen bei Menschen oder in Veterinärverfahren
nützlich
sein. Sie können
in zahlreichen bekannten Verfahren verwendet werden, wie beispielsweise:
- a) um die Regeneration von Knochen, der aufgrund
lokaler oder systemischer Erkrankungen, Störungen oder Defizite verlorengegangen
ist, zu fördern
und unterstützen (periodontale
Erkrankungen, Abszeß,
Tumorresektion, Osteoporose), um Knochendefekte oder Höhlungen
zu füllen;
- b) um Knochen zu ersetzten, der chirurgisch entfernt wurde oder
während
einer Verletzung verloren wurde;
- c) um die Bildung von Knochen in Nicht-Knochenstellen zu fördern und
zu begünstigen,
oder in der Nähe von
Knochen (Bandscheiben);
- d) um Alveolarkämme
zu erhöhen,
um Extraktionsfassungen zu füllen,
um die Osteointegration dentaler Vorrichtungen zu begünstigen;
- e) um die Retention und Stärke
anderer orthopädischer
Vorrichtungen in situ zu sichern (Nagel, Prothese, Fixierung);
- f) um die perkutane Zuführung
therapeutischer Mittel an Gewebe zu sichern (Verabreichung von Medikamenten);
- g) um die Verankerung und die Kontaktstelle zwischen Knochen
und artikulärer
Sehne zu begünstigen,
und
- h) um die Rekonstruktion, Reparatur und Funktionserholung von
Skelettmuskelgeweben wie beispielsweise Knochen, Sehnen und Fibro-Knorpelgeweben
zu reparieren.
-
Allgemeiner gesagt, können die
Zusammensetzungen für
alle Reparatur-, Regenerations-, Füll-, Ersatzverfahren nützlich sein,
die mit harten Geweben assoziiert sind, wie auch zum Verabreichen
von Medikamenten oder bioaktiven Mitteln an harte Gewebe.
-
Sie kann auch an Weichgewebe wie
beispielsweise Sehnen und Fibro-Knorpelgeweben verabreicht werden.
Die Zusammensetzung kann mit dem Blut oder Knochenmark oder zerstoßenem spongiosem
Knochen vor der Injektion an die Stelle gemischt werden. Diese Zugabe
steigert das osteogene Potential der Zusammensetzung und des Biomaterials.
-
Die Zusammensetzung kann zum Füllen und
Reparieren innerer Knochenhöhlungen,
für die
lokale Behandlung von osteoporotischen Knochen, bei demineralisierten
Knochen und Knochendemineralisierungsstörungen, für Knochendefekte oder Höhlungen,
beispielsweise im Fall periodontalen Defekten mit Knochenverlust,
für die
Steigerung des alveolaren Ridges oder chirurgisch durchgeführter Hartgewebsdefekt
nach der Resektion krankhafter Hartgewebsteile, für Knochenfrakturen
zum Liefern von Mitteln, die die Abfolge der Heilung der Fraktur
beschleunigen, wie auch für
die Knochenfusion, wie beispielsweise für die Wirbelsäulenknochenfusion
injiziert werden.
-
Typische Anwendungen der selbstbildenden
Mineral-Polymer-Hybridzusammensetzung
bestehen aus einzelnen Knochenläsionen,
wie solche die bei der Osteomyelitis, Rundzell (Round-Cell)-Läsionen, fibröse Displasie,
Knochenzysten, chondromyxioide Fibrome, Osteosarkom, nicht-ossifizierendes
Sarkom, Endochondrom, Chondroblastom, Gelenkrevisionsosteolyse oder ähnliche
beobachtet werden.
-
In einer weiteren Anwendung wird
die Mineral-Polymerzusammensetzung
auf die Kontaktstelle mit einer Prothese oder einem Implantat (orthopädisch) wie
beispielsweise einer Gelenkprothese (Hüfte, Knie) oder einer Schraube
(pedikular) angewendet. Sie kann für Gelenksrevisionen verwendet
werden.
-
Eine weitere Anwendung ist die Behandlung
von Metaphysen- und Diaphysen-Frakturen in Assoziierung mit einem
Fixierungsmittel. Diese Mineral-Polymerzusammensetzung kann mit
osteoinduktiven Substanzen wie beispielsweise autologem Blut oder
Knochenmark, Wachstumsfaktoren etc. assoziiert werden, um die Phasenabfolge
der Fraktur/Knochenheilung zu beschleunigen.
-
Die vorliegende Erfindung wird leichter
unter Referenz auf die folgenden Beispiele verstanden, die angegeben
werden um die Erfindung darzustellen statt ihren Bereich zu begrenzen.
-
Beispiel I
-
Herstellung
eines Flüssigbestandteils
-
Der Flüssigbestandteil der Knochenzusammensetzung
ist eine endothermisch selbstbildende wäßrige Lösung umfassend ein hydrophiles
kationisches Polymer und eine wasserlösliche organische Monophosphat-Quelle.
Ein repräsentativer
Flüssigbestandteil
ist eine wäßrige Chitosan/Glycerophosphat
[Chitosan GP]-Lösung.
Eine saure wäßrige Chitosan-Lösung (2,0%
G/V) wurde mit zuvor auf 83–97%
deacetyliertem Chitosan hergestellt, filtriert und dialysiert und
wurde aus einer 0,097 M (0,10 M) HCl-Lösung hergestellt. Die wäßrige Chitosan/Glycerophosphat-Lösung wurde
aus 2% (G/V) Chitosan in einer wäßrigen HCl-Lösung und einer
54% (G/V) Dinatriumglycerophosphat in destillierter Wasser-Lösung hergestellt.
Die Endkonzentration (G/V) in den selbstgelierenden Chitosan/Glycerophosphat-Systemen
waren ungefähr
1,6–2,0%
(Chitosan) und 6,75–8,2
(Glycerolphosphat) (siehe Tabelle 1).
-
Tabelle
1
Pufferungs/thermogelierende Mittel für die Flüssigbestandteile mit 1,0–2,0 Gew.-%
Chitosan
-
Glycerophosphat (GP)-Salze wirken
hier als Pufferungs/Thermogelierungsmittel für die Chitosan-Lösung. Andere
Pufferungs/Thermogelierungsphosphat-Quellen können verwendet werden, typischerweise
organische monobasische Phosphatsalze wie beispielsweise Glucosephosphat
oder Fructosephosphatsalze. Andere Pufferungsmittel können auch
mit Glycerophosphatsalzen assoziiert werden, um die Pufferungs/Thermogelierungswirkung
zu steigern, wie beispielsweise Aminosäuren oder organische Sulfonatsalze.
Tabelle 1 faßt
die potenteste Zusammensetzung von Flüssigbestandteilen zusammen.
Histidin wurde typischerweise mit GP in der Chitosan-Lösung gemischt
(Bsp.: 1,5% W/V Chitosan, 4,0% G/V GP + 4,0% G/V Histidin). BIS-TRIS kann alleine
als Pufferungs/Thermogelierungsmittel verwendet werden (Bsp.: 1,5%
G/V Chitosan + 2,0% G/V BIS-TRIS). HEPES-, TES- oder MES-Sulfonatmittel
kann alleine als Pufferungs/Thermogelierungsmittel verwendet werden
(Bsp.: 1,5% G/V HEPES, TES oder MES).
-
a) Zugabe eines zweiten
wasserlöslichen
Polymers in die Flüssigkomponente
-
Ein zweites wasserlösliches
Polymer kann in der wäßrigen Chitosan-GP-Lösung gelöst werden.
Tabelle 2 gibt die Zusammensetzung des Flüssigbestandteils an, der aus
Chitosan-GP plus
einem wasserlöslichen
Polymer besteht. Glycerophosphat kann vor der Lösung des zweiten Polymers hinzugegeben
werden oder nach der Lösung
des zweiten Polymers. Thermosensitive Polymere wie beispielsweise
Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Pluronic® wurden
als Sensitiva über
der Konzentration an Glycerophosphatsalzen angesehen. Es wurde herausgefunden,
daß diese
Salze die Gelier- oder Präzipitiertemperatur
des Polymers beeinflussen, wodurch sie zum Präzipitieren des Chitosan/GP/Polymer(2)-System
führen
(6).
-
Alle Polymere (2) wurden in einer
präparierten
Chitosan-GP-Lösung gelöst, außer Collagen
und im allgemeineren andere polykationische Mittel, die in Kombination
mit Chitosan gelöst
werden.
-
Tabelle
2
Flüssigbestandteilzusammensetzungen
mit einem dazugemischten zweiten wasserlöslichen Polymer
-
Alle dargestellten Konzentrationen
(%, Mol/l) sind Endkonzentrationen.
-
b) Zugabe wasserlöslicher
Inhaltsstoffe von Interesse
-
Einige organische Moleküle die in
Wasser löslich
oder mischbar sind, können
zu dem auf Chitosan-basierenden Flüssigbestandteil hinzugegeben
werden, um modifizierte oder verbesserte physikalisch/chemische Eigenschaften,
mechanische oder Handhabbarkeitsleistungen oder biologische Eigenschaften zu
ergeben. Dies schließt
ohne Beschränkungen
Polyole, Zucker, Aminosäuren
Saccharide und Polysaccharide ein.
-
Polyole & Zucker
-
Von besonderem Interesse können Polyole
sein wie beispielsweise Polyole mit Diolkohlenwasserstoff-Resten,
die für
das Verarbeiten oder die Leistung des Flüssigbestandteils nützlich sind
(siehe Tabelle 3). Von diesen Polyolen werden Zuckerpolyole, Saccharid-Polyole
und Glykole bevorzugt Glycerol-, Mannitol-, Sorbitol- und Ethylenglykol-Verbindungen wie
Triethylenglykol, Tetraethylenglykol wurden als gute repräsentative
Beispiele befunden, die attraktiv sind und Modifizierungen oder
Verbesserungen des Flüssigbestandteils bringen
oder zu einem thermogebildeten Gel führen. Zucker wie beispielsweise
Fructose, Glucose etc. können ähnlich verwendet
werden.
-
Tabelle
3
Flüssigbestandteilszusammensetzungen
mit hinzugegebenen wasserlöslichen
nicht-polymerischen Inhaltsstoffen (Polyolen)
-
Alle dargestellten Konzentrationen
(%, Mol/l) sind Endkonzentrationen.
-
Polysaccharide (GAGs)
-
Es kann von Interesse sein, andere
wasserlösliche
biochemische Inhaltsstoffe zu der flüssigen Chitosan-GP-Komponente hinzuzugeben.
Diese Inhaltsstoffe dürfen
jedoch die Chitosan-GP-Zusammensetzung (Inhaltsstoff) und seine
thermogelierende Eigenschaft nicht stören. Glycoaminoglycane können bis
zum einem gewissen Ausmaß zur
Chitosan-GP-Lösung
hinzugegeben werden. Es muß aufgepaßt werden,
daß nicht
die Präzipitierung
des Chitosans induziert wird. In Tabelle 4 wurde Heparin als das
zuzugebende GAG verwendet. Die Chitosan-Lösungen waren 4,0% G/V Chitosan
(Deacetylierung 95%) in 0,19 M HCl. Die GP-Lösungen waren 54,6% G/V in Wasser.
Heparin in Wasserlösungen
waren 1 mg/ml (A), 0,1 mg/ml (B), 10 μg/ml (C) und 1 μg/ml (D).
-
Tabelle
4
Flüssigbestandteilszusammensetzungen
mit zugegebenen wasserlöslichen
nicht-polymerischen Inhaltsstoff (Heparin)
-
c) Zugabe einer zweiten
wasserlöslichen
Phosphat-Quelle zum Flüssigbestandteil
-
Eine wäßrig saure Chitosan-Lösung (2,0–4,0 G/V)
wurde mit zu 83–85%
deacetylierten Chitosan gemacht, filtriert und dialysiert und wurde
aus einer 0,1 M HCl-Lösung
hergestellt.
-
Eine wäßrige Chitosan-GP-Lösung wurde
aus vorgekühltem
Chitosan in einer HCl-Lösung
und 54–55%
(G/V) Dinatriumglycerophosphat (GP) in einer destillierten Wasserlösung hergestellt.
Der pH-Wert der erhaltenen flüssigen
Chitosan-GP-Lösung
wurde bei 21°C
gemessen. Eine Phosphat-Lösung
(1) wurde mit 0,144 g/l KH2PO4·7H2O Kaliumdihydrogenphosphat hydriert) und
0,795 g/l Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat)
hergestellt und hatte einen pH-Wert
von 7,4 bis 20°C.
Mengen der Chitosan-GP-Lösung
und der Phosphat-Lösung
(1) wurden homogen gemischt, und dann wurde der pH-Wert der erhaltenen
Lösungen
gemessen. Die Lösungen
wurden schließlich
bei 37°C
zum Gelieren freigesetzt, wobei alle Hinweise auf eine Präzipitierung
notiert wurden. In der Tabelle 5 zeigten alle Chitosan-GP- + Phosphat-Lösung (1)
(80:20 bis 50:50 Vol) keine Anzeichen einer Präzipitation und gelierten innerhalb
von 30 Minuten bei 37°C.
-
Tabelle
5
Zusammensetzung von Flüssigbestandteilen,
die mit einer zweiten Quelle wasserlöslichen Phosphat supplementiert
sind
-
Alle dargestellten Konzentrationen
(%, Mol/l) sind Endkonzentrationen.
-
Eine konzentrierte Phosphat-Lösung (2)
wurde aus 283,92 g/l Na2HPO4 (0,2
mol/l Dinatriumhydrogenphosphat) und 239,96 g/l NaH2PO4 (0,2 mol/l Natriumdihydrogenphosphat) hergestellt
und hatte einen pH-Wert von 7,4 bei 37°C. Diese Phosphat-Lösung wurde
mit Verdünnungen
auf 1:1, 1:10, 1:100 und 1:1000 verwendet. Gleiche Volumina (50:50)
der verdünnten
bis konzentrierten Phosphat-Lösung
(2) und Chitosan-GP-Lösung wurden
homogen gemischt. Der pH-Wert der erhaltenen Lösungen wurde gemessen und die Lösungen wurden
bei 37°C
dem Gelieren ausgesetzt, wobei alle Zeichen einer Präzipitierung
notiert wurden. Alle Chitosan-GP/Phosphat (2) gelierten mit verschiedenen
Raten bei 37°C.
-
Eine konzentriertere Phosphat-Lösung (3)
wurde hergestellt 0,5 mol/l NaH2PO4 (600 g/l) und 0,5 mol/l Na2HPO4 (709,8 g/l). Volumina der konzentrierten
Phosphat-Lösung
(3) wurden zur Chitosan-GP-Lösung
hinzugegeben, und homogen gemischt. In Tabelle 6 wurde der pH-Wert
der erhaltenen Lösungen
gemessen und die Lösungen
bei 37°C
zum Gelieren stehengelassen, wobei alle Zeichen einer Präzipitierung
notiert wurden. Chitosan-GP ist vollständig mit 5 mM PBS-Lösung bei pH 7,2–7,4 kompatibel.
Die Kompatibilität
hängt von Phosphat-Gehalt
ab (Tabellen 1a–1b):
die Zugabe hochkonzentrierter Phosphat-Lösung (insbesondere dibasischer
Phosphate) macht das Chitosan-GP-System trüber und anfälliger für eine Präzipitierung oder heterogene
Gelierung.
-
Tabelle
6
Zusammensetzung aus Flüssigbestandteilen
supplementiert mit einer zweiten Quelle eines wasserlöslichen Phosphats
-
d) Zugabe einer wasserlöslichen
Carbonat-Quelle zum Flüssigbestandteil
-
Die Chitosan-GP-Lösungen wurden wie in Beispiel
1c hergestellt.
-
Eine Carbonat-Lösung wurde aus einer 0,2 mol/-Lösung Mononatriumcarbonat
mit einem pH-Wert von 8,16 bei 21°C
hergestellt. Gleiche Volumina (50:50) der verdünnten (1/10) bis konzentrierten
Carbonat-Lösung und
Chitosan-GP-Lösung
wurden homogen gemischt. Eine Carbonat (0,1 mol/l)- und Phosphat
(0,1 mol/l)-Lösung
wurde ebenfalls verwendet. Der pH-Wert wurde gemessen, und die Lösungen wurden
bei 37°C
zum Gelieren stehengelassen, wobei alle Zeichen einer Präzipitierung
notiert wurden (siehe Tabelle 7). Chitosan-GP-Systeme sind vollständig mit einem Carbonat-Puffer
wie beispielsweise 5 mM Phosphat/Carbonat-Puffer bei einem pH-Wert von 8,8 kompatibel.
Diese Kompatibilität
nimmt jedoch bei zu hohen Carbonat-Gehalten ab.
-
Tabelle
7
Zusammensetzung von Flüssigbestandteilen,
die mit einer Quelle wasserlöslichen
Carbonats supplementiert sind
-
d) Zugabe einer wasserlöslichen
Carbonat-Quelle zum Flüssigbestandteil
-
Im Beispiel 1d weisen flüssige Chitosan-GP-Formulierungen,
die mit wasserlöslichen
Phosphaten und/oder Carbonaten supplementiert sind, eine reduzierte
Lagerstabilität
und Stabilität
selbst bei niedrigen Temperaturen (4°C) auf. Dies ist dosisabhängig, je
konzentrierter der Gehalt an wasserlöslichen Phosphat und/oder Carbonat
in der Chitosan-GP-Formulierung
ist, desto weniger stabil ist die erhaltene Lösung.
-
e) Typische Herstellung
eines sterilen Flüssigbestandteils
-
Sterilisierungsverfahren
für Flüssigbestandteile
-
Die Sterilisierung des Flüssigbestandteils
kann während
der Herstellung und der Verarbeitung der Chitosan-GP-Lösungen durchgeführt werden.
Die Chitosan-GP-Systeme können
nicht durch Energizing-Verfahren aufgrund der unerwarteten und unerwünschten
thermalen Gelierung sterilisiert werden. Chitosan-Lösungen (kein
GP) und GP-Lösungen
(kein Chitosan) müssen
separat sterilisiert werden. Wäßrige GP-Lösungen haben
keine Viskosität
und werden in allen Fällen
durch Filtration sterilisiert, ohne irgendwelche bemerkbaren Nebenwirkungen.
Chitosan-Materialien (Feststoff) oder Chitosan-Lösungen (wäßriges saures Medium) müssen sterilisiert
werden, während
das Auftreten von signifikanten Abbauwirkungen sowohl des Chitosan-Polymers
und der Chitosan-GP-Systeme vermieden wird.
-
Die bevorzugten Sterilisierungsmethoden
für Chitosan
umfassen das Autoklavieren von Chitosan-Pulver oder -Lösung, und
die Röntgenbestrahlung
nicht-flüssigen
Chitosan-Materials (einschließlich
einer eingefrorenen Lösung)
(siehe Tabelle 8).
-
Tabelle
8
Wirkungen der Sterilisierung von Chitosan-GP-Systeme (keine
Zusätze)
-
Beispiel II
-
Inkorporieren von Knochenheilungs-
und/oder Induktionsmitteln in den Flüssigbestandteil
-
a) Inkorporation und Kompatibilität von Vollblut
und Knochenmark in der Flüssigkeit
von Mineral-Polymerzusammensetzungen
-
Ein Blutbestandteil oder Vollblut
eines Patienten der behandelt werden soll, wird häufig verwendet,
um mit Knochenfüllmaterialien
gemischt zu werden (Bsp.: Calciumphosphat oder Carbonatgranulat
gemischt mit autologen Blut).
-
Eine frische Blutprobe wurde aus
den aurikulären
Arterien und den subchondralen Defekten von Kaninchen gesammelt.
Das Blut wurde mit dem Flüssigbestandteil
von Mineral-Polymerzusammensetzungen
gemischt (Chitosan-GP). Knochenmark wurde aus der Tibia und Femur
gesammelt und frisch verwendet. Nach der vollständigen und schnellen Homogenisierung
wurde das Gelieren dieses bluthaltigen Flüssigbestandteils bei 37°C durch rheologische
Analysen (17) überwacht.
Das Gel hat einen elastischen Modus (G') von ungefähr 800–1000 Pa nach 9 h bei 37°C.
-
Dies zeigte, daß die Thermogelierung des Flüssigbestandteils
nicht durch Blut oder Mark getroffen wird und ermöglicht Blut
und seine Bestandteile und Knochenmark in die thermogelierende Hybridformulierung einzuschließen.
-
b) Inkorporation und Freisetzung
von Proteinen (Albumin) in die Flüssigkeit und/oder im festen
Bestandteil von Mineral-Polymerzusammensetzungen
-
Rinderserumalbumin (BSA) war das
Protein, das als Modell der Proteininkorporation und die Freisetzung
aus Hybridformulierungen entweder durch den Flüssig- und/oder Feststoffbestandteil
verwendet wurde.
-
Die Inkorporation von BSA in den
Flüssigbestandteil
wurde durch das Einfügen
des BSA direkt in die Flüssigbestandteilformulierung
durchgeführt.
Unter Verwendung einer 2-Spritzen-Prozedur, wird die Chitosan-Lösung und
eine Glycerophosphat-Lösung
homogen gemischt, dann wird eine Chitosan-GP-Lösung gleichermaßen mit
BSA in PBS (×1)
Lösung
gemischt. Der finale Chitosan-Gehalt in diesen Gelen betrug 1,44, 1,8
und 2,16% G/V. Der finale BSA-Gehalt in diesen Gelen betrug 250 μg/ml. Gele
werden in Petrischalen geformt (konstanter Oberflächenbereich)
(37°C, 1H),
dann mit 10 ml PBS (×1)
bedeckt. Nach der gewünschten Zeit
wird eine 1000 μl-Lösungsprobe
zum Titrieren des BSA-Gehalts eingesammelt und durch 1000 μl frischer PBS-Lösung ersetzt.
Der BSA-Gehalt wird spektrophotometrisch unter Verwendung eines
Coomassie-Plus-Protein-Assays (Pierce) bestimmt. Das aus den Chitosan-GP-Gelen
freigesetzte BSA wird nach 1, 3, 6, 24, 48 h, 4, 6 Tagen etc. bestimmt.
Die BSA-Freisetzung aus Chitosan-GP-Gelen ist schnell und nach 24
h sind mindestens 50% des BSA vollständig aus den Gelen freigesetzt.
Das Einschließen
von BSA in dem festen Bestandteil wurde durch das Kontaktieren von
biphasischem Calciumphosphat-Granula (2 Größen: <150 μm, 150–250 μm) mit Rinderserumalbumin
(BSA)-Lösungen durchgeführt. Das
BCP/BSA Gewichtsverhältnis
betrug 50 mg BCP auf 500, 1000 oder 2500 μg BSA. Die anfänglichen
BSA-Lösungen
wurden in einer Phosphat-gepufferten Lösung (PBS × 1) bei BSA-Konzentrationen
von ungefähr
1, 2 oder 5 mg/ml hergestellt. 500 μl einer BSA-Lösung wurde
auf 50 mg BCP-Granulat geschüttet.
Die Adsorptionen wurden in Zentrifugationsfiltern (Nanosep MF Micorconcentrator)
mit einer Filtergröße von 0,45 μm durchgeführt. Die
Adsorption wurde bei 37°C
für 24
Stunden durchgeführt.
Nach der Adsorbierung, wurden die BCP-Granula eingesammelt, durch Ultrazentrifugation
für 10
Minuten bei 13000 Upm. Die restliche BSA-Lösung wird eingesammelt. Die BCP-Granula
wurden in Zellkultureinsätze
getan (0,4 μm-Filter)
einer 24-Well-Platte,
und mit 1,5 ml PBS (×1). Nach
der gewünschten
Zeit wird eine 500 μl-Lösungsprobe
zum Titrieren des BSA-Gehalts
abgenommen und durch 500 μl
frischer PBS-Lösung
ersetzt. Der BSA-Gehalt wird spektrophotometrisch unter Verwendung
eines Coomassie-Plus-Protein-Assays (Pierce) bestimmt. Das BSA,
das aus dem BCP-Granulat freigesetzt wird, wird nach 1, 3, 6, 24,
48 h 4, 6 Tagen etc. bestimmt. Die BSA-Freisetzung aus BCP-Granula
ist progressiv.
-
Die BSA-Freisetzungen sind für beiden
Größen gleich
und entsprechen einer totalen Freisetzung von ungefähr 40 μg nach 700
Stunden (20 μg
nach 200 Stunden).
-
c) Inkorporation und Freisetzung
von Knochenprotein (BP) in den Flüssigbestandteil der Mineral-Polymerzusammensetzung
-
Das osteogene Mittel war ein Knochenprotein
(BP in der Tat ein Pool aus Knochenmorphogenese-Proteinen, die in
einer wäßrigen sauren
Umgebung gelöst
wurden. Die wäßrige Chitosan-GP-Lösung wurde
wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Eine BP-Lösung wurde
durch das Lösen
der Proteine in einer 0,01 M HCl (6,0 mg/ml) hergestellt. Drei Volumina
der BP-Lösung wurden
genommen und vorsichtig mit Chitosan-GP-Lösungen
gemischt, um klare homogene Chitosan-GP + BP-Zusammensetzungen mit verschiedenen
Protein-Gehalten zu ergeben. Das Volumen aller hergestellten Zusammensetzungen
wurde mit sterilem Wasser wie benötigt auf 12,5 ml komplettiert.
Alle Arbeitsschritte wurden unter sterilen Bedingungen bei 4°C durchgeführt. Der
endgültige
BP-Gehalt der drei Zusammensetzungen betrug 33, 100 und 330 μg/ml. Die
Gelbildung aller BP-haltigen Zusammensetzungen wurden innerhalb
weniger Minuten bei 37°C
erreicht. Das Einschließen
von BPs interferierte nicht mit der Gelbildung. Gelierte Chitosan-GP-/BP-Proben
wurden in vitro in Aktivitäts-/Freisetzungstests
getestet und in vivo in einem subkutanen Nagetiertest untersucht.
Als subkutaner Nagetiertest wurde verwendet: Long-Evans-Ratten (20)
wurden mit Natriumpentobarbital (400 μg) anästhesiert. Gelhaltige Proben
(200 μl)
wurden subkutan in Abwesenheit eines Einschnitts injiziert. Das
Gel bildete eine kugelförmige Struktur.
Jede Gruppe enthielt 5 Tiere. Die Gel-Zusammensetzungen wurden unter
Verwendung variabler BP-Dosen (0, 10, 30 μg) verglichen. Der subkutane
in vivo-Test beweist, daß BP
in der Chitosan-GP-Formulierung aktiv ist, und dadurch zur Induzierung
von neuen Knochen- und Knorpelgeweben führt.
-
Knochenheilungsfaktoren, die für die Frakturheilung
nützlich
sind, wurde als repräsentative
Knochenheilungsmittel, die in den Flüssigbestandteil eingeschlossen
werden sollen ausgewählt.
-
c) Inkorporation und Freisetzung
von Fibroblast Growth Factor (FGG) in dem Flüssigbestandteil der Mineral-Polymerzusammensetzung
-
Fibroblast Growth Factor (basic,
bFGF) wurde hier als Wachstumsfaktormitglied der TGF-CIGF-Familie,
die in dem Flüssigbestandteil
und den Hybridmaterialien eingeschlossen sein soll verwendet. bFGF
und bFGF mit Heparin wurden zu den Chitosan-GP-Lösungen hinzugegeben, bei bFGF
und bFGF/Heparin alleine als Kontrollen verwendet wurden. Heparin
in der Chitosan-GP-Lösung
wurde zu μg/ml
verwendet, während bFGF
1 μg/ml
betrug. Chitosan-GP (1 ml)-Lösungen
wurden in Schälchen
mit PBS und 50 μg/ml
Rinderserumalbumin bei 37°C
getan. 1 ml des Mediums wurde nach 0, 6, 24, 48 und 72 Stunden eingesammelt.
Der bFGF wird mittels ELISA (Quantikine FGF basic Immunoassay) quantifiziert.
Das bGFG in Chitosan-GP-Gelen (kein Heparin) wird hauptsächlich nach
24 h freigesetzt. Wenn es mit Heparin inkubiert wird, verblieb bFGF
(+ Heparin) in den Chitosan-GP-Gelen und die Freisetzung wird klar
verzögert.
-
Zusätzlich zum Flüssigbestandteil
können
bFGF und andere GFs mit Hilfe des Feststoffbestandteils immobilisiert
werden, oder direkt in die Hybridzusammensetzungen eingeschlossen
werden.
-
d) Inkorporation von humanem
demineralisiertem Knochenpulver (HDBP) in die Mineral-Polymerzusammensetzung
-
Demineralisiertes Knochenpulver (DBP)
ist ein demineralisiertes Knochenmatrix (DBM)-Material, das in festes
Pulver umgewandelt wird, und aus Nicht-Mineralien, nicht-lebenden organischen
Knochenbestandteilen (Collagen, Knochenproteine ...) zusammengesetzt
ist. Demineralisierte Knochenmatrix ist osteoinduktiv. Ein kortikales
demineralisiertes Knochenpulver (CDBP) (Community Tissue Services,
OH & Impladent,
NY, USA) aus humanen Allografts wurde als typische Beispiele ausgewählt. Es
ist eine allogene kortikale demineralisierte Knochenmatrix, die
in Partikeln von ungefähr
0,3–0,5
mm Größe zerstoßen worden
ist. CDBP wurde durch Bestrahlung sterilisiert und gefriergetrocknet.
Als Allografts wurde CDBP negativ auf HBsAG, anti-HBc, anti-HCV, STS. HIV 1/2,
HTLV-I und HIV-1-Antigen gestestet. Eine chitosan-GP-Formulierungsbasis
wurde zuerst durch das Herstellen einer 2,3% G/V Chitosan (84% Dacetylierung)
in 0,10 M HCl-Lösung
erhalten, und dann durch Mischen der gewünschten Menge eines 55% G/V
Dinatriumglycerophosphats in destillierter Wasserlösung. Endkonzentration
der klaren flüssigen
Chitosan-GP-Formulierung waren um 1,8–2,0% G/V Chitosan und 8,0%
G/V Glycerophosphat.
-
CDBP wurde in einem festen Zustand
in die Chitosan-GP-Lösung
inkorporiert, was zu einer CDBP in Chitosan-GP-Suspension führt. Das
Beladen einer Chitosan-GP mit CDBP (Impladent Ltd., NY, USA) wurde durch
das anfängliche
Feststoff-zu-Flüssiggewicht
oder Volumenverhältnis
bestimmt. Die Chitosan-GP/CDBP-Zusammensetzungen
wurden bei 37°C
geliert, indem sie homogen das CDBP einschließen.
-
Beispiel III
-
Selbstbildende Hybridzusammensetzung
und Material
-
Verschiedene Calciumphosphat-Materialien
wurden verwendet, um selbstbildende (gelierende) Hybridzusammensetzungen
und Materialien zu bilden (1).
Alle ausgewählten
Calciumphosphate wurden (klinisch) als osteokonduktiv anerkannt.
Tabelle 9 gibt die entsprechenden Zusammensetzungen und S/L-Verhältnisse
wider.
-
Tabelle
9
Entsprechende Zusammensetzungen und S/L-Verhältnisse
-
a) Zusammensetzung mit
Durapatithydroxyapatit
-
Eine Chitosan-GP-Formulierungsbasis
wurde zuerst durch das Herstellen einer 2,3% G/V Chitosan (85% Deacetylierung)
in 0,1 M HCl-Lösung
erhalten, und dann durch Mischen der gewünschten Menge einer 55% G/V-igen
Dinatriumglycerophosphat in destillierter Wasserlösung. Finale
Konzentrationen der klaren flüssigen
Chitosan-GP-Formulierung
betrugen 2,0% G/V Chitosan und 8,0% G/V Glycerophosphat. Die Ladung
in festen Durapatit-Partikeln wurde durch das Feststoff-zu-Flüssig-Gewichtsverhältnis bestimmt,
z.B. 1:10, 3:10 und 5:10 S/L-Beladungsverhältnis.
-
Typische Experimente wurden mit einer
3:10-Ca-P-Beladung (Tabelle 9) durchgeführt.
-
Durapatit-Partikel wurden durch das
Sieben in 0 bis 125 μm-Durchmesser, 212–250 μm-Durchmesser und >250 μm Durchmessergrößengruppen
ausgewählt.
Das homogene Mischen von Ca-P-Keramiken in Chitosan-GP wurde durch
das manuelle Kneten und magnetische Rühren über 2 bis 3 Stunden erreicht.
Die erhaltenen Aufschlämmungen
zeigen im allgemeinen eine größere Extrudierbarkeit
oder Fließeigenschaften,
die durch viskosimetrische Analysen beobachtet wird. Es zeigt sich,
daß höhere Scherraten
in einer Senkung der Viskosität
resultieren (<10000
mPa·s),
wobei eine höhere
Viskosität
bei niedrigeren Scherraten (bis zu 60000 mPa·s) beobachtet wird.
-
Alle Hybridzusammensetzungen weisen
rheologisch ein selbstgelierendes Verhalten auf, das für eine Flüssigbestandteileigenschaft
ist. In nahezu allen Fällen
induziert die Durapaptitbeladung erhöhtere viskoelastische Parameter
wie typischerweise die elastischen und viskosen Moduli (G' und G'') Durapaptit (212–250 μm) Inkorporierung scheint am
effizientesten beim Verbessern von G' und G'' zu
sein. In gewissen Ausmaß scheinen
die G'- und G''-Anstiegsraten
linear mit dem S/L-Verhältnis
korreliert zu sein. Die mechanischen Leistungsfähigkeiten, die als Kompressionsmodus
(transient und Gleichgewicht) ausgedrückt sind, sind nicht infolge
der Durapatitinkorporation markant erhöht, obwohl 3/10 bis 5/10 Beladung
Hybridgele mit höheren
Kompressionsstärken
zu Verfügung
zu stellen scheint (2, 4, 5, 7, 8 und 12).
-
b) Hybridmaterialien mit
Tricalciumphosphat (TCP)
-
Die ausgewählte Chitosan-GP-Lösung war
die gleiche wie zuvor in Beispiel 3a oben beschrieben. Die Beladung
von Tricalciumphosphat (TCP)-Partikeln, die als Feststoff zur Flüssiggewichtsverhältnis bestimmt wurde,
variierte (1:10, 3:10 und 5:10 S/L). Typische Experimente wurden
mit einem 3:10 Ca-P-Beladung (Tabelle 9) durchgeführt. Alle
Chitosan-GP/TCP-Zusammensetzungen
wurden mit viskosimetrischen und rheologischen Methoden überwacht
und bilden feste Hybridgele bei 37°C (3 und 9).
-
c) Hybridmaterialien mit
synthetischem nicht-keramischen Hydroxyapatit (HA Resorb Osteogen)
-
Die ausgewählte Chitosan-GP-Lösung war
die gleiche wie zuvor in Beispiel 3a oben beschrieben. Die Beladung
in synthetisches nicht-keramisches Hydroxyapatit-HA-Resorb-Osteogen (Impladent
Ltd., NY, USA)-Partikel betrug 1:10 und 3:10 S/L (Tabelle 9). Osteogenhydroxyapatit
ist dentales Hydroxyapatit-Material ungefähr 300–400 μm in der Größe. Alle Chitosan-GP/Osteogen-Zusammensetzungen
wurden mit viskosimetrischen und rheologischen Eigenschaften überwacht
und bildeten feste Hybridgele bei 37°C (10 und 13).
-
d) Hybridmaterialien mit
dichten Hydroxyapatit-Keramikgranula (Apafill-G)
-
Die ausgewählte Chitosan-GP-Lösung war
die gleiche wie im Beispiel 3a oben zuvor beschrieben. Die Beladung
in dichte Apafill-G-Hydroxyapatit (BIOMAT, Havana, Kuba) Partikeln
war 3:10 S/L (Tabelle 9). Apafill-G-Hydroxyapatit ist ein orthopädisches
und dentales Hydroxyapatit-Material von ungefähr 100–400 μm Größe. Alle Chitosan-GP/Apafill-Zusammensetzungen
wurden mit viskosimetrischen und rheologischen Verfahren überwacht
und bildeten feste Hybridgele bei 37°C.
-
e) Hybridmaterialine mit
corallinen Hydroxyapatit-Granula (Coralina)
-
Die ausgewählte Chitosan-GP-Lösung war
die gleiche wie zuvor in Beispiel 3a oben beschrieben. Die Beladung
in Coraline-Hydroxyapatit
(Laboratorio de Biomateriales, Kuba)-Partikel war 3:10 S/L (Tabelle
9). Corallina-Hydroxyapatit wird aus marinen Korallenmaterialien
hergestellt und wird als orthopädisches
und dentales nicht-resorbierbares Hydroxyapatit-Material in ungefähr 400 bis
2400 μm
Größe verwendet.
Alle Chitosan-GP/Corallina-Zusammensetzungen wurden mit viskometrischen
und rheologischen Verfahren überwacht und
bildeten bei 37°C
feste Hybridgele.
-
f) Hybridmaterialien mit
biphasischem Calciumphosphat (BCP)
-
Die ausgewählte Chitosan-GP-Lösung war
die gleich wie zuvor in Beispiel 3a oben beschrieben. HAP/β-TCP-Partikel
(35–40:65–60) biphasisches
Calciumphosphat (Clarkson Chromatographic Products Inc., PA, USA;
und Teknimed, Vic-en-Bigorre,
Frankreich) wurden in einem Feststoff zu Flüssigkeitsgewichtverhältnis von
1:10 bis 5:10 beladen (Tabelle 9). BCP ist eine ungefähr 40:60
(Gewicht) Pulvermischung eines Hydroxyapatits und eines β-Tricalciumphosphats.
Alle Chitosan-GP/BCP-Zusammensetzungen wurden mit viskosimetrischen
und rheologischen Verfahren überwacht,
und bildeten festen Hybridgele bei 37°C. Alle Materialien der Beispiele
2a bis 2f gelierten in feste Hybridgele oder zeigten endotherme
Anzeichen einer Gelierung für Beladungen,
die typischerweise von 0/10 bis 10/10 reichen, und bevorzugt von
0/10 bis 7/10 (0 bis 1 g/ml). Die ideale Ca-P-Beladung (Injizierbarkeit,
Gleichmäßigkeit
des Gels ...) schien im allgemeinen um 3/10 bis 5/10 zu sein, jedoch änderte sie
sich leicht mit der chemischen Art des Ca-Ps und der Granulometrie
(Größe, Dichte) (11, 14, 15 und 16).
-
g) Osteoinduktive Knochenhybridzusammensetzung
und Biomaterialien
-
Eine selbstbildende Knochen-Hybridzusammensetzung
und Biomaterial wurde aus Chitosan-GP, Hydroxyapatit und CDBP zusammengesetzt.
Das Chitosan-GP wurde auf 1,5% (G/V) Chitosan und 8,2% (G/V) hergestellt.
1,0 ml menschliches CDBP-Pulver wurde mit 10 ml Chitosan-GP-Lösung gemischt,
dann mit 3,0 g Durapaptit-Partikeln beladen (200–250 μm).
-
Die fließfähige daraus resultierende Suspension
wurde vorsichtig gemischt und homogenisiert (manuell und mechanisch).
Die Gelbildung wurde bei 37°C
erreicht und kontrolliert.
-
Beispiel IV
-
In vivo-Untersuchung der
Knochenzusammensetzungen, Biomaterialien und verwandte Bestandteile
-
a) Subkutane Injektion
von reinen Flüssigbestandteilen
-
Flüssigphasen, die aus wäßrigen thermogelierenden
Lösungen
aus Chitosan (2,0%, G/V) und Glycerophosphat (8,2% G/V) bestehen,
wurden steril hergestellt durch das Autoklavieren von Chitosan-Lösungen und
durch das Filtrieren von Glycerophosphat-Lösungen. Adulte albino Sprague
Dawley-Ratten wurden für
40 Minuten durch intraperitoneale Injektion von 2,7 mUkg eines Hypnorm® und
Midazolal (Versed®) Gemisches anästhesiert,
das durch das Mischen von 1 ml Hypnorm® und
1 ml 5 mg/ml Midazolal mit 2 ml sterilem Wasser hergestellt wurde.
Subkutane Injektionen von ungefähr
0,2 mlo/Injektion wurden auf jeder Seite der Wirbelsäulenmittellinie
durchgeführt.
Die Tiere wurden wieder ihren normalen Aktivitäten überlassen. Nach 3, 7, 14, 21, 30,
60, 90 und 120 Tagen wurden Opfer durch Kohlendioxid-Überdosierung
durchgeführt.
Die Implantate wurden eingesammelt, makroskopisch untersucht und
histologisch analysiert (H&E-Färbung auf dünnen Objektträgern). Oberflächliche
Beobachtungen zeigten, daß die
Chitosan-GP-Systeme in situ kohäsive
Matrizes mit runder bis ovaler Form bildeten. Zu keinem Zeitpunkt
verlagerten sich die Implantate subkutan. Die histologischen Analysen
zeigten eine reduzierte akute Entzündung, eine moderate chronische
Entzündung,
die mit der Erosion des Implantats assoziiert war. Chitosan-GP-Systeme
wurden als kohäsive,
geformte und residierende Implantate mit moderaten assoziierten
inflammatorischen Reaktionen befunden. Die Erosion in situ der Chitosan-GP-Implantate
war progressiv und peripher. Die Implantate und Materialien wurden
für 120
Tage in situ gelassen.
-
b) Intramuskuläre Injektion
reiner Flüssigbestandteile
-
Intramuskuläre Injektionen in Ratten wurden
mit den Materialien und den Protokollen, die im Beispiel 4a beschrieben
wurden, durchgeführt,
außer
daß die
Injektion intramuskulär
in die Muskelgewebe der unteren Extremitäten war. Die oberflächliche
Beobachtung zeigte, daß die
Chitosan-GP-Systeme
in situ kohäsive
Matrizes mit runden bis ovalen Formen bildeten. Die Implantate bewegten
sich subkutan zu keinem Zeitpunkt. Die histologischen Analysen zeigten
eine reduzierte akute Entzündung,
und eine moderate chronische Entzündung, die mit der Erosion
des Implantats assoziiert war. Chitosan-GP-Systeme wurden als kohäsive, geformte und
residierende Implantate mit moderaten assoziierten Entzündungsreaktionen
befunden. Die in situ-Erosion der Chitosan-GP-Implantate war progressiv
und peripher. Die Implantate und Materialien verblieben für 80 Tage
in situ.
-
c) Knocheninjektionen
reiner Flüssigbestandteile
-
Die Injektionen in die Knochen in
einem Ratten-Transkondylar-Modell
wurden mit den Materialien und Protokollen die in Beispiel 4a beschrieben
sind, durchgeführt,
außer
daß die
thermogelierenden Materialien in transkondylare zylindrische Defekte
eingefügt
wurden.
-
Die oberflächlichen Beobachtungen zeigten,
daß Chitosan-GP-Systeme in situ kohäsive Matrizes
bilden. Die histologischen Analysen zeigen eine reduzierte akute
Entzündung,
und eine moderate chronische Entzündung, die mit der Erosion
des Implantats assoziiert war.
-
d) Subkutane Injektionen
von Hybridmaterialien mit HA-Resorb
-
Subkutane Injektionen in Ratten wurden
mit den Materialien und Protokollen, die in Beispiel 4a beschrieben
wurden, durchgeführt.
Die Hybridzusammensetzungen waren wäßrig, und enthielten 2,0% G/V
Chitosan, 8,2% G/V Glycerophosphat und 30% G/V (ungefähr 3 g Kristall
je 10 g Lösung)
an HA Resorb synthetischen Hydroxyapatit-Kristallen. Chitosan-GP
wurde steril hergestellt (Chitosan autoklaviert; GP 0,22 μm filtriert).
HA-Resorbkristalle waren steril beim Mischen in der Lösung. Jede
Injektion betrug ungefähr
200 μl Volumen.
Die Hybridimplantate, die sich in situ bildeten waren kohäsiv, infiltriert
und bewegten sich in situ nicht. Die Implantate verblieben für eine Dauer
von mindestens 80 Tagen an der Stelle.
-
Während
die Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen Ausführungsformen
davon beschrieben worden ist, wird darunter verstanden, daß sie für weitere
Modifizierungen fähig
ist und daß diese
Anmeldung beabsichtigt jede Variation, Verwendungen oder Adaptationen
der Erfindung abzudecken, im allgemeinen, die Prinzipien der Erfindung
und einschließlich
solcher Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, die mit bekannter
oder gewöhnlicher
Praxis innerhalb des technischen Gebiets, mit dem die Erfindung
zusammenhängt
entstehen, und die auf die oben ausgeführten wesentlichen Eigenschaften
angewendet werden kann und die im Schutzbereich der angehängten Ansprüche erfolgt.